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Bioengineering

सरफेस प्लास्मोन रेजोनेंस के माध्यम से इंजीनियरिंग एंटीवायरल एजेंट

Published: June 14, 2022 doi: 10.3791/63541
Automatic Translation
1,2
1Department of Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 2Department of General Surgery, Medical University of Vienna

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एचए, एस ग्लाइकोप्रोटीन, संबंधित हाइब्रिड-टाइप ग्लाइकेन्स और उच्च-मैनोस ऑलिगोसैकराइड्स के लिए सीवी-एन बाइंडिंग की जांच करने के लिए एसपीआर बाइंडिंग परख के लिए नए उपकरणों का वर्णन करता है। एसपीआर का उपयोग इन ग्लाइकेन्स के लिए डिमेरिक या मोनोमेरिक सीवी-एन को बांधने के लिएकेडी को निर्धारित करने के लिए किया जाता है।

Abstract

सरफेस प्लास्मोन रेजोनेंस (एसपीआर) का उपयोग हेमग्लूटिनिन (एचए) को डोमेन-स्वैप्ड साइनोविरिन-एन (सीवी-एन) डिमर से बांधने और मैनोसिलेटेड पेप्टाइड्स और सीवी-एन के उच्च-आत्मीयता बाइंडिंग साइट के बीच बातचीत की निगरानी करने के लिए किया जाता है। वायरस लिफाफा स्पाइक्स जीपी 120, एचए, और इबोला ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी) 1,2 को डिमेरिक सीवीएन 2 पर उच्च और निम्न-आत्मीयता बाध्यकारी साइटों दोनों को बांधने के लिए रिपोर्ट किया गया है। डिमनोसिलेटेड एचए पेप्टाइड दो कम-आत्मीयता बाध्यकारी साइटों पर सीवीएन 2 के एक इंजीनियर अणु से भी बंधा हुआ है, जो संबंधित लिगैंड के लिए एक उच्च-आत्मीयता साइट को सहन कर रहा है और कार्बोहाइड्रेट-बाध्यकारी जेब में एक स्थिर डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को बदलने के लिए उत्परिवर्तित होता है, इस प्रकार मल्टीवेलेंट बाइंडिंग की पुष्टि करता है। एचए बाइंडिंग को 275 एनएम के पृथक्करण स्थिरांक (केडी) पर छद्म-एंटीबॉडी सीवीएन 2 की एक उच्च-आत्मीयता बाध्यकारी साइट पर दिखाया गया है जो ओलिगोमेराइजेशन के माध्यम से मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस टाइप 1 (एचआईवी -1) को बेअसर करता है। डोमेन-स्वैप किए गए सीवीएन 2 में डाइसल्फ़ाइड पुलों की संख्या को सहसंबंधित करने से, जो ग्लूटामिक एसिड और आर्जिनिन के ध्रुवीय अवशेष जोड़े में सिस्टीन को प्रतिस्थापित करके 4 से 2 तक कम हो जाते हैं, के परिणामस्वरूप एचए के लिए बाध्यकारी संबंध कम हो जाता है। सबसे मजबूत इंटरैक्शन में से, इबोला जीपी 1,2 सीवीएन 2 से जुड़ा हुआ है, जिसमें ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन के बिना लिफाफा ग्लाइकन का उपयोग करके निचले नैनोमोलर रेंज में दो उच्च-आत्मीयता बाध्यकारी साइटें हैं। वर्तमान अध्ययन में, मल्टीस्पेसिफिक मोनोमेरिक सीवी-एन को गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) स्पाइक (एस) ग्लाइकोप्रोटीन से जोड़ने को नैनोमोलर केडी की तुलना मेंकेडी = 18.6 μM पर मापा जाता है, और मध्य-μ-मोलर रेंज में इसके रिसेप्टर-बाइंडिंगडोमेन के माध्यम से मापा जाता है।

Introduction

टेथेरिन से जुड़ी एंटीवायरल गतिविधि इंटरफेरॉन-α द्वारा प्रेरित होती है, और इसमें प्रोटीन-आधारित टेथर शामिल होते हैं, जो संक्रमित कोशिका सतहों पर पूरी तरह से गठित वायरियन के प्रतिधारण की ओरजाता है। वायरस रिलीज के निषेध में टेथेरिन ग्लाइकोसिलेशन की आवश्यकता अनिश्चित बनी हुई है, जिसका अर्थ है कि इन विट्रो अध्ययन 1,2 के लिए पुनः संयोजक रूप से व्यक्त ग्लाइकेन्स पर ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न का महत्व, जो (इन्फ्लूएंजा वायरस के मामले में) सतह-व्यक्त इन्फ्लूएंजा हेमग्लूटिनिन एचए 3,4 की रचना पर निर्भर करता है . यह नोट किया गया है कि एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन से जुड़े ओलिगोसैकराइड का संशोधन एचआईवी टाइप -1 रिलीज2 के टेथरिन-मध्यस्थता प्रतिबंध के लिए पर्याप्त है, जबकि डिमराइजेशन वायरस रिलीज को रोकने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है, जिससे ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन या ग्लाइकोसिल-फॉस्फेटिडिल-इनोसिटोल (जीपीआई) -एंकर शामिलहोते हैं। . कई लिफाफे वाले वायरस, रेट्रोवायरस और फिलोवायरस को अवरुद्ध करने के लिए मानव और मुराइन टेथेरिन के लिए अद्वितीय विशेषताओं का वर्णन किया गया है। बीएसटी -2 / टेथरिन जन्मजात प्रतिरक्षा 1,6 का एक इंटरफेरॉन-इंड्यूसेबल एंटीवायरल प्रोटीन है, जो व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीवायरल गतिविधि के साथ कार्य करता है और लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन5 द्वारा या तो टेथेरिन को स्थानांतरित करने या टेथरिन6 की संरचना को बाधित करने के लिए विरोध किया जाता है। उदाहरण के लिए, इन्फ्लूएंजा ए वायरस पर सतह-व्यक्त लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन एचए और न्यूरामिनिडेस एक तनाव-विशिष्ट तरीके से टेथेरिन प्रतिरोध के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है, जिससे मेजबान रिसेप्टर बाइंडिंग साइटों की पहचान की सुविधा मिलतीहै। ग्लाइकन-लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी का अध्ययन एचए पर तेजी से अनुकूलित ग्लाइकन ढाल के साथ उनकी बातचीत के स्टोइकोमेट्री में किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप इन्फ्लूएंजा ए एच 3 एन 2 और एच 1 एन 1 उपप्रकार4 के लिए बाध्यकारी संबंध होता है।

एंटीवायरल एजेंटों और वायरस लिफाफा स्पाइक्स, यानी, कार्बोहाइड्रेट लिगेंड, और पूरक इम्यूनोलॉजिकल और स्पेक्ट्रोस्कोपिक तरीकों के बीच बाध्यकारी तंत्र को स्पष्ट करने के लिए, मोनो-, डी- और ट्राई-मैनोस मोइटीज को रासायनिक रूप से संश्लेषित किया जाता है। मैनोसिलेटेड पेप्टाइड्स ग्लाइकोसिल {बीटा}-पेरासिटेट्स के एज़िडो ग्लाइकोसिलेशन के माध्यम से 1,2-ट्रांस ग्लाइकोसिल एज़ाइड्स ट्रांसफॉर्मेशन9 के माध्यम से बनाए जाते हैं, जो आमतौर पर पाए जाने वाले एन-एसिटाइल ग्लूकोसामाइन और जीवन-धमकाने वाले वायरस की सतह पर उच्च-मैनोज़ ओलिगोसेकेराइड की नकल करते हैं। ट्रायज़ोल बायोआइसोस्टर का उपयोग उन लिंकेज की नकल करने के लिए किया जाता है जो एचए पेप्टाइड10 के मैनोसिलेटेड अवशेष बनाते हैं और एचए हेड डोमेन पर दूसरे एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन स्पॉट के आसपास एंटीवायरल सीवी-एन डेरिवेटिव के साथ साइट-विशिष्ट इंटरैक्शन की सुविधा प्रदान करते हैं (4 एन-लिंक्ड ग्लाइकेन्स एन 54, एन 97, एन 181, एन 301 के साथ एचए टॉप)8,11,12 . ग्लूटामिक एसिड (ग्लू) और आर्जिनिन (एआरजी) और परिणामस्वरूप हेलिक्स द्विध्रुवीय के बीच बातचीत ने मॉडल पेप्टाइड्स और प्रोटीन दोनों की अच्छी स्थिरता प्रकट की, लेकिन एसपीआर का उपयोग करके कल्पना की जाती है। यदि ग्लाइकन मोइटीज़ पर रिसेप्टर बाइंडिंग को सीधे बाधित करके एचए10 पर एकल रासायनिक रूप से संश्लेषित ग्लाइकोसिलेशन साइट को पहचानने के साथ तुलना की जाती है, तो इसके रिसेप्टर के लिए चार-साइट उत्परिवर्तित एफसी संरचना का एक उच्च संबंध विवो में प्रभावकारक कार्यों को प्राप्त करने के लिए दिखाया जाता है,जो एफसी उत्परिवर्ती से जुड़े एन-लिंक्ड ग्लाइकेन्स की असंबंधित संरचना को यांत्रिक रूप से निर्धारित करने के लिए प्रकट करता है।

सीवी-एन एचआईवी 14,15, इन्फ्लूएंजा 16 और इबोला वायरस के खिलाफ एंटीवायरल गतिविधि प्रदर्शित करता है, जो लिफाफा स्पाइक प्रोटीन12,17,18,19 पर उच्च-मैनोस ऑलिगोसेकेराइड संशोधनों के लिए नैनोमोलर बाइंडिंग द्वारा मध्यस्थता करता है। सीवी-एन में एक उच्च-आत्मीयता कार्बोहाइड्रेट-बाइंडिंग साइट (एच) या सहसंयोजक रूप से जुड़े डिमेरिक सीवीएन 2 में दो एचएस के लिए इन्फ्लुएंजा एचए बाइंडिंग को क्रमशः संतुलन पृथक्करण स्थिरांक (केडी) = 5.7 एनएम (चित्रा 1 ए) और केडी = 2.7 एनएम निर्धारित किया जाता है। सीवी-एन और सीवीएन 2 दोनों एक या दो कम-आत्मीयता कार्बोहाइड्रेट-बाध्यकारी साइटों (एल) के 12,17,20,21 को आश्रय देते हैं। इबोला जीपी 1,2 कम नैनोमोलर रेंज (केडी = 26 एनएम) में समानताओं के साथ सीवीएन 2 के 2 एच को बांधता है। सीवी-एन डब्ल्यूटी इबोला जीपी 1,2 और एचए के लिए बाध्यकारी केडी = 34 एनएम से केडी = 5.7 एनएम (ए / न्यूयॉर्क / 55/04)12 से समानताएं प्रदर्शित करता है। सीवी-एन जैसे लेक्टिन, जो विशेष रूप से वायरल लिफाफे पर उच्च-मैनोज़ ग्लाइकेन्स को लक्षित करते हैं, हेपेटाइटिस सी वायरस, सार्स-सीओवी, हर्पीसवायरस, मारबर्ग वायरस और खसरा वायरस22 की प्रतिकृति को रोकते हैं।

छोटे सीवी-एन अणु का 20 से अधिक वर्षों तक अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है क्योंकि यह वायरल प्रविष्टि16,18 को रोकने के लिए वायरस की एक विस्तृत श्रृंखला को बांधने के लिए कार्यात्मक है। संरचनात्मक विश्लेषण और बाध्यकारी आत्मीयता परख वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन10,19 के लिए उत्साह बढ़ाने के लिए माइक्रोमोलर रेंज में द्विसंयोजक बंधन द्वारा एक डोमेन-स्वैप किए गए सीवीएन 2 डिमर में दो एल की क्रॉस-लिंकिंग का संकेत देते हैं। मैन (8) डी 1 डी 3 हथियारों और मैन (9) पर मैन1-2मैन के चयनात्मक बंधन में विपरीत प्रोटीन प्रोटोमर्स20 पर स्थित अलग-अलग समानताओं के दो बाध्यकारी स्थल शामिल हैं, जिससे नैनोमोलर बाइंडिंग समानताओं तक पहुंचते हैं (चित्रा 1 बी)। इस प्रकार, सीवीएन 2 को एचआईवी जीपी 120 पर एपिटोप्स को बांधने के लिए इसके आवेदन से संबंधित एक छद्म एंटीबॉडी माना जाता है, जो वायरस-न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी17 के समान है। इसमें, लेखक अपने रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी) के माध्यम से सार्स-सीओवी-2 स्पाइक के लिए सीवीएन 2 के संभावित बंधन की जांच करने में रुचि रखता है। सार्स-सीओवी-2 आरबीडी के साथ स्थिर मानव एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम (एसीई)-2 के बाध्यकारी वक्रों के परिणामस्वरूप इस जैविक रूप से प्रासंगिक बाध्यकारी इंटरैक्शन के लिएकेडी = 4.7 एनएम होताहै।

इसके विपरीत, चयनित इम्युनोग्लोबुलिन वर्ग विशिष्ट और सुसंगत संरचनात्मक प्रोटीन पैटर्न को पहचानते हैं, जो झिल्ली-लंगर वाले एचए क्षेत्रों में आत्मीयता परिपक्वता के लिए एक सब्सट्रेट प्रदान करतेहैं। सीवी-एन लगभग सभी इन्फ्लूएंजा ए और बी वायरस16 में अत्यधिक शक्तिशाली गतिविधि दिखाता है, और यह व्यापक रूप से निष्क्रिय एंटीवायरल एजेंट है। हमारा ज्ञान एचए 1 और एचए 2 के तने पर लक्षित एपिटोप्स के स्थान पर अधूरा है जिसमें संभवतः एंटीबॉडी को अत्यधिक निष्क्रिय करके और लेक्टिन बाइंडिंग25 की तुलना में ग्लाइकन-लक्ष्यीकरण के लिए एपिटोपिक संरचनाएं शामिल हैं।

Figure 1
चित्रा 1: सीवी-एन के लिए एसपीआर बाइंडिंग परख का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व वायरस लिफाफा स्पाइक्स। (ए) सीवी-एन बाइंडिंग के लिए एसपीआर परख लिगैंड से: एचए पूर्ण लंबाई प्रोटीन (90 केडीए)। काइनेटिक डेटा सेट (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 एनएम) इन्फ्लूएंजा एचए ए / न्यूयॉर्क / 55/04 (एच 3 एन 2) के लिए वास्तविक समय डबल-संदर्भित बाइंडिंग दिखाता है। (बी) सीवीएन 2 एल 0 संस्करण वी 2 500 एनएम से 16 एसएम की एकाग्रता सीमा के भीतर स्थिर लिगैंड डीएम से जुड़ा हुआ है। एच अवशेषों को ग्रे रंग में हाइलाइट किया गया है। E58 और R73 वाइल्डटाइप प्रोटीन में सिस्टीन के लिए एक प्रतिस्थापन हैं और V2 को चार डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड के बजाय तीन के साथ एक स्थिर प्रोटीन फोल्ड बनाते हैं कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जबकि झिल्ली-डिस्टल एचए शीर्ष भाग पर ग्लाइकन ढाल सीवी-एन12 के लिए उच्च-आत्मीयता बंधन को प्रेरित करता है, एचए शीर्ष भाग के डाइसल्फ़ाइड पुल से सटे एचए के लिए सीवीएन 2 बाइंडिंग को इसके कम-आत्मीयता साइटों10,12 पर देखा गया है। सीवी-एन द्वारा कार्बोहाइड्रेट-बाइंडिंग में विभिन्न ध्रुवीय इंटरैक्शन और इंटरैक्शन साइटों की पहचान की जाती है। इन इंटरैक्शन को बाइंडिंग साइट में नॉक-आउट वेरिएंट उत्पन्न करके सत्यापित किया जाता है ताकि सिलिको अनुमानित ग्लाइकोसिलेशन12 में बाइंडिंग समानताओं को सहसंबंधित किया जा सके। इस प्रकार, परियोजना का उद्देश्य सार्स-संबंधित 2019-एनसीओवी स्पाइक्स और सार्स-सीओवी-2 से लघु पेप्टाइड अनुक्रमों के साथ बंधन संबंध और विशिष्टता में पहले से परीक्षण किए गए रासायनिक रूप से मैनोसिलेटेड एचए पेप्टाइड्स की तुलना करना है, जो स्वाभाविक रूप से विभिन्न एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन साइटों और ओ-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन की एक छोटी संख्या द्वारा संशोधित होते हैं। क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और बाइंडिंग परख का उपयोग करते हुए, पिंटो और सहकर्मियों ने एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, एस 309 की रिपोर्ट की, जो संभावित रूप से रिसेप्टर अटैचमेंट26 के साथ प्रतिस्पर्धा किए बिना सार्स-सीओवी-2 स्पाइक प्रोटीन पर एक एपिटोप को पहचानता है, जिसमें सर्बेकोवायरस उपजीनस के भीतर एक संरक्षित ग्लाइकन होता है। इस अध्ययन का प्रोटोकॉल बताता है कि सीवी-एन वेरिएंट को डिजाइन करना, व्यक्त करना और विशेषता देना यह अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है कि सीवी-एन और सीवीएन 2 एसपीआर तकनीक10,12 का उपयोग करके ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन और सिंथेटिक मैनोसिलेटेड पेप्टाइड्स से कैसे जुड़ते हैं।

टेंडम-लिंक्ड डिमर सीवीएन 2 एल 027 और बाइंडिंग-साइट वेरिएंट (वी 2-वी 5) को पुनः संयोजक रूप से व्यक्त किया जाता है और वेरिएंट डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड रिप्लेसमेंट (सी 58 ई और सी 73 आर) के साथ होते हैं (चित्रा 2 ए)। इसके अलावा, एकल-बिंदु उत्परिवर्तन ई 41 ए के साथ एक उत्परिवर्ती तैयार किया जाता है क्योंकि इस स्थिति को एक इंटरमॉलिक्युलर क्रॉस-कॉन्टैक्टिंग अवशेष के रूप में देखा गया है। यह उत्परिवर्ती लेक्टिन और उच्च-मैनोज़ ओलिगोसेकेराइड्स के बीच एसपीआर बाइंडिंग माप के लिए एक और दिलचस्प अणु है जो बाइंडिंग डोमेन को समझता है और डिमेरिक फॉर्म के साथ तुलना की अनुमति देता है। सीवीएन 2 की डोमेन-स्वैप क्रिस्टल संरचना एक लचीला लिंकर दिखाती है, जो 49 और 54 अवशेषों के बीच फैली हुई है। दो डोमेन कठोर निकायों के रूप में हिंज के चारों ओर घूमना जारी रख सकते हैं, या तो इंट्रामोलेक्यूलर डोमेन इंटरैक्शन (डोमेन ए-अवशेष 1-39; 90-101- डोमेन बी-अवशेष 40-89 के साथ) के माध्यम से एक मोनोमर विकसित कर सकते हैं या इंटरमॉलिक्युलर डोमेन स्वैपिंग द्वारा एक डिमर [डोमेन ए (पहले मोनोमर का) डोमेन बी (दूसरे का), और डोमेन बी (पहली मोनोमर का) डोमेन ए (दूसरी प्रति का)] के साथ। ग्लू 4128 को छोड़कर, दो प्रोटोमर्स ए और बी डोमेन के बीच कोई करीबी बातचीत नहीं है। सीवी-एन के लिए जीन को 40-मेर संश्लेषित ऑलिगोस29 के साथ दोहराव वाली पीसीआर विधि का उपयोग करके विकसित किया जा सकता है और फिर इसे पीईटी 11 ए के एनडीईआई और बीएएमएचआई साइटों में विभाजित किया जाता है ताकि इलेक्ट्रोकॉम्पिटेंट कोशिकाओं में परिवर्तन (इलेक्ट्रोपोरेशन) किया जा सके, जैसा कि कीफ, जे.आर.27 द्वारा वर्णित है। प्रोटीन, जिसका उपयोग संबंधित क्रिस्टल संरचना (पीडीबी आईडी 3 एस 3 वाई) को प्राप्त करने के लिए किया जाता है, में एक एन-टर्मिनल 6-हिस्टिडाइन शुद्धिकरण टैग शामिल है, जिसके बाद फैक्टर एक्सए प्रोटीज क्लीवेज साइट है। साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस का उपयोग बिंदु उत्परिवर्तन करने, कोडन स्विच करने और अमीनो एसिड विनिमय के लिए एकल या एकाधिक बेस या कोडन डालने या हटाने के लिए किया जाता है। ये परिवर्तन प्रोटीन फ़ंक्शन और संरचना में अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। पुनः संयोजक रूप से व्यक्त और शुद्ध सीवी-एन, सीवीएन 2, और सीवीएन 3 का जैव-भौतिक रूप से अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है 20,21,27, उत्पादन करने के लिए सस्ते हैं, और इसलिए एसपीआर सेंसर चिप्स पर स्थिर ग्लाइकेन के लिए बाध्यकारी परख को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है। पारंपरिक एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) ग्लाइकन लिगेंड के स्थिरीकरण तकनीक से संबंधित कम प्रजनन क्षमता प्रदान करता है और विभिन्न बाइंडिंग-साइट वेरिएंट के वास्तविक समय बाइंडिंग को बदल देता है, जो एसपीआर के लिए दिखाया गया है, समापन बिंदु परख में।

बाइंडिंग-एफिनिटी वेरिएंट CVN2L0-V2 (डाइसल्फ़ाइड ब्रिज प्रतिस्थापन10 के साथ होमोडिमेरिक सीवी-एन की एक बरकरार तह) को एस्चेरिचिया कोलाई (ई. कोलाई) में हिस-टैग के साथ व्यक्त किया जाता है, जिसे आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके नी-एनटीए कॉलम पर शुद्ध किया जाता है और एसपीआर का उपयोग करके एचए (एच 3 एन 2), मोनोमैनोसिलेटेड एचए-पेप्टाइड और डायमैनोसिलेटेड एचए-पेप्टाइड से जुड़ने के लिए परीक्षण किया जाता है। प्रतिक्रियाशील एस्टर या बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन प्रोटीन इंजीनियरिंग के माध्यम से। अनुक्रमिक रन की एक ही प्रक्रिया उन लिगेंड पर लागू होती है, जो30 के नीचे वर्णित आणविक इंटरैक्शन विश्लेषण के लिए गतिज जानकारी प्राप्त करने के लिए सीवी-एन और सीवी-एन (और सीवीएन 2) के विभिन्न कमजोर पड़ने को इंजेक्ट करती है। आरबीडी-स्थिर एसपीआर सेंसर चिप का उपयोग सीवी-एन से एस पेप्टाइड्स पर बाध्यकारी अध्ययन के लिए किया जाता है, और समानताओं की तुलना मानव एसीई 2 के साथ सार्स-सीओवी -2 बाइंडिंग से की जाती है।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन के लिए, सीवी-एन के बजाय एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख में सीवीएन-छोटे यूबिकिटिन जैसे संशोधक (सूमो) संलयन प्रोटीन का उपयोग किया गया है और यह सेल-आधारित परख के लिए उपयुक्त है। पुनः संयोजक पूर्ण लंबाई इन्फ्लूएंजा ए वायरस एचए एच 3 प्रोटीन व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें) या मानक प्रोटोकॉल12 के अनुसार स्तनधारी एचईके 293 सेल लाइनों और बैकुलोवायरस-संक्रमित कीट कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। वुहान -1 स्पाइक प्रोटीन स्तनधारी एचईके 293 कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। मोनोमैनोसिलेटेड पेप्टाइड (एमएम) और डिमनोसिलेटेड पेप्टाइड (डीएम) का संश्लेषण सीवीएन 2 और मोनोमैनोसिलेटेड छोटे अणु10 के लिए सजातीय लिगेंड का पता लगाने की अनुमति देता है।

1. सीवी-एन निर्माण बनाना

  1. CVN2 वेरिएंट और CVN2L0 प्रोटीन (PDB ID 3S3Y) में से प्रत्येक के लिए, वाणिज्यिक स्रोतों से PET27b (+) वेक्टर में N-टर्मिनल pelB लीडर अनुक्रम और His-tag के साथ जीन निर्माण प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका, पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
  2. CVN2L0 और उसके वेरिएंट (V2, V3, V4, और V5) प्राप्त करें; चित्रा 2 ए, सी) एक सीवीएन 2 एल 0 टेम्पलेट जीन की पृष्ठभूमि में जिसमें प्रत्येक सीवी-एन दोहराव के लिए दो अलग-अलग डीएनए अनुक्रम शामिल हैं।
  3. लियोफिलाइज्ड प्लास्मिड डीएनए को बाँझ विआयनीकृत आसुत जल (डीडीएच2ओ) में 100 एनजी / μL की अंतिम एकाग्रता में भंग करें।

2. प्लास्मिड डीएनए रूपांतरित कोशिकाओं के साथ एलबी-एगर प्लेटों की तैयारी

  1. 10 ग्राम/लीटर पेप्टोन, 5 ग्राम/लीटर खमीर निकालने और 5 ग्राम/लीटर एनएसीएल को डीडीएच2ओ में घोलकर कल्चर मीडियम एलबी-लेनोक्स तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें), और पीएच को 7.4 में समायोजित करें। पहले प्रकाशित रिपोर्ट 10 के बाद रासायनिक विधि द्वारा प्रत्येक संस्करण (वी 2-वी 5) के लिए सक्षम ई कोलाई बीएल21 (डीई 3) में परिवर्तन करें।
  2. घोल को विभाजित करें (900 μL और 100 μL), LB-agar प्लेटों (50 μg / mL kanamycin) पर 100 μL स्थानांतरित करें, और धीरे से बाँझ सेल स्प्रेडर का उपयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आगर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।

3. क्लोनिंग

  1. सीवी-एन के लिए जीन को पीईटी 11 ए के एनडीईआई और बीएएमएचआई साइटों में उपक्लोन करें ( सामग्री की तालिका देखें) संदर्भ27 के बाद इलेक्ट्रोकॉम्पिटेंट कोशिकाओं में परिवर्तन (इलेक्ट्रोपोरेशन) के लिए।

4. साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस

  1. CVN2L029 और उत्परिवर्ती CVN-E41A को CVN2L0 टेम्पलेट जीन की पृष्ठभूमि में उत्पन्न करने के लिए जिसमें प्रत्येक CV-N रिपीट27 के लिए दो विशिष्ट DNA अनुक्रम होते हैं।
  2. पीसीआर31 को चलाने के लिए साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस किट (सामग्री की तालिका देखें) और विशिष्ट म्यूटाजेनिक प्राइमरों का उपयोग करके उत्परिवर्तन करें।
    1. 5-50 एनजी (जैसे, डीएसडीएनए टेम्पलेट के 5, 10, 20, और 50 एनजी) से लेकर डबल-फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) टेम्पलेट की कई सांद्रता का उपयोग करके नमूना प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला शुरू करें। प्राइमर एकाग्रता को स्थिर रखें।
      नोट: पीसीआर मिश्रण और थर्मल साइक्लिंग प्रोटोकॉल का उपयोग आमतौर पर साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस किट32 के लिए निर्देश मैनुअल में वर्णित के रूप में किया जाता है।
  3. खनिज तेल ओवरले के नीचे Dpn I प्रतिबंध एंजाइम (1 μL, 10 U/μL, सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। अच्छी तरह से और धीरे-धीरे प्रतिक्रियाओं को मिलाएं, 1 मिनट के लिए टेबल-टॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में स्पिन करें, और माता-पिता के सुपरकोइल्ड डीएसडीएनए को पचाने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत इनक्यूबेट करें।

5. जीवाणु कोशिकाओं का परिवर्तन

  1. XL1-ब्लू सुपरक्षम कोशिकाओं को बर्फ पर धीरे से पिघलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रत्येक नियंत्रण और नमूना प्रतिक्रिया को बदलने के लिए, सुपरकॉम्पिटेंट कोशिकाओं (50 μL) को एक प्रीचिल्ड पॉलीप्रोपाइलीन राउंड-बॉटम ट्यूब (14 एमएल) में बदल दें।
    1. प्रत्येक नियंत्रण और नमूना प्रतिक्रिया (उत्परिवर्तित एसएसडीएनए) से डीपीएन आई-उपचारित एकल-फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) के 1 μL को सुपरसक्षम कोशिकाओं के अलग-अलग एलिकोट में स्थानांतरित करें, जो पूरक स्ट्रैंड को संश्लेषित करते हैं। 30 मिनट के लिए बर्फ पर प्रतिक्रियाओं को मिलाने और इनक्यूबेट करने के लिए परिवर्तन प्रतिक्रियाओं को सावधानीपूर्वक घुमाएं।
      नोट: डीपीएन आई-उपचारित डीएनए को परिवर्तन प्रतिक्रिया में स्थानांतरित करने से पहले, पिपेट टिप से किसी भी शेष खनिज तेल को सावधानीपूर्वक हटाने की सिफारिश की जाती है। एक वैकल्पिक नियंत्रण के रूप में, एक्सएल 1-ब्लू सुपरक्षम कोशिकाओं की परिवर्तन दक्षता को पीयूसी 18 नियंत्रण प्लास्मिड (1 μL) के 0.1 ng / μL को सुपरसक्षम कोशिकाओं के 50 μL एलिकोट के साथ मिलाकर जांचने की आवश्यकता होती है।
  2. 45 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर परिवर्तन प्रतिक्रियाओं के लिए हीट पल्स लागू करें, और फिर प्रतिक्रियाओं को 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
    नोट: लागू गर्मी पल्स को पहले से ही पॉलीप्रोपाइलीन राउंड-बॉटम ट्यूबों (14 एमएल) में उल्लिखित स्थितियों के लिए अनुकूलित किया गया है।
  3. 0.5 एमएल एनजेडवाई + शोरबा जोड़ें (प्रति लीटर: 10 ग्राम एनजेड अमाइन (कैसिइन हाइड्रोलाइसेट), 5 ग्राम खमीर निकालने, 5 ग्राम एनएसीएल, 1 एम एमजीसीएल2 का 12.5 एमएल, 1 एम एमजीएसओ4 का 12.5 एमएल, 2 एम ग्लूकोज का 10 एमएल, पीएच 7.5, और 42 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया) और 225-25 डिग्री सेल्सियस पर हिलाने के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर परिवर्तन प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें। एलबी-एम्पीसिलीन एगर प्लेटों पर प्रत्येक परिवर्तन प्रतिक्रिया की सही मात्रा (नियंत्रण प्लास्मिड परिवर्तन से 5 μL; नमूना परिवर्तन से 250 μL) प्लेट करें।
    नोट: परिवर्तन नियंत्रण और म्यूटेनेसिस के लिए, एलबी-एम्पीसिलीन एगर प्लेटों पर कोशिकाओं को फैलाएं, जिनमें 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल-β-डी-गैलेक्टोपाइरानोसाइड (एक्स-गैल, 80 μg / mL) और आइसोप्रोपिल -1-थियो-β-डी-गैलेक्टोपाइरानोसाइड (आईपीटीजी, 20 एमएम) ( सामग्री की तालिका देखें) होती है। परिवर्तित ई की एक एकल कॉलोनी के साथ सेल संस्कृतियों के 50 एमएल को टीका लगाएं। विश्लेषण के लिए उत्परिवर्तित प्लास्मिड डीएनए को शुद्ध करने के लिए कोलाई कोशिकाएं। म्यूटेनेसिस की पुष्टि बाहरी सुविधा में डीएनए अनुक्रमण द्वारा की जाती है।

6. अभिव्यक्ति और प्रोटीन शुद्धिकरण

  1. बड़े पैमाने पर संस्कृति के लिए, रूपांतरित प्लेट से एक ही कॉलोनी के साथ एलबी (एम्पीसिलीन युक्त) की एक छोटी मात्रा का टीकाकरण करें।
  2. रात भर की संस्कृति का उपयोग करके, अभिव्यक्ति संस्कृति को एडिटिव्स के साथ टीका लगाएं, जैसे कि एमजीसीएल2 का 10 एमएम, एमजीएसओ 4 का 10 एमएमऔर ग्लूकोज का 20 एमएम, बीज संस्कृति को 1/100 तक पतला करना।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर जोरदार झटकों के साथ कोशिकाओं को विकसित करें। कोशिकाओं को 20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने से पहले कोशिकाओं को 0.4-0.6 (मध्य-लॉग चरण) के बीच एबीएस 600 एनएम तक बढ़ाएं। 1 mM IPTG के साथ प्रेरित करें और रातोंरात बढ़ें।
    2. फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके कोशिकाओं को काटें, और एक पिपेट के साथ सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  3. सेल पेलेट को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) बफर में पुन: निलंबित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4,000 x g पर पुन: सेंट्रीफ्यूज करें। फिर, एक पिपेट के साथ सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। शेष गोली को 10 एमएल लाइसिस बफर में पुन: निलंबित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए निलंबन को इनक्यूबेट करें।
    नोट: लाइसिस बफर की संरचना: (NaH2PO4 का 50 mM, NaCl का 300 mM, 2% Triton-X100, लाइसोजाइम का 500 ng/mL, 1 mM फेनिलमेथिलसल्फोनाइलफ्लोराइड (PMSF), 1 mM dithiothytriitol, 1 mM MgCl2, pH 8, सामग्री की तालिका देखें)।
    1. मिश्रण को दो फ्रीज-पिघलना चक्र (-80 डिग्री सेल्सियस) के अधीन करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा घुलनशील और अघुलनशील अंशों को अलग करें और पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (PAGE) का उपयोग करके उनका विश्लेषण करें, विशेष रूप से, सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस)-पेज33 (चित्रा 2 बी, सी)।
      नोट: कोशिकाओं को कई तरीकों से अलग किया जा सकता है, जैसे कि फ्रीज-पिघलना, सोनिकेशन, होमोजेनाइजेशन, एंजाइमेटिक लाइसिस, या इन विधियों का संयोजन। उच्च प्रोटीन पैदावार एकत्र करने के लिए समावेश निकायों से शुद्धिकरण की सिफारिश कीजाती है।
  4. नी-एनटीए कॉलम क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके प्रोटीन को शुद्ध करें ( सामग्री की तालिका देखें)। घुलनशील अंश को पुनर्जीवित नी-एनटीए मोती स्तंभ (1 एमएल / मिनट) पर लोड करें। ग्रेडिएंट शुरू करने से पहले सिस्टम को टीबीएस बफर (ट्राइस का 50 एमएम, सोडियम क्लोराइड का 150 एमएम, पीएच 7.5) के साथ धोएं (60 मिनट से अधिक टीबीएस में 0-100% 500 एमएम इमिडाज़ोल) और अंशों (1 एमएल / मिनट) को इकट्ठा करें। 100 एमएम पीबीएस (चित्रा 2 सी, डी) के खिलाफ जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए शुद्ध प्रोटीन को डायलाइज़ करें।
  5. वैकल्पिक रूप से, 14 एमएल ट्यूबों में हिस-सिलेक्ट नी2 + एफिनिटी जेल ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें ताकि क्रमशः 20 एमएम इमिडाज़ोल और 250 एमएम इमिडाज़ोल के साथ बफर समाधान में अपने-टैग किए गए पुनः संयोजक रूप से व्यक्त सीवी-एन को बांधा और फिर से निलंबित किया जा सके। कम से कम 30 मिनट के लिए बैच में इनक्यूबेट करें।
    नोट: इन अर्ध-शुद्ध प्रोटीनों को जैविक नमूनों के बफर एक्सचेंज और क्लीनअप के लिए एकल-उपयोग प्रीपैक्ड कॉलम में लागू करें, उदाहरण के लिए, कार्बोहाइड्रेट और प्रोटीन, जो स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी से 1-1.5 एमएल एल्यूएट लोड कर सकते हैं।
  6. प्रोटीन समाधानों को 10 केडीए कट-ऑफ फिल्टर ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूबों में स्थानांतरित करें और उन्हें 4,500 x g और 4 °C पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजिंग करके केंद्रित करें। एसपीआर माप के लिए, विश्लेषण समाधानों को 10 एमएम एचईपीईएस, 150 एमएम सोडियम क्लोराइड, 3 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए), और 0.05% ट्वीन 20, पीएच 7.4 (एचबीएस-ईपी (+), सामग्री की तालिका देखें) में विनिमय करें।
    1. इस एसपीआर रनिंग बफर को 1: 10 के कमजोर पड़ने वाले कारक में जोड़ें और 4,500 x g और 4 °C पर 10 मिनट के लिए प्रारंभिक मात्रा में चार बार सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. मुख्य प्रोटीन CVN2L0 के लिए गणना किए गए विलोपन गुणांक (20,440 M-1 cm-1) के आधार पर नैनोड्रॉप यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके 280 nm पर प्रोटीन सांद्रता निर्धारितकरें। रिक्त स्थान के रूप में पीबीएस (100 एमएम, पीएच 7.0) या एसपीआर बफर का उपयोग करें, और प्रोटीन एकाग्रता को तीन कमजोर पड़ने वाले चरणों (1: 1, 1: 10, और 1: 100) पर मापें।

Figure 2
चित्र 2: CV-N अनुक्रम और अभिव्यक्ति। (A) CVN2 प्रत्येक CV-N रिपीट (प्रत्येक 101 एमिनो एसिड) और चार डाइसल्फ़ाइड पुलों के बीच एक लिंकर के बिना E में pET11a वेक्टर में व्यक्त किया जाता है। कोलाई। (बी) सीवी-एन (मोनोमर) और सीवीएन 2 (डिमर) के लिए दो स्वतंत्र कॉलोनियों की अभिव्यक्ति। (सी) डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड वेरिएंट को एसडीएस-पेज पर शुद्ध और विश्लेषण किया जाता है। एक कम आणविक भार मार्कर (6 μL) का उपयोग संदर्भ के रूप में किया जाता है। WT = CVN2L0 चार डाइसल्फ़ाइड पुलों को धारण करता है जैसा कि (A) में चिह्नित है। वी 2 58 और 73 पदों पर ध्रुवीय अवशेषों द्वारा डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड प्रतिस्थापन के साथ एक संस्करण है। V3-V5 दो शेष S-S बांड वाले वेरिएंट हैं और या तो ध्रुवीय (C58E-C73R) या गैर-ध्रुवीय (C58W-C73M) अमीनो एसिड या इन अवशेष जोड़ी प्रतिस्थापनों के संयोजन को प्रतिस्थापित करते हैं। (D) शुद्ध CVN2L0 के HPLC क्रोमैटोग्राम को 30 मिनट से अधिक बफर A में 5% -65% बफर B से रैखिक ढाल के साथ 1 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर एल्यूटेट किया जाता है। बफर A है: ddH2O में 0.1% (v/v) ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड, बफर B है: 0.08% (v/v) एसिटोनिट्राइल में ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड। प्रोटीन का विश्लेषण 214 एनएम और 280 एनएम पर उच्च प्रदर्शन सिलिका जेल 300-5-सी 4 (150 x 4.6 मिमी) कॉलम पर किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

7. एसपीआर स्पेक्ट्रोस्कोपी

  1. पुनर्जनन बफर के रूप में बफर एचबीएस-ईपी (+) और 10 एमएम ग्लाइसिन एचसीएल पीएच 1.5-1.6 चलाने के साथ दोहरी चैनल एसपीआर सिस्टम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें। उपकरण, डेगैसर, ऑटो-सैंपलर और पंप चालू करें और 1 घंटे के लिए डीडीएच20 के साथ पूरे सिस्टम को धो लें। एक अलग बोतल में रेडी-टू-यूज़ रनिंग बफर रखें।
  2. डिटेक्टर पर एमरसन तेल गिराएं और एक पतली सोने की फिल्म के साथ लेपित ग्लास सेंसर चिप ( सामग्री की तालिका देखें) को माउंट करें और ऊपरी तरफ कार्बोक्सीमिथाइलडेक्सट्रान हाइड्रोगेल के साथ सीधे तीन-पोर्ट फ्लो सेल के नीचे डिटेक्टर पर कार्यात्मक हों। हैंडलिंग को नीचे खींचकर सेटिंग को ठीक करें।
    नोट: सी 19 आरबीडीएचसी 30 एम 200 एनएम स्ट्रेप्टाविडिन डेरिवेटाइज्ड कार्बोक्सीमिथाइलडेक्सट्रान हाइड्रोगेल बायोटिनाइलेटेड गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस -2 आरबीडी प्रोटीन के मध्यम घनत्व के साथ, पूर्व-स्थिर लिगैंड के साथ एक तैयार सेंसरचिप है।

8. एचए, एस प्रोटीन और आरबीडी के लिए सीवी-एन बाइंडिंग के लिए एसपीआर बाइंडिंग परख

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए प्रोटीनयुक्त लिगेंड को सेंसर चिप्स में स्थिर करें।
    1. मेनू पट्टी में प्रपत्र पर क्लिक करके एक रन तालिका खोलें और एकीकृत SPRAutoLink सॉफ़्टवेयर में तालिका संपादक चलाएँ ( सामग्री तालिका देखें). उपलब्ध रन तालिकाओं की सूची से BASIC_Immobilization चुनें और क्लिक करें और कंप्यूटर स्क्रीन पर प्रयोगात्मक प्रक्रिया के चरणों का पालन करें। उपयोग किए गए संबंधित नमूना संपादक को दाएं ऊपरी कोने में दिखाया गया है।
    2. आगे के विश्लेषण के लिए ऑटोसैंपलर में रखे गए दो रैक के लिए अभिकर्मकों की सूची भरने के लिए फॉर्म अनुभाग में नमूना सेट संपादक पर क्लिक करें। रैक को आगे या घर वापस लाने के लिए मेनू बार में "टूल" के रूप में ऑटोसैंपलर डायरेक्ट कंट्रोल पर क्लिक करें। ऑपरेटिंग तापमान के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस चुनें।
      नोट: एसपीआर सॉफ्टवेयर संबंधित उपकरणों का चयन करके, साथ ही ऑटोसैंपलर-हैंडलिंग, और फॉर्म पर क्लिक करके "एसपीआर इंस्ट्रूमेंट डायरेक्ट कंट्रोल" और "पंप डायरेक्ट कंट्रोल" की अनुमति देता है; डेटा विश्लेषण करने के लिए टेबल एडिटर, डेटा-प्लॉट या पोस्ट-प्रोसेसिंग भी चुना जा सकता है। फ़ाइलें सीधे डिफ़ॉल्ट निर्देशिका में सहेजी जाती हैं और पोस्ट-प्रोसेसिंग विंडो से scrubber.files के रूप में निर्यात की जाती हैं।
  2. उपकरण और पंप डायरेक्ट कंट्रोल पर क्लिक करके डीडीएच20 को शामिल करने के लिए पंप शुरू करें और एसपीआर इंस्ट्रूमेंट डायरेक्ट कंट्रोल पर क्लिक करके डेटा रिकॉर्ड करें, और हर बार नई दिखाई देने वाली विंडो में शुरू करें। युग्मन अभिकर्मकों (चरण 8.3) को 300 μL शीशियों में रखें, उन्हें ऑटोसैंपलर रैक में डालें और रन पर क्लिक करके रन टेबल शुरू करें।
    नोट: चिप सतहों को या तो 10 एमएम ग्लाइसिन बफर पीएच 9.0 के साथ वातानुकूलित किया जाता है या ईडीसी / एनएचएस सक्रियण मिश्रण30 के लिए कार्बोक्सिल डेरिवेटाइज्ड चिप सतह को कंडीशन करने के लिए 1 एम सोडियम क्लोराइड, 0.1 एम सोडियम बोरेट बफर पीएच 9.0 के साथ फ्लश किया जा सकता है।
  3. इस सरल प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए, सीएमडी 500 डी चिप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एक सूक्ष्म-अपवर्तक सूचकांक इकाइयों (μRIU) = 2500 - 3000 प्रवाह सेल को स्थिर HA के साथ और 400 प्रवाह सेल स्पाइक प्रोटीन के साथ उत्पन्न करें। 15 μL/min की प्रवाह दर पर, निम्नलिखित अनुक्रमिक चरणों को लागू करके 0.4 M N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl) कार्बोडिमाइड हाइड्रोक्लोराइड (EDC*HCl) और 0.1 M N-hydroxysuccinide (NHS) के जलीय और समान मिश्रण को इंजेक्ट करें।
    1. 25,000 μL / min पर रिफिल पंप रिफिल, 30 सेकंड के लिए बेसलाइन समायोजन करें, 6 मिनट के संपर्क समय में नमूना सक्रियण समाधान (ईडीसी / एनएचएस) के 90 μL इंजेक्ट करें, और फिर 5 मिनट के लिए पकड़ें।
    2. रासायनिक रूप से संश्लेषित पेप्टाइड्स 10, एचए, और स्पाइक प्रोटीन को 20 μg/mL पर इंजेक्ट करने और गतिहीन करने के लिए केवल बाएं प्रवाह सेल (नीले) पर1 मिनट के लिए बेसलाइन चलने के बाद इस चक्र को दोहराएं, और 1 M इथेनॉलमाइन HCl pH 8.5 के साथ सक्रिय चिप सतह को बुझाने से पहले 1.5 मिनट के लिए ddH2O के साथ बाद के बेसलाइन समायोजन की अनुमति दें।
  4. ट्यूबों को तरल नमूने से डीडीएच20 से डेगासर तक एचबीएस-ईपी (+) (पूरक चित्रा 1) के साथ बोतल में स्विच करें।
  5. एसपीआर सेंसरग्राम का विश्लेषण करें।
    1. गतिज अध्ययन करने के लिए, विभिन्न विश्लेषण सांद्रता (10-5-10-8 एम) का उपयोग करें, प्रत्येक इंजेक्शन के बाद पुनर्जनन चरण और विभिन्न विश्लेषणों के बाद रिक्त माप के साथ। प्रवाह दर को 10 μL / min तक बदलें और 4 मिनट संपर्क समय के लिए इंजेक्शन शुरू करें, फिर 5 मिनट बेसलाइन उत्पादन, और 30 सेकंड के अंतराल के साथ प्रत्येक 2 मिनट के दो पुनर्जनन चरण।
    2. रिक्त माप के लिए बफर समाधान इंजेक्ट करें जिसके सेंसरग्राम को विभिन्न प्रोटीन सांद्रता को सामान्य करने के लिए नमूना रन से घटाया जाता है।
  6. फॉर्म पर क्लिक करें, नीचे स्क्रॉल करें, और इस ऑपरेशन मोड पर क्लिक करके "पोस्ट-प्रोसेसिंग" में बदलें। प्रत्येक प्रवाह सेल के लिए डेटा प्लॉट फॉर्म में समय के साथ उत्पन्न बाइंडिंग कर्व्स का चयन करने के लिए जोड़ें पर क्लिक करें, और ओवरले को स्क्रबर फ़ाइल (.ovr) के रूप में निर्यात करें। फ़ाइल सहेजने के विकल्प खोलने के लिए फ़ाइल पर क्लिक करें. बाएं और दाएं वक्रों को संरेखित करके और लिगैंड चैनल से दूसरे संदर्भ चैनल के संकेतों को घटाकर प्रतिक्रिया वक्र प्राप्त करें।
    नोट: डेटा को कम्प्यूटेशनल रूप से सेंसरग्राम को परिभाषित करके "पोस्ट-प्रोसेसिंग" में संचालित किया जाता है। इसे बाएं और दाएं प्रवाह कोशिकाओं से सेंसरग्राम के ओवरले में रखा जाता है, या दोनों चैनलों के अंतर से सेंसरग्राम के रूप में दर्शाया जाता है।
  7. नमक या किसी भी प्रोटीन संदूषण के निशान को हटाने के लिए बांधने के माप से पहले और बाद में 50-100 एमएम ग्लाइसिन बफर पीएच 9.5, पानी और 20% इथेनॉल के साथ पूरे तरल पदार्थ को साफ करें, या 0.5% एसडीएस और ग्लाइसिन के साथ।
    नोट: उपकरण क्षति को रोकने के लिए, चिप कारतूस को उपकरण में फिर से डालने से पहले ग्लास चिप की यांत्रिक स्थिरता की जांच करने की सिफारिश की जाती है यदि चिप्स को बफर के तहत या 100% आर्द्रता पर संग्रहीत किया गया है।

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Representative Results

तीन अलग-अलग एसपीआर प्रयोगों में एचए शीर्ष क्षेत्र में बंधन के लिए एक डिमेरिक डोमेन-स्वैप्ड सीवीएन 2 एल 0 अणु का परीक्षण किया जाता है और बाध्यकारी आत्मीयता को केडी मानों में प्रस्तुत किया जाता है। डोमेन बी को एच-बाइंडिंग साइटों को शामिल माना जाता है, जो एक डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को आयनिक अवशेषों में बदलने से प्रभावित होते हैं, और डोमेन ए एल10,18 बनाता है। CVN2L0 और वेरिएंट V2 (तीन डाइसल्फ़ाइड ब्रिज) और V5 (दो डाइसल्फ़ाइड ब्रिज) के एकल इंजेक्शन को पहले एचए-युग्मित सेंसर चिप से बांधने के लिए परीक्षण किया जाता है ताकि ऑटोसैंपलर और रनिंग टेबल एडिटर (चित्रा 3 ए और पूरक चित्रा 2) का उपयोग करके कैनेटीक्स माप स्थापित करने से पहले बाध्यकारी क्षमताओं का अनुमान लगाया जा सके। समय के साथ सिस्टम में नैनोमोलर और μ-मोलर रेंज में विभिन्न सांद्रता में सीवीएन 2 एल 0, वी 2 और वी 5 की एक श्रृंखला के लिए बार-बार इंजेक्शन स्वचालित होते हैं (चित्रा 3 बी-डी)। बरकरार Cys-Cys बांड की संख्या को सहसंबंधित करते हुए, CVN2L0 अच्छी संतृप्ति तक पहुंचने पर KD = 255 nM पर स्थिर एचए को बांध रहा है। इस मामले में, दोनोंकेडी मान, या तो गतिज डेटा से गणना की जाती है या संतुलन डेटा को लैंगमुइर बाइंडिंग समताप रेखा में फिट करके, मध्यम समझौते में हैं (तालिका 1 और पूरक चित्रा 3, पूरक चित्रा 4)।

Figure 3
चित्रा 3: मल्टीवेलेंट इंटरैक्शन के माध्यम से लिगैंड बाइंडिंग के लिए एसपीआर बाइंडिंग परख। सीवीएन 2 (डब्ल्यूटी) और बाइंडिंग साइट-वेरिएंट वी 2 और वी 5 को उच्च-आत्मीयता कार्बोहाइड्रेट-बाइंडिंग पॉकेट में डाइसल्फ़ाइड प्रतिस्थापन के साथ सहसंयोजक रूप से स्थिर एचए को बांधने के लिए परीक्षण किया जाता है। (ए) सीवीएन 2, वी 2 और वी 5 के बाएं और दाएं प्रवाह सेल बाइंडिंग वक्रों को एसपीआर रन प्रोटोकॉल से निकाला जा सकता है, और सेंसरग्राम को एक ओवरले में संक्षेपित किया जाता है। (बी) पारंपरिक एसपीआर प्रयोग से सेंसरग्राम को सीवीएन 2 एल 0 से एचए में बांधने के लिए गतिज विश्लेषण के रूप में दिखाया गया है, जिसमें 10-4 से 10-8 एम तक विश्लेषण सांद्रता इंजेक्ट की जाती है। आरयू = प्रतिक्रिया इकाइयाँ। एक सीएमडी 500 डी सेंसर चिप का उपयोग किया जाता है। (सी) एचए के लिए वी 2 बाइंडिंग के लिए एसपीआर सेंसरग्राम। (डी) वी 5 एचए के लिए बाध्यकारी। चित्र (B-D) संदर्भ10 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ka (M-1 s-1) kd (s-1) केडी [एचए]
गतिज		 केडी [एचए]
संतुलन
CVN2 5.1 e3 1.3 x10-3 255 nM 246 nM
V2 4.0 e3 1.1 x10-3 275 nM 255 nM
V5 1.2 e3 5.8 x10-2 5 μM 4.9 μM
CVN2L0 2.07 e4 3.0 x10-3 147 nM 600 nM
2.27 e4 3.0 x10-3 133 nM 490 nM

तालिका 1: सीवीएन 2 की बाध्यकारी समानताएं और एसपीआर के माध्यम से मापा गया एचए के वेरिएंट। स्क्रबर 2.0 (एक बायोलॉजिक सॉफ्टवेयर) का उपयोग वास्तविक समय एसपीआर एसोसिएशन और पृथक्करण वक्रों को फिट करने और गतिज और संतुलन डेटा से संतुलन पृथक्करण स्थिरांक (केडी) की गणना करने के लिए किया जाता है। Ka = एसोसिएशन दर स्थिर। केडी = पृथक्करण दर स्थिर।

जबकि CVN2L0 और V2 को HA से बांधने के लिएKD मान नैनोमोलर रेंज में हैं, V5 बाइंडिंग में कम हो जाता है (तालिका 1)। वी 5 में, दो डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को आयन-पेयरिंग अवशेषों द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है जो उत्परिवर्तित ग्लू और एआरजी अवशेषों (चित्रा 2 ए, 3 डी) के बीच संभावित आयनिक इंटरैक्शन को पुन: प्रशिक्षित करते हैं। प्राथमिक डेटा का विश्लेषण एसोसिएशन की एकीकृत दर और पृथक्करण समीकरणों की दर के बाद किया जाता है, जो स्थिर लिगैंड के साथ घुलनशील सीवी-एन की बातचीत के बाध्यकारी कैनेटीक्स और चिप की सतह से गठित परिसर के पृथक्करण का वर्णन करता है। दो स्वतंत्र माप किए जाते हैं, और प्रतिकृति से प्राप्त सेंसरग्राम का विश्लेषण किया जाता है। KD की गणना koff/k के भागफल के रूप में (अनुपूरक तालिका 1)10,35 के रूप में की जाती है। हालांकि, केडी संतुलन डेटा से संबंधित है जो लैंगमुइर बाइंडिंग इज़ोटेर्म36 को फिट करता है, जहां संतुलन बाध्यकारी प्रतिक्रिया को विश्लेषण एकाग्रता (पूरक चित्रा 3 ए, 4 ए, 3 बी, 4 बी) के कार्य के रूप में प्लॉट किया जाता है। एकाग्रता-निर्भर तरीके से, पृथक्करण दर स्थिर kd को विश्लेषण के बाद निर्धारित किया जाता है और एसोसिएशन दर स्थिर k a का अनुमान लगाने के लिए एसोसिएशन चरण फिटिंग (kon) में शामिल किया जाताहै। (तालिका 1, पूरक चित्र 3 सी, पूरक चित्रा 4 सी)।

इसके बाद, सीवी-एन से एचए के बंधन की तुलना आरबीडी के साथ इसकी बातचीत से की जाती है। सार्स-सीओवी-2 आरबीडी के लिए सीवी-एन डब्ल्यूटी बाइंडिंग को एचए (केडी = 5.7 एनएम) 8,10,12 से जुड़ने और एस प्रोटीन (केडी = 18.6 μM, चित्रा 5) से बांधने की तुलना में कमजोर आत्मीयता (KD = 260 μM, चित्रा 4A) पर मापा जाता है। आरबीडी एस 1 सबयूनिट (चित्रा 4 ए) पर संभवतः संरक्षित कार्बोहाइड्रेट के विशिष्ट लक्ष्यीकरण को मानते हुए, आरबीडी के लिए सीवी-एन डब्ल्यूटी बाइंडिंग के लिए एकाग्रता बनाम प्रतिक्रिया को प्लॉट किया गया है। सीवीएन 2 एल 0-वी 4 को डीएम से बांधने के लिए एक ही आत्मीयता प्लॉट दिखाया गया है जो अब डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड के प्रतिस्थापन के कारण विश्लेषण योग्य नहीं है जो छोटे ग्लाइकोसिलेटेड पेप्टाइड्स (चित्रा 4 बी) के लिए उच्च-आत्मीयता बंधन में हस्तक्षेप करता है।

CVN2L0-V4 (ग्लू-आर्ग अवशेषों या एम्फीपैथिक अमीनो एसिड Trp और Met द्वारा सिस्टीन अवशेषों के असममित प्रतिस्थापन के विपरीत 2 डाइसल्फ़ाइड बांड) छद्म-डोमेन बी कार्बोहाइड्रेट-बाइंडिंग साइट10 के आसपास गैर-ध्रुवीय हाइड्रोजन बॉन्ड नेटवर्क बना सकते हैं। एचए प्रोटीन पर ग्लाइकेन्स का उच्च घनत्व सिस्टीन (पूरक तालिका 1) के बजाय ध्रुवीय ग्लू-एआरजी अवशेषों के साथ बंधन तक पहुंचता है, और सीवीएन 2 एल 0 और ग्लू-एआरजी में संशोधन के बीच मैनोसिलेटेड पेप्टाइड्स (डीएम के लिए केडी = 10 एसएम) के साथ एक संबंध, लेकिन इस मोनोग्लाइकोसिलेटेड पेप्टाइड से वेरिएंट के निरंतर पृथक्करण को दर्शाता है, विशेष रूप से जब एच को दोनों मोनोमर्स पर संशोधित किया जाता है। डीएम के साथ CVN2L0-V4 के बीच बातचीत के लिए, 56 μM CVN2L0-V4 इंजेक्शन की प्रतिक्रिया R अधिकतम की तुलना में अधिक प्रतिक्रिया देतीहै। (चित्र 4बी)। V5 (2x Glu-Arg) सतह-बाध्य DM (डेटा नहीं दिखाया गया) से पृथक्करण में विफल रहता है। संक्षेप में, देशी एच के बिना पेप्टाइड और आरबीडी के लिए मोनोमर बाइंडिंग के लिए सीवीएन 2 पर सभी सेंसरग्राम के लिए इंजेक्शन समाप्त करने से पहले कम सांद्रता के प्रतिक्रिया वक्र ों में गिरावट आती है।

Figure 4
चित्रा 4: आरबीडी के लिए (ए) सीवी-एन डब्ल्यूटी मोनोमर बाइंडिंग का एसपीआर विश्लेषण। केडी की गणना गतिज डेटा (बाईं ओर, केडी = 260 μM) फिट करके की जाती है और लिगैंड और विश्लेषण के बीच 1: 1 बाइंडिंग के लिए एक साधारण बायोमोलेक्यूलर मॉडल का उपयोग करके आत्मीयता डेटा (दाईं ओर) के साथ तुलना की जाती है (केडी इक्विल = 274 μM)। संतुलन बाध्यकारी प्रतिक्रिया या बाध्यकारी क्षमता को एसपीआर बाइंडिंग कर्व्स (0-605 μM CVN) की तुलना में एकाग्रता के कार्य के रूप में प्लॉट किया जाता है। एच = उच्च-आत्मीयता बाध्यकारी साइट। एल = कम आत्मीयता बाइंडिंग साइट। दोनों सीवी-एन और सीवीएन 2 एल 0 पर पाए जाते हैं। (बी) डीमेरिक सीवीएन 2 एल 0-वी 4 डीएम के लिए बाध्यकारी है, बिना विश्लेषण योग्यकेडी के 2 एल मानते हुए। CVN2L0-V4 सांद्रता 56 μM, 28 μM, 14 μM, 7 μM, 3.5 μM हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: उत्परिवर्ती सीवीएन-ई 41 ए और सीवी-एन डब्ल्यूटी (ए) एस ग्लाइकोप्रोटीन के लिए बाध्यकारी। तीर एसोसिएशन और पृथक्करण चरण की शुरुआत का संकेत देते हैं। (ख) सार्स-सीओवी-2 पर आरबीडी के लिए सीवीएन-ई41ए बाध्यकारी। लिगेंड को एचसी पॉलीकार्बोक्सिलेट और सीएमडी 500 डी सेंसर चिप्स पर पूर्व-स्थिर किया जाता है। कोविड -19 एस 1 सबयूनिट [पिंटो, डी एट अल.26; और बार्न्स, सी. एट अल.37] का उपयोग आरबीडी स्थिरीकरण के लिए किया जाता है। प्रवाह दर: 30 μL / min, 25 ° C; प्लॉट किया गया कच्चा डेटा। इसकी तुलना में, 1: 200 के कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ आरबीडी के लिए मानव रक्त सीरम एंटीबॉडी के बंधन को चित्रित किया गया है। (ग) सीवी-एन डब्ल्यूटी की एसपीआर परख एस ग्लाइकोप्रोटीन से जुड़ी हुई है जिसे सीवी-एन को पकड़ने के लिए 400 μRIU के प्रतिक्रिया स्तर तक स्थिर किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यह पहले दिखाया गया है कि एकल एल के साथ मोनोमेरिक सीवी-एन पर्याप्त रूप से जीपी 120 को बांध नहीं सकता है, लेकिन सीवी-एन की न्यूट्रलाइजेशन क्षमता के लिए दो कार्बोहाइड्रेट-बाइंडिंग साइटों की क्रॉस-लिंकिंग की आवश्यकता होती है और मुख्य रूप से 2 एच12,19 के साथ कार्यात्मक होने के लिए डिमराइजेशन द्वारा बहाल किया जाता है। इसलिए, एक मोनोमेरिक उत्परिवर्ती सीवीएन-ई 41 ए व्यक्त किया जाता है, जिसे छद्म-डोमेन बी को अस्थिर करने का संदेह है या दूसरे डोमेन ए के साथ कनेक्टिविटी को बाधित कर सकता है, जैसे कि सीवी-एन डब्ल्यूटी में पाया जाता है। यद्यपि 605-680 μM विश्लेषण सांद्रता के लिए SPR प्रतिक्रिया क्रमशः CV-N WT और E41A बाइंडिंग के लिए उच्च प्रतिक्रिया इकाइयों और विशिष्ट SPR सेंसरग्राम में परिणाम देती है, उत्परिवर्ती पतला होने पर अस्थिर होता है (चित्रा 5)।

पूरक चित्रा 1: इन्फ्लूएंजा एचए टॉप के हिस्से के रूप में डीएम मिमिक्री को कैप्चर करने के लिए एसपीआर सेंसरग्राम। स्क्रीनशॉट: एसपीआर डेटा प्लॉट एसपीआर सेंसर चिप सीएमडी 500 डी पर डीएम के स्थिरीकरण के लिए एसपीआर रन प्रोटोकॉल दिखाता है, जिसे 500 एनएम कार्बोक्सीमिथाइल डेक्सट्रान हाइड्रोगेल के साथ लेपित किया जाता है और उच्च लिगैंड घनत्व पर कम आणविक भार विश्लेषणों के कैनेटीक्स विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। सेंसरचिप्स को सीधे एमरसन तेल के साथ डिटेक्टर पर लगाया जाता है और तीन-पोर्ट प्रवाह सेल के नीचे तय किया जाता है। 1 एम इथेनॉलमाइन एचसीएल पीएच 8.5 के साथ सक्रिय चिप की सतह को बुझाने के बाद, सीवीएन 2 को दो बार इंजेक्ट किया जाता है (एकाग्रता = 1 μM और 2 μM, क्रमशः)। बैंगनी: प्रवाह सेल 1 और प्रवाह सेल 2 के बीच अंतर; ब्लू: फ्लो सेल 1: 3000-4000 माइक्रो-अपवर्तक सूचकांक इकाइयां (μRIU) लिगैंड डीएम के 400 एनएम समाधान से एक सक्रिय कार्बोक्सिलेटेड सतह पर लेपित होती हैं। लाल: संदर्भ प्रवाह सेल 2. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: मैनुअल एचए-कार्यात्मक सीएमडी 500 डी सेंसर चिप पर चलता है जो डिमेरिक सीवीएन 2 एल 0-वी 5, वी 2, और सीवीएन 2 एल 0 के बंधन को दर्शाता है। 30-50 μL/min से प्रवाह दर को बढ़ाने पर, CVN2L0 और डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड वेरिएंट को His-tag के साथ व्यक्त किया जाता है और Ni-NTA पर शुद्ध किया जाता है और मध्य-μM-रेंज में इंजेक्ट किया जाता है और 3 मिनट के एसोसिएशन चरण और 2 मिनट के पृथक्करण चरण के साथ HA से बांधने के लिए परीक्षण किया जाता है। इंजेक्शन वी 5 (15 μM), V2 (2.4 μM), 0 μM, CVN2L0 एक सूमो-संलयन प्रोटीन (1 μM) और CVN2L0 (2 μM) से उप-क्लोन हैं। शारीरिक पीएच पर रनिंग बफर का उपयोग 25 डिग्री सेल्सियस पर सभी प्रयोगों के लिए किया जाता है। सिस्टम में इंजेक्शन से पहले सभी समाधानों को डिगैस और फ़िल्टर किया जाता है (0.2 μm)। बैंगनी: प्रवाह सेल 1 और प्रवाह सेल 2 के बीच अंतर; प्रतिक्रिया 0.2 सेकंड के अंतराल पर दर्ज की जाती है। नीला: प्रवाह सेल 1: 2540 μRIU HA। लाल: संदर्भ प्रवाह सेल 2. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: सीवीएन 2 एचए के लिए बाध्यकारी। जब वक्र ऑटो-संरेखित होते हैं तो सेंसरग्राम का विश्लेषण। (ए) सेंसरग्राम स्क्रबर सॉफ्टवेयर (बाएं) का उपयोग करके शून्य और संरेखित होते हैं और बाध्यकारी समताप रेखाएं बाध्य विश्लेषणों (दाएं) के लिए एकाग्रता-निर्भर प्रतिक्रिया वक्र दिखाती हैं। (बी) बाध्यकारी समताप प्रतिशत क्षमता में व्यक्त किया गया है। (सी) कम्प्यूटेशनल रूप से फिट सैद्धांतिक संघ और पृथक्करण वक्र। (डी) फिट किए गए वक्रों के बिना एसपीआर सेंसरग्राम पर कैनेटीक्स डेटा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 4: सीवीएन 2 एचए के लिए बाध्यकारी। जब वक्र मैन्युअल रूप से संरेखित होते हैं तो सेंसरग्राम का विश्लेषण। (ए) सेंसरग्राम स्क्रबर सॉफ्टवेयर (बाएं) का उपयोग करके शून्य और संरेखित होते हैं और बाध्यकारी समताप रेखाएं बाध्य विश्लेषणों (दाएं) के लिए एकाग्रता-निर्भर प्रतिक्रिया वक्र दिखाती हैं। (बी) बाध्यकारी समताप प्रतिशत क्षमता में व्यक्त किया गया है। (सी) कम्प्यूटेशनल रूप से फिट सैद्धांतिक संघ और पृथक्करण वक्र। (डी) फिट किए गए वक्रों के बिना एसपीआर सेंसरग्राम पर कैनेटीक्स डेटा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: लैंगमुइर 1: 1 बाइंडिंग मॉडल का उपयोग करके सीवीएन 2 एल 0 और सिस-साइस बॉन्ड वेरिएंट वी 2, वी 4 और वी 5 को एचए में बांधने के लिए एसपीआर सेंसरग्राम से प्राप्त काइनेटिक डेटा। KD [M] = koff/kon या kd/ka। सभी डेटा HBS-EP (+) बफर में 25 °C पर उत्पन्न होता है: कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सीवी-एन की बाध्यकारी आत्मीयता कार्यात्मक बाइंडिंग साइटों की संख्या के साथ सहसंबद्ध है [डोमेन बी पर 2 एच, और डोमेन (एस) ए पर 2 एल जब डोमेन-स्वैप्ड डिमर के रूप में इंजीनियर किया जाता है]। परिवर्तित बाइंडिंग एफिनिटी (CVN2L0-V2, CV-N का एक होमोडिमेरिक स्थिर तह जिसमें एक डाइसल्फ़ाइड ब्रिज नॉक-आउट शामिल है) वाला एक प्रकार ई. कोलाई में व्यक्त किया जाता है, शुद्ध किया जाता है, और SPR10 का उपयोग करके HA-प्रोटीन (H3N2) से जुड़ने के लिए सकारात्मक रूप से परीक्षण किया जाता है, और H या L कार्बोहाइड्रेट-बाइंडिंग साइटों और KD1 = 49 nM और KD2 = 8 μM38 के साथ HA को बांधने पर एक संवहन परिवर्तन दिखाता है। . चूंकि सीवीएन 2 में ग्लाइकन-टारगेटिंग पॉकेट के पास डाइसल्फ़ाइड पुलों की संख्या 4 से घटकर 2 हो गई, एचए प्रोटीन के लिए बाध्यकारी संबंध कम हो गया (आंकड़े 3 बी-डी और पूरक तालिका 1)। डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड वेरिएंट को साइस को प्रतिस्थापित करके और ध्रुवीय अवशेष जोड़े ग्लू - एआरजी को थोड़ा कम स्थिरता के साथ सम्मिलित करके बनाया जाता है। वेरिएंट अन्यथा एक ही अणु का प्रतिनिधित्व करते हैं, और चार बाध्यकारी साइटें कार्यात्मक हैं, हालांकि चिप पर मल्टीसाइट बाइंडिंग दो डाइसल्फ़ाइड प्रतिस्थापन के आधार पर सभी वेरिएंट के लिए प्रभावित होती है। दो उच्च-आत्मीयता बाइंडिंग पॉकेट में दोनों डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड का एक गैर-ध्रुवीय प्रतिस्थापन संस्करण CVN2L0-V3 बनाता है, जो सक्रिय रूप से एचए-पेप्टाइड को इसके मोनोमैनोसिलेटेड और डाइमैनोसिलेटेड दोनों रूपों में बांधता है। CVN2L0-V3 के साथ बातचीत की पुष्टि माइक्रोमोलर सांद्रता और एसटीडी-एनएमआर के माध्यम से समाधान में सिंथेटिक पेप्टाइड्स (एमएम और डीएम) के साथ बंधन के लिए की जाती है। विशेष रूप से, एमएम के लिए सीवीएन 2 एसपीआर बाइंडिंग प्रयोग आरमैक्स की अपर्याप्त गणना, एसपीआर तकनीक की एक सामान्य कमी और स्थिर एमएम10 के लिए कमजोर बाध्यकारी समानताओं के कारण विश्लेषण योग्य नहीं हैं। इस पेप्टाइड और अन्य पेप्टाइड्स के बढ़े हुए लिगैंड घनत्व बाध्यकारी चयनात्मकता को कम करता है। एसपीआर का उपयोग करते हुए, उच्च स्थिरता के साथ डिमेरिक सीवीएन 2 एल 0 (2 एच + 2 एल) एचए के लिए मल्टीवेलेंट बाइंडिंग दिखाता है, जिसे कीट कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, और उच्च-मैनोज़ ओलिगोसैकराइड्स के लिए एकल रासायनिक रूप से इंजीनियर बायोमिमिक्री पर डिमैनोज के लिए विशिष्टता, एक बाध्यकारी मॉडल 1: 1 मानते हुए। ऑलिगो-मैनोसाइड्स के लिए बंधन आमतौर पर आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री द्वारा मापा जाता है, जिसके लिए लेक्टिन17 के खिलाफ लिगैंड की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है।

मोनोमैनोज या मैन (7) से छोटे किसी भी ग्लाइकन के लिए प्रतिस्पर्धी बंधन15 से पहले नहीं पाया गया है, जो इन ग्लाइकन मोइटीज की मान्यता में पेप्टाइड बैकबोन के साथ रासायनिक लिंकेज की भागीदारी को दर्शाता है। लक्ष्य में मैननोज-मैनोज़ लिंकेज की संख्या विविध थी, जो उच्च-आत्मीयता ग्लाइकन जेब में ट्रिप्टोफैन इंटरैक्शन को समझती थी। ट्राइज़ोल-लिंक्ड मोनोमैनोज या ट्रायज़ोल-लिंक्ड डाइमैनोज़ के साथ पेप्टाइड्स के संशोधन का प्रकार केडी मानों को निर्धारित कर सकता है, विशेष रूप से एच के लिए। सीवीएन 2 एल 0 (2 एच + 2 एल) और सीवीएन 2 एल 0-वी 2 (1 एच + 2 एल) की डीएम सेबांधने के संबंध में, के ऑफ डीएम बनाम एचए 10 से सीवीएन 2 एल 0-वी 2 पृथक्करण से अधिकतम10 गुना अधिक है। गतिज दर स्थिरांक को मापने के अलावा, एसपीआर वास्तव में संतुलन तक पहुंचने के बिना बहुत धीरे-धीरे संतुलन प्रणालियों के लिए संतुलन स्थिरांक का अनुमान लगाने की अनुमति देता है (तालिका 1)। इसके विपरीत, kon डोमेन-स्वैप किए गए CVN2L0 और इसके डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड वेरिएंट (V2, V4, और V5) के सभी बाइंडिंग कर्व्स के लिए HA (पूरक तालिका 1), या DM के लिए अच्छे सापेक्ष प्रतिक्रिया मानों को व्यक्त करता है, जबकि पृथक्करण दर स्थिर k off V4 और V5 के लिए तेजी से ऑफ-रेटदिखाता है, दो कार्यात्मक L वाले दो वेरिएंट, और DM से संबंधित गैर-विश्लेषण योग्य KD के साथ V4 (आंकड़े 4B) ). डोमेन बी को एच और डोमेन ए को संबंधित एल असाइन करना एक पिछली खोज है जो डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड वेरिएंट के लिए एसपीआर में विभिन्न बाध्यकारी समानताओं को प्रकट करने का आधार है, जो एचए18,28 के लिए निर्दिष्ट है।

एसपीआर बायोमेडिकल रिसर्च 35 में बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन विश्लेषण के लिएअग्रणी उपकरणों में से एक है। यदि एसपीआर उपकरण में थोक विश्लेषण एकाग्रता का एक विशिष्ट, समयबद्ध नियंत्रण संभव है, तो मैक्रोमोलेक्यूल्स के बीच बाध्यकारी प्रगति के कैनेटीक्स का मात्रात्मक मूल्यांकन संभव है, जिसमें बहु-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स 39 का विश्लेषण करने मेंबढ़ती रुचि है। इसके उपयोग में चुनौती व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले कार्बोक्सीमिथाइल डेक्सट्रान, या एचसी पॉलीकार्बोक्सिलेट हाइड्रोगेल सतह पर इंटरैक्शन घटकों में से एक की नियंत्रित स्थिति है, जो छोटे और बड़े बायोमोलेक्यूल्स को पकड़ती है। चिप की सतह के स्थिरीकरण और बाध्यकारी क्षमता को अनुकूलित करने के लिए, स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन सैंडविच स्थिरीकरण और प्रोटीन के माध्यम से स्थिरीकरण एक एंटी-हिज एंटीबॉडी के लिए हिज-टैगउपलब्ध हैं। प्रोटीन की बायोफिज़िकल विशेषताएं या छोटे अणुओं के कार्यात्मक समूह स्थिरीकरण परिणामों में हस्तक्षेप कर सकते हैं, लेकिन यहां वर्णित ग्लाइकोप्रोटीन और ग्लाइकोपेप्टाइड्स के साथ किसी भी कठिनाई का अनुभव किया जाता है जो ईडीसी / एनएचएस रसायन विज्ञान के माध्यम से सहसंयोजक रूप से बंधे होते हैं। स्थिर ग्लाइकेन्स, या तो ग्लाइकोप्रोटीन या सिंथेटिक समरूप रूप से मोनो- या डिमैनोसिलेटेड ग्लाइकोपेप्टाइड्स, का उपयोग विभिन्न इंजीनियर सीवी-एन वेरिएंट को स्क्रीन करने के लिए पुन: प्रयोज्य चिप्स पर किया जाता है, और बाध्यकारी परख पूरी तरह से शुद्ध और पुनः संयोजक रूप से व्यक्त लेक्टिन पर लागू होते हैं। इंजेक्शन प्रोटीन समाधान में अशुद्धियां एसपीआर चैनल सिस्टम को नुकसान पहुंचा रही हैं। यद्यपि इस अध्ययन में एक इन विट्रो सिस्टम पर प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है, वायरल स्पाइक्स पर ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न को इस छोटे मॉडल प्रोटीन की प्रत्येक विश्लेषण एकाग्रता द्वारा चुनिंदा रूप से पहचाना जा सकता है क्योंकि अनुकूलित द्रव्यमान हस्तांतरण सीमा36 के साथ समय के साथ इंजेक्शन दिया जाता है। सीवी-एन का आकार ~ 11 केडीए है और वायरल स्पाइक प्रोटीन के लिए इसके बंधन के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एसपीआर डेटा का समर्थन करता है।

उच्च-मैनोज़ ग्लाइकेन्स के लिए सीवी-एन की बाध्यकारी विशिष्टता की पुष्टि संरचनात्मक रूप से कार्यात्मक ग्लाइकेन्स और मोनो-मैनोसिलेटेड पेप्टाइड से जुड़ने के बजाय डायमैनोसिलेटेड पेप्टाइड मिमेटिक के साथ द्विसंयोजक बाध्यकारी बातचीत द्वारा की जाती है। बिंदु उत्परिवर्तन ग्लू 41अला के साथ एक संस्करण मोनोमेरिक 101-अवशेष प्रोटीन को व्यक्त करता है जिसमें प्रत्येक प्रोटोमर पर दो परस्पर जुड़े कार्बोहाइड्रेट-बाध्यकारी साइटें होती हैं। इसलिए, यह उत्परिवर्तन साइट उच्च और निम्न-आत्मीयता कार्बोहाइड्रेट साइटों के बीच एक संपर्क अवशेष को समाप्त कर देती है और एन-एसिटाइल-डी-ग्लूकोसामाइन के लिए आणविक बाध्यकारी शक्ति को कम करती है। सीवीएन-ई41ए को सार्स-सीओवी-2 स्पाइक प्रोटीन से जोड़ना, जिसमें जटिल प्रकार के एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन और ओ-ग्लाइकोसिलेशन होते हैं, एसपीआर में हासिल किया जाता है, लेकिन इस स्पाइक के लिए सीवी-एन बाइंडिंग शारीरिक प्रासंगिकता के बिना स्पाइक प्रोटीन और आरबीडी दोनों के लिए है, जैसा कि माइक्रोमोलर सांद्रता (चित्रा 4,5) पर मापा जाता है।

इस अध्ययन में विकसित और उत्पन्न मैनोसिलेटेड पेप्टाइड्स का उपयोग एसपीआर और एनएमआर द्वारा एंटीवायरल एजेंटों की बाध्यकारी विशेषताओं को स्क्रीन करने के लिए प्रोटीन मचानों के रूप में किया जाता है, क्योंकि वे परिभाषित अमीनो एसिड अनुक्रम10 से जुड़े कार्बोहाइड्रेट-बाध्यकारी परख के लिए अपरिवर्तनीय लिगेंड का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, एसटीडी-एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी एक लेबल-मुक्त तकनीक है, जैसे कि एसपीआर, जो संवहन चयन10,41 द्वारा कार्बोहाइड्रेट-बाइंडिंग के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। ऐसी सेटिंग्स में, एसटीडी-एनएमआर विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों मेंकेडी के बंधन, एपिटोप मैपिंग और प्रत्यक्ष निर्धारण के माध्यम से बायोएक्टिव लिगेंड की पहचान करने के लिए यौगिकों की एक बड़ी लाइब्रेरी के लिए तेजी से स्क्रीनिंग विधियों के विकास की अनुमति देता है। शून्य संतृप्ति समय41,42 की सीमा पर एसटीडी मानों का उपयोग करके प्रोटीन-लिगैंड एसोसिएशन वक्र का विश्लेषण करके सटीककेडी मान प्राप्त किए जा सकते हैं। इसलिए, एसटीडी-एनएमआर विधि द्वारा प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन की पूछताछ पूरी की गई थी, लेकिन केडीकी गणना एसपीआर प्रणाली पर की जाती है।

ह्यूमन 2019-एनसीओवी (वुहान-हू-1-2019 नॉवल कोरोनावायरस) का अनुमान 11 (18 में से) अनुमानित एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन साइटों से सार्स-सीओवी43 से है। पैराटोप मैपिंग से मेजबान-व्युत्पन्न एन-ग्लाइकेन्स के साथ कुछ परस्पर क्रियाओं का पता चलता है और एपिटोप संपर्कों में एंटीबॉडी दैहिक हाइपरम्यूटेशन के नगण्य योगदानहोते हैं। एंटीवायरल लेक्टिन की क्षमता और इन्फ्लूएंजा एचए ग्लाइकोप्रोटीन पर अत्यधिक संरक्षित एपिटोप्स को बांधने के लिए एंटीबॉडी को मोटे तौर पर बेअसर करना निवारक और चिकित्सीय उपयोग के लिए टीकों के तर्कसंगत डिजाइन के लिए सबसे महत्वपूर्ण है। हालांकि, मेजबान रिसेप्टर बाइंडिंग साइट के आसपास प्रतिरक्षा-दमनकारी एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है। डेटा संक्रमण के दौरान प्राप्त एंटीबॉडी से बचने के लिए वायरस स्पाइक प्रोटीन की क्षमता या गैर-इम्युनोजेनिक सीवी-एन को बांधने की क्षमता में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है और इस प्रकार नए अनुकूलित एंटीवायरल सीवीएन 2 वेरिएंट के लिए संरचना-आधारित कम्प्यूटेशनल प्रोटीन डिजाइन का मार्गदर्शन कर सकता है। इसके विपरीत, विवो में प्रभावकारक कार्यों को प्राप्त करने के लिए ग्लाइकोसिलेटेड एफसी एमिनो एसिड उत्परिवर्ती का अपने रिसेप्टर से संबंध, ग्लाइकोसिलेशन साइटों की संरचना का उपयोग करता है, और इसमें शामिल ग्लाइकेन की संख्या, इसलिए बंधन आत्मीयता के लिए महत्वपूर्ण हो सकती है लेकिन न्यूट्रलाइजेशन क्षमता के लिए निर्धारित नहीं की जा सकती है।

एक साथ लिया गया, कम रोटामर्स को अकेले प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की तुलना में कम्प्यूटेशनल प्रोटीन डिजाइन द्वारा प्रोटीन से कार्बोहाइड्रेट लिगेंड को बांधने की भविष्यवाणी की जाती है। डोमेन-स्वैप ्ड सीवीएन 2, हालांकि, कार्बोहाइड्रेट-बाइंडिंग साइटों की विभिन्न संख्याओं को वहन करते हुए, एच के लिए जिम्मेदार विभिन्न बाध्यकारी-समानताओं को प्रकट करने और वायरल लिफाफा स्पाइक्स और न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी (एनएबी) पर ऑलिगोमैनोज क्लस्टर के बीच बहुसंयोजक इंटरैक्शन बनाने के लिए आवश्यक स्थिरता और लचीलापन प्रदान करता है, इस प्रकार अवरोध परख को प्रयोगात्मक रूप से मान्य करने की अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक ने टीयू वीन में जैव प्रौद्योगिकी और माइक्रोबायोलॉजी विभाग और चिकित्सा विभाग III, वियना मेडिकल यूनिवर्सिटी में नेफ्रोलॉजी और डायलिसिस विभाग से डॉ क्रिश्चियन डर्नटल को स्वीकार किया, विशेष रूप से तकनीकी और वैज्ञानिक सहायता के लिए डॉ मार्कस वाहरमैन। स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्राकृतिक संसाधन और जीवन विज्ञान विश्वविद्यालय (बीओकेयू) वियना में जैव प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक एसपीआर बाध्यकारी परख करने पर सहायक वैज्ञानिक चर्चाओं के लिए जर्मनी के ड्यूसेलडोर्फ में ज़ैनटेक बायोएनालिटिक्स के डॉ निको डैंकबार को अपनी गहरी स्वीकृति व्यक्त करना चाहता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta primeplus Cytiva
Amicon tubes Merck C7715
Ampillicin Sigma-Aldrich A5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge Beckman Coulter B06320
Cell spreader Sigma-Aldrich HS86655 silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA Oligos Sigma-Aldrich OLIGO
Custom Gensynthesis GenScript #1390661  cloning vector: pET27b(+) 
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL Thermo Scientific 50-105-5354
Dionex UlitMate 3000 Thermo Scientific IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL)  Fisher Scientific ER1701
DTT Merck DTT-RO
EDC Merck 39391
EDTA Merck E9884
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120086
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge Sigma-Aldrich Z606235
Ethanol Merck 51976
Ethanolamine HCl Merck E6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack Corning 352057
Glucose Merck G8270
Glycine HCl Merck 55097
HA H3 protein Abcam ab69751
HEPES Merck H3375
His-select Ni2+ Merck H0537
Imidazole Merck I2399
IPTG Merck I6758
Kanamycin A Sigma-Aldrich K1377
Kromasil 300-5-C4 Nouryon
LB agar Merck 52062
LB agar Merck 19344
LB Lennox Merck L3022
Lysozyme Merck 10837059001
Magnesium chloride Merck M8266
Magnesium sulfate Merck M7506
NaH2P04 Merck S0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer Thermo Scientific ND2000CLAPTOP
NaOH Merck S5881
NHS Merck 130672
NZ amine (casein hydrolysate) Merck C0626
PBS Merck 806552
PD MidiTrap G-10 Sigma-Aldrich GE28-9180-11
Peptone Merck 70171
pET11a Merck Millipore (Novagen) 69436 
PMSF Merck PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) Qiagen 27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9 Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System Reichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis Reichert
SDS Merck 11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid Stratagene #200518
Sodim chloride Merck S9888
Sodium acetate.Trihydrate Merck 236500
SPR sensor chip C19RBDHC30M XanTec bioanalytics SCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500D XanTec bioanalytics SCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes Thermo Scientific 101R20
TBS Merck T5912 10x, solution
Triton-X100 Merck T8787
Tryptone Merck 93657
Tween20 Merck P1379
Vortex-Genie 2 Mixer Merck Z258423
X-gal Merck XGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent Cells Stratagene #200236
Yeast extract Merck Y1625

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References

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Maier, I. Engineering Antiviral… More

Maier, I. Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (184), e63541, doi:10.3791/63541 (2022).

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