Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tekniske antivirale midler via overflateplasmonresonans

Published: June 14, 2022 doi: 10.3791/63541
Automatic Translation
1,2
1Department of Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 2Department of General Surgery, Medical University of Vienna

Summary

Denne protokollen beskriver nye verktøy for SPR-bindingsanalyser for å undersøke CV-N-binding til HA, S-glykoprotein, relaterte hybrid-type glykaner og oligosakkarider med høy mannose. SPR brukes til å bestemme KD for binding av enten dimerisk eller monomer CV-N til disse glykanene.

Abstract

Overflateplasmonresonans (SPR) brukes til å måle hemagglutinin (HA) binding til domenebyttet Cyanovirin-N (CV-N) dimer og for å overvåke interaksjoner mellom mannosylerte peptider og CV-Ns bindingssted for høy affinitet. Viruskonvoluttpigger gp120, HA og Ebola glykoprotein (GP) 1,2 har blitt rapportert å binde både høy- og lavaffinitetsbindingssteder på dimerisk CVN2. Dimannosylert HA-peptid er også bundet på de to bindingsstedene med lav affinitet til et konstruert molekyl av CVN2, som bærer et høyaffinitetssted for den respektive liganden og mutert for å erstatte en stabiliserende disulfidbinding i karbohydratbindende lomme, og bekrefter dermed multivalent binding. HA-binding er vist til ett bindingssted med høy affinitet av pseudoantistoff CVN2 ved en dissosiasjonskonstant (KD) på 275 nM som ytterligere nøytraliserer humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) gjennom oligomerisering. Korrelering av antall disulfidbroer i domenebyttet CVN2, som reduseres fra 4 til 2 ved å erstatte cystiner i polare restpar av glutaminsyre og arginin, resulterer i redusert bindingsaffinitet til HA. Blant de sterkeste interaksjonene er Ebola GP1,2 bundet av CVN2 med to bindingssteder med høy affinitet i det nedre nanomolare området ved bruk av konvoluttglykanet uten transmembrandomene. I denne studien måles binding av det multispesifikke monomere CV-N til alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glykoprotein ved K D = 18,6 μM sammenlignet med nanomolar KD til de andre virustoppene, og via dets reseptorbindende domene i midten av μ-molare området.

Introduction

Tetherin-assosiert antiviral aktivitet induseres av interferon-α, og den består av proteinbaserte tethers, som fører til oppbevaring av fullt dannede virioner på infiserte celleoverflater1. Nødvendigheten av tetheringlykosylering ved hemming av virusfrigjøring er fortsatt usikker, noe som antyder betydningen av glykosyleringsmønstre på rekombinant uttrykte glykaner for in vitro-studier 1,2, som avhenger av konformasjonen av (i tilfelle influensavirus) overflateuttrykt influensa hemagglutinin HA 3,4 . Det har blitt bemerket at modifisering av oligosakkarid bundet til N-bundet glykosylering er nok for tetherinmediert begrensning av HIV type-1-frigjøring2, mens dimerisering spiller en viktig rolle i å forhindre virusfrigivelse, og derved involverer transmembrandomenet eller glykosylfosfatidyl-inositol (GPI) -anker for tethering av spirende virioner5 . Unike funksjoner er beskrevet for humant og murine tetherin for å blokkere flere innkapslede virus, retrovirus og filovirus. BST-2 / tetherin er et interferoninduserbart antiviralt protein av den medfødte immuniteten1,6, som virker med bredspektret antiviral aktivitet og motvirkes av konvoluttglykoproteiner5 for enten å translokere tetherin eller forstyrre strukturen av tetherin 6. For eksempel er overflate-uttrykt konvoluttglykoprotein HA og neuraminidase på influensa A-virus kjent for tetherinantagonisme på en stammespesifikk måte7, noe som letter anerkjennelsen av vertsreseptorbindingssteder8. Glykanmålrettede antistoffer studeres i støkiometrien av deres interaksjoner med de raskt tilpassede glykanskjoldene på HA, noe som resulterer i bindingsaffinitet til influensa A H3N2 og H1N1 subtyper4.

For å belyse bindingsmekanismene mellom antivirale midler og viruskonvoluttpigger, dvs. karbohydratligander, og komplementære immunologiske og spektroskopiske metoder, syntetiseres mono-, di- og tri-mannose-deler kjemisk. De mannosylerte peptidene dannes via azidoglykosylering av glykosyler {beta}-peracetater til 1,2-trans glykosylazider transformasjon9, som etterligner de typisk funnet N-acetylglukosamin og høymannose oligosakkarider på overflaten av livstruende virus. Triazolbioisostere brukes til å etterligne koblinger som danner mannosylert rest av HA-peptid10 og letter stedsspesifikke interaksjoner med antivirale CV-N-derivater rundt det andre N-koblede glykosyleringspunktet på HA-hodedomenet (HA-topp med 4 N-bundne glykaner N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Interaksjoner mellom glutaminsyre (Glu) og arginin (Arg) og den resulterende helix-dipolen manifesterte god stabilitet av både modellpeptider og proteiner, men visualiseres ved hjelp av SPR. Hvis sammenlignet med å gjenkjenne et enkelt kjemisk syntetisert glykosyleringssted på HA10 ved direkte å hemme reseptorbinding på glykandelene, vises en høyere affinitet av en fire-site mutert Fc-struktur til reseptoren for å fremkalle effektorfunksjoner in vivo, og avslører den ikke-relaterte sammensetningen av N-bundne glykaner festet til Fc-mutanten for å være mekanistisk bestemt13.

CV-N viser antiviral aktivitet mot HIV 14,15, influensa16 og Ebola-virus, som er mediert av nanomolar binding til oligosakkaridmodifikasjoner med høy mannose på konvoluttpiggproteiner12,17,18,19. Influensa HA-binding til ett karbohydratbindende sted med høy affinitet (H) i CV-N eller to Hs i kovalent koblet dimerisk CVN2 er bestemt til å ha likevektsdissosiasjonskonstanter (K D) = henholdsvis 5,7 nM (figur 1A) og KD = 2,7 nM. Både CV-N og CVN2 har en eller to karbohydratbindende steder med lav affinitet (L) s 12,17,20,21. Ebola GP1,2 binder seg til 2H CVN2 med affiniteter i det nedre nanomolare området (KD = 26 nM). CV-N WT binding til Ebola GP1,2 og HA viser slektskap fra K D = 34 nM til KD = 5,7 nM (A/New York/55/04)12. Lektiner, som CV-N, som spesifikt retter seg mot høymannoseglykaner på virushylsene, hemmer ytterligere replikasjon av hepatitt C-virus, SARS-CoV, herpesvirus, Marburg-virus og meslingvirus22.

Det lille CV-N-molekylet har blitt studert grundig i mer enn 20 år, da det funksjonaliserer for å binde et bredt spekter av virus for å hemme viral oppføring16,18. Strukturelle analyser og bindingsaffinitetsanalyser indikerer kryssbinding av to L-er i en domenebyttet CVN2-dimer ved bivalent binding i mikromolarområdet for å øke aviditeten til virale konvoluttglykoproteiner10,19. Selektiv binding av Manα1-2Manα på Man(8) D1D3-armer og Man(9) består av to bindingssteder med forskjellig affinitet lokalisert på motsatte proteinprotomerer20, og når dermed nanomolære bindingsaffiniteter (figur 1B). CVN2 anses således som et pseudoantistoff angående dets anvendelse for å binde epitoper på HIV gp120, i likhet med virusnøytraliserende antistoffer17. Her er forfatteren interessert i å undersøke den potensielle bindingen av CVN2 til SARS-CoV-2-piggen via sitt reseptorbindende domene (RBD). Bindingskurver for immobilisert humant angiotensinkonverterende enzym (ACE)-2 med SARS-CoV-2 RBD resulterer i KD = 4,7 nM for denne biologisk relevante bindingsinteraksjonen23.

Derimot gjenkjenner utvalgte immunglobulinklasser spesifikke og konsistente strukturelle proteinmønstre, som gir et substrat for affinitetsmodning i de membranforankrede HA-regionene24. CV-N viser svært potent aktivitet i nesten alle influensa A- og B-virus16, og det er et bredt nøytraliserende antiviralt middel. Vår kunnskap er ufullstendig på plasseringen av målrettede epitoper på stammen av HA1 og HA2 som muligens involverer epitopiske strukturer for glykanmålretting av svært nøytraliserende antistoffer og sammenlignet med lektinbinding25.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av SPR-bindingsanalysen for CV-N til viruskonvoluttpigger. (A) SPR-analyse for CV-N-binding til ligand: HA protein i full lengde (90 kDa). Kinetisk datasett (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) som viser dobbeltreferert binding i sanntid til influensa HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variant V2 binding til immobilisert ligand DM innenfor et konsentrasjonsområde på 500 nM til 16 μM. Sekvens: L-rester er uthevet i gult. H-rester er uthevet i grått. E58 og R73 er en erstatning for cysteiner i wildtypeproteinet og gjør V2 til en stabil proteinfold med tre i stedet for fire disulfidbindinger Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Mens glykanskjoldet på den membrandistale HA-toppdelen induserer høy affinitetsbinding til CV-N 12, har CVN2-binding til HA ved siden av en disulfidbro av HA-toppdelen videre blitt observert på lavaffinitetsstedene10,12. Ulike polare interaksjoner og interaksjonssteder identifiseres i karbohydratbinding ved CV-N. Disse interaksjonene verifiseres ved å generere knock-out-varianter i bindingsstedet for å korrelere bindingsaffiniteter til in silico predikert glykosylering12. Prosjektet tar derfor sikte på å sammenligne tidligere testede kjemisk mannosylerte HA-peptider i bindingsaffinitet og spesifisitet med korte peptidsekvenser fra SARS-relaterte 2019-nCoV-pigger og SARS-CoV-2, naturlig forekommende modifisert av et lite antall forskjellige N-bundne glykosyleringssteder og O-bundet glykosylering. Ved hjelp av kryo-elektronmikroskopi og bindingsanalyser rapporterer Pinto og kolleger et monoklonalt antistoff, S309, som potensielt gjenkjenner en epitop på SARS-CoV-2-piggprotein som inneholder et konservert glykan i Sarbecovirus-underslekten, uten å konkurrere med reseptorvedlegg26. Protokollen i denne studien beskriver hvordan design, uttrykk og karakterisering av CV-N-varianter er viktig for å studere hvordan CV-N og CVN2 binder seg til glykosylerte proteiner og syntetiske mannosylerte peptider ved hjelp av SPR-teknologien10,12.

Tandemkoblede dimer CVN2L027 og bindingsstedsvarianter (V2-V5) uttrykkes rekombinant og varianter er med disulfidbindingserstatninger (C58E og C73R) (figur 2A). Også en mutant med en enkeltpunktsmutasjon E41A er forberedt fordi denne posisjonen har blitt sett på som en intermolekylær krysskontaktrest. Denne mutanten er et annet interessant molekyl for SPR-bindingsmålinger mellom lektin- og høymannoseoligosakkarider som dechiffrerer bindingsdomener og tillater sammenligning med den dimeriske formen. Den domenebyttede krystallstrukturen til CVN2 viser en fleksibel kobling, som strekker seg mellom 49 og 54 rester. De to domenene kan fortsette å bevege seg rundt hengslet som stive legemer, og utvikle enten en monomer gjennom intramolekylære domeneinteraksjoner (domene A -rester 1-39;90-101- med domene B -rester 40-89) eller en dimer ved intermolekylær domenebytte [domene A (av den første monomeren) med domene B (av den andre), og domene B (av den første monomeren) med domene A (av den andre kopien)]. Det er ingen nære interaksjoner mellom de to protomerenes A- og B-domener, bortsett fra Glu4128. Genet for CV-N kan utvikles ved hjelp av en repeterende PCR-metode med 40-mer syntetiserte oligoer29 og blir deretter subklonert inn i NdeI- og BamHI-stedene til pET11a for transformasjon (elektroporering) til elektrokompetente celler som beskrevet av Keeffe, JR.27. Proteinet, som brukes til å oppnå den respektive krystallstrukturen (PDB ID 3S3Y), inkluderer en N-terminal 6-histidinrensingskode etterfulgt av et Faktor Xa proteasespaltningssted. Site-rettet mutagenese brukes til å lage punktmutasjoner, bytte kodoner og sette inn eller slette enkle eller flere baser eller kodoner for aminosyreutveksling. Disse transformasjonene gir uvurderlig innsikt i proteinfunksjon og struktur. Rekombinant uttrykt og renset CV-N, CVN2 og CVN3 har blitt biofysisk godt studert20,21,27, er billige å produsere, og brukes derfor til å karakterisere bindingsanalyser til glykaner immobilisert på SPR-sensorbrikker. Konvensjonell enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) gir mindre reproduserbarhet angående immobiliseringsteknikken til glykanligander og forvandler sanntidsbinding av forskjellige bindingsstedsvarianter, som er vist for SPR, til endepunktanalyser.

Bindingsaffinitetsvarianten CVN2L0-V2 (en intakt fold av homodimer CV-N med en disulfidbrosubstitusjon10) uttrykkes med en His-tag i Escherichia coli (E. coli), renset over Ni-NTA-kolonnen ved bruk av affinitetskromatografi og testet for binding til HA (H3N2), monomannosylert HA-peptid og dimannosylert HA-peptid ved bruk av SPR. Kjemisk mannosylerte peptider, eller HA- og S-protein, er alle ligander og amin koblet til den hydrofile chipoverflaten via reaktive estere eller biotin-streptavidin protein engineering. Den samme prosedyren for sekvensielle løp brukes på disse ligandene, injisering av forskjellige fortynninger av CV-N og varianter av CV-N (og CVN2) for å oppnå kinetisk informasjon for molekylære interaksjonsanalyser som beskrevet nedenfor30. RBD-immobilisert SPR-sensorbrikke brukes til bindingsstudier på CV-N til S-peptider, og affiniteter sammenlignes med SARS-CoV-2-binding med human ACE2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

For denne studien har et CVN-lite ubiquitinlignende modifikator (SUMO) fusjonsprotein blitt brukt i enzymbundne immunosorbentanalyser i stedet for CV-N og er egnet for cellebaserte analyser. Rekombinant full lengde influensa A-virus HA H3-protein oppnås kommersielt (se materialtabell) eller uttrykkes i pattedyrs HEK293-cellelinjer og baculovirusinfiserte insektceller i henhold til standardprotokoller12. Wuhan-1 spikeprotein uttrykkes i pattedyr HEK293-celler. Syntesen av monomannosylert peptid (MM) og dimannosylert peptid (DM) tillater påvisning av homogene ligander til CVN2 og monomannosylert lite molekyl10.

1. Opprette CV-N-konstruksjoner

  1. For hver av CVN2-variantene og CVN2L0-proteinet (PDB ID 3S3Y), oppnå genkonstruksjonen med en N-terminal pelB-ledersekvens og His-tag i pET27b (+) vektor fra kommersielle kilder (se Materialtabell, tilleggsfil 1).
  2. Få tak i CVN2L0 og dens varianter (V2, V3, V4 og V5; Figur 2A,C) i bakgrunnen av et CVN2L0-malgen som består av to forskjellige DNA-sekvenser for hver CV-N-repetisjon.
  3. Oppløs det lyofiliserte plasmid-DNA i sterilt deionisert destillert vann (ddH2O) til en endelig konsentrasjon på 100 ng / μL.

2. Fremstilling av LB-agarplater med plasmid-DNA-transformerte celler

  1. Forbered kulturmedium LB-Lennox ved å oppløse 10 g / L pepton, 5 g / L gjærekstrakt og 5 g / L NaCl i ddH2O (se Materialtabell), og juster pH til 7,4. Utføre transformasjonen til kompetent E. coli BL21 (DE3) for hver variant (V2-V5) ved kjemisk metode etter en tidligere publisert rapport10.
  2. Del oppløsningen (900 μL og 100 μL), overfør 100 μL på LB-agarplater (50 μg / ml kanamycin), og bruk forsiktig en steril cellespreder. Rug agarplatene over natten ved 37 °C.

3. Kloning

  1. Subkloner genet for CV-N til NdeI- og BamHI-stedene til pET11a (se materialtabell) for transformasjon (elektroporering) til elektrokompetente celler etter referanse27.

4. Site-rettet mutagenese

  1. For å generere CVN2L029 og mutant CVN-E41A i bakgrunnen av et CVN2L0-malgen som inneholder to fremtredende DNA-sekvenser for hver CV-N-repetisjon27.
  2. Lag mutasjoner ved hjelp av et stedsrettet mutagenesesett (se materialtabell) og spesifikke mutagene primere 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' og 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' for å kjøre PCR31.
    1. Start en serie prøvereaksjoner ved å bruke flere konsentrasjoner av dobbeltstrenget DNA (dsDNA) mal fra 5-50 ng (f.eks. 5, 10, 20 og 50 ng dsDNA-mal). Hold primerkonsentrasjonen konstant.
      MERK: PCR-blandingen og termisk syklusprotokollen brukes vanligvis som beskrevet i bruksanvisningen for det stedsrettede mutagenesesettet32.
  3. Legg til Dpn I-restriksjonsenzymet (1 μL, 10 U/μL, se Materialtabell) under mineraloljeoverlegget. Bland reaksjonene grundig og forsiktig, spinn ned i en mikrosentrifuge ved bordplaten i 1 min, og inkuber umiddelbart ved 37 °C i 1 time for å fordøye foreldrenes supercoiled dsDNA.

5. Transformasjon av bakterieceller

  1. Tine XL1-Blue superkompetente celler (se Materialtabell) forsiktig på is. For å transformere hver kontroll- og prøvereaksjon, aliquot de superkompetente cellene (50 μL) til et forkjølt polypropylen rundbunnsrør (14 ml).
    1. Overfør 1 μL av Dpn I-behandlet enkeltstrenget DNA (ssDNA) fra hver kontroll- og prøvereaksjon (mutert ssDNA) for å skille aliquots av de superkompetente cellene, som syntetiserer komplementærstrengen. Virvle transformasjonsreaksjonene forsiktig for å blande og inkubere reaksjonene på is i 30 minutter.
      MERK: Før du overfører Dpn I-behandlet DNA til transformasjonsreaksjonen, anbefales det å fjerne gjenværende mineralolje forsiktig fra pipettespissen. Som en valgfri kontroll må transformasjonseffektiviteten til XL1-Blue superkompetente celler kontrolleres ved å blande 0,1 ng / μL av pUC18-kontrollplasmidet (1 μL) med en 50 μL aliquot av de superkompetente cellene.
  2. Påfør varmepuls på transformasjonsreaksjonene ved 42 °C i 45 s, og legg deretter reaksjonene på is i 2 minutter.
    MERK: Den påførte varmepulsen er allerede optimalisert for de nevnte forholdene i polypropylen rundbunnsrør (14 ml).
  3. Tilsett 0,5 ml NZY+ buljong (som inneholder per liter: 10 g NZ-amin (kaseinhydrolysat), 5 g gjærekstrakt, 5 g NaCl, 12,5 ml 1 M MgCl 2, 12,5 ml 1 M MgSO4, 10 ml2 M glukose, pH 7,5 og forvarmet til 42 °C) og inkuber transformasjonsreaksjonene ved 37 °C med risting ved 225-250 o/min i 1 time. Plate riktig volum av hver transformasjonsreaksjon (5 μL fra kontrollplasmidtransformasjon; 250 μL fra prøvetransformasjon) på LB-ampicillin agarplater.
    MERK: For transformasjonskontrollene og mutagenese, spre celler på LB-ampicillin agarplater som har 5-bromo-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-gal, 80 μg / ml) og isopropyl-1-tio-β-D-galaktopyranosid (IPTG, 20 mM) (se materialtabell). Inokulere 50 ml av cellekulturer med en enkelt koloni av transformert E. coliceller for å rense mutert plasmid-DNA for analyser. Mutagenese bekreftes ved DNA-sekvensering ved et eksternt anlegg.

6. Ekspresjon og proteinrensing

  1. For en storskala kultur, inokulere en liten mengde LB (som inneholder ampicillin) med en enkelt koloni fra den transformerte platen.
  2. Ved hjelp av nattkulturen inokulerer du uttrykkskulturen med tilsetningsstoffer, for eksempel 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 og 20 mM glukose, og fortynner frøkulturen til 1/100.
    1. Dyrk celler med kraftig risting ved 37 °C. Dyrk celler til en Abs 600 nm mellom 0,4-0,6 (midt-log fase) før du kjøler cellene til 20 ° C. Induser med 1 mM IPTG og vokse over natten.
    2. Høst deretter cellene ved å sentrifugere ved 4000 x g i 15 minutter ved 4 °C, og kast supernatanten med en pipette.
  3. Resuspendere cellepelleten i fosfatbufret saltvann (PBS) buffer og sentrifuge ved 4000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Kast deretter supernatanten med en pipette. Resuspender den gjenværende pelleten i 10 ml lysisbuffer og inkuber suspensjonen i 1 time ved 37 °C.
    MERK: Sammensetning av lysisbuffer: (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 2% Triton-X100, 500 ng / ml lysozym, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM dithiothreitol, 1 mM MgCl2, pH 8, se Materialtabell).
    1. Utsett blandingen for to fryse-tine-sykluser (-80 °C). Separer løselige og uoppløselige fraksjoner ved sentrifugering ved 4000 x g i 15 minutter ved 4 ° C og analyser dem ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese (PAGE), spesielt natriumdodecylsulfat (SDS) -SIDE33 (figur 2B, C).
      MERK: Celler kan lyses på flere måter, for eksempel fryse-tine, sonikering, homogenisering, enzymatisk lysis eller en kombinasjon av disse metodene. Rensing fra inkluderingslegemer anbefales for å samle høye proteinutbytter26.
  4. Rens proteiner ved hjelp av Ni-NTA kolonnekromatografi (se Tabell over materialer). Legg den løselige fraksjonen på en regenerert Ni-NTA-perlekolonne (1 ml / min). Vask systemet med TBS-buffer (50 mM Tris, 150 mM natriumklorid, pH 7,5) før du starter en gradient (0-100 % 500 mM imidazol i TBS over 60 min) og samle fraksjoner (1 ml / min). Dialyser de rensede proteinene for biokjemisk karakterisering mot 100 mM PBS (Figur 2C,D).
  5. Alternativt kan du bruke His-Select Ni 2+ affinitetsgel (se materialtabell) i 14 ml rør for å binde og suspendere hans merkede rekombinant uttrykte CV-N i bufferløsninger med henholdsvis 20 mM imidazol og250 mM imidazol. Inkuber i batch i minst 30 min.
    MERK: Påfør disse halvrensede proteinene på en engangs ferdigpakket kolonne for bufferutveksling og opprydding av biologiske prøver, for eksempel karbohydrater og proteiner, som kan laste 1-1,5 ml eluat fra immobilisert metallaffinitetskromatografi.
  6. Overfør proteinløsningene til sentrifugeringsrør med et 10 kDa avskjæringsfilter (se Materialtabell) og konsentrer dem ved sentrifugering i 10 minutter ved 4,500 x g og 4 °C. For SPR-målinger, bytt analyttløsningene til 10 mM HEPES, 150 mM natriumklorid, 3 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og 0,05% Tween20, pH 7,4 (HBS-EP (+), se Materialtabell).
    1. Legg denne SPR-kjørebufferen til en fortynningsfaktor på 1:10 og sentrifuger fire ganger til startvolumet i 10 minutter ved 4 500 x g og 4 °C.
  7. Bestem proteinkonsentrasjonen ved 280 nm ved hjelp av et NanoDrop UV-Vis-spektrofotometer (se materialtabell) basert på den beregnede utryddelseskoeffisienten (20.440 M-1 cm-1) for hovedproteinet CVN2L0 som viser en størrelse på 23.474 Da34. Bruk PBS (100 mM, pH 7,0) eller SPR-buffer som et tomt, og mål proteinkonsentrasjonen ved tre fortynningstrinn (1:1, 1:10 og 1:100).

Figure 2
Figur 2: CV-N-sekvenser og uttrykk. (A) CVN2 uten kobling mellom hver CV-N-repetisjon (101 aminosyrer hver) og fire disulfidbroer uttrykkes i pET11a-vektor i E. Coli. (B) Uttrykk for to uavhengige kolonier for CV-N (monomer) og CVN2 (dimer). (C) Disulfidbindingsvarianter renses og analyseres på SDS-PAGE. En markør med lav molekylvekt (6 μL) brukes som referanse. WT = CVN2L0 med fire disulfidbroer som merket i (A). V2 er en variant med en disulfidbindingserstatning av polare rester i posisjonene 58 og 73. V3-V5 er varianter med to gjenværende S-S-bindinger og enten polare (C58E-C73R) eller ikke-polare (C58W-C73M) som erstatter aminosyrer eller en kombinasjon av disse restparsubstitusjonene. (D) HPLC-kromatogrammer av renset CVN2L0 elueres med en strømningshastighet på 1 ml / min med en lineær gradient fra 5% -65% buffer B i buffer A over 30 min. Buffer A er: 0,1% (v / v) trifluoreddiksyre i ddH2O, buffer B er: 0,08% (v / v) trifluoreddiksyre i acetonitril. Protein analyseres på en høyytelses silikagel 300-5-C4 (150 x 4,6 mm) kolonne ved 214 nm og 280 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

7. SPR-spektroskopi

  1. Bruk Dual Channel SPR-systemet (se materialtabell) med kjørende buffer HBS-EP (+) og 10 mM glycin HCl pH 1,5-1,6 som regenereringsbuffer. Slå på instrumentet, lufteren, automatisk prøvetaker og pumpe og vask hele systemet med ddH20 i 1 time. Plasser bruksklar buffer i en separat flaske.
  2. Slipp emersionolje på detektoren og monter en glasssensorbrikke (se materialtabell) belagt med en tynn gullfilm og på oversiden funksjonalisert med karboksymetyldekronhydrogel direkte på detektoren under treportsstrømningscellen. Løs innstillingen ved å trekke ned håndteringen.
    MERK: C19RBDHC30M 200 nm streptavidinderivatisert karboksymetyldekstranhydrogel med middels tetthet av biotinylert alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus-2 RBD-protein, er en klar til bruk sensorchip med pre-immobilisert ligand.

8. SPR-bindingsanalyse for CV-N-binding til HA, S-protein og RBD

  1. Immobiliser proteinligandene til sensorbrikker ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Åpne en run-tabell ved å klikke på Form i menylinjen og Kjør Table Editor i den integrerte SPRAutoLink-programvaren (se Materialtabell). Velg og klikk på BASIC_Immobilization fra listen over tilgjengelige kjøretabeller og følg trinnene i den eksperimentelle prosedyren på dataskjermen. Den respektive eksempelredigereren som brukes, vises i øvre høyre hjørne.
    2. Klikk på Redigeringsprogram for eksempelsett i Skjema-delen for å fylle ut reagenslisten for to stativer plassert i den automatiske prøvetakeren for videre analyser. Klikk på Autosampler Direct Control som et "Verktøy" i menylinjen for å bringe stativene frem eller hjem. Velg 4 °C som driftstemperatur.
      MERK: SPR-programvaren tillater "SPR Instrument Direct Control" og "Pump Direct Control" ved å velge de tilsvarende verktøyene, samt autosampler-håndtering, og ved å klikke på Form; også Run Table Editor, Data-Plot eller Post-Processing kan velges for å utføre dataanalyse. Filer lagres direkte i standardkatalogen og eksporteres som scrubber.files fra etterbehandlingsvinduet.
  2. Start pumpen for å infisere ddH20 ved å klikke på Verktøy og Pump Direct Control og registrere data ved å klikke på SPR Instrument Direct Control, og hver gang Start i de nylig viste vinduene. Sett koblingsreagensene (trinn 8.3) i 300 μL hetteglass, legg dem i autosampler-stativene og start løpetabellen ved å klikke på Kjør.
    MERK: Sponoverflater er enten betinget av 10 mM glycinbuffer pH 9.0 eller kan ha blitt skyllet med 1 M natriumklorid, 0.1 M natriumboratbuffer pH 9.0 for å kondisjonere karboksylderivatisert chipoverflate for EDC / NHS aktiveringsblanding30.
  3. For denne enkle protein-protein-interaksjonen, bruk CMD500D-brikken (se materialtabell) for å generere en mikrobrytningsindeksenheter (μRIU) = 2500 - 3000 strømningscelle med immobilisert HA og μRIU = 400 strømningscelle med piggprotein. Ved en infusjonsstrømningshastighet på 15 μL / min, injiser en vandig og lik blanding av 0,4 M N-etyl-N'-(dimetylaminopropyl) karbodimidhydroklorid (EDC * HCl) og 0,1 M N-hydroksysuccinimid (NHS) ved å bruke følgende sekvensielle trinn.
    1. Påfylling av pumpepåfylling ved 25 000 μL/min, utfør baselinejustering i 30 s, injiser 90 μL prøveaktiveringsløsning (EDC/NHS) over 6 min kontakttid, og hold deretter i ytterligere 5 minutter.
    2. Gjenta denne syklusen etter baseline løping i 1 min ved 10 μL / min på bare venstre strømningscelle (blå) for å injisere og immobilisere kjemisk syntetiserte peptider10, HA og piggprotein ved 20 μg / ml, og tillat den påfølgende baseline justeringen med ddH2O i 1,5 min før du slukker den aktiverte chipoverflaten med 1 M etanolamin HCl pH 8,5.
  4. Bytt rørene fra væskeprøvetakeren til lufteren fra ddH20 i flasken med HBS-EP(+) (supplerende figur 1).
  5. Analyser SPR-sensorgrammene.
    1. For å utføre kinetiske studier, bruk forskjellige analyttkonsentrasjoner (10-5-10-8 M), med et regenereringstrinn etter hver injeksjon og blanke målinger etter forskjellige analytter. Endre strømningshastigheten til 10 μL/min og start injeksjonene i 4 minutter kontakttid, deretter 5 min baseline generasjon, og to regenereringstrinn på 2 minutter hver med et intervall på 30 s.
    2. Injiser bufferløsningen for blanke målinger hvis sensorgrammer trekkes fra prøvekjøringer for å normalisere forskjellige proteinkonsentrasjoner.
  6. Klikk på Skjema, bla ned og endre til "Etterbehandling" ved å klikke på denne driftsmodusen. Klikk på Legg til for å velge bindingskurver generert over tid i Data Plot-skjemaet for hver flytcelle, og eksporter overlegget som en scrubberfil (.ovr). Klikk på Fil for å åpne fillagringsalternativene. Oppnå responskurver ved å justere venstre og høyre kurver og trekke signaler fra den andre referansekanalen fra ligandkanalen.
    MERK: Data drives i "Post-Processing" ved å definere sensorgrammer beregningsmessig. Den settes inn i et overlegg av sensorgrammer fra venstre og høyre strømningsceller, eller representeres som sensorgrammer fra forskjellen mellom begge kanalene.
  7. Rengjør hele fluidikken med 50-100 mM glycinbuffer pH 9,5, vann og 20% etanol før og etter bindingsmålinger for å fjerne spor av salt eller proteinforurensning, eller strengere, med 0,5% SDS og glycin.
    MERK: For å forhindre skade på instrumentet, anbefales det å kontrollere glassbrikkens mekaniske stabilitet før du setter brikkepatronen inn i instrumentet igjen hvis sjetongene har blitt lagret under buffer eller ved 100% fuktighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et dimerisk domenebyttet CVN2L0-molekyl testes for binding til HA-toppregionen i tre separate SPR-eksperimenter, og bindingsaffinitet presenteres i KD-verdier. Domene B antas å omfatte H-bindende steder, som påvirkes ved å erstatte en disulfidbinding i ioniske rester, og domene A danner L10,18. Enkeltinjeksjoner av CVN2L0 og variantene V2 (tre disulfidbroer) og V5 (to disulfidbroer) testes først for binding til den HA-koblede sensorbrikken for å estimere bindingskapasitet før kinetikkmålingen settes opp ved hjelp av autosampleren og løpetabelleditoren (figur 3A og supplerende figur 2). Gjentatte injeksjoner automatiseres for en serie CVN2L0, V2 og V5 ved forskjellige konsentrasjoner i nanomolar og μ-molar rekkevidde i systemet over tid (figur 3B-D). CVN2L0 korrelerer antall intakte Cys-Cys-bindinger, og binder immobilisert HA ved KD = 255 nM når den oppnår god metning. I dette tilfellet er begge K D-verdiene, beregnet enten fra kinetiske data eller ved å tilpasse likevektsdataene til Langmuir-bindingsisotermen, i moderat samsvar (tabell 1 og supplerende figur 3, supplerende figur 4).

Figure 3
Figur 3: SPR-bindingsanalyse for ligandbinding via multivalente interaksjoner. CVN2 (WT) og bindingsstedsvariantene V2 og V5 med disulfiderstatninger i karbohydratbindende lomme med høy affinitet testes for binding av kovalent immobilisert HA. (A) Venstre og høyre strømningscellebindingskurver for CVN2, V2 og V5 kan ekstraheres fra SPR-kjøreprotokollen, og sensorgrammer oppsummeres i et overlegg. (B) Sensorgram fra konvensjonelt SPR-eksperiment vist som kinetiske analyser for binding av CVN2L0 til HA, injeksjon av analyttkonsentrasjoner fra 10-4 til 10-8 M. CVN2L0 måles opp til høyeste konsentrasjon ved 1,5 μM (topplinje) og opptil 500 nM (bunnlinje), der ingen metning på chipoverflaten eller likevektsbinding oppnås. RU = Svarenheter. En CMD500D sensorbrikke brukes. (C) SPR-sensorgram for V2-binding til HA. (D) V5 binding til HA. Figuren (B-D) er gjengitt med tillatelse fra referanse10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

ka (M-1 s-1) kd (s-1) KD [HA]
Kinetisk		 KD [HA]
Likevekt
CVN2 5.1 e3 1,3 x 10-3 255 nM 246 nM
V2 4.0 e3 1,1 x10-3 275 nM 255 nM
V5 1.2 e3 5,8 x 10-2 5 mikrometer 4,9 μM
CVN2L0 2,07 E4 3,0 x10-3 147 nM 600 nM
2,27 E4 3,0 x10-3 133 nM 490 nM

Tabell 1: Bindingsaffiniteter av CVN2 og varianter til HA målt via SPR. Scrubber 2.0 (en BioLogic-programvare) brukes til å passe til sanntids SPR-assosiasjons- og dissosiasjonskurver og for å beregne likevektsdissosiasjonskonstantene (KD) fra kinetiske og likevektsdata. Ka = assosiasjonsrate konstant. Kd = dissosiasjonshastighetskonstant.

Mens KD-verdier for binding av CVN2L0 og V2 til HA begge er i nanomolarområdet, reduseres V5 i binding (tabell 1). I V5 erstattes to disulfidbindinger av ioneparrester som omskolerer potensielle ioniske interaksjoner mellom muterte glu- og argrester (figur 2A,3D). Primærdata analyseres etter den integrerte assosiasjonshastigheten og frekvensen av dissosiasjonsligninger, som beskriver bindingskinetikken til samspillet mellom løselig CV-N med immobilisert ligand og dissosiasjonen av det dannede komplekset fra chipoverflaten. To uavhengige målinger utføres, og sensorgrammer, tilsvarende de som er oppnådd fra replikaer, analyseres. KD beregnes som kvotienten av kav/kpå (tilleggstabell 1)10,35. KD er imidlertid relatert til likevektsdataene som passer til Langmuir-bindingsisotermen 36, hvor likevektsbindingsresponsen er plottet som en funksjon av analyttkonsentrasjonen (tilleggsfigur 3A,4A,3B,4B). På en konsentrasjonsavhengig måte bestemmes dissosiasjonshastighetskonstanten kd etter analyser og inkorporeres i assosiasjonsfasetilpasning (kpå) for å estimere assosiasjonshastighetskonstanten ka. (Tabell 1, supplerende figur 3C, supplerende figur 4C).

Deretter sammenlignes bindingen av CV-N til HA med samspillet med RBD. CV-N WT-binding til SARS-CoV-2 RBD måles ved svakere affinitet (K D = 260 μM, figur 4A) sammenlignet med binding til HA (K D = 5,7 nM)8,10,12 og binding til S-protein (KD = 18,6 μM, figur 5). Konsentrasjon versus respons er plottet for CV-N WT-binding til RBD, forutsatt spesifikk målretting av muligens konserverte karbohydrater på RBD S1-underenheten (figur 4A). Det samme affinitetsplottet er vist for CVN2L0-V4-binding til DM som ikke lenger er analyserbar på grunn av erstatning av disulfidbindinger som forstyrrer høyaffinitetsbinding til små glykosylerte peptider (figur 4B).

CVN2L0-V4 (2 disulfidbindinger motsatt av usymmetrisk erstatning av cysteinrester med enten Glu-Arg-rester eller amfipatiske aminosyrer Trp og Met) kan danne ikke-polare hydrogenbindingsnettverk rundt pseudodomenet B karbohydratbindende sted10. Høyere tetthet av glykaner på HA-protein når binding med polare Glu-Arg-rester i stedet for cystiner (supplerende tabell 1), og en assosiasjon med mannosylerte peptider (KD = 10 μM for DM) mellom CVN2L0 og modifikasjoner i Glu-Arg, men viser diskontinuerlig dissosiasjon av varianter fra dette monoglykosylerte peptidet, spesielt når H modifiseres på begge monomerer. For interaksjonen mellom CVN2L0-V4 og DM gir responsen på 56 μM CVN2L0-V4 injeksjon en høyere respons enn Rmax. (Figur 4B). V5 (2x Glu-Arg) mislykkes i dissosiasjon fra overflatebundet DM (data ikke vist). I sum avtar responskurver med lavere konsentrasjoner før injeksjonen avsluttes for alle sensorgrammer på CVN2-binding til peptid uten innfødt H og monomerbinding til RBD.

Figure 4
Figur 4: SPR-analyser av (A) CV-N WT-monomerbinding til RBD. K D beregnes ved å tilpasse kinetiske data (venstre side, K D = 260 μM) og sammenlignes med affinitetsdata (høyre side) ved hjelp av en enkel biomolekylær modell for 1:1-binding mellom ligand og analytt (KD equil = 274 μM). Likevektsbindingsrespons eller bindingskapasitet plottes som en funksjon av konsentrasjon sammenlignet med SPR-bindingskurvene (0-605 μM CVN). H = Bindingssted med høy affinitet. L = Bindingssted med lav affinitet. Begge finnes på CV-N og CVN2L0. (B) Dimerisk CVN2L0-V4 binding til DM, forutsatt 2L uten analyserbar KD. CVN2L0-V4 konsentrasjoner er 56 μM, 28 μM, 14 μM, 7 μM, 3,5 μM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Mutert CVN-E41A og CV-N WT-binding til (A) S glykoprotein. Pilene indikerer begynnelsen på assosiasjons- og dissosiasjonsfasen. (B) CVN-E41A binding til RBD på SARS-CoV-2. Ligandene er pre-immobilisert på HC polykarboksylat og CMD500D sensor chips. Covid-19 S1 underenhet [Pinto, D. et al.26; og Barnes, C. et al.37] brukes til RBD-immobilisering. Strømningshastighet: 30 μL / min, 25 ° C; plottede rådata. Til sammenligning er bindingen av humane blodserumantistoffer mot RBD med en fortynningsfaktor på 1:200 avbildet. (C) SPR-analyse av CV-N WT-binding til S glykoprotein som er immobilisert til et responsnivå på 400 μRIU for å fange CV-N. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Det har tidligere vist seg at monomer CV-N med en enkelt L ikke kan binde gp120 tilstrekkelig, men at CV-Ns nøytraliseringsevne krever kryssbinding av to karbohydratbindende steder og hovedsakelig gjenopprettes ved dimerisering for å funksjonalisere med 2H12,19. Derfor uttrykkes en monomer mutant CVN-E41A, som mistenkes å destabilisere pseudo-domene B eller kan avbryte forbindelsen med det andre domenet A, som funnet i CV-N WT. CVN-E41A monomer avslører stabilitet ved binding til S-protein som ligner på CV-N-monomer. Selv om SPR-respons for 605-680 μM analyttkonsentrasjoner resulterer i høye responsenheter og typiske SPR-sensorgrammer for henholdsvis CV-N WT- og E41A-binding, er mutanten ustabil når den fortynnes (figur 5).

Supplerende figur 1: SPR-sensorgram for å fange DM-etterligning som en del av influensa HA-toppen. Skjermbilde: SPR-dataplott som viser SPR-kjøreprotokollen for immobilisering av DM på SPR-sensorbrikke CMD500D, som er belagt med 500 nm karboksymetyl-dekstranhydrogel og egnet for kinetikkanalyser av analytter med lav molekylvekt på høy ligandtetthet. Sensorchips er direkte montert på detektoren med emersion olje og festet under en tre-port strømningscelle. Etter å ha slukket den aktiverte chipoverflaten med 1 M etanolamin HCl pH 8,5, injiseres CVN2 to ganger (konsentrasjon =1 μM og 2 μM, henholdsvis). Lilla: Forskjellen mellom flytcelle 1 og flytcelle 2; respons registreres med et intervall på 0,2 s. Blå: Strømningscelle 1: 3000-4000 mikrobrytningsindeksenheter (μRIU) belagt fra en 400 nM-løsning av liganden DM til en aktivert karboksylert overflate. Rød: Referanseflytcelle 2. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Manuell kjøring på HA-funksjonalisert CMD500D-sensorbrikke som viser binding av dimerisk CVN2L0-V5, V2 og CVN2L0. Ved infusjonsstrømningshastigheter fra 30-50 μL / min injiseres CVN2L0 og disulfidbindingsvarianter uttrykt med en His-tag og renset over Ni-NTA i midten av μM-området og testes for binding til HA med en assosiasjonsfase på 3 min og dissosiasjonsfase på 2 min. Injeksjonene er V5 (15 μM), V2 (2,4 μM), 0 μM, CVN2L0 subklonet fra et SUMO-fusjonsprotein (1 μM) og CVN2L0 (2 μM). Løpebuffer ved fysiologisk pH brukes til alle forsøk ved 25 °C. Alle løsninger avgasses og filtreres (0,2 μm) før injeksjon i systemet. Lilla: Forskjellen mellom flytcelle 1 og flytcelle 2; responsen registreres med et intervall på 0,2 sek. Blå: Flytcelle 1: 2540 μRIU HA. Rød: Referanseflytcelle 2. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3: CVN2 binding til HA. Analyser av sensorgrammer når kurver justeres automatisk. (A) Sensorgrammer nullet og justert ved hjelp av Scrubber software (venstre) og bindende isoterm som viser konsentrasjonsavhengig responskurve til bundne analytter (høyre). (B) Bindende isoterm uttrykt i prosent kapasitet. (C) Beregningsmessig tilpassede teoretiske assosiasjons- og dissosiasjonskurver. (D) Kinetikkdata på SPR-sensorgrammer uten tilpassede kurver. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 4: CVN2 binding til HA. Analyser av sensorgrammer når kurver justeres manuelt. (A) Sensorgrammer nullet og justert ved hjelp av Scrubber software (venstre) og bindende isoterm som viser konsentrasjonsavhengig responskurve til bundne analytter (høyre). (B) Bindende isoterm uttrykt i prosent kapasitet. (C) Beregningsmessig tilpassede teoretiske assosiasjons- og dissosiasjonskurver. (D) Kinetikkdata på SPR-sensorgrammer uten tilpassede kurver. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 1: Kinetiske data hentet fra SPR-sensorgrammer for binding av CVN2L0- og Cys-Cys-bindingsvariantene V2, V4 og V5 til HA ved bruk av en Langmuir 1:1-bindingsmodell. KD [M] = k av/k på  eller kd/ka. Alle data genereres ved 25 °C i HBS-EP(+)-buffer.: Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CV-Ns bindingsaffinitet er korrelert med antall funksjonelle bindingssteder [2H på domener B, og 2L på domene(r) A når de konstrueres som domenebyttede dimer]. En variant med endret bindingsaffinitet (CVN2L0-V2, en homodimer stabil fold av CV-N som består av en disulfidbro knock-out) uttrykkes i E. coli, renset og positivt testet for binding til HA-protein (H3N2) ved bruk av SPR10, og viser en konformasjonsendring ved binding av HA med enten H eller L karbohydratbindende steder og KD1 = 49 nM og KD2 = 8 μM38 . Da antall disulfidbroer nær glykanmålingslommen i CVN2 gikk ned fra 4 til 2, ble bindingsaffiniteten til HA-proteinet redusert (figur 3B-D og supplerende tabell 1). Disulfidbindingsvarianter opprettes ved å erstatte Cys og sette inn polare restpar Glu - Arg med litt avtagende stabilitet. Variantene representerer ellers det samme molekylet, og de fire bindingsstedene er funksjonelle, selv om multisitebinding på brikken påvirkes for alle varianter basert på to disulfidsubstitusjoner. En ikke-polar substitusjon av begge disulfidbindingene i de to bindingslommene med høy affinitet gjør variant CVN2L0-V3, som aktivt binder HA-peptidet i både monomannosylert og dimannosylert form. Interaksjonene med CVN2L0-V3 er bekreftet for mikromolære konsentrasjoner og binding med syntetiske peptider (MM og DM) i oppløsning via STD-NMR. Spesielt er CVN2 SPR-bindingseksperimenter til MM ikke analyserbare på grunn av utilstrekkelig beregning av Rmax, en generell ulempe ved SPR-teknikken og svake bindingsaffiniteter til den immobiliserte MM10. Økt ligandtetthet av dette peptidet og andre peptider reduserer bindingsselektiviteten. Ved bruk av SPR viser dimerisk CVN2L0 (2H+2L) med høy stabilitet multivalent binding til HA, som uttrykkes i insektceller, og spesifisitet for dimannose på en enkelt kjemisk konstruert biomimikk for oligosakkarider med høy mannose, forutsatt en bindingsmodell 1:1. Binding til oligo-mannosider måles vanligvis ved isotermisk titreringskalorimetri, noe som krever en høyere konsentrasjon av ligand for å bli tittered mot lektinet17.

Konkurransedyktig binding til monomannose eller glykan mindre enn Man(7) er ikke funnet før noen av15, noe som indikerer involvering av den kjemiske koblingen med peptidryggraden i anerkjennelse av disse glykandelene. Antall mannose-mannose-koblinger i målet var variert, og dechiffrerte tryptofan-interaksjoner i glykanlommen med høy affinitet. Type modifisering av peptider med triazolbundet monomannose eller triazolbundet dimannose kan bestemme KD-verdier, spesielt til H. Når det gjelder bindingsaffiniteter mellom CVN2L0 (2H+2L) og CVN2L0-V2 (1H+2L) til DM, er koff maksimalt 10 ganger høyere når det gjelder CVN2L0-V2-dissosiasjon fra DM versus HA10. I tillegg til å måle kinetiske hastighetskonstanter, tillater SPR å estimere likevektskonstantene for svært sakte likevektssystemer uten å faktisk nå likevekt (tabell 1). Derimot uttrykker kon gode relative responsverdier for alle bindingskurver for domenebyttede CVN2L0 og dens disulfidbindingsvarianter (V2, V4 og V5) til HA (tilleggstabell 1), eller DM, mens dissosiasjonsratekonstanten koff viser raskere avsatser for V4 og V5, to varianter med to funksjonelle L og V4 med ikke-analyserbar KD angående DM (Figur 4B ). Tildeling av domene B til H og domene A den respektive L er et tidligere funn som grunnlag for disulfidbindingsvariantene for å avsløre forskjellige bindingsaffiniteter i SPR, spesifisert, til HA18,28.

SPR er et av de ledende verktøyene for biomolekylær interaksjonsanalyse i biomedisinsk forskning35. Hvis en spesifikk, tidsbestemt kontroll av bulkanalyttkonsentrasjonen er mulig i SPR-instrumentet, er den kvantitative evalueringen av kinetikken til bindingsfremgang mellom makromolekyler mulig, med økende interesse for å analysere multiproteinkomplekser39. Utfordringen ved bruk er kontrollert posisjonering av en av interaksjonskomponentene på den mye brukte karboksymetyldekstran, eller HC-polykarboksylathydrogeloverflaten, som fanger små og store biomolekyler. For å optimalisere immobilisering og bindingskapasitet av chipoverflaten, er streptavidin-biotin sandwich immobilisering og immobilisering via protein His-tag til et anti-hans antistoff tilgjengelig40. De biofysiske egenskapene til proteiner eller funksjonelle grupper av små molekyler kan forstyrre immobiliseringsresultater, men eventuelle vanskeligheter oppleves med de her beskrevne glykoproteiner og glykopeptider som er kovalent bundet via EDC / NHS-kjemi. De immobiliserte glykanene, enten glykoprotein eller de syntetiske homogent mono- eller dimannosylerte glykopeptidene, brukes på gjenbrukbare chips for å skjerme forskjellige konstruerte CV-N-varianter, og bindingsanalyser påføres på fullstendig rensede og rekombinant uttrykte lektiner. Urenheter i injisert proteinoppløsning skader SPR-kanalsystemet. Selv om eksperimentelle prosedyrer er beskrevet på et in vitro-system i denne studien, kan glykosyleringsmønsteret på virale pigger gjenkjennes selektivt av hver analyttkonsentrasjon av dette lille modellproteinet som injiseres over tid med optimalisert masseoverføringsbegrensning36. Størrelsen på CV-N er ~ 11 kDa og støtter reproduserbare SPR-data for binding til virale piggproteiner.

CV-Ns bindingsspesifisitet til høymannoseglykaner bekreftes av den bivalente bindingsinteraksjonen med det dimannosylerte peptidet mimetisk snarere enn binding til strukturelt funksjonelle glykaner og det monomannosylerte peptidet ved bruk av isotermisk titreringskalorimetri (data ikke vist). En variant med punktmutasjonen Glu41Ala uttrykker det monomere 101-restproteinet med to sammenflettede karbohydratbindingssteder på hver protomer. Derfor avskaffer dette mutasjonsstedet en kontaktrest mellom karbohydratstedene med høy og lav affinitet og reduserer molekylær bindingsstyrke til N-acetyl-D-glukosamin. Binding av CVN-E41A til SARS-CoV-2 piggprotein, med kompleks type N-bundet glykosylering og O-glykosylering, oppnås i SPR, men CV-N-binding til denne piggen er for både piggproteinet og RBD uten fysiologisk relevans, målt ved mikromolare konsentrasjoner (figur 4,5).

Mannosylerte peptider utviklet og generert i denne studien brukes som proteinstillas for å screene de antivirale midlenes bindingsegenskaper ved SPR og NMR, da de representerer uforanderlige ligander for karbohydratbindende analyser festet til en definert aminosyresekvens10. Videre er STD-NMR-spektroskopi en etikettfri teknikk, for eksempel SPR, som tillater karakterisering av karbohydratbinding ved konformasjonsvalg10,41. I slike innstillinger tillater STD-NMR utvikling av raske screeningsmetoder for et stort bibliotek av forbindelser for å identifisere bioaktive ligander via binding, epitopkartlegging og direkte bestemmelse av KD under forskjellige eksperimentelle forhold. Nøyaktige KD-verdier kan oppnås ved å analysere protein-ligand-assosiasjonskurven ved bruk av STD-verdier ved grensen for null metningstid41,42. Derfor ble undersøkelsen av protein-ligand-interaksjoner ved STD-NMR-metoden oppnådd, men KDs beregnes på SPR-systemet.

Human 2019-nCoV (Wuhan-Hu-1-2019 novel coronavirus) anslås å variere mellom 11 (av 18) spådde N-koblede glykosyleringssteder til SARS-CoV43. Epitop/paratopkartlegging avslører noen interaksjoner med vertsavledede N-glykaner og ubetydelige bidrag av antistoff somatiske hypermutasjoner til epitopkontakter37. Antivirale lektiners og bredt nøytraliserende antistoffers evne til å binde sterkt konserverte epitoper på influensa HA-glykoproteinet er viktigst for rasjonell utforming av vaksiner for forebyggende og terapeutisk bruk. Ytterligere undersøkelser er imidlertid nødvendig for å evaluere effekten av immunsuppressiv N-bundet glykosylering rundt vertsreseptorbindingsstedet. Dataene kan gi innsikt i potensialet til viruspiggproteiner for å unnslippe fra antistoffer fremkalt under infeksjon eller for å binde ikke-immunogen CV-N og dermed veilede strukturbasert beregningsproteindesign for nye optimaliserte antivirale CVN2-varianter. Derimot bruker affiniteten til glykosylert Fc-aminosyremutant til reseptoren for å fremkalle effektorfunksjoner in vivo, en sammensetning av glykosyleringssteder, og antall glycaner som er involvert, kan derfor være viktig for bindingsaffinitet, men kan ikke bestemmes for nøytraliseringsevne.

Samlet sett er færre rotamers spådd å binde karbohydratligander til proteiner ved beregningsproteindesign enn protein-protein-interaksjoner alene. Domenebyttet CVN2, som bærer forskjellige antall karbohydratbindende steder, gir imidlertid den nødvendige stabiliteten og fleksibiliteten til å avsløre forskjellige bindingsaffiniteter som tilskrives H og å danne de multivalente interaksjonene mellom oligomannoseklynger på virale konvoluttpigger og nøytraliserende antistoffer (NAb), og dermed tillate at inhiberingsanalyser kan valideres eksperimentelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatteren anerkjenner Dr. Christian Derntl fra Institutt for bioteknologi og mikrobiologi ved TU Wien og Institutt for medisin III, Divisjon for nefrologi og dialyse ved Det medisinske universitetet i Wien, spesielt Dr. Markus Wahrmann for teknisk og vitenskapelig støtte. Proteinuttrykk i pattedyrceller ble støttet av Institutt for bioteknologi ved Universitetet for naturressurser og biovitenskap (BOKU) Wien. Forfatteren ønsker å uttrykke sin dype anerkjennelse til Dr. Nico Dankbar fra XanTec bioanalyse i Düsseldorf, Tyskland, for nyttige vitenskapelige diskusjoner om å utføre SPR-bindingsanalysene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta primeplus Cytiva
Amicon tubes Merck C7715
Ampillicin Sigma-Aldrich A5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge Beckman Coulter B06320
Cell spreader Sigma-Aldrich HS86655 silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA Oligos Sigma-Aldrich OLIGO
Custom Gensynthesis GenScript #1390661  cloning vector: pET27b(+) 
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL Thermo Scientific 50-105-5354
Dionex UlitMate 3000 Thermo Scientific IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL)  Fisher Scientific ER1701
DTT Merck DTT-RO
EDC Merck 39391
EDTA Merck E9884
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120086
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge Sigma-Aldrich Z606235
Ethanol Merck 51976
Ethanolamine HCl Merck E6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack Corning 352057
Glucose Merck G8270
Glycine HCl Merck 55097
HA H3 protein Abcam ab69751
HEPES Merck H3375
His-select Ni2+ Merck H0537
Imidazole Merck I2399
IPTG Merck I6758
Kanamycin A Sigma-Aldrich K1377
Kromasil 300-5-C4 Nouryon
LB agar Merck 52062
LB agar Merck 19344
LB Lennox Merck L3022
Lysozyme Merck 10837059001
Magnesium chloride Merck M8266
Magnesium sulfate Merck M7506
NaH2P04 Merck S0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer Thermo Scientific ND2000CLAPTOP
NaOH Merck S5881
NHS Merck 130672
NZ amine (casein hydrolysate) Merck C0626
PBS Merck 806552
PD MidiTrap G-10 Sigma-Aldrich GE28-9180-11
Peptone Merck 70171
pET11a Merck Millipore (Novagen) 69436 
PMSF Merck PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) Qiagen 27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9 Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System Reichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis Reichert
SDS Merck 11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid Stratagene #200518
Sodim chloride Merck S9888
Sodium acetate.Trihydrate Merck 236500
SPR sensor chip C19RBDHC30M XanTec bioanalytics SCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500D XanTec bioanalytics SCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes Thermo Scientific 101R20
TBS Merck T5912 10x, solution
Triton-X100 Merck T8787
Tryptone Merck 93657
Tween20 Merck P1379
Vortex-Genie 2 Mixer Merck Z258423
X-gal Merck XGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent Cells Stratagene #200236
Yeast extract Merck Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
  2. Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26 (2018).
  3. Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
  4. Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
  5. Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
  6. Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
  7. Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
  8. Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
  9. Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
  10. Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
  11. Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
  12. Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621 (2021).
  13. Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
  14. Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
  15. Bolmstedt, A. J., O'Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
  16. O'Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
  17. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  18. Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
  19. Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
  20. Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
  21. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  22. Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
  23. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  24. Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
  25. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  26. Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
  27. Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
  28. Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
  29. Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
  30. Fischer, M. J. E. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mol, N., Fischer, M. 627, Humana Press. (2010).
  31. Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , Anaheim. 532-535 (2005).
  32. QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual. , Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to,potential%20for%20generating%20random%20mutations%20during%20the%20reaction (2005).
  33. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  34. Expasy.org. , Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022).
  35. Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
  36. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
  37. Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
  38. Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28. , Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022).
  39. Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. Schuck, P. 5, Springer. New York. 97-141 (2007).
  40. Method Development Notes. , Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022).
  41. Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. Chemistry. 16 (26), 7803-7812 (2010).
  42. Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
  43. Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).

Tags

Bioengineering utgave 184 Cyanovirin-N overflateplasmonresonans metningsoverføringsforskjell-NMR konvoluttpigger glykan rekombinant glykoprotein
Tekniske antivirale midler <em>via</em> overflateplasmonresonans
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maier, I. Engineering Antiviral… More

Maier, I. Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (184), e63541, doi:10.3791/63541 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter