Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Engineering antivirale middelen via Surface Plasmon Resonance

Published: June 14, 2022 doi: 10.3791/63541
Automatic Translation
1,2
1Department of Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 2Department of General Surgery, Medical University of Vienna

Summary

Het huidige protocol beschrijft nieuwe hulpmiddelen voor SPR-bindingstests om CV-N-binding aan HA, S-glycoproteïne, gerelateerde hybride-type glycanen en oligosacchariden met een hoog mannosegehalte te onderzoeken. SPR wordt gebruikt om de KD te bepalen voor het binden van dimerische of monomere CV-N aan deze glycanen.

Abstract

Oppervlakteplasmonresonantie (SPR) wordt gebruikt om hemagglutinine (HA) binding aan domein-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimeer te meten en om interacties tussen gemannosyleerde peptiden en CV-N's hoge affiniteit bindingsplaats te monitoren. Virus enveloppen spikes gp120, HA en Ebola glycoproteïne (GP) 1,2 zijn gemeld om zowel hoge als lage affiniteit bindingsplaatsen op dimerische CVN2 te binden. Gedimannosyleerd HA-peptide is ook gebonden aan de twee bindingsplaatsen met lage affiniteit aan een gemanipuleerd molecuul van CVN2, dat een hoge affiniteitsplaats voor het respectieve ligand draagt en gemuteerd is om een stabiliserende disulfidebinding in de koolhydraatbindende pocket te vervangen, waardoor multivalente binding wordt bevestigd. HA-binding wordt aangetoond aan één hoge-affiniteitsbindingsplaats van pseudo-antilichaam CVN2 bij een dissociatieconstante (KD) van 275 nM die het humaan immunodeficiëntievirus type 1 (HIV-1) verder neutraliseert door oligomerisatie. Het correleren van het aantal disulfidebruggen in domein-swapped CVN2, die worden verminderd van 4 naar 2 door cystines te vervangen door polaire residuparen van glutaminezuur en arginine, resulteert in verminderde bindingsaffiniteit voor HA. Een van de sterkste interacties is Ebola GP1,2 gebonden door CVN2 met twee bindingsplaatsen met hoge affiniteit in het lagere nanomolaire bereik met behulp van het enveloppeglycaan zonder een transmembraandomein. In deze studie wordt de binding van het multispecifieke monomere CV-N aan ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoproteïne gemeten bij KD = 18,6 μM in vergelijking met nanomolair KD aan die andere viruspieken, en via het receptorbindende domein in het midden-μ-molaire bereik.

Introduction

Tetherin-geassocieerde antivirale activiteit wordt geïnduceerd door interferon-α, en het omvat op eiwitten gebaseerde tethers, die leiden tot het behoud van volledig gevormde virionen op geïnfecteerde celoppervlakken1. De noodzaak van tetherineglycosylering bij de remming van virusafgifte blijft onzeker, wat impliceert dat glycosylatiepatronen op recombinant tot expressie gebrachte glycanen voor in vitro studies 1,2, die afhankelijk is van de conformatie van (in het geval van influenzavirus) oppervlakte-uitgedrukt influenza hemagglutinine HA 3,4 . Er is opgemerkt dat modificatie van oligosaccharide gebonden aan N-gebonden glycosylering voldoende is voor tetherin-gemedieerde beperking van HIV type-1 release2, terwijl dimerisatie een essentiële rol speelt bij het voorkomen van virusafgifte, waarbij het transmembraandomein of glycosyl-fosfatidyl-inositol (GPI)-anker betrokken is voor het aanbinden van de ontluikende virionen5 . Unieke kenmerken worden beschreven voor menselijke en muriene tetherin om meerdere omhulde virussen, retrovirussen en filovirussen te blokkeren. BST-2/tetherin is een interferon-induceerbaar antiviraal eiwit van de aangeboren immuniteit 1,6, dat werkt met breedspectrum antivirale activiteit en wordt tegengewerkt door envelop glycoproteïnen5 om tetherine te transloceren of de structuur van tetherinte verstoren 6. Bijvoorbeeld, oppervlakte-uitgedrukte envelop glycoproteïne HA en neuraminidase op influenza A-virus zijn bekend voor tetherine-antagonisme op een stamspecifieke manier7, waardoor de herkenning van gastheerreceptorbindingsplaatsenwordt vergemakkelijkt 8. Glycaan-gerichte antilichamen worden bestudeerd in de stoichiometrie van hun interacties met de snel aanpassende glycaanschilden op HA, wat resulteert in bindingsaffiniteit met influenza A H3N2 en H1N1 subtypen4.

Om de bindingsmechanismen tussen antivirale middelen en virusenveloppieken, d.w.z. koolhydraatliganden, en complementaire immunologische en spectroscopische methoden op te helderen, worden mono-, di- en tri-mannose moieties chemisch gesynthetiseerd. De gemannosyleerde peptiden worden gemaakt via azidoglycosylering van glycosyl {beta}-peracetaten tot 1,2-trans glycosylazidentransformatie9, waarbij de typisch aangetroffen N-acetylglucosamine en hoog-mannose oligosacchariden op het oppervlak van levensbedreigende virussen worden nagebootst. Triazol bio-isotopen worden gebruikt om verbanden na te bootsen die het gemannosyleerde residu van HA-peptide10 vormen en sitespecifieke interacties met antivirale CV-N-derivaten rond de tweede N-gebonden glycosylatieplek op het HA-hoofddomein (HA-top met 4 N-gebonden glycanen N54, N97, N181, N301) 8,11,12 . Interacties tussen glutaminezuur (Glu) en arginine (Arg) en de resulterende helix dipool manifesteerden een goede stabiliteit van zowel modelpeptiden als eiwitten, maar worden gevisualiseerd met behulp van SPR. In vergelijking met het herkennen van een enkele chemisch gesynthetiseerde glycosylatieplaats op HA10 door de receptorbinding op de glycaanmoieties direct te remmen, wordt aangetoond dat een hogere affiniteit van een vier-site gemuteerde Fc-structuur naar zijn receptor effectorfuncties in vivo oproept, waardoor de niet-gerelateerde samenstelling van N-gebonden glycanen die aan Fc-mutant zijn gehecht, mechanistisch wordt bepaald13.

CV-N toont antivirale activiteit tegen HIV14,15, influenza16 en ebolavirus, dat wordt gemedieerd door nanomolaire binding aan oligosaccharidemodificaties met een hoog mannosegehalte op enveloppe spike-eiwitten 12,17,18,19. Influenza HA binding aan één koolhydraatbindende plaats met hoge affiniteit (H) in CV-N of twee H's in covalent gebonden dimerisch CVN2 wordt bepaald om evenwichtsdissociatieconstanten (KD) = 5,7 nM (figuur 1A) en KD = 2,7 nM te hebben. Zowel CV-N als CVN2 herbergen nog een of twee koolhydraatbindplaatsen met lage affiniteit (L)s 12,17,20,21. Ebola GP1,2 bindt aan 2H cvn2 met affiniteiten in het lagere nanomolaire bereik (KD = 26 nM). CV-N WT binding aan Ebola GP1,2 en HA vertoont affiniteiten van KD = 34 nM tot KD = 5,7 nM (A/New York/55/04)12. Lectines, zoals CV-N, die zich specifiek richten op glycanen met een hoog mannosegehalte op de virale enveloppen, remmen de replicatie van hepatitis C-virus, SARS-CoV, herpesvirus, Marburg-virus en mazelenvirus22 verder.

Het kleine CV-N-molecuul is al meer dan 20 jaar grondig bestudeerd omdat het functionaliseert om een breed scala aan virussen te binden om virale binnenkomst te remmen16,18. Structurele analyses en bindingsaffiniteitstests wijzen op cross-linking van twee L's in een domein-swapped CVN2-dimeer door bivalente binding in het micromolaire bereik om de aviditeit naar virale envelop glycoproteïnen te verbeteren10,19. Selectieve binding van Manα1-2Manα op Man(8) D1D3-armen en Man(9) bestaat uit twee bindingsplaatsen van verschillende affiniteiten op tegengestelde eiwitprotomeren20, waardoor nanomolaire bindingsaffiniteiten worden bereikt (figuur 1B). Cvn2 wordt dus beschouwd als een pseudo-antilichaam met betrekking tot de toepassing ervan om epitopen te binden op HIV gp120, vergelijkbaar met virusneutraliserende antilichamen17. Hierin is de auteur geïnteresseerd in het onderzoeken van de potentiële binding van CVN2 aan de SARS-CoV-2-piek via zijn receptorbindende domein (RBD). Bindingscurven van geïmmobiliseerd humaan angiotensine-converterend enzym (ACE)-2 met de SARS-CoV-2 RBD resulteren in KD = 4,7 nM voor deze biologisch relevante bindingsinteractie23.

Daarentegen herkennen geselecteerde immunoglobulineklassen specifieke en consistente structurele eiwitpatronen, die een substraat geven voor affiniteitsrijping in de membraangeankerde HA-regio's24. CV-N vertoont zeer krachtige activiteit in bijna alle influenza A- en B-virussen16, en het is een breed neutraliserend antiviraal middel. Onze kennis is onvolledig over de locatie van gerichte epitopen op de stam van HA1 en HA2 die mogelijk epitopische structuren voor glycaan-targeting omvatten door sterk neutraliserende antilichamen en in vergelijking met lectinebinding25.

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van de SPR-bindingstest voor CV-N naar virus enveloppenpieken. (A) SPR-test voor CV-N binding aan ligand: HA-eiwit over de volledige lengte (90 kDa). Kinetische dataset (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) met real-time dubbele verwijzing naar influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). B) CVN2L0 variant V2 binding aan geïmmobiliseerd ligand DM binnen een concentratiebereik van 500 nM tot 16 μM. Volgorde: L-residuen worden geel gemarkeerd. H-residuen worden grijs gemarkeerd. E58 en R73 zijn een vervanging voor cysteines in het wildtype eiwit en maken van V2 een stabiele eiwitplooi met drie in plaats van vier disulfide bindingen Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Terwijl het glycaanschild op het membraan-distale HA-bovenste deel een hoge affiniteitsbinding aan CV-N12 induceert, is CVN2-binding aan HA naast een disulfidebrug van het HA-bovenste deel verder waargenomen op de locaties met lage affiniteit10,12. Verschillende polaire interacties en interactieplaatsen worden geïdentificeerd in koolhydraatbinding door CV-N. Deze interacties worden geverifieerd door knock-outvarianten in de bindingsplaats te genereren om bindingsaffiniteiten te correleren met in silico voorspelde glycosylatie12. Het project heeft dus tot doel om eerder geteste chemisch gemannosyleerde HA-peptiden in bindingsaffiniteit en specificiteit te vergelijken met korte peptidesequenties van SARS-gerelateerde 2019-nCoV-spikes en SARS-CoV-2, van nature voorkomend gemodificeerd door een klein aantal verschillende N-gebonden glycosylatieplaatsen en O-gebonden glycosylering. Met behulp van cryo-elektronenmicroscopie en bindingstests rapporteren Pinto en collega's een monoklonaal antilichaam, S309, dat mogelijk een epitoop herkent op SARS-CoV-2 spike-eiwit dat een geconserveerd glycaan bevat in het Sarbecovirus-subgenus, zonder te concurreren met receptoraanhechting26. Het protocol van deze studie beschrijft hoe het ontwerpen, tot expressie brengen en karakteriseren van CV-N-varianten belangrijk is om te bestuderen hoe CV-N en CVN2 binden aan geglycosyleerde eiwitten en synthetische gemannosyleerde peptiden met behulp van de SPR-technologie10,12.

Tandem-gebonden dimeer CVN2L027 en bindingsplaatsvarianten (V2-V5) worden recombinant uitgedrukt en varianten zijn met disulfidebindingsvervangingen (C58E en C73R) (figuur 2A). Ook wordt een mutant met een single-point mutatie E41A voorbereid omdat deze positie is gezien als een intermoleculair kruiscontacterend residu. Deze mutant is een ander interessant molecuul voor SPR-bindingsmetingen tussen het lectine en de oligosacchariden met een hoog mannosegehalte die bindingsdomeinen ontcijferen en maakt vergelijking met de dimerische vorm mogelijk. De domein-swapped kristalstructuur van CVN2 toont een flexibele linker, die zich uitstrekt tussen 49 en 54 residuen. De twee domeinen kunnen als starre lichamen rond het scharnier blijven bewegen en ofwel een monomeer ontwikkelen door intramoleculaire domeininteracties (domein A -residuen 1-39;90-101- met domein B -residuen 40-89) of een dimeer door intermoleculaire domeinruil [domein A (van het eerste monomeer) met domein B (van de tweede), en domein B (van het eerste monomeer) met domein A (van de tweede kopie)]. Er zijn geen nauwe interacties tussen de A- en B-domeinen van de twee protomeren, behalve Glu4128. Het gen voor CV-N kan worden ontwikkeld met behulp van een repetitieve PCR-methode met 40-mer gesynthetiseerdeoligo's 29 en wordt vervolgens gesubcloned in de NdeI- en BamHI-sites van pET11a voor transformatie (elektroporatie) in elektrocompetente cellen zoals beschreven door Keeffe, J.R.27. Het eiwit, dat wordt gebruikt voor het bereiken van de respectieve kristalstructuur (PDB ID 3S3Y), bevat een N-terminale 6-histidinezuiveringstag gevolgd door een Factor Xa-proteasesplitsingsplaats. Site-gerichte mutagenese wordt gebruikt om puntmutaties te maken, codons te schakelen en enkele of meerdere basen of codons in te brengen of te verwijderen voor aminozuuruitwisseling. Deze transformaties geven van onschatbare waarde inzicht in de eiwitfunctie en -structuur. Recombinant uitgedrukt en gezuiverd CV-N, CVN2 en CVN3 zijn biofysisch goed bestudeerd 20,21,27, zijn goedkoop te produceren en worden daarom gebruikt om bindingstests te karakteriseren voor glycanen die zijn geïmmobiliseerd op SPR-sensorchips. Conventionele enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) biedt minder reproduceerbaarheid met betrekking tot de immobilisatietechniek van glycaanliganden en transformeert real-time binding van verschillende bindingsplaatsvarianten, die wordt getoond voor SPR, in eindpunttests.

Bindingsaffiniteitsvariant CVN2L0-V2 (een intacte vouw van homodimere CV-N met een disulfidebrugsubstitutie10) wordt uitgedrukt met een His-tag in Escherichia coli (E. coli), gezuiverd over Ni-NTA-kolom met affiniteitschromatografie en getest op binding aan HA (H3N2), monomannosylated HA-peptide en gediamanosyleerd HA-peptide met behulp van SPR. Chemisch gemannosyleerde peptiden, of HA- en S-eiwit, zijn allemaal liganden en amine gekoppeld aan het hydrofiele chipoppervlak via reactieve esters of biotine-streptavidin eiwittechnologie. Dezelfde procedure van sequentiële runs wordt toegepast op die liganden, waarbij verschillende verdunningen van CV-N en varianten van CV-N (en CVN2) worden geïnjecteerd om kinetische informatie te verkrijgen voor de moleculaire interactieanalyses zoals beschreven onder30. RBD-geïmmobiliseerde SPR-sensorchip wordt gebruikt voor bindingsstudies op CV-N naar S-peptiden en affiniteiten worden vergeleken met SARS-CoV-2-binding met de menselijke ACE2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Voor deze studie is een CVN-klein ubiquitine-achtig modifier (SUMO) fusie-eiwit gebruikt in enzymgebonden immunosorbente assays in plaats van CV-N en is geschikt voor celgebaseerde assays. Recombinant influenza A-virus HA H3-eiwit over de volledige lengte wordt commercieel verkregen (zie materiaaltabel) of tot expressie gebracht in hek293-cellijnen van zoogdieren en met baculovirus geïnfecteerde insectencellen volgens standaardprotocollen12. Wuhan-1 spike eiwit komt tot expressie in hek293-cellen van zoogdieren. De synthese van monomannosylated peptide (MM) en dimannosylated peptide (DM) maakt de detectie van homogene liganden tot CVN2 en monomannosylated small molecule10 mogelijk.

1. Cv-N constructies maken

  1. Verkrijg voor elk van de CVN2-varianten en het CVN2L0-eiwit (PDB ID 3S3Y) het genconstruct met een N-terminale pelB-leidersequentie en His-tag in pET27b(+) vector uit commerciële bronnen (zie Materiaalstabel, Aanvullend bestand 1).
  2. Verkrijg CVN2L0 en zijn varianten (V2, V3, V4 en V5; Figuur 2A,C) op de achtergrond van een CVN2L0-sjabloongen bestaande uit twee verschillende DNA-sequenties voor elke CV-N-herhaling.
  3. Los het gelyofiliseerde plasmide-DNA op in steriel gedeïoniseerd gedestilleerd water (ddH2O) tot een eindconcentratie van 100 ng/μL.

2. Bereiding van LB-agar platen met plasmide DNA getransformeerde cellen

  1. Bereid kweekmedium LB-Lennox door 10 g/L pepton, 5 g/L gistextract en 5 g/L NaCl op te lossen in ddH2O (zie Materiaaltabel) en stel de pH in op 7,4. Voer de omzetting in competente E. coli BL21 (DE3) uit voor elke variant (V2-V5) met chemische methode volgens een eerder gepubliceerd rapport10.
  2. Splits de oplossing (900 μL en 100 μL), breng 100 μL over op LB-agarplaten (50 μg/ml kanamycine) en gebruik voorzichtig een steriele celverspreider. Incubeer de agarplaten een nacht bij 37 °C.

3. Klonen

  1. Subclone het gen voor CV-N in de NdeI- en BamHI-sites van pET11a (zie Materiaaltabel) voor transformatie (elektroporatie) in elektrocompetente cellen volgens referentie27.

4. Locatiegerichte mutagenese

  1. Het genereren van CVN2L029 en mutant CVN-E41A op de achtergrond van een CVN2L0-sjabloongen met twee onderscheiden DNA-sequenties voor elke CV-N-herhaling27.
  2. Maak mutaties met behulp van een site-directed mutagenese kit (zie Tabel van materialen) en specifieke mutagene primers 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcaggtcagg-3' en 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' voor het uitvoeren van de PCR31.
    1. Start een reeks monsterreacties met behulp van meerdere concentraties dubbelstrengs DNA (dsDNA) sjabloon variërend van 5-50 ng (bijv. 5, 10, 20 en 50 ng dsDNA-sjabloon). Houd de primerconcentratie constant.
      OPMERKING: De PCR-mix en het thermische cyclusprotocol worden over het algemeen gebruikt zoals beschreven in de handleiding voor de site-gerichte mutagenesekit32.
  3. Voeg het Dpn I-restrictie-enzym (1 μL, 10 U/μL, zie Materiaaltabel) toe onder de minerale olie-overlay. Meng de reacties grondig en voorzichtig, draai gedurende 1 minuut in een microcentrifuge op tafel en incubeer onmiddellijk bij 37 °C gedurende 1 uur voor het verteren van de ouderlijke supercoiled dsDNA.

5. Transformatie van bacteriële cellen

  1. Ontdooi de XL1-Blue supercompetente cellen (zie Tabel van Materialen) voorzichtig op ijs. Om elke controle- en monsterreactie om te zetten, aliquot de supercompetente cellen (50 μL) naar een vooraf gechilleerde polypropyleen buis met ronde bodem (14 ml).
    1. Breng 1 μL van het met Dpn I behandelde enkelstrengs DNA (ssDNA) over van elke controle- en monsterreactie (gemuteerd ssDNA) naar afzonderlijke aliquots van de supercompetente cellen, die de complementaire streng synthetiseren. Draai de transformatiereacties voorzichtig om de reacties gedurende 30 minuten op ijs te mengen en te incuberen.
      OPMERKING: Voordat u het met Dpn I behandelde DNA overbrengt naar de transformatiereactie, wordt aanbevolen om alle resterende minerale olie zorgvuldig uit de pipetpunt te verwijderen. Als optionele controle moet de transformatie-efficiëntie van de XL1-Blue supercompetente cellen worden gecontroleerd door 0,1 ng/μL van het pUC18-controleplasmide (1 μL) te mengen met een aliquot van 50 μL van de supercompetente cellen.
  2. Breng warmtepuls aan op de transformatiereacties bij 42 °C gedurende 45 s en plaats de reacties vervolgens gedurende 2 minuten op ijs.
    OPMERKING: De toegepaste warmtepuls is al geoptimaliseerd voor de genoemde omstandigheden in polypropyleen buizen met ronde bodem (14 ml).
  3. Voeg 0,5 ml NZY+ bouillon toe (bevattende per liter: 10 g NZ-amine (caseïnehydrolysaat), 5 g gistextract, 5 g NaCl, 12,5 ml 1 M MgCl2, 12,5 ml 1 M MgSO4, 10 ml 2 M glucose, pH 7,5 en voorverwarmd tot 42 °C) en incubeer de transformatiereacties bij 37 °C met schudden bij 225-250 tpm gedurende 1 uur. Plaat het juiste volume van elke transformatiereactie (5 μL van controleplasmidetransformatie; 250 μL van monstertransformatie) op LB-ampicilline agarplaten.
    OPMERKING: Voor de transformatiecontroles en mutagenese, spreadcellen op LB-ampicilline agar platen met 5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal, 80 μg/ml) en isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG, 20 mM) (zie Materiaaltabel). Ent 50 ml van de celculturen in met een enkele kolonie getransformeerde E. coli-cellen om gemuteerd plasmide-DNA te zuiveren voor analyses. Mutagenese wordt bevestigd door DNA-sequencing in een externe faciliteit.

6. Expressie en eiwitzuivering

  1. Voor een grootschalige kweek, ent een kleine hoeveelheid LB (met ampicilline) met een enkele kolonie van de getransformeerde plaat.
  2. Gebruik de nachtcultuur ent de expressiecultuur met additieven, zoals 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 en 20 mM glucose, waardoor de zaadcultuur verdunt tot 1/100.
    1. Kweek cellen met krachtig schudden bij 37 °C. Kweek cellen tot een Abs 600 nm tussen 0,4-0,6 (mid-log fase) voordat de cellen worden gekoeld tot 20 °C. Induceer met 1 mM IPTG en groei 's nachts.
    2. Oogst vervolgens de cellen door centrifugeren op 4.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg met een pipet.
  3. Resuspendeer de celpellet in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer en recentrifugeer bij 4.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Gooi vervolgens het supernatant weg met een pipet. Resuspenseer de resterende pellet in 10 ml lysisbuffer en incubeer de suspensie gedurende 1 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: Samenstelling van de lysisbuffer: (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 2% Triton-X100, 500 ng/ml lysozym, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 1 mM dithiothreitol, 1 mM MgCl2, pH 8, zie Materiaaltabel).
    1. Onderwerp het mengsel aan twee vries-dooicycli (-80 °C). Scheid oplosbare en onoplosbare fracties door centrifugatie bij 4.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en analyseer ze met behulp van polyacrylamidegelelektroforese (PAGE), in het bijzonder natriumdodecylsulfaat (SDS)-PAGINA33 (figuur 2B,C).
      OPMERKING: Cellen kunnen op verschillende manieren worden gelyseerd, zoals vries-dooi, ultrasoonapparaat, homogenisatie, enzymatische lysis of een combinatie van deze methoden. Zuivering van inclusielichamen wordt aanbevolen voor het verzamelen van hoge eiwitopbrengsten26.
  4. Zuiver eiwitten met behulp van Ni-NTA kolomchromatografie (zie Materiaaltabel). Laad de oplosbare fractie op een geregenereerde Ni-NTA-kraalkolom (1 ml/min). Was het systeem met TBS-buffer (50 mM Tris, 150 mM natriumchloride, pH 7,5) voordat u begint met een gradiënt (0-100% 500 mM imidazool in TBS gedurende 60 min) en het verzamelen van fracties (1 ml/min). Dialyseer de gezuiverde eiwitten voor biochemische karakterisering tegen 100 mM PBS (figuur 2C,D).
  5. U kunt ook His-Select Ni2+ affiniteitsgel (zie Materiaaltabel) gebruiken in buizen van 14 ml om zijn gelabelde recombinant tot expressie gebrachte CV-N te binden en opnieuw op te schorten in bufferoplossingen met respectievelijk 20 mM imidazool en 250 mM imidazool. Incubeer in batch gedurende ten minste 30 minuten.
    OPMERKING: Breng deze semi-gezuiverde eiwitten aan op een voorverpakte kolom voor eenmalig gebruik voor bufferuitwisseling en opschoning van biologische monsters, bijvoorbeeld koolhydraten en eiwitten, die 1-1,5 ml kunnen laden uit geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie.
  6. Breng de eiwitoplossingen over in centrifugatiebuizen met een 10 kDa cut-off filter (zie Materiaaltabel) en concentreer ze door ze gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 4.500 x g en 4 °C. Wissel voor SPR-metingen de analytoplossingen uit tot 10 mM HEPES, 150 mM natriumchloride, 3 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en 0,05% Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), zie Materiaaltabel).
    1. Voeg deze SPR-loopbuffer toe aan een verdunningsfactor van 1:10 en centrifugeer viermaal tot het oorspronkelijke volume gedurende 10 minuten bij 4.500 x g en 4 °C.
  7. Bepaal de eiwitconcentratie bij 280 nm met behulp van een NanoDrop UV-Vis spectrofotometer (zie Tabel van Materialen) op basis van de berekende extinctiecoëfficiënt (20.440 M-1 cm-1) voor het hoofdeiwit CVN2L0 met een grootte van 23.474 Da34. Gebruik PBS (100 mM, pH 7,0) of SPR-buffer als blanco en meet de eiwitconcentratie in drie verdunningsstappen (1:1, 1:10 en 1:100).

Figure 2
Figuur 2: CV-N-sequenties en expressie. (A) CVN2 zonder linker tussen elke CV-N-repeat (elk 101 aminozuren) en vier disulfidebruggen wordt uitgedrukt in pET11a-vector in E. coli. (B) Uitdrukkingen van twee onafhankelijke kolonies voor CV-N (monomeer) en CVN2 (dimeer). (C) Disulfide bindingsvarianten worden gezuiverd en geanalyseerd op SDS-PAGE. Een marker met een laag molecuulgewicht (6 μL) wordt als referentie gebruikt. WT = CVN2L0 met vier disulfidebruggen zoals aangegeven in (A). V2 is een variant met een disulfidebindingsvervanging door polaire residuen op posities 58 en 73. V3-V5 zijn varianten met twee resterende S-S-bindingen en ofwel polaire (C58E-C73R) of apolaire (C58W-C73M) vervangende aminozuren of een combinatie van deze residuepaarsubstituties. (D) HPLC-chromatogrammen van gezuiverd CVN2L0 worden geëlueerd met een stroomsnelheid van 1 ml/min met een lineaire gradiënt van 5%-65% buffer B in buffer A gedurende 30 min. Buffer A is: 0,1% (v/v) trifluorazijnzuur in ddH2O, buffer B is: 0,08% (v/v) trifluorazijnzuur in acetonitril. Eiwit wordt geanalyseerd op een hoogwaardige silicagel 300-5-C4 (150 x 4,6 mm) kolom bij 214 nm en 280 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. SPR-spectroscopie

  1. Gebruik het Dual Channel SPR-systeem (zie Materiaaltabel) met loopbuffer HBS-EP(+) en 10 mM glycine HCl pH 1,5-1,6 als regeneratiebuffer. Schakel het instrument, de ontgasser, de auto-sampler en pomp in en was het hele systeem met ddH20 gedurende 1 uur. Plaats de gebruiksklare loopbuffer in een aparte fles.
  2. Laat emersionolie op de detector vallen en monteer een glazen sensorchip (zie Materiaaltabel) gecoat met een dunne gouden film en aan de bovenzijde gefunctionaliseerd met carboxymethyldextran hydrogel rechtstreeks op de detector onder de driepoorts flowcel. Corrigeer de instelling door de bediening naar beneden te trekken.
    OPMERKING: C19RBDHC30M 200 nm streptavidin gederivatiseerde carboxymethyldextran hydrogel met een gemiddelde dichtheid van gebiotinyleerd ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus-2 RBD-eiwit, is een kant-en-klare sensorchip met het vooraf geïmmobiliseerde ligand.

8. SPR-bindingstest voor CV-N-binding aan HA, S-eiwit en RBD

  1. Immobiliseer de eiwithoudende liganden tot sensorchips volgens de onderstaande stappen.
    1. Open een uitvoeringstabel door te klikken op Formulier in de menubalk en Tabeleditor uitvoeren in de geïntegreerde SPRAutoLink-software (zie Materiaaltabel). Kies en klik op BASIC_Immobilization in de lijst met beschikbare uitvoeringstabellen en volg de stappen van de experimentele procedure op het computerscherm. De respectievelijke voorbeeldeditor die wordt gebruikt, wordt in de rechterbovenhoek weergegeven.
    2. Klik op Sample Set Editor in het gedeelte Formulier om de lijst met reagentia in te vullen voor twee racks die in de autosampler zijn geplaatst voor verdere analyses. Klik op Autosampler Direct Control als "Tool" in de menubalk om de racks naar voren of terug naar huis te brengen. Kies 4 °C als bedrijfstemperatuur.
      OPMERKING: De SPR-software maakt "SPR Instrument Direct Control" en "Pump Direct Control" mogelijk door de bijbehorende gereedschappen te selecteren, evenals autosampler-handling, en door op Formulier te klikken; ook Tabeleditor, Data-Plot of Post-Processing uitvoeren kan worden gekozen om gegevensanalyse uit te voeren. Bestanden worden direct opgeslagen in de standaardmap en geëxporteerd als scrubber.files vanuit het venster Nabewerking.
  2. Start de pomp om ddH20 te infunderen door op Tools and Pump Direct Control te klikken en registreer gegevens door op SPR Instrument Direct Control te klikken, en elke keer start in de nieuw verschijnende vensters. Plaats de koppelreagentia (stap 8.3) in injectieflacons van 300 μL, plaats ze in de autosampler-rekken en start de run-tabel door op Uitvoeren te klikken.
    OPMERKING: Chipoppervlakken zijn ofwel geconditioneerd met 10 mM glycinebuffer pH 9,0 of kunnen zijn gespoeld met 1 M natriumchloride, 0,1 M natriumboraatbuffer pH 9,0 om het carboxyl gederivatiseerde chipoppervlak te conditioneren voor EDC / NHS-activeringsmix30.
  3. Gebruik voor deze eenvoudige eiwit-eiwitinteractie de CMD500D-chip (zie Materiaaltabel) om een microbrekingsindexeenheden (μRIU) = 2500 - 3000 stroomcel met geïmmobiliseerde HA en μRIU = 400 stroomcel met spike-eiwit te genereren. Injecteer bij een infuse-debiet van 15 μL/min een waterig en gelijk mengsel van 0,4 M N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride (EDC*HCl) en 0,1 M N-hydroxysuccinimide (NHS) door de volgende opeenvolgende stappen toe te passen.
    1. Navulling van de pomp op 25.000 μL/min, voer de basislijnaanpassing gedurende 30 s uit, injecteer 90 μL monsteractiveringsoplossing (EDC/NHS) gedurende 6 minuten contacttijd en houd deze vervolgens nog eens 5 minuten vast.
    2. Herhaal deze cyclus na baseline gedurende 1 minuut bij 10 μL/min op alleen de linker flowcel (blauw) om chemisch gesynthetiseerde peptiden 10, HA en spike-eiwit bij20 μg/ml te injecteren en te immobiliseren, en laat de daaropvolgende basislijnaanpassing met ddH2O gedurende 1,5 minuut toe voordat het geactiveerde chipoppervlak wordt geblust met 1 M ethanolamine HCl pH 8,5.
  4. Schakel de buizen van de vloeibare monsternemer naar de ontgasser van ddH20 in de fles met HBS-EP(+) (aanvullende figuur 1).
  5. Analyseer de SPR-sensorgrammen.
    1. Om kinetisch onderzoek uit te voeren, gebruikt u verschillende analytconcentraties (10-5-10-8 M), met een regeneratiestap na elke injectie en blanco metingen na verschillende analyten. Verander het debiet in 10 μL/min en start injecties gedurende 4 minuten contacttijd, vervolgens 5 minuten basislijngeneratie en twee regeneratiestappen van elk 2 minuten met een interval van 30 s.
    2. Injecteer de bufferoplossing voor blanco metingen waarvan de sensorgrammen worden afgetrokken van monsterruns om verschillende eiwitconcentraties te normaliseren.
  6. Klik op Formulier, scrol omlaag en ga naar "Nabewerking" door op deze bewerkingsmodus te klikken. Klik op Toevoegen om bindingscurven te selecteren die in de loop van de tijd zijn gegenereerd in het gegevensplotformulier voor elke stroomcel en exporteer de overlay als een scrubberbestand (.ovr). Klik op Bestand om de opties voor het opslaan van bestanden te openen. Verkrijg responscurven door linker- en rechtercurven uit te lijnen en signalen van het tweede referentiekanaal af te trekken van die van het ligandkanaal.
    OPMERKING: Gegevens worden gebruikt in "Post-Processing" door sensorgrammen computationeel te definiëren. Het wordt in een overlay van sensorgrammen van linker- en rechterstroomcellen geplaatst, of weergegeven als sensorgrammen van het verschil van beide kanalen.
  7. Reinig de volledige fluidics met 50-100 mM glycine buffer pH 9,5, water en 20% ethanol voor en na bindende metingen om sporen van zout of eiwitverontreiniging te verwijderen, of strenger, met 0,5% SDS en glycine.
    OPMERKING: Om schade aan het instrument te voorkomen, wordt aanbevolen om de mechanische stabiliteit van de glazen chip te controleren voordat u de chipcartridge opnieuw in het instrument plaatst als chips onder buffer of bij 100% vochtigheid zijn opgeslagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een dimerisch domein-swapped CVN2L0-molecuul wordt getest op binding aan het HA-topgebied in drie afzonderlijke SPR-experimenten en bindingsaffiniteit wordt gepresenteerd in KD-waarden. Domein B wordt verondersteld H-bindingsplaatsen te omvatten, die worden beïnvloed door het vervangen van een disulfidebinding in ionische residuen, en domein A vormt L 10,18. Enkelvoudige injecties van CVN2L0 en varianten V2 (drie disulfidebruggen) en V5 (twee disulfidebruggen) worden eerst getest op binding aan de HA-gekoppelde sensorchip om de bindingscapaciteit te schatten voordat de kinetische meting wordt ingesteld met behulp van de autosampler en lopende tabeleditor (figuur 3A en aanvullende figuur 2). Herhaalde injecties worden geautomatiseerd voor een reeks CVN2L0, V2 en V5 in verschillende concentraties in het nanomolaire en μ-molaire bereik in het systeem in de loop van de tijd (figuur 3B-D). Door het aantal intacte Cys-Cys-bindingen te correleren, bindt CVN2L0 geïmmobiliseerd HA bij KD = 255 nM bij het bereiken van een goede verzadiging. In dit geval zijn beide KD-waarden, berekend op basis van kinetische gegevens of door de evenwichtsgegevens toe te passen op de Langmuir-bindingsisotherm, in matige overeenstemming (tabel 1 en aanvullende figuur 3, aanvullende figuur 4).

Figure 3
Figuur 3: SPR-bindingstest voor ligandbinding via multivalente interacties. CVN2 (WT) en bindingsplaatsvarianten V2 en V5 met disulfidevervangers in de koolhydraatbindende pocket met hoge affiniteit worden getest op het binden van covalent geïmmobiliseerd HA. (A) Linker- en rechterstroomcelbindingscurven van CVN2, V2 en V5 kunnen worden geëxtraheerd uit het SPR-runprotocol en sensorgrammen worden samengevat in een overlay. (B) Sensorgram van conventioneel SPR-experiment getoond als kinetische analyses voor binding van CVN2L0 aan HA, waarbij analytconcentraties van 10-4 tot 10-8 M. CVN2L0 wordt gemeten tot de hoogste concentratie bij 1,5 μM (bovenste lijn) en tot 500 nM (bottom line), waarvoor geen verzadiging op het chipoppervlak of evenwichtsbinding wordt bereikt. RU = Responseenheden. Er wordt gebruik gemaakt van een CMD500D sensorchip. (C) SPR-sensorgram voor V2-binding aan HA. D) V5 bindend voor HA. De figuur (B-D) is met toestemming overgenomen uit referentie10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ka (M-1 s-1) kd (s-1) KD [HA]
Kinetisch		 KD [HA]
Evenwicht
Cvn2 5.1 E3 1,3 x10-3 255 nM 246 nM
V2 4,0 E3 1,1 x10-3 275 nM 255 nM
V5 1,2 E3 5,8 x10-2 5 μM 4,9 μM
Cvn2l0 2,07 e4 3,0 x10-3 147 nM 600 nM
2,27 e4 3,0 x10-3 133 nM 490 nM

Tabel 1: Bindingsaffiniteiten van CVN2 en varianten aan HA gemeten via SPR. Scrubber 2.0 (een BioLogic-software) wordt gebruikt om real-time SPR-associatie- en dissociatiecurven te passen en om de evenwichtsdissociatieconstanten (KD) te berekenen op basis van kinetische en evenwichtsgegevens. Ka = associatiesnelheidsconstante. Kd = dissociatiesnelheidsconstante.

Terwijl de KD-waarden voor de binding van CVN2L0 en V2 aan HA beide in het nanomolaire bereik liggen, is V5 verminderd in binding (tabel 1). In V5 worden twee disulfidebindingen vervangen door ionenparenresiduen die potentiële ionische interacties tussen gemuteerde Glu- en Arg-residuen opnieuw trainen (figuur 2A, 3D). Primaire gegevens worden geanalyseerd volgens de geïntegreerde associatiesnelheid en snelheid van dissociatievergelijkingen, die de bindingskinetiek beschrijven van de interactie van oplosbaar CV-N met geïmmobiliseerd ligand en de dissociatie van het gevormde complex van het chipoppervlak. Twee onafhankelijke metingen worden uitgevoerd en sensorgrammen, equivalent aan die verkregen uit replicaties, worden geanalyseerd. KD wordt berekend als het quotiënt van koff/kop (aanvullende tabel 1)10,35. KD is echter gerelateerd aan de evenwichtsgegevens die passen bij de Langmuir-bindingisotherme36, waarbij de evenwichtsbindingsrespons wordt uitgezet als functie van de analytconcentratie (aanvullende figuur 3A,4A,3B,4B). Op een concentratieafhankelijke manier wordt dissociatiesnelheidsconstante kd na analyses bepaald en opgenomen in associatiefase-aanpassing (kon) om de associatiesnelheidsconstante ka te schatten. (Tabel 1, Aanvullend figuur 3C, Aanvullend figuur 4C).

Vervolgens wordt de binding van CV-N aan HA vergeleken met de interactie met RBD. CV-N WT-binding aan SARS-CoV-2 RBD wordt gemeten bij zwakkere affiniteit (KD = 260 μM, figuur 4A) in vergelijking met binding aan HA (KD = 5,7 nM)8,10,12 en binding aan S-eiwit (KD = 18,6 μM, figuur 5). Concentratie versus respons wordt uitgezet voor CV-N WT-binding aan RBD, uitgaande van specifieke targeting van mogelijk geconserveerde koolhydraten op de RBD S1-subeenheid (figuur 4A). Dezelfde affiniteitsplot wordt getoond voor CVN2L0-V4-binding aan DM die niet langer kan worden geanalyseerd vanwege de vervanging van disulfidebindingen die interfereren met hoge affiniteitsbinding aan kleine geglycosyleerde peptiden (figuur 4B).

CVN2L0-V4 (2 disulfidebindingen tegenover onsymmetrische vervanging van cysteïneresiduen door Glu-Arg-residuen of amfipathische aminozuren Trp en Met) kan apolaire waterstofbrugnetwerken vormen rond de pseudo-domein B koolhydraatbindende plaats10. Hogere dichtheid van glycanen op HA-eiwit bereikt binding met polaire Glu-Arg-residuen in plaats van cystines (aanvullende tabel 1), en een associatie met gemannosyleerde peptiden (KD = 10 μM voor DM) tussen CVN2L0 en modificaties in Glu-Arg, maar vertoont discontinue dissociatie van varianten van dit monoglycosylated peptide, in het bijzonder wanneer H wordt gemodificeerd op beide monomeren. Voor de interactie tussen CVN2L0-V4 met DM levert de respons van 56 μM CVN2L0-V4 injectie een hogere respons op dan Rmax. (Figuur 4B). V5 (2x Glu-Arg) faalt in dissociatie van oppervlaktegebonden DM (gegevens niet weergegeven). Kortom, responscurves van lagere concentraties nemen af voordat de injectie voor alle sensorgrammen op CVN2-binding aan peptide zonder native H en monomeerbinding aan RBD wordt beëindigd.

Figure 4
Figuur 4: SPR-analyses van (A) CV-N WT-monomeerbinding aan RBD. KD wordt berekend door kinetische gegevens (linkerkant, KD = 260 μM) aan te passen en te vergelijken met affiniteitsgegevens (rechterkant) met behulp van een eenvoudig biomoleculair model voor 1:1 binding tussen ligand en analyt (KD equil = 274 μM). Evenwichtsbindingsrespons of bindingscapaciteit wordt uitgezet als functie van de concentratie in vergelijking met de SPR-bindingscurven (0-605 μM CVN). H = Bindingsplaats met hoge affiniteit. L = Bindingsplaats met lage affiniteit. Beide zijn te vinden op CV-N en CVN2L0. (B) Dimeric CVN2L0-V4 binding aan DM, uitgaande van 2L zonder analyseerbare KD. CVN2L0-V4 concentraties zijn 56 μM, 28 μM, 14 μM, 7 μM, 3,5 μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Mutant CVN-E41A en CV-N WT binding aan (A) S-glycoproteïne. Pijlen geven het begin van de associatie- en dissociatiefase aan. (B) CVN-E41A bindend voor RBD op SARS-CoV-2. De liganden worden vooraf geïmmobiliseerd op HC-polycarboxylaat en CMD500D-sensorchips. Covid-19 S1 subunit [Pinto, D. et al.26; en Barnes, C. et al.37] wordt gebruikt voor RBD-immobilisatie. Debiet: 30 μL/min, 25 °C; uitgezette ruwe gegevens. Ter vergelijking: de binding van menselijke bloedserumantistoffen aan RBD met een verdunningsfactor van 1:200 wordt weergegeven. (C) SPR-assay van CV-N WT binding aan S-glycoproteïne dat is geïmmobiliseerd tot een responsniveau van 400 μRIU om CV-N te vangen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het is eerder aangetoond dat monomere CV-N met een enkele L gp120 niet voldoende kan binden, maar dat het neutralisatievermogen van CV-N cross-linking van twee koolhydraatbindende plaatsen vereist en voornamelijk wordt hersteld door dimerisatie om te functionaliseren met 2H 12,19. Vandaar dat een monomere mutant CVN-E41A tot expressie wordt gebracht, waarvan wordt vermoed dat het pseudo-domein B destabiliseert of de connectiviteit met het tweede domein A kan onderbreken, zoals gevonden in CV-N WT. CVN-E41A monomeer onthult stabiliteit bij binding aan S-eiwit vergelijkbaar met CV-N monomeer. Hoewel SPR-respons voor 605-680 μM-analytconcentraties resulteert in hoge responseenheden en typische SPR-sensorgrammen voor respectievelijk CV-N WT- en E41A-binding, is de mutant onstabiel wanneer verdund (figuur 5).

Aanvullende figuur 1: SPR-sensorgram voor het vastleggen van DM-mimiek als onderdeel van influenza HA top. Screenshot: SPR data plot toont het SPR run protocol voor de immobilisatie van DM op SPR sensor chip CMD500D, die is gecoat met 500 nm carboxymethyl dextran hydrogel en geschikt voor kinetische analyses van analyten met een laag molecuulgewicht op hoge liganddichtheid. Sensorchips worden direct op de detector gemonteerd met emersionolie en bevestigd onder een driepoorts flowcel. Na het doven van het geactiveerde chipoppervlak met 1 M ethanolamine HCl pH 8,5, wordt CVN2 tweemaal geïnjecteerd (concentratie = respectievelijk 1 μM en 2 μM). Paars: Verschil tussen stroomcel 1 en stroomcel 2; respons wordt geregistreerd met een interval van 0,2 s. Blauw: Stroomcel 1: 3000-4000 micro-refractieve indexeenheden (μRIU) gecoat van een 400 nM-oplossing van het ligand DM naar een geactiveerd carboxyloppervlak. Rood: Referentiestroomcel 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Handmatige uitvoering op HA-gefunctionaliseerde CMD500D-sensorchip met binding van dimerische CVN2L0-V5, V2 en CVN2L0. Bij infuse-stroomsnelheden van 30-50 μL/min worden CVN2L0- en disulfidebindingsvarianten, uitgedrukt met een His-tag en gezuiverd over Ni-NTA, geïnjecteerd in het midden-μM-bereik en getest op binding aan HA met een associatiefase van 3 min en dissociatiefase van 2 min. Injecties zijn V5 (15 μM), V2 (2,4 μM), 0 μM, CVN2L0 gesubcloned van een SUMO-fusie-eiwit (1 μM) en CVN2L0 (2 μM). Voor alle experimenten bij 25 °C wordt een loopbuffer bij fysiologische pH gebruikt. Alle oplossingen worden ontgast en gefilterd (0,2 μm) voordat ze in het systeem worden geïnjecteerd. Paars: Verschil tussen stroomcel 1 en stroomcel 2; respons wordt geregistreerd met een interval van 0,2 sec. Blauw: Stroomcel 1: 2540 μRIU HA. Rood: Referentiestroomcel 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: CVN2-binding aan HA. Analyses van sensorgrammen wanneer curven automatisch worden uitgelijnd. (A) Sensorgrammen op nul en uitgelijnd met behulp van Scrubber-software (links) en bindende isotherme met concentratieafhankelijke responscurve naar gebonden analyten (rechts). (B) Bindende isotherme, uitgedrukt in procentuele capaciteit. (C) Computationeel passende theoretische associatie- en dissociatiecurven. (D) Kinetische gegevens over SPR-sensorgrammen zonder aangebrachte curven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: CVN2-binding aan HA. Analyses van sensorgrammen wanneer curven handmatig worden uitgelijnd. (A) Sensorgrammen op nul en uitgelijnd met behulp van Scrubber-software (links) en bindende isotherme met concentratieafhankelijke responscurve naar gebonden analyten (rechts). (B) Bindende isotherme, uitgedrukt in procentuele capaciteit. (C) Computationeel passende theoretische associatie- en dissociatiecurven. (D) Kinetische gegevens over SPR-sensorgrammen zonder aangebrachte curven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Kinetische gegevens verkregen uit SPR-sensorgrammen voor de binding van CVN2L0- en Cys-Cys-bindingsvarianten V2, V4 en V5 aan HA met behulp van een Langmuir 1:1-bindingsmodel. KD [M] = kuit/kaan of kd/ka. Alle gegevens worden gegenereerd bij 25 °C in HBS-EP(+) buffer.: Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De bindingsaffiniteit van CV-N is gecorreleerd met het aantal functionele bindingsplaatsen [2H op domeinen B en 2L op domein(en) A wanneer ontworpen als domein-swapped dimer]. Een variant met een veranderde bindingsaffiniteit (CVN2L0-V2, een homodimere stabiele vouw van CV-N bestaande uit een disulfidebrug knock-out) wordt uitgedrukt in E. coli, gezuiverd en positief getest op binding aan HA-eiwit (H3N2) met behulp van SPR10, en vertoont een conformatieverandering bij binding van HA met H- of L-koolhydraatbindende plaatsen en KD1 = 49 nM en KD2 = 8 μM38 . Naarmate het aantal disulfidebruggen in de buurt van de glycaan-gerichte pocket in CVN2 afnam van 4 naar 2, nam de bindingsaffiniteit voor HA-eiwit af (figuren 3B-D en aanvullende tabel 1). Disulfidebindingsvarianten worden gemaakt door Cys te vervangen en polaire residuparen Glu - Arg in te brengen met een licht afnemende stabiliteit. De varianten vertegenwoordigen verder hetzelfde molecuul en de vier bindingsplaatsen zijn functioneel, hoewel multisietbinding op de chip voor alle varianten wordt beïnvloed op basis van twee disulfidesubstituties. Een niet-polaire substitutie van beide disulfidebindingen in de twee bindingszakken met hoge affiniteit maakt variant CVN2L0-V3, die het HA-peptide actief bindt in zowel zijn monomannosylated als dimannosylated vorm. De interacties met CVN2L0-V3 worden bevestigd voor micromolaire concentraties en binding met de synthetische peptiden (MM en DM) in oplossing via STD-NMR. Met name CVN2 SPR-bindingsexperimenten aan MM zijn niet analyseerbaar vanwege onvoldoende berekening van Rmax, een algemeen nadeel van de SPR-techniek en zwakke bindingsaffiniteiten aan de geïmmobiliseerde MM10. Verhoogde liganddichtheid van dit peptide en andere peptiden vermindert de bindingsselectiviteit. Met behulp van SPR vertoont dimerisch CVN2L0 (2H +2L) met hoge stabiliteit multivalente binding aan HA, dat tot expressie komt in insectencellen, en specificiteit voor dimannose op een enkele chemisch gemanipuleerde biomimicry voor oligosacchariden met een hoog mannosegehalte, uitgaande van een bindingsmodel 1: 1. Binding aan oligo-mannosiden wordt meestal gemeten met isotherme titratiecalorimetrie, waarvoor een hogere concentratie ligand tegen het lectine moet worden gesmeten17.

Concurrerende binding aan monomannose of een glycaan kleiner dan Man(7) is niet gevonden vóór15, wat wijst op de betrokkenheid van de chemische koppeling met de peptide-ruggengraat bij de herkenning van deze glycaanmoieties. Het aantal mannose-mannose-verbindingen in het doelwit was gevarieerd, waardoor tryptofaaninteracties in de glycaanzak met hoge affiniteit werden ontcijferd. Het type modificatie van peptiden met triazol-gebonden monomannose of triazol-gebonden dimannose kan KD-waarden bepalen, met name ten opzichte van H. Wat betreft bindingsaffiniteiten van CVN2L0 (2H+2L) en CVN2L0-V2 (1H+2L) tot DM, is koff maximaal 10-voudig hoger wat betreft CVN2L0-V2 dissociatie van DM versus HA10. Naast het meten van kinetische snelheidsconstanten, maakt SPR het mogelijk om de evenwichtsconstanten voor zeer langzaam balancerende systemen te schatten zonder daadwerkelijk evenwicht te bereiken (tabel 1). Daarentegen drukt kon goede relatieve responswaarden uit voor alle bindingscurven van domein-swapped CVN2L0 en zijn disulfidebindingsvarianten (V2, V4 en V5) tot HA (aanvullende tabel 1), of DM, terwijl de dissociatiesnelheid constante koff-rates laat zien voor V4 en V5, twee varianten met twee functionele L en V4 met niet-analyseerbare KD met betrekking tot DM (figuren 4B ). Het toewijzen van domein B aan H en domein A aan de respectievelijke L is een eerdere bevinding die gebaseerd is op de disulfidebindingsvarianten om verschillende bindingsaffiniteiten in SPR te onthullen, gespecificeerd, aan HA18,28.

SPR is een van de toonaangevende tools voor biomoleculaire interactieanalyse in biomedisch onderzoek35. Als een specifieke, getimede controle van de bulkanalytconcentratie haalbaar is in het SPR-instrument, is de kwantitatieve evaluatie van de kinetiek van bindingsvoortgang tussen macromoleculen mogelijk, met toenemende belangstelling voor het analyseren van multi-eiwitcomplexen39. De uitdaging bij het gebruik ervan is de gecontroleerde positionering van een van de interactiecomponenten op het veelgebruikte carboxymethyl dextran, of HC polycarboxylaat hydrogel oppervlak, dat kleine en grote biomoleculen vangt. Om immobilisatie en bindingscapaciteit van het chipoppervlak te optimaliseren, zijn streptavidin-biotine sandwich immobilisatie en immobilisatie via eiwit His-tag tot een anti-zijn antilichaam beschikbaar40. De biofysische kenmerken van eiwitten of functionele groepen van kleine moleculen kunnen interfereren met immobilisatieresultaten, maar eventuele problemen worden ervaren met de hierin beschreven glycoproteïnen en glycopeptiden die covalent gebonden zijn via EDC / NHS-chemie. De geïmmobiliseerde glycanen, glycoproteïne of de synthetische homogeen mono- of gedimannosyleerde glycopeptiden, worden gebruikt op herbruikbare chips om verschillende gemanipuleerde CV-N-varianten te screenen, en bindende assays worden toegepast op volledig gezuiverde en recombinant tot expressie gebrachte lectines. Onzuiverheden in de geïnjecteerde eiwitoplossing beschadigen het SPR-kanaalsysteem. Hoewel experimentele procedures in deze studie op een in vitro systeem worden beschreven, kan het glycosyleringspatroon op virale spikes selectief worden herkend door elke analytconcentratie van dit kleine modeleiwit zoals geïnjecteerd in de loop van de tijd met geoptimaliseerde massaoverdrachtsbeperking36. De grootte van CV-N is ~11 kDa en ondersteunt reproduceerbare SPR-gegevens voor de binding aan virale spike-eiwitten.

De bindingsspecificiteit van CV-N aan hoog-mannose glycanen wordt bevestigd door de bivalente bindingsinteractie met het gediamanosyleerde peptide mimetisch in plaats van binding aan structureel functionele glycanen en het mono-mannosylated peptide met behulp van isothermische titratiecalorimetrie (gegevens niet getoond). Een variant met de puntmutatie Glu41Ala drukt het monomere 101-residu-eiwit uit met twee verweven koolhydraatbindingsplaatsen op elk protomeer. Daarom schaft deze mutatieplaats een contactresidu tussen de koolhydraatplaatsen met hoge en lage affiniteit op en vermindert de moleculaire bindingssterkte tot N-acetyl-D-glucosamine. Binding van CVN-E41A aan SARS-CoV-2 spike-eiwit, met complex-type N-gebonden glycosylering en O-glycosylatie, wordt bereikt in de SPR, maar CV-N binding aan deze piek is voor zowel het spike-eiwit als RBD zonder fysiologische relevantie, zoals gemeten bij micromolaire concentraties (figuur 4,5).

Gemannosyleerde peptiden ontwikkeld en gegenereerd in deze studie worden gebruikt als eiwitsteigers om de bindingskenmerken van de antivirale middelen door SPR en NMR te screenen, omdat ze onveranderlijke liganden vertegenwoordigen voor koolhydraatbindende assays die zijn gekoppeld aan een gedefinieerde aminozuursequentie10. Bovendien is STD-NMR-spectroscopie een labelvrije techniek, zoals SPR, die de karakterisering van koolhydraatbinding door conformatieselectiemogelijk maakt 10,41. In dergelijke omgevingen maakt STD-NMR de ontwikkeling mogelijk van snelle screeningmethoden voor een grote bibliotheek van verbindingen om bioactieve liganden te identificeren via binding, epitoopkartering en directe bepaling van KD onder verschillende experimentele omstandigheden. Nauwkeurige KD-waarden kunnen worden verkregen door de eiwit-ligandassociatiecurve te analyseren met behulp van SOA-waarden op de grens van nulverzadigingstijd41,42. Daarom werd de ondervraging van eiwit-ligandinteracties door de STD-NMR-methode bereikt, maar KD-sworden berekend op het SPR-systeem.

Humaan 2019-nCoV (Wuhan-Hu-1-2019 nieuw coronavirus) verschilt naar schatting tussen 11 (van de 18) voorspelde N-gekoppelde glycosylatieplaatsen aan SARS-CoV43. Epitoop/paratoop mapping onthult enkele wisselwerkingen met gastheer-afgeleide N-glycanen en verwaarloosbare bijdragen van antilichaam somatische hypermutaties aan epitoopcontacten37. Het vermogen van antivirale lectines en breed neutraliserende antilichamen om sterk geconserveerde epitopen op het influenza HA-glycoproteïne te binden, is het belangrijkst voor het rationele ontwerp van vaccins voor preventief en therapeutisch gebruik. Verder onderzoek is echter nodig om het effect van immuunonderdrukkende N-gebonden glycosylering rond de gastheerreceptorbindingsplaats te evalueren. De gegevens kunnen inzicht geven in het potentieel van virus spike-eiwitten om te ontsnappen uit antilichamen die tijdens infectie worden opgewekt of om niet-immunogene CV-N te binden en zo het op structuur gebaseerde computationele eiwitontwerp voor nieuwe geoptimaliseerde antivirale CVN2-varianten te begeleiden. Daarentegen kan de affiniteit van geglycosyleerde Fc-aminozuurmutant voor zijn receptor om effectorfuncties in vivo uit te lokken, een samenstelling van glycosylatieplaatsen gebruiken en het aantal betrokken glycanen daarom belangrijk zijn voor bindende affiniteit, maar kan niet worden bepaald voor neutralisatievermogen.

Alles bij elkaar worden minder rotameren voorspeld om koolhydraatliganden aan eiwitten te binden door computationeel eiwitontwerp dan eiwit-eiwitinteracties alleen. Domein-swapped CVN2, echter met verschillende aantallen koolhydraatbindende plaatsen, biedt de nodige stabiliteit en flexibiliteit om verschillende bindingsaffiniteiten toegeschreven aan H te onthullen en om de multivalente interacties tussen oligomannoseclusters op virale enveloppenpieken en neutraliserende antilichamen (NAb) te vormen, waardoor remmingstests experimenteel kunnen worden gevalideerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteur heeft niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteur erkent Dr. Christian Derntl van de afdeling Biotechnologie en Microbiologie aan de TU Wien en de afdeling Geneeskunde III, afdeling Nefrologie en Dialyse aan de Medische Universiteit van Wenen, in het bijzonder Dr. Markus Wahrmann voor technische en wetenschappelijke ondersteuning. Eiwitexpressie in zoogdiercellen werd ondersteund door de afdeling Biotechnologie van de Universiteit voor Natuurlijke Hulpbronnen en Levenswetenschappen (BOKU) Wenen. De auteur wil haar diepe erkentelijkheid betuigen aan Dr. Nico Dankbar van XanTec bioanalytics in Düsseldorf, Duitsland, voor nuttige wetenschappelijke discussies over het uitvoeren van de SPR-bindingstests.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta primeplus Cytiva
Amicon tubes Merck C7715
Ampillicin Sigma-Aldrich A5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge Beckman Coulter B06320
Cell spreader Sigma-Aldrich HS86655 silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA Oligos Sigma-Aldrich OLIGO
Custom Gensynthesis GenScript #1390661  cloning vector: pET27b(+) 
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL Thermo Scientific 50-105-5354
Dionex UlitMate 3000 Thermo Scientific IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL)  Fisher Scientific ER1701
DTT Merck DTT-RO
EDC Merck 39391
EDTA Merck E9884
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120086
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge Sigma-Aldrich Z606235
Ethanol Merck 51976
Ethanolamine HCl Merck E6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack Corning 352057
Glucose Merck G8270
Glycine HCl Merck 55097
HA H3 protein Abcam ab69751
HEPES Merck H3375
His-select Ni2+ Merck H0537
Imidazole Merck I2399
IPTG Merck I6758
Kanamycin A Sigma-Aldrich K1377
Kromasil 300-5-C4 Nouryon
LB agar Merck 52062
LB agar Merck 19344
LB Lennox Merck L3022
Lysozyme Merck 10837059001
Magnesium chloride Merck M8266
Magnesium sulfate Merck M7506
NaH2P04 Merck S0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer Thermo Scientific ND2000CLAPTOP
NaOH Merck S5881
NHS Merck 130672
NZ amine (casein hydrolysate) Merck C0626
PBS Merck 806552
PD MidiTrap G-10 Sigma-Aldrich GE28-9180-11
Peptone Merck 70171
pET11a Merck Millipore (Novagen) 69436 
PMSF Merck PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) Qiagen 27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9 Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System Reichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis Reichert
SDS Merck 11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid Stratagene #200518
Sodim chloride Merck S9888
Sodium acetate.Trihydrate Merck 236500
SPR sensor chip C19RBDHC30M XanTec bioanalytics SCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500D XanTec bioanalytics SCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes Thermo Scientific 101R20
TBS Merck T5912 10x, solution
Triton-X100 Merck T8787
Tryptone Merck 93657
Tween20 Merck P1379
Vortex-Genie 2 Mixer Merck Z258423
X-gal Merck XGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent Cells Stratagene #200236
Yeast extract Merck Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
  2. Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26 (2018).
  3. Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
  4. Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
  5. Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
  6. Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
  7. Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
  8. Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
  9. Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
  10. Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
  11. Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
  12. Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621 (2021).
  13. Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
  14. Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
  15. Bolmstedt, A. J., O'Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
  16. O'Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
  17. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  18. Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
  19. Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
  20. Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
  21. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  22. Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
  23. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  24. Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
  25. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  26. Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
  27. Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
  28. Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
  29. Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
  30. Fischer, M. J. E. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mol, N., Fischer, M. 627, Humana Press. (2010).
  31. Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , Anaheim. 532-535 (2005).
  32. QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual. , Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to,potential%20for%20generating%20random%20mutations%20during%20the%20reaction (2005).
  33. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  34. Expasy.org. , Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022).
  35. Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
  36. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
  37. Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
  38. Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28. , Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022).
  39. Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. Schuck, P. 5, Springer. New York. 97-141 (2007).
  40. Method Development Notes. , Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022).
  41. Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. Chemistry. 16 (26), 7803-7812 (2010).
  42. Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
  43. Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).

Tags

Bio-engineering Cyanovirin-N oppervlakte plasmon resonantie verzadiging transfer verschil-NMR envelope spikes glycaan recombinant glycoproteïne
Engineering antivirale middelen <em>via</em> Surface Plasmon Resonance
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maier, I. Engineering Antiviral… More

Maier, I. Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (184), e63541, doi:10.3791/63541 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter