Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

هندسة العوامل المضادة للفيروسات عبر رنين البلازمون السطحي

Published: June 14, 2022 doi: 10.3791/63541
Automatic Translation
1,2
1Department of Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 2Department of General Surgery, Medical University of Vienna

Summary

يصف البروتوكول الحالي أدوات جديدة لمقايسات ربط SPR لفحص ارتباط CV-N ب HA ، والبروتين السكري S ، والجليكان الهجين ذي الصلة ، والسكريات قليلة السكاريد عالية المانوز. يستخدم SPR لتحديد KD لربط إما ثنائي أو أحادي CV-N بهذه الجليكانات.

Abstract

يستخدم رنين البلازمون السطحي (SPR) لقياس ارتباط الهيماجلوتينين (HA) بثنائي ثنائي السيانوفيرين-N (CV-N) المبادل بالمجال ولمراقبة التفاعلات بين الببتيدات المانوسيلية وموقع الارتباط عالي التقارب ل CV-N. تم الإبلاغ عن طفرات غلاف الفيروس gp120 و HA و Ebola glycoprotein (GP) 1,2 لربط كل من مواقع الربط عالية ومنخفضة التقارب على CVN2 الثنائي. يرتبط ببتيد HA ثنائي المانوسيلات أيضا في موقعي الربط منخفض التقارب بجزيء مهندس من CVN2 ، والذي يحمل موقعا عالي التقارب لليجند المعني ويتحور ليحل محل رابطة ثاني كبريتيد مستقرة في جيب ربط الكربوهيدرات ، مما يؤكد الارتباط متعدد التكافؤ. يظهر ارتباط HA بموقع ربط عالي التقارب للجسم المضاد الزائف CVN2 عند ثابت تفكك (KD) يبلغ 275 نانومتر مما يزيد من تحييد فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) من خلال قلة القلة. يؤدي ربط عدد جسور ثاني كبريتيد في CVN2 المبادلة بالمجال ، والتي يتم تقليلها من 4 إلى 2 عن طريق استبدال السيستين في أزواج بقايا قطبية من حمض الجلوتاميك والأرجينين ، إلى تقليل تقارب الارتباط ب HA. من بين أقوى التفاعلات ، يرتبط الإيبولا GP1,2 ب CVN2 مع موقعين ملزمين عالي التقارب في النطاق النانوي السفلي باستخدام غلاف الجليكان بدون مجال عبر الغشاء. في هذه الدراسة ، يتم قياس ارتباط CV-N أحادي متعدد الأنواع بفيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) سبايك (S) بروتين سكري عند K D = 18.6 μM مقارنة ب nanomolar KD لتلك المسامير الفيروسية الأخرى ، وعبر مجال ربط المستقبلات في نطاق منتصف μ المولي.

Introduction

يتم تحفيز النشاط المضاد للفيروسات المرتبط ب Tetherin بواسطة α الإنترفيرون ، وهو يشتمل على حبال قائمة على البروتين ، مما يؤدي إلى الاحتفاظ بالفيروسات المشكلة بالكامل على أسطح الخلايا المصابة1. لا تزال ضرورة غليكوزيل التيثرين في تثبيط إطلاق الفيروس غير مؤكدة ، مما يعني أهمية أنماط الجليكوزيل على الجليكان المعبر عنه بشكل مؤتلف للدراسات المختبرية 1,2 ، والتي تعتمد على تشكيل (في حالة فيروس الأنفلونزا) الأنفلونزا المعبر عنها سطحيا هيماغلوتينين HA 3,4 . وقد لوحظ أن تعديل قليل السكاريد المربوط بالجليكوزيل المرتبط ب N يكفي لتقييد إطلاق فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1بوساطة التيثرين 2 ، بينما يلعب dimerization دورا أساسيا في منع إطلاق الفيروس ، وبالتالي إشراك المجال عبر الغشاء أو مرساة جليكوزيل فوسفاتيديل إينوسيتول (GPI) لربط الفيروسات الناشئة5 . يتم وصف الميزات الفريدة للحبل البشري والفئران لمنع العديد من الفيروسات المغلفة والفيروسات القهقرية والفيروسات الخيطية. BST-2 / tetherin هو بروتين مضاد للفيروسات يمكن تحريضه بواسطة الإنترفيرون للمناعة الفطرية 1,6 ، ويعمل مع نشاط مضاد للفيروسات واسع الطيف ويتم معاداته بواسطة البروتينات السكرية المغلفة5 إما لنقل التيثرين أو تعطيل بنية التيثرين 6. على سبيل المثال ، يعرف البروتين السكري المغلف المعبر عنه سطحيا HA والنورامينيداز على فيروس الأنفلونزا A بمعاداة التيثرين بطريقة خاصة بالسلالة7 ، مما يسهل التعرف على مواقع ربط مستقبلات المضيف8. تتم دراسة الأجسام المضادة التي تستهدف الجليكان في القياس المتكافئ لتفاعلاتها مع دروع الجليكان سريعة التخصيص على HA ، مما يؤدي إلى تقارب ملزم بالنوعين الفرعيين4 من الأنفلونزا A H3N2 و H1N1.

لتوضيح آليات الربط بين العوامل المضادة للفيروسات وطفرات غلاف الفيروس ، أي روابط الكربوهيدرات ، والطرق المناعية والطيفية التكميلية ، يتم تصنيع شقوق أحادية وثنائية وثلاثية مانوز كيميائيا. يتم إنشاء الببتيدات المانوسيلية عن طريق أزيدو جليكوزيل من جليكوزيل {بيتا}-بيراسيتات إلى 1،2-trans glycosyl azidesتحويل 9 ، مما يحاكي الجلوكوزامين N-acetyl الموجود عادة وقليل السكاريد عالي المانوز على سطح الفيروسات التي تهدد الحياة. تستخدم الإيزوكوسترات الحيوية التريازول لتقليد الروابط التي تشكل بقايا مانوسيلات من ببتيد HA10 وتسهيل التفاعلات الخاصة بالموقع مع مشتقات CV-N المضادة للفيروسات حول بقعة الجليكوزيل الثانية المرتبطة ب N على مجال رأس HA (قمة HA مع 4 جليكان مرتبط ب N N54 ، N97 ، N181 ، N301) 8،11،12 . أظهرت التفاعلات بين حمض الجلوتاميك (Glu) والأرجينين (Arg) وثنائي القطب الحلزوني الناتج استقرارا جيدا لكل من الببتيدات النموذجية والبروتينات ولكن يتم تصورها باستخدام SPR. إذا ما قورنت بالتعرف على موقع جليكوزيل واحد مركب كيميائيا على HA10 عن طريق تثبيط ارتباط المستقبلات مباشرة على شقوق الجليكان ، فإن التقارب الأعلى لهيكل Fc المتحور المكون من أربعة مواقع لمستقبلاته يظهر أنه يستنبط وظائف المستجيب في الجسم الحي ، مما يكشف عن التركيب غير ذي الصلة للجليكان المرتبط ب N المرتبط بمتحولة Fc ليتم تحديده ميكانيكيا13.

يعرض CV-N نشاطا مضادا للفيروسات ضد فيروس نقص المناعة البشرية 14،15 والإنفلونزا16 وفيروس الإيبولا ، والذي يتم بوساطة الارتباط النانوي بتعديلات قليل السكاريد عالية المانوز على بروتينات سبايك المغلف 12،17،18،19. تم تحديد ارتباط الأنفلونزا HA بموقع واحد عالي التقارب لربط الكربوهيدرات (H) في CV-N أو اثنين من Hs في CVN2 ثنائي الارتباط تساهميا للحصول على ثوابت تفكك التوازن (K D) = 5.7 نانومتر (الشكل 1A) و KD = 2.7 نانومتر ، على التوالي. يحتوي كل من CV-N و CVN2 على واحد أو اثنين من مواقع ربط الكربوهيدرات منخفضة التقارب (L) s12،17،20،21. يرتبط الإيبولا GP1,2 ب 2H من CVN2 مع تقارب في النطاق النانوي السفلي (KD = 26 نانومتر). يظهر ارتباط CV-N WT بالإيبولا GP1,2 و HA صلات من K D = 34 نانومتر إلى KD = 5.7 نانومتر (A / New York / 55/04)12. الليكتين ، مثل CV-N ، الذي يستهدف على وجه التحديد جليكان عالي المانوز على الأظرف الفيروسية ، يمنع تكاثر فيروس التهاب الكبد C ، و SARS-CoV ، وفيروس الهربس ، وفيروس ماربورغ ، وفيروس الحصبة22.

تمت دراسة جزيء CV-N الصغير بدقة لأكثر من 20 عاما لأنه يعمل على ربط مجموعة واسعة من الفيروسات لمنع دخول الفيروس16,18. تشير التحليلات الهيكلية ومقايسات تقارب الربط إلى الربط المتقاطع لاثنين من Ls في ثنائي CVN2 المبادل بالمجال عن طريق الارتباط ثنائي التكافؤ في نطاق micromolar لتعزيز الحساسية للبروتينات السكرية المغلفة الفيروسية10,19. يتكون الارتباط الانتقائي ل Manα1-2Manα على أذرع Man(8) D1D3 و Man(9) من موقعين ملزمين لهما صلات مختلفة يقعان على بروتومرات البروتينالمعاكسة 20 ، وبالتالي الوصول إلى تقارب الارتباط النانوي (الشكل 1B). وبالتالي ، يعتبر CVN2 جسما مضادا زائفا فيما يتعلق بتطبيقه لربط الحواتم على فيروس نقص المناعة البشرية gp120 ، على غرار الأجسام المضادة المعادلة للفيروس17. هنا ، يهتم المؤلف بالتحقيق في الارتباط المحتمل ل CVN2 بارتفاع SARS-CoV-2 عبر مجال ربط المستقبلات (RBD). تؤدي منحنيات الربط للإنزيم البشري المحول للأنجيوتنسين (ACE) -2 مع SARS-CoV-2 RBD إلى KD = 4.7 نانومتر لهذا التفاعل المرتبط بيولوجيا23.

على النقيض من ذلك ، تتعرف فئات الغلوبولين المناعي المختارة على أنماط البروتين الهيكلية المحددة والمتسقة ، والتي تضفي ركيزة لنضج التقارب في مناطق HA المثبتة بالغشاء24. يظهر CV-N نشاطا قويا للغاية في جميع فيروسات الأنفلونزا A و B تقريبا16 ، وهو عامل مضاد للفيروسات على نطاق واسع. معرفتنا غير مكتملة حول موقع الحلقات المستهدفة على جذع HA1 و HA2 والتي ربما تتضمن هياكل epitopic لاستهداف الجليكان بواسطة أجسام مضادة شديدة التحييد وبالمقارنة مع ربط الليكتين25.

Figure 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لمقايسة ربط SPR ل CV-N إلى طفرات غلاف الفيروس. (أ) مقايسة SPR لربط CV-N بالليجند: بروتين HA كامل الطول (90 كيلو دالتون). مجموعة البيانات الحركية (5120 ، 2560 ، 1280 ، 640 ، 320 ، 160 ، 80 ، 40 ، 20 ، 10 ، 5 ، 2.5 ، 0 نانومتر) تظهر الارتباط المرجعي المزدوج في الوقت الفعلي بالأنفلونزا HA A / New-York / 55/04 (H3N2). (B) ارتباط متغير CVN2L0 V2 بربط DM المجمد ضمن نطاق تركيز يتراوح بين 500 نانومتر و 16 ميكرومتر. التسلسل: يتم تمييز بقايا L باللون الأصفر. يتم تمييز بقايا H باللون الرمادي. E58 و R73 هما بديل للسيستين في البروتين البري ويجعلان V2 طية بروتين مستقرة مع ثلاثة بدلا من أربعة روابط ثاني كبريتيد الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

في حين أن درع الجليكان الموجود على الجزء العلوي من HA البعيد الغشائي يحفز ارتباطا عالي التقارب ب CV-N 12 ، فقد لوحظ ارتباط CVN2 ب HA المجاور لجسر ثاني كبريتيد الجزء العلوي من HA في مواقعه منخفضة التقارب10,12. يتم تحديد التفاعلات القطبية المختلفة ومواقع التفاعل في ربط الكربوهيدرات بواسطة CV-N. يتم التحقق من هذه التفاعلات عن طريق توليد متغيرات خروج المغلوب في موقع الربط لربط صلات الربط في السيليكو المتوقعجليكوزيل 12. وبالتالي ، يهدف المشروع إلى مقارنة ببتيدات HA التي تم اختبارها كيميائيا سابقا في تقارب وخصوصية ملزمة مع تسلسلات ببتيد قصيرة من طفرات 2019-nCoV المرتبطة بالسارس و SARS-CoV-2 ، والتي تحدث بشكل طبيعي معدلة بواسطة عدد صغير من مواقع الجليكوزيل المختلفة المرتبطة ب N والجليكوزيل المرتبط ب O. باستخدام المجهر الإلكتروني بالتبريد وفحوصات الربط ، أبلغ بينتو وزملاؤه عن جسم مضاد أحادي النسيلة ، S309 ، من المحتمل أن يتعرف على حاتم على بروتين سبايك SARS-CoV-2 يحتوي على جليكان محفوظ داخل الجنس الفرعي لفيروس Sarbecovirus ، دون التنافس مع مرفق المستقبل26. يصف بروتوكول هذه الدراسة مدى أهمية تصميم متغيرات CV-N والتعبير عنها وتوصيفها لدراسة كيفية ارتباط CV-N و CVN2 بالبروتينات الغليكوزيلاتية والببتيدات الاصطناعية باستخدام تقنية SPR10,12.

يتم التعبير عن ثنائي التدوير المرتبط بالترادف CVN2L027 ومتغيرات موقع الربط (V2-V5) بشكل مؤتلف والمتغيرات مع بدائل رابطة ثاني كبريتيد (C58E و C73R) (الشكل 2 أ). أيضا ، يتم إعداد طفرة مع طفرة أحادية النقطة E41A لأن هذا الموقف ينظر إليه على أنه بقايا تلامس بين الجزيئات. هذا الطفرة هي جزيء آخر مثير للاهتمام لقياسات ربط SPR بين الليكتين والسكريات قليلة السكاريد عالية المانوز التي تفك رموز مجالات الربط وتسمح بالمقارنة مع الشكل الثنائي. يظهر الهيكل البلوري المبدل المجال ل CVN2 رابطا مرنا يمتد بين 49 و 54 بقايا. يمكن أن يستمر المجالان في التحرك حول المفصلة كأجسام صلبة ، ويطوران إما مونومر من خلال تفاعلات المجال داخل الجزيئات (المجال A - بقايا 1-39 ؛ 90-101- مع المجال B - بقايا 40-89) أو ثنائي عن طريق تبديل المجال بين الجزيئات [المجال A (من المونومر الأول) مع المجال B (من الثاني) ، والمجال B (من المونومر الأول) مع المجال A (من النسخة الثانية)]. لا توجد تفاعلات وثيقة بين المجالين A و B للأوليين ، باستثناء Glu4128. يمكن تطوير جين CV-N باستخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل المتكررة مع أوليغوس29 المركب 40 مير ثم يتم استنساخه في مواقع NdeI و BamHI ل pET11a للتحويل (التثقيب الكهربائي) إلى خلايا كهروبيئية كما وصفها Keeffe، J.R.27. يتضمن البروتين ، الذي يستخدم لتحقيق البنية البلورية المعنية (PDB ID 3S3Y) ، علامة تنقية N-terminal 6-histidine متبوعة بموقع انقسام البروتياز العامل Xa. يستخدم الطفرات الموجهة للموقع لعمل طفرات نقطية ، وتبديل الكودونات ، وإدخال أو حذف قواعد أو كودونات مفردة أو متعددة لتبادل الأحماض الأمينية. توفر هذه التحولات نظرة ثاقبة لا تقدر بثمن في وظيفة البروتين وهيكله. تمت دراسة CV-N و CVN2 و CVN3 المعبر عنها وتنقيتها بشكل جيد من الناحية الفيزيائية الحيوية20،21،27 ، وهي رخيصة الإنتاج ، وبالتالي تستخدم لتوصيف مقايسات الربط بالجليكان المثبت على رقائق مستشعر SPR. يوفر مقايسة الممتز المناعي التقليدي المرتبط بالإنزيم (ELISA) قابلية استنساخ أقل فيما يتعلق بتقنية تجميد روابط الجليكان ويحول الارتباط في الوقت الفعلي لمتغيرات موقع الربط المختلفة ، والتي تظهر ل SPR ، إلى مقايسات نقطة النهاية.

يتم التعبير عن متغير التقارب المرتبط CVN2L0-V2 (طية سليمة من CV-N المتجانس مع استبدال جسر ثاني كبريتيد10) بعلامة His-tag في الإشريكية القولونية (E. coli) ، ويتم تنقيتها فوق عمود Ni-NTA باستخدام كروماتوغرافيا التقارب واختبارها للارتباط ب HA (H3N2) ، ببتيد HA-أحادي المانوسيلات وببتيد HA-ثنائي المانوسيلات باستخدام SPR. الببتيدات المانوسيلية كيميائيا ، أو بروتين HA و S ، كلها روابط وأمين مقترنة بسطح الرقاقة المحبة للماء عن طريق الإسترات التفاعلية أو هندسة بروتين البيوتين ستربتافيدين. يتم تطبيق نفس الإجراء الخاص بالتشغيل المتسلسل على تلك الروابط ، وحقن التخفيفات المختلفة ل CV-N ومتغيرات CV-N (و CVN2) للحصول على معلومات حركية لتحليلات التفاعل الجزيئي كما هو موضح أدناه30. تستخدم رقاقة مستشعر SPR المجمدة RBD لدراسات الربط على ببتيدات CV-N إلى S ، وتتم مقارنة الصلات بربط SARS-CoV-2 مع ACE2 البشري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بالنسبة للدراسة الحالية ، تم استخدام بروتين اندماج صغير يشبه يوبيكويتين (SUMO) CVN في مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم بدلا من CV-N وهو مناسب للمقايسات القائمة على الخلايا. يتم الحصول على بروتين HA H3 لفيروس الأنفلونزا الكامل المؤتلف تجاريا (انظر جدول المواد) أو يتم التعبير عنه في خطوط خلايا HEK293 في الثدييات وخلايا الحشرات المصابة بالفيروس البقعي وفقا للبروتوكولات القياسية12. يتم التعبير عن بروتين سبايك Wuhan-1 في خلايا HEK293 في الثدييات. يسمح تخليق الببتيد أحادي المومانوسيلات (MM) والببتيد ثنائي المونيل (DM) بالكشف عن الروابط المتجانسة ل CVN2 والجزيء الصغير أحادي المومانوسيلات10.

1. إنشاء هياكل CV-N

  1. لكل من متغيرات CVN2 وبروتين CVN2L0 (PDB ID 3S3Y) ، احصل على بنية الجين بتسلسل قائد pelB N-terminal وعلامة His-tag في pET27b (+) من مصادر تجارية (انظر جدول المواد ، الملف التكميلي 1).
  2. الحصول على CVN2L0 ومتغيراته (V2 و V3 و V4 و V5 ؛ الشكل 2A ، C) في خلفية جين قالب CVN2L0 يتكون من تسلسلين مختلفين من الحمض النووي لكل تكرار CV-N.
  3. إذابة الحمض النووي البلازميد المجفف بالتجميد في الماء المقطر المعقم منزوع الأيونات (ddH2O) إلى تركيز نهائي قدره 100 نانوغرام / ميكرولتر.

2. تحضير صفائح LB-agar مع خلايا الحمض النووي المحول للبلازميد

  1. تحضير وسط الاستزراع LB-Lennox عن طريق إذابة 10 جم / لتر من الببتون ، و 5 جم / لتر من خلاصة الخميرة ، و 5 جم / لتر من كلوريد الصوديوم في ddH2O (انظر جدول المواد) ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. قم بإجراء التحويل إلى E. coli BL21 (DE3) المختصة لكل متغير (V2-V5) بالطريقة الكيميائية بعد تقرير منشور مسبقا10.
  2. قم بتقسيم المحلول (900 ميكرولتر و 100 ميكرولتر) ، وانقل 100 ميكرولتر على ألواح LB-agar (50 ميكروغرام / مل كاناميسين) ، واستخدم برفق موزع الخلايا المعقمة. احتضان ألواح الآجار طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

3. الاستنساخ

  1. استنساخ جين CV-N في مواقع NdeI و BamHI ل pET11a (انظر جدول المواد) للتحويل (التثقيب الكهربائي) إلى خلايا كهروبيئية بعد المرجع27.

4. الطفرات الموجهة للموقع

  1. لتوليد CVN2L029 و CVN-E41A الطافر في خلفية جين قالب CVN2L0 يحتوي على تسلسلين متميزين للحمض النووي لكل CV-N كرر27.
  2. قم بإجراء طفرات باستخدام مجموعة الطفرات الموجهة للموقع (انظر جدول المواد) وبادئات مطفرة محددة 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' و 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' لتشغيل PCR31.
    1. ابدأ سلسلة من تفاعلات العينات باستخدام تركيزات متعددة من قالب الحمض النووي المزدوج (dsDNA) تتراوح من 5-50 نانوغرام (على سبيل المثال ، 5 و 10 و 20 و 50 نانوغرام من قالب dsDNA). حافظ على تركيز التمهيدي ثابتا.
      ملاحظة: يتم استخدام مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل وبروتوكول الدورة الحرارية بشكل عام كما هو موضح في دليل التعليمات لمجموعة الطفرات الموجهة للموقع32.
  3. أضف إنزيم تقييد Dpn I (1 ميكرولتر ، 10 وحدة / ميكرولتر ، انظر جدول المواد) أسفل تراكب الزيت المعدني. امزج التفاعلات جيدا وبلطف ، وقم بتدويرها لأسفل في جهاز طرد مركزي دقيق على سطح الطاولة لمدة 1 دقيقة ، واحتضانها على الفور عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لهضم dsDNA الأبوي فائق الالتفاف.

5. تحول الخلايا البكتيرية

  1. قم بإذابة الخلايا فائقة الكفاءة XL1-Blue (انظر جدول المواد) برفق على الجليد. لتحويل كل عنصر تحكم وتفاعل عينة ، قم بتقسيم الخلايا فائقة الكفاءة (50 ميكرولتر) إلى أنبوب دائري القاع من مادة البولي بروبيلين المبردة مسبقا (14 مل).
    1. نقل 1 ميكرولتر من الحمض النووي أحادي الشريط المعالج ب Dpn I (ssDNA) من كل تفاعل تحكم وعينة (ssDNA متحور) لفصل حصص الخلايا فائقة الكفاءة ، والتي توليف الشريط التكميلي. حرك تفاعلات التحول بعناية لخلط واحتضان التفاعلات على الجليد لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: قبل نقل الحمض النووي المعالج ب Dpn I إلى تفاعل التحويل ، يوصى بإزالة أي زيت معدني متبقي بعناية من طرف الماصة. كعنصر تحكم اختياري ، يجب فحص كفاءة تحويل الخلايا فائقة الكفاءة XL1-Blue عن طريق خلط 0.1 نانوغرام / ميكرولتر من بلازميد التحكم pUC18 (1 ميكرولتر) مع حصص 50 ميكرولتر من الخلايا فائقة الكفاءة.
  2. ضع نبضة حرارية على تفاعلات التحول عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، ثم ضع التفاعلات على الجليد لمدة 2 دقيقة.
    ملاحظة: تم بالفعل تحسين النبض الحراري المطبق للظروف المذكورة في أنابيب البولي بروبلين المستديرة القاع (14 مل).
  3. أضف 0.5 مل من مرق NZY + (يحتوي على لكل لتر: 10 جم من أمين NZ (تحلل الكازين المائي) ، 5 جم من مستخلص الخميرة ، 5 جم من كلوريد الصوديوم ، 12.5 مل من 1 M MgCl2 ، 12.5 مل من 1 M MgSO4 ، 10 مل من 2 M جلوكوز ، درجة حموضة 7.5 ، ومسخن مسبقا إلى 42 درجة مئوية) واحتضان تفاعلات التحول عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 225-250 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة. قم بلوحة الحجم الصحيح لكل تفاعل تحويل (5 ميكرولتر من تحويل بلازميد التحكم ؛ 250 ميكرولتر من تحويل العينة) على ألواح أجار LB-ampicillin.
    ملاحظة: بالنسبة لضوابط التحول والطفرات، انشر الخلايا على ألواح أجار LB-ampicillin التي تحتوي على 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-β-D-galactopyranoside (X-gal، 80 ميكروغرام/مل) وإيزوبروبيل-1-ثيو-β-D-غالاكتوبيرانوسيد (IPTG، 20 mM) (انظر جدول المواد). تلقيح 50 مل من مزارع الخلايا بمستعمرة واحدة من E المتحولة. خلايا قولونية لتنقية الحمض النووي البلازميد المتحور للتحليلات. يتم تأكيد الطفرات عن طريق تسلسل الحمض النووي في منشأة خارجية.

6. التعبير وتنقية البروتين

  1. للحصول على ثقافة واسعة النطاق ، قم بتلقيح كمية صغيرة من LB (تحتوي على الأمبيسلين) بمستعمرة واحدة من اللوحة المحولة.
  2. باستخدام الثقافة الليلية ، قم بتلقيح ثقافة التعبير بإضافات ، مثل 10 mM من MgCl2 ، و 10 mM من MgSO 4 ، و 20 mM من الجلوكوز، مما يخفف من ثقافة البذور إلى 1/100.
    1. تنمو الخلايا مع اهتزاز قوي عند 37 درجة مئوية. تنمو الخلايا إلى ABS 600 نانومتر بين 0.4-0.6 (مرحلة منتصف السجل) قبل تبريد الخلايا إلى 20 درجة مئوية. حث مع 1 mM IPTG وتنمو بين عشية وضحاها.
    2. بعد ذلك ، احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
  3. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وأعد الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ثم ، تجاهل الطاف مع ماصة. أعد تعليق الحبيبات المتبقية في 10 مل من محلول التحلل واحتضان التعليق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تركيب محلول التحلل: (50 mM من NaH 2 PO4، 300 mM من كلوريد الصوديوم، 2٪ Triton-X100، 500 نانوغرام/مل من الليزوزيم، 1 mM من فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF)، 1 mM من ثنائي ثيوثريتول، 1 mM من MgCl2، الرقم الهيدروجيني 8، انظر جدول المواد).
    1. أخضع الخليط لدورتي تجميد وذوبان (-80 درجة مئوية). فصل الكسور القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتحليلها باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد (PAGE) ، على وجه الخصوص ، كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) - الصفحة33 (الشكل 2B ، C).
      ملاحظة: يمكن تحلل الخلايا بعدة طرق ، مثل ذوبان الجليد بالتجميد ، أو الصوتنة ، أو التجانس ، أو التحلل الأنزيمي ، أو مزيج من هذه الطرق. يوصى بالتنقية من هيئات التضمين لجمع غلات البروتين العالية26.
  4. تنقية البروتينات باستخدام كروماتوغرافيا عمود Ni-NTA (انظر جدول المواد). قم بتحميل الكسر القابل للذوبان على عمود حبة Ni-NTA المجدد (1 مل / دقيقة). اغسل النظام بمخزن TBS المؤقت (50 مللي متر من Tris ، 150 mM من كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.5) قبل بدء التدرج (0-100٪ 500 mM imidazole في TBS على مدار 60 دقيقة) وجمع الكسور (1 مل / دقيقة). غسيل البروتينات المنقاة للتوصيف الكيميائي الحيوي مقابل 100 mM PBS (الشكل 2C ، D).
  5. بدلا من ذلك ، استخدم جل التقارب His-Select Ni2+ (انظر جدول المواد) في أنابيب سعة 14 مل لربط وإعادة تعليق CV-N المعبر عنه المؤتلف الموسوم به في المحاليل العازلة مع 20 mM imidazole و 250 mM imidazole ، على التوالي. احتضان دفعة واحدة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    ملاحظة: قم بتطبيق هذه البروتينات شبه المنقاة على عمود معبأ مسبقا للاستخدام مرة واحدة لتبادل المخزن المؤقت وتنظيف العينات البيولوجية ، على سبيل المثال ، الكربوهيدرات والبروتينات ، والتي يمكن أن تحمل 1-1.5 مل من كروماتوغرافيا التقارب المعدني الثابت.
  6. نقل محاليل البروتين إلى أنابيب الطرد المركزي مع مرشح قطع 10 كيلو دالتون (انظر جدول المواد) وتركيزها عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 4500 × جم و 4 درجات مئوية. بالنسبة لقياسات SPR ، استبدل المحاليل المراد تحليلها ب 10 mM HEPES ، و 150 mM كلوريد الصوديوم ، و 3 mM من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، و 0.05٪ Tween20 ، و pH 7.4 (HBS-EP (+) ، انظر جدول المواد).
    1. أضف هذا المخزن المؤقت لتشغيل SPR إلى عامل تخفيف 1:10 وأجهزة طرد مركزي أربع مرات إلى الحجم الأولي لمدة 10 دقائق عند 4500 × جم و 4 درجات مئوية.
  7. تحديد تركيز البروتين عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop UV-Vis (انظر جدول المواد) بناء على معامل الانقراض المحسوب (20,440 M-1 cm-1) للبروتين الرئيسي CVN2L0 الذي يظهر حجما 23,474 Da34. استخدم PBS (100 mM ، pH 7.0) أو SPR buffer كفراغ ، وقم بقياس تركيز البروتين في ثلاث خطوات تخفيف (1: 1 ، 1: 10 ، و 1: 100).

Figure 2
الشكل 2: تسلسلات CV-N والتعبير. (أ) يتم التعبير عن CVN2 بدون رابط بين كل تكرار CV-N (101 حمض أميني لكل منهما) وأربعة جسور ثاني كبريتيد في متجه pET11a في E. القولونية. (ب) تعبيرات مستعمرتين مستقلتين ل CV-N (مونومر) و CVN2 (ديمر). (ج) يتم تنقية متغيرات رابطة ثاني كبريتيد وتحليلها على SDS-PAGE. يتم استخدام علامة الوزن الجزيئي المنخفض (6 ميكرولتر) كمرجع. WT = CVN2L0 تحمل أربعة جسور ثاني كبريتيد كما هو موضح في (A). V2 هو متغير مع استبدال رابطة ثاني كبريتيد ببقايا قطبية في الموضعين 58 و 73. V3-V5 هي متغيرات مع اثنين من روابط S-S المتبقية وإما قطبية (C58E-C73R) أو غير قطبية (C58W-C73M) تحل محل الأحماض الأمينية أو مزيج من بدائل زوج البقايا هذه. (د) يتم استخلاص كروماتوجرام HPLC ل CVN2L0 المنقى بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة مع تدرج خطي من 5٪ -65٪ مخزن مؤقت B في المخزن المؤقت A على مدار 30 دقيقة. المخزن المؤقت A هو: 0.1٪ (v / v) حمض ثلاثي فلورو أسيتيك في ddH2O ، المخزن المؤقت B هو: 0.08٪ (v / v) حمض ثلاثي فلورو أسيتيك في الأسيتونيتريل. يتم تحليل البروتين على عمود هلام السيليكا عالي الأداء 300-5-C4 (150 × 4.6 مم) عند 214 نانومتر و 280 نانومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

7. التحليل الطيفي SPR

  1. استخدم نظام SPR ثنائي القناة (انظر جدول المواد) مع تشغيل المخزن المؤقت HBS-EP (+) و 10 mM glycine HCl pH 1.5-1.6 كمخزن مؤقت للتجديد. قم بتشغيل الجهاز ، وجهاز إزالة العينات ، وأخذ العينات التلقائي ، وضخ وغسل النظام بأكمله باستخدام ddH20 لمدة 1 ساعة. ضع المخزن المؤقت للتشغيل الجاهز للاستخدام في زجاجة منفصلة.
  2. قم بإسقاط زيت الانتفاخ على الكاشف وقم بتركيب شريحة مستشعر زجاجية (انظر جدول المواد) مطلية بغشاء ذهبي رقيق وعلى الجانب العلوي تعمل بهيدروجيل كربوكسي ميثيل ديكستران مباشرة على الكاشف أسفل خلية التدفق ثلاثية المنافذ. قم بإصلاح الإعداد عن طريق سحب المناولة لأسفل.
    ملاحظة: C19RBDHC30M 200 نانومتر ستربتافيدين مشتق كربوكسي ميثيل ديكستران هيدروجيل مع كثافة متوسطة من بروتين فيروس كورونا 2 RBD المصاب بالبيوتينيل المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة ، هو عبارة عن شريحة استشعار جاهزة للاستخدام مع ليجند مثبت مسبقا.

8. مقايسة ربط SPR لربط CV-N ببروتين HA و S و RBD

  1. شل حركة الروابط البروتينية إلى رقائق المستشعر باتباع الخطوات أدناه.
    1. افتح جدول تشغيل بالنقر فوق نموذج في شريط القائمة وتشغيل محرر الجدول في برنامج SPRAutoLink المدمج (انظر جدول المواد). اختر وانقر فوق BASIC_Immobilization من قائمة جداول التشغيل المتاحة واتبع خطوات الإجراء التجريبي على شاشة الكمبيوتر. يظهر محرر النماذج المستخدم في الزاوية العلوية اليمنى.
    2. انقر فوق محرر مجموعة العينات في قسم النموذج لملء قائمة الكواشف لرفين موضوعين في أخذ العينات الأوتوماتيكي لمزيد من التحليلات. انقر فوق التحكم المباشر في أخذ العينات التلقائي ك "أداة" في شريط القائمة لإعادة الرفوف إلى الأمام أو إلى المنزل. اختر 4 درجات مئوية كدرجة حرارة التشغيل.
      ملاحظة: يسمح برنامج SPR ب "التحكم المباشر في أداة SPR" و "التحكم المباشر للمضخة" عن طريق اختيار الأدوات المقابلة ، بالإضافة إلى معالجة أخذ العينات التلقائي ، والنقر فوق النموذج ؛ كما يمكن اختيار تشغيل محرر الجدول أو مخطط البيانات أو المعالجة اللاحقة لإجراء تحليل البيانات. يتم حفظ الملفات مباشرة في الدليل الافتراضي وتصديرها كملفات scrubber.files من نافذة ما بعد المعالجة.
  2. ابدأ تشغيل المضخة لبث ddH20 بالنقر فوق أدوات والتحكم المباشر في المضخة وتسجيل البيانات بالنقر فوق التحكم المباشر في أداة SPR ، وفي كل مرة ابدأ في النوافذ التي تظهر حديثا. ضع كواشف التوصيل (الخطوة 8.3) في قارورة سعة 300 ميكرولتر ، وضعها في رفوف أخذ العينات الأوتوماتيكية وابدأ جدول التشغيل بالنقر فوق تشغيل.
    ملاحظة: يتم تكييف أسطح الرقائق إما بمحلول جليكاين 10 mM pH 9.0 أو ربما تم غسلها باستخدام 1 M كلوريد الصوديوم ، 0.1 M محلول بورات الصوديوم pH 9.0 لتكييف سطح رقاقة مشتق من الكربوكسيل لمزيج تنشيط EDC / NHS30.
  3. لهذا التفاعل البسيط بين البروتين والبروتين ، استخدم شريحة CMD500D (انظر جدول المواد) لإنشاء وحدات معامل الانكسار الدقيق (μRIU) = 2500 - 3000 خلية تدفق مع HA و μRIU = 400 خلية تدفق مع بروتين سبايك. عند معدل تدفق لبث يبلغ 15 ميكرولتر / دقيقة ، قم بحقن خليط مائي ومتساو من 0.4 M N-ethyl-N'- (dimethylaminopropyl) كربودايميد هيدروكلوريد (EDC * HCl) و 0.1 M N-hydroxysuccinimide (NHS) عن طريق تطبيق الخطوات المتسلسلة التالية.
    1. إعادة تعبئة مضخة إعادة الملء عند 25000 ميكرولتر / دقيقة ، وإجراء تعديل خط الأساس لمدة 30 ثانية ، وحقن 90 ميكرولتر من محلول تنشيط العينة (EDC / NHS) على مدار 6 دقائق من وقت الاتصال ، ثم الاستمرار لمدة 5 دقائق أخرى.
    2. كرر هذه الدورة بعد تشغيل خط الأساس لمدة دقيقة واحدة عند 10 ميكرولتر / دقيقة على خلية التدفق اليسرى فقط (الأزرق) لحقن وشل حركة الببتيدات المركبة كيميائيا 10 و HA وبروتين السنبلة عند20 ميكروغرام / مل ، والسماح بتعديل خط الأساس اللاحق باستخدام ddH2O لمدة 1.5 دقيقة قبل إخماد سطح الرقاقة المنشط ب 1 M إيثانولامين حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.5.
  4. قم بتبديل الأنابيب من جهاز أخذ العينات السائل إلى جهاز إزالة الغازات من ddH20 إلى الزجاجة باستخدام HBS-EP (+) (الشكل التكميلي 1).
  5. تحليل مخططات استشعار SPR.
    1. لإجراء دراسات حركية ، استخدم تركيزات تحليلية مختلفة (10-5-10-8 م) ، مع خطوة تجديد بعد كل حقنة وقياسات فارغة بعد تحليلات مختلفة. قم بتغيير معدل التدفق إلى 10 ميكرولتر / دقيقة وابدأ الحقن لمدة 4 دقائق من وقت التلامس ، ثم 5 دقائق من توليد خط الأساس ، وخطوتين تجديد مدة كل منهما 2 دقيقة بفاصل 30 ثانية.
    2. حقن المحلول العازل للقياسات الفارغة التي يتم طرح أجهزة الاستشعار الخاصة بها من تشغيل العينات لتطبيع تركيزات البروتين المختلفة.
  6. انقر فوق النموذج ، وقم بالتمرير لأسفل ، وقم بالتغيير إلى "المعالجة اللاحقة" بالنقر فوق وضع التشغيل هذا. انقر فوق إضافة لتحديد منحنيات الربط التي تم إنشاؤها بمرور الوقت في نموذج مخطط البيانات لكل خلية تدفق ، وقم بتصدير التراكب كملف تنقية (.ovr). انقر فوق ملف لفتح خيارات حفظ الملف. احصل على منحنيات الاستجابة عن طريق محاذاة منحنيات اليسار واليمين وطرح إشارات القناة المرجعية الثانية من إشارات قناة الرباط.
    ملاحظة: يتم تشغيل البيانات في "مرحلة ما بعد المعالجة" عن طريق تحديد المخططات الحسية حسابيا. يتم وضعه في تراكب من المخططات الحسية من خلايا التدفق اليمنى واليسرى ، أو يتم تمثيله كمخططات حسية من اختلاف كلتا القناتين.
  7. نظف السوائل بالكامل باستخدام 50-100 مللي مول من محلول الجلايسين بدرجة حموضة 9.5 وماء و 20٪ إيثانول قبل وبعد قياسات الربط لإزالة آثار الملح أو أي تلوث بالبروتين ، أو أكثر صرامة ، مع 0.5٪ SDS وجلايسين.
    ملاحظة: لمنع تلف الجهاز ، يوصى بالتحقق من الاستقرار الميكانيكي للرقاقة الزجاجية قبل إعادة إدخال خرطوشة الرقاقة في الجهاز إذا تم تخزين الرقائق تحت المخزن المؤقت أو في رطوبة 100٪.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم اختبار جزيء CVN2L0 ثنائي المجال المبدل للارتباط بالمنطقة العليا HA في ثلاث تجارب SPR منفصلة ويتم تقديم تقارب الربط بقيم KD. يفترض أن المجال B يشتمل على مواقع ربط H ، والتي تتأثر باستبدال رابطة ثاني كبريتيد في بقايا أيونية ، ويشكل المجال A L10,18. يتم اختبار الحقن الفردي ل CVN2L0 والمتغيرات V2 (ثلاثة جسور ثاني كبريتيد) و V5 (جسران ثاني كبريتيد) أولا للارتباط بشريحة مستشعر HA المقترنة لتقدير قدرات الربط قبل إعداد قياس الحركية باستخدام أخذ العينات الأوتوماتيكي ومحرر جدول التشغيل (الشكل 3A والشكل التكميلي 2). يتم أتمتة الحقن المتكرر لسلسلة من CVN2L0 و V2 و V5 بتركيزات مختلفة في نطاق النانو مولار و μ مولار في النظام بمرور الوقت (الشكل 3B-D). ربط عدد روابط Cys-Cys السليمة ، CVN2L0 ملزم يجمد HA عند KD = 255 نانومتر عند الوصول إلى تشبع جيد. في هذه الحالة ، تكون كلتا قيمتي KD ، المحسوبة إما من البيانات الحركية أو عن طريق ملاءمة بيانات التوازن مع متساوي الحرارة المرتبط ب Langmuir ، في اتفاق معتدل (الجدول 1 والشكل التكميلي 3 ، الشكل التكميلي 4).

Figure 3
الشكل 3: مقايسة ربط SPR لربط الرباط عبر التفاعلات متعددة التكافؤ. يتم اختبار CVN2 (WT) ومتغيرات موقع الربط V2 و V5 مع بدائل ثاني كبريتيد في جيب ربط الكربوهيدرات عالي التقارب لربط HA المتجمد تساهميا. (أ) يمكن استخراج منحنيات ربط خلايا التدفق الأيسر والأيمن ل CVN2 و V2 و V5 من بروتوكول تشغيل SPR ، ويتم تلخيص مخططات الاستشعار في تراكب. (ب) مخطط حسي من تجربة SPR التقليدية يظهر كتحليلات حركية لربط CVN2L0 ب HA ، وحقن تركيزات التحليل من 10-4 إلى 10-8 M. يتم قياس CVN2L0 حتى أعلى تركيز عند 1.5 ميكرومتر (الخط العلوي) وحتى 500 نانومتر (الحد الأدنى) ، حيث لا يتم تحقيق تشبع على سطح الرقاقة ولا ربط التوازن. RU = وحدات الاستجابة. يتم استخدام شريحة مستشعر CMD500D. (ج) مخطط استشعار SPR لربط V2 ب HA. (د) V5 ملزمة ل HA. الشكل (B-D) مستنسخ بإذن من المرجع10. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

كأ (م-1 ق-1) كد (S-1) كد [هكتار]
الحركيه		 كد [هكتار]
التوازن
CVN2 5.1 ه3 1.3 × 10-3 255 نيوتن متر 246 نانومتر
V2 4.0 e3 1.1 x10-3 275 نانومتر 255 نيوتن متر
V5 1.2 ه3 5.8 x10-2 5 ميكرومتر 4.9 ميكرومتر
CVN2L0 2.07 ه4 3.0 x10-3 147 نانومتر 600 نانومتر
2.27 ه4 3.0 x10-3 133 نانومتر 490 نيوتن متر

الجدول 1: تقارب ربط CVN2 والمتغيرات ب HA المقاسة عبر SPR. يستخدم Scrubber 2.0 (برنامج BioLogic) لملاءمة منحنيات ارتباط SPR وتفكك SPR في الوقت الفعلي ولحساب ثوابت تفكك التوازن (KD) من البيانات الحركية والتوازن. كا = ثابت معدل الارتباط. دينار كويتي = معدل التفكك ثابت.

في حين أن قيم KD لربط CVN2L0 و V2 ب HA كلاهما في نطاق نانومولي ، فإن V5 يتضاءل في الربط (الجدول 1). في V5 ، يتم استبدال رابطتين من ثاني كبريتيد ببقايا اقتران الأيونات التي تعيد تدريب التفاعلات الأيونية المحتملة بين بقايا Glu و Arg المتحولة (الشكل 2A ، 3D). يتم تحليل البيانات الأولية باتباع معدل الارتباط المتكامل ومعادلات معدل التفكك ، والتي تصف حركية الربط لتفاعل CV-N القابل للذوبان مع الربيطة المجمدة وتفكك المركب المتشكل من سطح الرقاقة. يتم إجراء قياسين مستقلين ، ويتم تحليل المخططات الحسية ، المكافئة لتلك التي تم الحصول عليها من النسخ المتماثلة. يتم حساب KD على أنه حاصل قسمة koff / kعلى (الجدول التكميلي 1) 10,35. ومع ذلك ، يرتبط KD ببيانات التوازن التي تناسب ارتباط Langmuir isotherm36 ، حيث يتم رسم استجابة ارتباط التوازن كدالة لتركيز المادة المراد تحليلها (الشكل التكميلي 3A ، 4A ، 3B ، 4B). بطريقة تعتمد على التركيز ، يتم تحديد ثابت معدل التفكك kd بعد التحليلات ودمجها في تركيب مرحلة الارتباط (kon) لتقدير ثابت معدل الارتباط ka. (الجدول 1، الشكل التكميلي 3 جيم، الشكل التكميلي 4 جيم).

بعد ذلك ، تتم مقارنة ربط CV-N ب HA بتفاعله مع RBD. يتم قياس ارتباط CV-N WT ب SARS-CoV-2 RBD عند تقارب أضعف (K D = 260 ميكرومتر ، الشكل 4A) مقارنة بالارتباط ب HA (KD = 5.7 نانومتر) 8،10،12 والارتباط ببروتين S (KD = 18.6 ميكرومتر ، الشكل 5). يتم رسم التركيز مقابل الاستجابة لربط CV-N WT ب RBD ، بافتراض استهداف محدد للكربوهيدرات المحفوظة المحتملة على الوحدة الفرعية RBD S1 (الشكل 4 أ). يظهر نفس مخطط التقارب لارتباط CVN2L0-V4 ب DM الذي لم يعد قابلا للتحليل بسبب استبدال روابط ثاني كبريتيد التي تتداخل مع الارتباط عالي التقارب بالببتيدات الصغيرة الغليكوزيلاتية (الشكل 4 ب).

CVN2L0-V4 (2 روابط ثاني كبريتيد مقابل الاستبدال غير المتماثل لبقايا السيستين إما ببقايا Glu-Arg أو الأحماض الأمينية البرمائية Trp و Met) يمكن أن تشكل شبكات روابط هيدروجينية غير قطبية حول موقع ربط الكربوهيدرات B الزائف10. تصل الكثافة العالية للجليكان على بروتين HA إلى الارتباط ببقايا Glu-Arg القطبية بدلا من السيستين (الجدول التكميلي 1) ، وارتباط مع الببتيدات المانوسيلية (KD = 10 μM ل DM) بين CVN2L0 والتعديلات في Glu-Arg ، ولكنها تظهر تفككا متقطعا للمتغيرات من هذا الببتيد أحادي الغليكوزيلاتي ، خاصة عندما يتم تعديل H على كلا المونومرات. بالنسبة للتفاعل بين CVN2L0-V4 مع DM ، فإن استجابة حقن CVN2L0-V4 56 ميكرومتر تعطي استجابة أعلى من Rmax. (الشكل 4 ب). فشل V5 (2x Glu-Arg) في الانفصال عن DM المرتبط بالسطح (البيانات غير معروضة). باختصار ، تنخفض منحنيات الاستجابة للتركيزات المنخفضة قبل إنهاء الحقن لجميع أجهزة الاستشعار على ارتباط CVN2 بالببتيد بدون ارتباط H الأصلي والمونومر ب RBD.

Figure 4
الشكل 4: تحليلات SPR ل (A) ارتباط مونومر CV-N WT ب RBD. يتم حساب K D عن طريق ملاءمة البيانات الحركية (الجانب الأيسر ، K D = 260 μM) ومقارنتها ببيانات التقارب (الجانب الأيمن) باستخدام نموذج جزيئي حيوي بسيط للربط 1: 1 بين ligand و analyte (KD equil = 274 μM). يتم رسم استجابة ربط التوازن أو قدرة الربط كدالة للتركيز مقارنة بمنحنيات ربط SPR (0-605 ميكرومتر CVN). H = موقع ربط عالي التقارب. L = موقع ربط منخفض التقارب. كلاهما موجود على CV-N و CVN2L0. (ب) ارتباط ثنائي CVN2L0-V4 ب DM ، بافتراض 2L دون تحليل KD. تركيزات CVN2L0-V4 هي 56 ميكرومتر ، 28 ميكرومتر ، 14 ميكرومتر ، 7 ميكرومتر ، 3.5 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: ارتباط CVN-E41A الطافر و CV-N WT بالبروتين السكري (A) S. تشير الأسهم إلى بداية مرحلة الارتباط والتفكك. (ب) ربط CVN-E41A ب RBD على SARS-CoV-2. يتم تثبيت الروابط مسبقا على رقائق مستشعر HC polycarboxylate و CMD500D. تستخدم الوحدة الفرعية Covid-19 S1 [Pinto، D. et al.26 ؛ و Barnes، C. et al.37] لتجميد RBD. معدل التدفق: 30 ميكرولتر / دقيقة ، 25 درجة مئوية ؛ البيانات الخام المرسومة. بالمقارنة ، تم تصوير ارتباط الأجسام المضادة لمصل الدم البشري ب RBD بعامل تخفيف 1: 200. (C) مقايسة SPR لارتباط CV-N WT بالبروتين السكري S الذي يجمد إلى مستوى استجابة يبلغ 400 μRIU لالتقاط CV-N. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لقد ثبت من قبل أن CV-N الأحادي مع L واحد لا يمكن أن يربط gp120 بشكل كاف ، ولكن قدرة تحييد CV-N تتطلب الربط المتقاطع لموقعين مرتبطين بالكربوهيدرات ويتم استعادتها في الغالب عن طريق dimerization لتعمل مع 2H12,19. ومن ثم ، يتم التعبير عن متحولة أحادية CVN-E41A ، والتي يشتبه في أنها تزعزع استقرار المجال الزائف B أو يمكن أن تقطع الاتصال بالمجال الثاني A ، مثل الموجود في CV-N WT. CVN-E41A monomer يكشف عن الاستقرار عند الارتباط ببروتين S مشابه لمونومر CV-N. على الرغم من أن استجابة SPR لتركيزات التحليل 605-680 ميكرومتر تؤدي إلى وحدات استجابة عالية وحساسات SPR نموذجية لربط CV-N WT و E41A ، على التوالي ، فإن الطفرة غير مستقرة عند تخفيفها (الشكل 5).

الشكل التكميلي 1: مخطط استشعار SPR لالتقاط تقليد DM كجزء من قمة HA. لقطة شاشة: مخطط بيانات SPR يوضح بروتوكول تشغيل SPR لتجميد DM على شريحة مستشعر SPR CMD500D ، المطلية بهيدروجيل كربوكسي ميثيل ديكستران 500 نانومتر ومناسبة للتحليلات الحركية لتحليلات الوزن الجزيئي المنخفض على كثافة ليجند عالية. يتم تثبيت شرائح الاستشعار مباشرة على الكاشف بزيت الانبعاث ويتم تثبيتها أسفل خلية تدفق ثلاثية المنافذ. بعد تبريد سطح الرقاقة المنشط ب 1 M إيثانولامين حمض الهيدروكلوريك pH 8.5 ، يتم حقن CVN2 مرتين (التركيز = 1 ميكرومتر و 2 ميكرومتر ، على التوالي). أرجواني: الفرق بين خلية التدفق 1 وخلية التدفق 2 ؛ يتم تسجيل الاستجابة بفاصل 0.2 ثانية. أزرق: خلية التدفق 1: 3000-4000 وحدة معامل الانكسار الدقيقة (μRIU) المغلفة من محلول 400 نانومتر من ligand DM إلى سطح كربوكسيل نشط. أحمر: خلية التدفق المرجعي 2. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: التشغيل اليدوي على شريحة مستشعر CMD500D التي تعمل بوظيفة HA والتي تظهر ربط CVN2L0-V5 و V2 و CVN2L0 dimeric . عند معدلات تدفق التسريب من 30-50 ميكرولتر / دقيقة ، يتم حقن متغيرات CVN2L0 ورابطة ثاني كبريتيد معبرا عنها بعلامة His-وتنقيتها عبر Ni-NTA في نطاق منتصف ميكرومتر واختبارها للارتباط ب HA مع مرحلة ارتباط مدتها 3 دقائق ومرحلة تفكك مدتها دقيقتان. الحقن هي V5 (15 ميكرومتر) ، V2 (2.4 ميكرومتر) ، 0 ميكرومتر ، CVN2L0 مستنسخة من بروتين اندماج سومو (1 ميكرومتر) ، و CVN2L0 (2 ميكرومتر). يتم استخدام تشغيل المخزن المؤقت عند درجة الحموضة الفسيولوجية لجميع التجارب عند 25 درجة مئوية. يتم تفريغ جميع المحاليل وتصفيتها (0.2 ميكرومتر) قبل الحقن في النظام. أرجواني: الفرق بين خلية التدفق 1 وخلية التدفق 2 ؛ يتم تسجيل الاستجابة بفاصل 0.2 ثانية. الأزرق: خلية التدفق 1: 2540 μRIU HA. أحمر: خلية التدفق المرجعي 2. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: CVN2 ملزم ب HA. تحليل المخططات الحسية عند محاذاة المنحنيات تلقائيا. (أ) تم تصفير المستشعرات ومحاذاتها باستخدام برنامج Scrubber (يسار) وربط متساوي الحرارة يظهر منحنى استجابة يعتمد على التركيز للتحليلات المقيدة (يمين). (ب) الربط متساوي الحرارة معبرا عنه بالسعة المئوية. (ج) الارتباط النظري المركب حسابيا ومنحنيات التفكك. (د) بيانات الحركية على مخططات استشعار SPR بدون منحنيات مجهزة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: CVN2 ملزم ل HA. تحليل المخططات الحسية عند محاذاة المنحنيات يدويا. (أ) تم تصفير المستشعرات ومحاذاتها باستخدام برنامج Scrubber (يسار) وربط متساوي الحرارة يظهر منحنى استجابة يعتمد على التركيز للتحليلات المقيدة (يمين). (ب) الربط متساوي الحرارة معبرا عنه بالسعة المئوية. (ج) الارتباط النظري المركب حسابيا ومنحنيات التفكك. (د) بيانات الحركية على مخططات استشعار SPR بدون منحنيات مجهزة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: البيانات الحركية التي تم الحصول عليها من أجهزة استشعار SPR لربط متغيرات رابطة CVN2L0 و Cys-Cys V2 و V4 و V5 ب HA باستخدام نموذج ربط Langmuir 1: 1. KD [M] = k إيقاف / k تشغيل  أو kd / ka. يتم إنشاء جميع البيانات عند 25 درجة مئوية في المخزن المؤقت HBS-EP (+): الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يرتبط تقارب ربط CV-N بعدد مواقع الربط الوظيفية [2H على المجالات B ، و 2L على المجال (المجالات) A عند هندستها كثنائي مبدل بالمجال]. يتم التعبير عن متغير مع تقارب ربط متغير (CVN2L0-V2 ، طية مستقرة متجانسة من CV-N تتكون من ضربة قاضية لجسر ثاني كبريتيد) في الإشريكية القولونية ، وتنقيتها ، واختبارها إيجابيا للارتباط ببروتين HA (H3N2) باستخدام SPR10 ، ويظهر تغييرا مطابقا عند ربط HA إما بمواقع ربط الكربوهيدرات H أو L و KD1 = 49 نانومتر و KD2 = 8 ميكرومتر38 . نظرا لانخفاض عدد جسور ثاني كبريتيد بالقرب من الجيب الذي يستهدف الجليكان في CVN2 من 4 إلى 2 ، انخفض تقارب الارتباط ببروتين HA (الأشكال 3B-D والجدول التكميلي 1). يتم إنشاء متغيرات رابطة ثاني كبريتيد عن طريق استبدال Cys وإدخال أزواج البقايا القطبية Glu - Arg مع انخفاض طفيف في الاستقرار. تمثل المتغيرات بخلاف ذلك نفس الجزيء ، ومواقع الربط الأربعة وظيفية ، على الرغم من أن الارتباط متعدد المواقع على الشريحة يتأثر بجميع المتغيرات بناء على بديلين لثاني كبريتيد. إن الاستبدال غير القطبي لكلا رابطتي ثاني كبريتيد في جيبي الربط عالي التقارب يجعل المتغير CVN2L0-V3 ، الذي يربط بنشاط ببتيد HA في كل من شكله أحادي المومانوسيل وثنائي المانوسيلات. تم تأكيد التفاعلات مع CVN2L0-V3 لتركيزات micromolar والارتباط مع الببتيدات الاصطناعية (MM و DM) في المحلول عبر STD-NMR. والجدير بالذكر أن تجارب ربط CVN2 SPR ب MM غير قابلة للتحليل بسبب عدم كفاية حساب Rmax ، وهو عيب عام في تقنية SPR ، وضعف صلات الربط ب MM10 الثابت. زيادة كثافة الليجند لهذا الببتيد والببتيدات الأخرى يقلل من انتقائية الربط. باستخدام SPR ، يظهر ثنائي CVN2L0 (2H + 2L) مع ثبات عال ارتباطا متعدد التكافؤ ب HA ، والذي يتم التعبير عنه في خلايا الحشرات ، وخصوصية الديمانوز على محاكاة حيوية واحدة مهندسة كيميائيا لقليل السكاريد عالي المانوز ، بافتراض نموذج ربط 1: 1. عادة ما يتم قياس الارتباط ب oligo-mannosides بواسطة كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة ، والذي يتطلب تركيزا أعلى من الليجند ليتم معايرته مقابل الليكتين17.

لم يتم العثور على ارتباط تنافسي ب monomannose أو أي جليكان أصغر من Man(7) قبل أي من15 ، مما يشير إلى تورط الارتباط الكيميائي مع العمود الفقري للببتيد في التعرف على هذه الشقوق الجليكانية. كان عدد روابط المانوز والمانوز في الهدف متنوعا ، مما أدى إلى فك رموز تفاعلات التربتوفان في جيب الجليكان عالي التقارب. قد يحدد نوع تعديل الببتيدات مع أحادي المونومانوز المرتبط بالتريازول أو الديمانوز المرتبط بالتريازول قيم KD ، ولا سيما H. فيما يتعلق بصلات الارتباط من CVN2L0 (2H + 2L) و CVN2L0-V2 (1H + 2L) إلى DM ، فإن koff أعلى بمقدار 10 أضعاف كحد أقصى فيما يتعلق بتفكك CVN2L0-V2 من DM مقابل HA10. إلى جانب قياس ثوابت معدل الحركة ، يسمح SPR بتقدير ثوابت التوازن لأنظمة التوازن البطيئة للغاية دون الوصول فعليا إلى التوازن (الجدول 1). على النقيض من ذلك ، يعبر kon عن قيم استجابة نسبية جيدة لجميع منحنيات الربط ل CVN2L0 المبادلة بالمجال ومتغيرات رابطة ثاني كبريتيد (V2 و V4 و V5) إلى HA (الجدول التكميلي 1) ، أو DM ، بينما يظهر ثابت معدل التفكك koff معدلات إيقاف أسرع ل V4 و V5 ، ومتغيران يحملان حرفين L وظيفيين ، و V4 مع KD غير قابل للتحليل فيما يتعلق ب DM (الأشكال 4B ). إن تعيين المجال B إلى H والمجال A المعني L هو اكتشاف سابق يستند إلى متغيرات رابطة ثاني كبريتيد للكشف عن تقاربات ربط مختلفة في SPR ، المحددة ، إلى HA18,28.

SPR هي واحدة من الأدوات الرائدة لتحليل التفاعل الجزيئي الحيوي في البحوث الطبية الحيوية35. إذا كان التحكم المحدد والموقوت لتركيز المادة المراد تحليلها بكميات كبيرة ممكنا في أداة SPR ، فإن التقييم الكمي لحركية تقدم الربط بين الجزيئات الكبيرة ممكن ، مع زيادة الاهتمام بتحليل المجمعات متعددة البروتينات39. يتمثل التحدي في استخدامه في التحكم في تحديد موقع أحد مكونات التفاعل على سطح كربوكسي ميثيل ديكستران المستخدم على نطاق واسع ، أو سطح هيدروجيل HC polycarboxylate ، والذي يلتقط الجزيئات الحيوية الصغيرة والكبيرة. لتحسين قدرة الشلل والربط لسطح الرقاقة ، يتوفر تجميد شطيرة الستربتافيدين والبيوتين والشلل عن طريق البروتين His-tag إلى جسم مضاد له40. قد تتداخل الخصائص الفيزيائية الحيوية للبروتينات أو المجموعات الوظيفية للجزيئات الصغيرة مع نتائج الشلل ، ولكن هناك أي صعوبات تواجه البروتينات السكرية الموصوفة هنا والجليكوببتيدات المرتبطة تساهميا عبر كيمياء EDC / NHS. يتم استخدام الجليكان المتجمد ، إما البروتين السكري أو الجليكوببتيدات الاصطناعية المتجانسة أحادية أو ثنائية الميل ، على رقائق قابلة لإعادة الاستخدام لفحص مختلف متغيرات CV-N المهندسة ، ويتم تطبيق فحوصات الربط على محاضرات نقية بالكامل ومعبر عنها بشكل مؤتلف. الشوائب في محلول البروتين المحقون تلحق الضرر بنظام قناة SPR. على الرغم من وصف الإجراءات التجريبية على نظام في المختبر في هذه الدراسة ، يمكن التعرف على نمط الجليكوزيل على المسامير الفيروسية بشكل انتقائي من خلال كل تركيز تحليلي لهذا البروتين النموذجي الصغير كما تم حقنه بمرور الوقت مع الحد الأمثل لنقل الكتلة36. حجم CV-N هو ~ 11 كيلو دالتون ويدعم بيانات SPR القابلة للتكرار لارتباطها ببروتينات سبايك الفيروسية.

يتم تأكيد خصوصية ارتباط CV-N بالجليكان عالي المانوز من خلال تفاعل الربط ثنائي التكافؤ مع محاكاة الببتيد ثنائي المانوسيل بدلا من الارتباط بالجليكان الوظيفي هيكليا والببتيد أحادي المونزيل باستخدام كالوريمتر معايرة متساوي الحرارة (البيانات غير معروضة). يعبر متغير مع طفرة نقطية Glu41Ala عن البروتين أحادي 101 بقايا مع موقعين متشابكين لربط الكربوهيدرات على كل بروتومر. لذلك ، يلغي موقع الطفرة هذا بقايا التلامس بين مواقع الكربوهيدرات عالية ومنخفضة التقارب ويقلل من قوة الارتباط الجزيئي ب N-acetyl-D-glucosamine. يتم تحقيق ارتباط CVN-E41A ببروتين سبايك SARS-CoV-2 ، الذي يحمل جليكوزيل مرتبط من النوع N معقد و O-glycosylation ، في SPR ، لكن ارتباط CV-N بهذا الارتفاع هو لكل من بروتين السنبلة و RBD بدون أهمية فسيولوجية ، كما تم قياسه بتركيزات ميكرومولار (الشكل 4,5).

تستخدم الببتيدات المانوسيلاتية التي تم تطويرها وتوليدها في هذه الدراسة كسقالات بروتينية لفحص خصائص ربط العوامل المضادة للفيروسات بواسطة SPR و NMR ، لأنها تمثل روابط ثابتة لمقايسات ربط الكربوهيدرات المرتبطة بتسلسل الأحماض الأمينية المحدد10. علاوة على ذلك ، فإن التحليل الطيفي STD-NMR هو تقنية خالية من الملصقات ، مثل SPR ، والتي تسمح بتوصيف ارتباط الكربوهيدرات عن طريق الاختيار المطابق10,41. في مثل هذه الظروف ، يسمح STD-NMR بتطوير طرق فحص سريعة لمكتبة كبيرة من المركبات لتحديد الروابط النشطة بيولوجيا عن طريق الربط ، ورسم خرائط الخاتمة ، والتحديد المباشر ل KD في ظل ظروف تجريبية مختلفة. يمكن الحصول على قيم KD دقيقة من خلال تحليل منحنى ارتباط البروتين باستخدام قيم STD عند حد وقت التشبع الصفري41,42. لذلك ، تم إجراء استجواب تفاعلات البروتين والرباط بواسطة طريقة STD-NMR ، ولكن يتم حساب KDs على نظام SPR.

يقدر أن الإنسان 2019-nCoV (فيروس كورونا الجديد Wuhan-Hu-1-2019) يختلف بين 11 (من أصل 18) موقعا متوقعا للجليكوزيل المرتبط ب N إلى SARS-CoV43. يكشف رسم خرائط Epitope / paratope عن بعض التفاعلات مع N-glycans المشتقة من المضيف والمساهمات الضئيلة لفرط الطفرات الجسدية للأجسام المضادة لجهات اتصال epitope37. إن قدرة المحاضرات المضادة للفيروسات والأجسام المضادة المعادلة على نطاق واسع على ربط الحلقات المحفوظة للغاية على البروتين السكري HA للأنفلونزا هي الأكثر أهمية للتصميم العقلاني للقاحات للاستخدام الوقائي والعلاجي. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق لتقييم تأثير الجليكوزيل المرتبط ب N المثبط للمناعة حول موقع ربط مستقبلات المضيف. قد توفر البيانات نظرة ثاقبة لإمكانات بروتينات ارتفاع الفيروس للهروب من الأجسام المضادة المستنبطة أثناء العدوى أو لربط CV-N غير المناعي ، وبالتالي توجيه تصميم البروتين الحسابي القائم على البنية لمتغيرات CVN2 الجديدة المحسنة المضادة للفيروسات. على النقيض من ذلك ، فإن تقارب متحور الأحماض الأمينية Fc الغليكوزيلاتي لمستقبلاته لاستنباط وظائف المستجيب في الجسم الحي ، يستخدم تركيبة من مواقع الجليكوزيل ، وعدد الجليكان المعني ، قد يكون مهما لتقارب الربط ولكن قد لا يتم تحديده لقدرة التحييد.

مجتمعة ، من المتوقع أن يربط عدد أقل من الروتامير روابط الكربوهيدرات بالبروتينات عن طريق تصميم البروتين الحسابي أكثر من تفاعلات البروتين والبروتين وحدها. ومع ذلك ، فإن CVN2 المبادلة بالمجال ، والتي تحمل أعدادا مختلفة من مواقع ربط الكربوهيدرات ، توفر الاستقرار والمرونة اللازمين للكشف عن صلات الربط المختلفة المنسوبة إلى H ولتشكيل التفاعلات متعددة التكافؤ بين مجموعات oligomannose على طفرات الغلاف الفيروسي والأجسام المضادة المعادلة (NAb) ، مما يسمح بالتحقق من صحة فحوصات التثبيط تجريبيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.

Acknowledgments

يعترف المؤلف بالدكتور كريستيان ديرنتل من قسم التكنولوجيا الحيوية وعلم الأحياء الدقيقة في TU Wien وقسم الطب الثالث ، قسم أمراض الكلى وغسيل الكلى في جامعة فيينا الطبية ، وخاصة الدكتور ماركوس وهرمان للدعم الفني والعلمي. تم دعم تعبير البروتين في خلايا الثدييات من قبل قسم التكنولوجيا الحيوية في جامعة الموارد الطبيعية وعلوم الحياة (BOKU) في فيينا. تريد الكاتبة أن تعرب عن تقديرها العميق للدكتور نيكو دانكبار من XanTec bioanalytics في دوسلدورف ، ألمانيا ، لإجراء مناقشات علمية مفيدة حول إجراء فحوصات ربط SPR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta primeplus Cytiva
Amicon tubes Merck C7715
Ampillicin Sigma-Aldrich A5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge Beckman Coulter B06320
Cell spreader Sigma-Aldrich HS86655 silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA Oligos Sigma-Aldrich OLIGO
Custom Gensynthesis GenScript #1390661  cloning vector: pET27b(+) 
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL Thermo Scientific 50-105-5354
Dionex UlitMate 3000 Thermo Scientific IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL)  Fisher Scientific ER1701
DTT Merck DTT-RO
EDC Merck 39391
EDTA Merck E9884
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120086
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge Sigma-Aldrich Z606235
Ethanol Merck 51976
Ethanolamine HCl Merck E6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack Corning 352057
Glucose Merck G8270
Glycine HCl Merck 55097
HA H3 protein Abcam ab69751
HEPES Merck H3375
His-select Ni2+ Merck H0537
Imidazole Merck I2399
IPTG Merck I6758
Kanamycin A Sigma-Aldrich K1377
Kromasil 300-5-C4 Nouryon
LB agar Merck 52062
LB agar Merck 19344
LB Lennox Merck L3022
Lysozyme Merck 10837059001
Magnesium chloride Merck M8266
Magnesium sulfate Merck M7506
NaH2P04 Merck S0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer Thermo Scientific ND2000CLAPTOP
NaOH Merck S5881
NHS Merck 130672
NZ amine (casein hydrolysate) Merck C0626
PBS Merck 806552
PD MidiTrap G-10 Sigma-Aldrich GE28-9180-11
Peptone Merck 70171
pET11a Merck Millipore (Novagen) 69436 
PMSF Merck PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) Qiagen 27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9 Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System Reichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis Reichert
SDS Merck 11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid Stratagene #200518
Sodim chloride Merck S9888
Sodium acetate.Trihydrate Merck 236500
SPR sensor chip C19RBDHC30M XanTec bioanalytics SCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500D XanTec bioanalytics SCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes Thermo Scientific 101R20
TBS Merck T5912 10x, solution
Triton-X100 Merck T8787
Tryptone Merck 93657
Tween20 Merck P1379
Vortex-Genie 2 Mixer Merck Z258423
X-gal Merck XGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent Cells Stratagene #200236
Yeast extract Merck Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
  2. Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26 (2018).
  3. Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
  4. Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
  5. Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
  6. Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
  7. Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
  8. Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
  9. Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
  10. Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
  11. Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
  12. Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621 (2021).
  13. Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
  14. Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
  15. Bolmstedt, A. J., O'Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
  16. O'Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
  17. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  18. Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
  19. Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
  20. Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
  21. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  22. Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
  23. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  24. Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
  25. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  26. Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
  27. Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
  28. Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
  29. Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
  30. Fischer, M. J. E. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mol, N., Fischer, M. 627, Humana Press. (2010).
  31. Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , Anaheim. 532-535 (2005).
  32. QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual. , Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to,potential%20for%20generating%20random%20mutations%20during%20the%20reaction (2005).
  33. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  34. Expasy.org. , Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022).
  35. Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
  36. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
  37. Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
  38. Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28. , Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022).
  39. Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. Schuck, P. 5, Springer. New York. 97-141 (2007).
  40. Method Development Notes. , Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022).
  41. Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. Chemistry. 16 (26), 7803-7812 (2010).
  42. Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
  43. Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 184 ، Cyanovirin-N ، رنين البلازمون السطحي ، فرق نقل التشبع - الرنين المغناطيسي النووي ، مسامير المغلف ، الجليكان ، البروتين السكري المؤتلف
هندسة العوامل المضادة للفيروسات <em>عبر</em> رنين البلازمون السطحي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maier, I. Engineering Antiviral… More

Maier, I. Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (184), e63541, doi:10.3791/63541 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter