Summary
이 프로토콜은 래트 기관지로부터 내인성 상피의 선택적 제거 및 루멘 표면 상의 외인성 세포의 균질한 분포를 허용하는 이미징-활성화된 생물반응기를 기술하고, 이어서 세포-조직 구축물의 장기 시험관내 배양을 허용한다.
Abstract
기도 조직에 대한 반복적 인 손상은 폐 기능을 손상시키고 만성 폐쇄성 폐 질환과 같은 만성 폐 질환을 일으킬 수 있습니다. 재생 의학 및 생물 반응기 기술의 발전은 약물을 스크리닝하고, 질병을 모델링하고, 조직 교체를 엔지니어링하는 데 사용할 수있는 실험실 성장 기능 조직 및 장기 구조물을 생산할 수있는 기회를 제공합니다. 여기에서, 시험관내 조직 조작 및 배양 동안 외식화된 래트 기관지의 내강을 계내에서 시각화할 수 있게 하는 이미징 양식과 결합된 소형화된 생물반응기가 설명된다. 이 생물반응기를 사용하여, 프로토콜은 기도 조직 매트릭스의 본질적인 생화학적 특징과 울트라구조를 보존하면서 내인성 세포 성분의 영상화 유도 선택적 제거를 입증한다. 더욱이, 계내에서 광학 모니터링을 갖는 탈세포화된 기도 루멘 상의 외인성 세포의 전달, 균일한 분포, 및 후속적인 연장된 배양이 도시된다. 이 결과는 영상-유도된 생물반응기가 잠재적으로 기능적인 시험관내 기도 조직의 생성을 용이하게 하는데 사용될 수 있다는 것을 강조한다.
Introduction
호흡기의 발광 표면은 주로 다중 섬모, 클럽, 잔 및 기저 줄기 세포 1,2로 구성된 상피 층으로 줄 지어 있습니다. 상피층은 폐의 주요 방어 메커니즘 역할을하며, 흡입 된 병원균, 미립자 또는 화학 가스로부터 기저기도 조직을 보호하는 생물 물리학 적 장벽 역할을합니다. 그것은 세포 간 단단한 접합 형성, 점액 균 클리어런스, 항균 및 항산화 분비 3,4를 포함한 여러 메커니즘을 통해기도 조직을 보호합니다. 결함이있는기도 상피는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)5, 원발성 섬모 운동 장애 (PCD)6 및 낭포성 섬유증 (CF)7과 같은 치명적인 호흡기 질환과 관련이 있습니다.
폐 온 칩 (LOC) 기술의 발전은 인간의 폐 발달을 연구하고, 다양한 폐 질환을 모델링하고, 엄격하게 조절되는 체외 환경에서 새로운 치료 물질을 개발할 수있는 기회를 나타냅니다. 예를 들어, 기도 상피 및 내피는 폐 조직을 교환하는 가스를 모방하기 위해 얇고 다공성 멤브레인의 반대편에서 배양될 수 있어, 충실한 질병 모델링 및 약물 테스트(8)를 가능하게 한다. 유사하게, 시험관내 질환 모델은 COPD9 및 낭포성 섬유증10과 같은 시험관내 기도 질환을 모델링하기 위해 생성되었다. 그러나, LOC 디바이스의 주요 과제는 시험관내(11)에서 폐 조직 및 동적 세포-조직 매트릭스 상호작용의 복잡한 3차원(3D) 아키텍처를 재반복하는 것이다.
최근에, 생체외 폐 조직(12)의 조작을 허용하는 혁신적인 조직 공학 방법론이 개발되었다. 이들 방법론을 사용하여, 탈착된 동종성 또는 이종 조직 이식편은 화학적, 물리적, 기계적 치료(13)를 통해 폐 조직으로부터 내인성 세포를 제거함으로써 제조될 수 있다. 또한, 탈세포화된 폐 스캐폴드 내의 보존된 천연 조직 세포외 매트릭스(ECM)는 이식된 세포가 부착, 증식 및 분화하기 위한 물리-모방 구조적, 생화학적, 및 생체역학적 단서를 제공한다(14,15).
여기서, 시험 관내 조직 조작 및 삼출된 쥐 기관 조직의 배양을 허용하기 위해 LOC와 조직 공학 기술을 결합하여 만들어진 영상-유도 생물반응기 시스템이 보고된다. 이 기도 조직 생물반응기를 사용하여, 프로토콜은 기도 조직의 근본적인 상피하 세포 및 생화학적 성분을 파괴하지 않으면서 내인성 상피 세포의 선택적 제거를 입증한다. 다음으로 우리는 새로 시딩된 외인성 세포, 예컨대 중간엽 줄기 세포 (MSCs)의 균질한 분포 및 순간적인 침착을 보여주고, 세포가 로딩된 콜라겐 I 프리겔 용액을 주입함으로써 뾰족한 기도 루멘 상에 나타낸다. 또한, 생물반응기에 집적된 미세광학 이미징 장치를 이용함으로써, 상피 제거 및 내인성 세포 전달 동안 기관 내강의 시각화도 행해진다. 또한, 기관 및 새로 이식된 세포는 눈에 띄는 세포 사멸 및 조직 분해 없이 4일 동안 생물반응기에서 배양될 수 있음을 보여준다. 우리는 영상 지원 생물반응기 플랫폼, 박막 기반 탈상피화 기술, 및 본 연구에 사용된 세포 전달 방법이 시험관내 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 기도 조직 생성에 유용할 수 있다고 구상한다.
생물반응기는 프로그램가능한 시린지 펌프, 관류 펌프, 및 분리된 래트 기관을 배양하기 위한 인공호흡기에 연결된 직사각형 챔버를 포함한다. 생물반응기는 기관 또는 조직 배양 챔버에 연결된 입구 및 출구를 특징으로 하여 기관지의 내부 및 외부 공간에 시약(예를 들어, 배양 배지)을 별도로 공급합니다(그림 1). 맞춤형 이미징 시스템을 사용하여 시험 관 내에서 배양된 쥐의 내부를 세포 수준에서 시각화할 수 있습니다(그림 2). 기관지의 내인성 상피는 세제 기반 탈세포화 용액의 점적과 진동 보조 기도 세척을 통해 제거됩니다 (그림 3). 타입 I 콜라겐과 같은 하이드로겔 용액은 외인성 세포를 뾰족한 기관 루멘을 가로질러 균일하고 순간적으로 시딩하기 위한 전달 비히클로서 사용된다(도 4). 생물반응기를 구성하고 실험을 수행하는 데 사용되는 모든 물질은 물질 표에 제공됩니다.
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Protocol
아래의 동물 조직 프로토콜은 스티븐스 공과 대학 (Stevens Institute of Technology)의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 동물 복지 지침 및 규정에 의해 승인되었으며 실험 동물 사용에 대한 NIH (National Institutes of Health) 지침을 준수합니다.
1. 영상 유도 쥐 기관지 생물반응기의 설계 및 시공
- 쥐 기관 생물반응기의 설계 및 제작
- CAD 생성기 소프트웨어를 사용하여 입구, 출구 및 조직 배양 챔버와 같은 관련 설계로 생물반응기 챔버의 CAD(컴퓨터 지원 설계) 모델을 만듭니다. 이 연구에서는 그림 1A-C에 제시된 형상과 치수를 사용합니다. CAD 생성기 소프트웨어의 튜토리얼은16,17에서 찾을 수 있습니다.
- 생성 된 CAD 모델을 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 컨트롤러 소프트웨어로 내보내고 CNC 기계를 사용하여 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 플라스틱을 절단하여 생물 반응기 챔버를 만듭니다. CNC 컨트롤러 소프트웨어의 튜토리얼은18에서 찾을 수 있습니다.
참고: PTFE 외에도 초고분자량 폴리에틸렌(UHMWPE) 및 폴리에테르이미드와 같은 다른 플라스틱 재료를 사용하여 배양 챔버를 제작할 수 있습니다. - Luer 어댑터 및 나사와 같은 모든 생물반응기 구성 요소를 멸균하여 장치에서 배양된 조직 및 세포의 오염을 방지합니다. 모든 생물반응기 성분을 깨끗한 환경에서 주 조직 배양 챔버에 조립한다(도 1A).
- 그라디언트 인덱스(GRIN) 렌즈 기반 영상화 장치 구축
- in situ 이미징 장치를 만들려면 튜브 렌즈를 적층 가능한 렌즈 튜브에 삽입하고 고정 링을 사용하여 고정하십시오. 렌즈 튜브 어셈블리를 C-마운트 어댑터를 통해 과학적인 CMOS 카메라에 장착합니다.
- Micro-Manager와 같은 소프트웨어를 사용하여 카메라를 작동하고 사진 및 비디오를 획득하십시오. 장거리(예를 들어, 카메라로부터 10m)에 위치한 물체를 조준하고, 사용되는 이미징 소프트웨어에 의해 피사체의 초점이 맞춰진 이미지가 컴퓨터 스크린 상에 형성될 때까지 카메라의 튜브 렌즈와 이미징 센서 사이의 거리를 조정한다.
- 이중 에지 초분해능 이색성 거울에 필터 렌즈를 장착하고 조립 로드, 나사 케이지 플레이트 및 케이지 큐브를 포함한 광학 케이지 시스템 구성 요소를 사용하여 장치에 레이저를 장착합니다.
- 대물 렌즈(20x)를 장치에 연결합니다. XY 변환기를 통해 렌즈 튜브의 원위 끝에 GRIN 렌즈(직경 = 500μm)를 장착합니다. GRIN 렌즈와 대물 렌즈 사이의 거리를 조정하여 초점을 맞춘 현미경 이미지를 형성합니다(그림 2A,B).
2. 쥐 기관의 분리
- 수술 부위를 소독하고 수술 전에 121°C에서 30분 동안 오토클레이브를 이용하여 수술 기구를 멸균한다.
- 래트를 유도 챔버에 놓고 작은 기화기를 사용하여 15분 동안 이소플루란의 2.5%를 전달하여 동물을 마취시킨다. 페달 반사에 의해 마취 깊이를 평가하십시오. 이렇게하려면 발가락을 단단히 꼬집고 동물이 발가락 꼬집음에 반응하지 않는지 확인하십시오.
- 마취 후 챔버에서 이소플루란을 제거하고 측방 꼬리 정맥을 통해 1,000 unit/mL 헤파린 1 mL를 투여하여 폐 혈관 구조에서 혈액 응고를 방지합니다.
- 동물을 안락사시키기 위해, 동물을 추가로 15-20분 동안 5% 이소플루란에 노출시킨다. 유도 챔버에서 동물을 제거하고 페이스 업 수핀 위치의 수술 보드에 놓습니다.
- 접착 테이프를 사용하여 다리와 꼬리를 고정시켜 수술 보드에 쥐를 고정시킵니다. 다음으로, 70 % 이소프로필 알코올 (IPA)을 사용하여 쥐의 목과 가슴 부위를 멸균하십시오. 피부에 가위를 사용하여 3-4cm 절개를하여 복강을 엽니 다.
참고: 가위 끝을 위쪽으로 향하게 하여 피부를 깊게 자르지 않도록 주의하십시오. - 가위를 사용하여 열등한 정맥 카바 (IVC)를 횡단하고 exsanguination에 의해 안락사를 확인합니다.
- 목의 중간 선에있는 가위를 사용하여 절개를하고 기관을 노출시켜 기관 절제술을 수행하십시오. 흉벽에 절개를하고 갈비뼈 사이를 절단하여 폐에 연결된 기관 끝에 도달하여 중간 선 흉부 절제술을 수행하십시오. 다음으로, 이두박근과 가위를 사용하여 기관의 양쪽 끝을 자르고 기관을 분리하십시오.
- 단리 후, 20 mL의 1x 포스페이트 완충 식염수 (1x PBS)를 사용하여 기관을 헹구었다. 멸균된 이두박근을 사용하여 기관을 생물반응기로 옮깁니다. 기관지의 두 끝을 4-0 봉합사 나사를 사용하여 Luer 커넥터에 고정하십시오.
- 5mL/min의 유속으로 생물반응기 챔버에 연결된 튜브를 통해 프로그래밍 가능한 시린지 펌프를 사용하여 5mL의 배양액을 생물반응기 챔버로 전달합니다.
참고: 배양 배지는 둘베코의 변형 이글 배지 (DMEM), 재조합 인간 FGF-염기성 (0.1 ng/mL), 태아 소 혈청 (FBS, 10%), 및 항생제-항균제 (1%)로 구성된다. - 아크릴 플라스틱 뚜껑과 나사로 생물반응기 뚜껑을 단단히 닫습니다. 튜브 내의 배양 배지의 흐름을 방지하기 위해 남성/여성 Luer 플러그와 생물반응기 챔버 튜빙 연결을 닫습니다.
3. 기관 상피의 이미징 유도 제거
- 기관 내강을 밝은 필드 또는 형광으로 시각화하려면 생물반응기를 이미징 스테이지에 놓습니다(그림 3A).
- CFSE 용액을 1x PBS로 희석하여 CFSE 세포 표지 키트에 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) 용액 (농도: 100 μM)을 제조하였다.
참고: 원래 CFSE 용액의 농도는 10 mM입니다(디메틸설폭사이드(DMSO)에서). - 5 mL/min의 유속으로 기관 캐뉼라에 연결된 튜빙을 통해 시린지 펌프를 통해 기관지를 통해 CFSE 용액 500 μL를 주입하십시오. CFSE 용액이 기관을 채울 때 펌프를 중지하십시오. 10분 동안 기다린 다음, 시린지 펌프를 사용하여 1x PBS 중 10 mL를 주입하여 기관 루멘을 세척한 후 잔류 비혼입 CFSE 시약을 제거하였다.
- GRIN 렌즈의 원위 이미징 단부를 기관의 한쪽 끝에 부착된 Luer 커넥터를 통해 기관지에 삽입합니다. 그런 다음 기관 표면이 집중 될 때까지 기관 내부의 GRIN 렌즈를 부드럽게 움직이고 20x 배율로 밝은 필드 또는 형광으로 사진과 비디오를 촬영하십시오.
- Micro-Manager 소프트웨어에서 밝은 필드 이미지를 캡처하려면 아래 단계를 따르십시오.
- 케이지 큐브를 통해 백색광을 도입하여 기관 내강을 비추십시오. 라이브 아이콘을 클릭하면 기관의 발광 표면이 실시간으로 표시됩니다. 이미징 설정 > 노출(ms) 을 사용하여 노출 시간을 원하는 값으로 변경합니다. 본 연구에서, 사용된 노출 시간은 10 ms 및 50 ms의 범위였다.
- 이미지의 대비와 밝기를 조정하려면 히스토그램 및 강도 배율 창을 사용하여 대화형 히스토그램 디스플레이의 끝점에서 흑백 화살표를 이동합니다. 또는 소프트웨어가 밝기와 대비를 자동으로 최적의 수준으로 조정할 수있는 자동 스트레치 옵션을 사용하십시오.
- 스냅 아이콘을 클릭하여 이미지를 고정시킵니다. 그런 다음 설정 > 이미지 변위로 내보내기를 사용하여 이미지를 원하는 형식으로 저장합니다. 또는 ImageJ > 설정을 사용하여 이미지를 ImageJ 소프트웨어로 직접 내보내고 저장합니다.
- 형광 모드에서 사진 및 비디오를 얻으려면 케이지 큐브를 통해 CFSE 특정 레이저 광 (CFSE : 여기 파장 : 488nm, 방출 파장 : 515nm)으로 기관 루멘을 비추십시오. 3.5.2-3.5.3단계에 따라 이미지를 가져옵니다. 사진과 비디오를 찍은 후 기관지에서 GRIN 렌즈를 부드럽게 제거하십시오.
- 하기와 같이 탈상피화를 수행한다.
- 증류수(DI) 물에 2% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 탈세포 화 용액을 준비한다. 기관 캐뉼라를 통한 주사기 펌프를 사용하여 기관 내강에 세제 용액의 박막을 생성함으로써 6.3 mL/min의 유속으로 기관을 통해 50 μL의 SDS를 주입하십시오.
- 남성 / 여성 Luer 플러그를 사용하여 생물 반응기의 튜브 연결을 닫고 생물 반응기를 인큐베이터로 옮깁니다. SDS가 37°C에서 10분 동안 기관 내에 거주하도록 허용한다. 또 다른 50 μL의 SDS 용액을 기관지를 통해 주입하고 10분 동안 인큐베이션한다.
- 3x 동안 10 mL/min의 유속으로 주사기 펌프를 통해 500 μL의 1x PBS로 기관 루멘을 관개하여 용해된 상피 및 SDS를 제거한다. 생물반응기를 진탕기 위에 놓고 약 0.3 mm의 20 Hz 주파수와 변위 진폭에서 생물반응기를 기계적으로 진동시켜 기관 내강으로부터 SDS 처리된 상피 세포의 분리를 물리적으로 촉진한다.
참고: 이 연구에서 셰이커는 서브우퍼 스피커, 서브우퍼 플레이트 앰프 및 가속도계를 조립하여 맞춤 제작되었습니다. 정현파 파형은 컴퓨터에 의해 생성되어 증폭기를 통해 셰이커에 공급 되었으며, 셰이커의 응답은 가속도계를 통해 모니터링되었습니다(그림 3B). 또한, 전자기 및 관성 쉐이커와 같은 통상적인 쉐이커는 세포의 분리를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 이렇게 하려면 셰이커의 주파수와 가속도를 각각 20Hz 및 0.5g(변위 진폭 0.3mm에 해당)으로 설정합니다. - 기관 루멘을 통해 500 μL의 1x PBS를 두 번 주입하여 기관지가 기계적으로 진동하는 동안 잔류 SDS 및 세포 파편을 제거한다. 상피 제거 절차에 따라, 단계 3.6에서와 같이 GRIN 렌즈 이미징 장치를 사용하여 CFSE의 강도를 측정하여 상피층의 클리어런스를 평가한다(도 3C).
4. 추가 분석을위한 기관지 조직 준비
- 상피 제거를 확인하려면 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색, 삼색, 펜타크롬 및 면역염색과 같은 추가 조직 분석을 수행합니다. 이렇게 하기 위해, 생물반응기로부터 기관을 제거하고, 4°C에서 하룻밤 동안 1x PBS(pH = 7.4) 중의 4% 중성 완충 파라포름알데히드 용액 30 mL에 고정시켰다.
- 탈수 및 아래 단계에 따라 고정된 기관 조직을 내장한다.
- 고정 후, 기관 조직을 10 mL의 1x PBS로 세척하고, 기관지를 30 mL의 70% 알코올로 옮기고, 밤새 4°C에서 유지한다. 날카로운 칼날을 사용하여 기관지를 작은 원통형 절편 (~ 5mm)으로 자르고 카세트를 내장 한 조직에 조직 섹션을 삽입하십시오 (길이 x 너비 x 높이 : 4cm x 2.5cm x 0.5cm). 각 카세트에 두 개의 기관 섹션을 보관하십시오.
- 일련의 이소프로필 알코올 (IPA) 용액 (85 %, 90 %, 95 %, 100 % )에서 절편을 각 용액의 30 mL에서 1 시간 동안 탈수하십시오. 다음 솔루션을 추가하기 전에 이전 솔루션을 제거하십시오.
- 완료시, 카세트를 30 mL의 클리어링제 (예를 들어, 자일렌)에 2 시간 동안 침지시켜 IPA 용액을 조직 절편으로부터 완전히 대체시킨다. 적절한 환기가 가능한 흄 후드에서이 단계를 수행하십시오.
- 카세트를 파라핀에 2시간 동안 침지시키고, 이어서 이들을 4°C에서 하룻밤 동안 파라핀에 임베드시킨다. 다음으로, 파라핀 포매된 조직을 H&E, 삼색, 펜타크롬 및 면역염색을 위한 마이크로톰 장치를 사용하여 얇은 절편(5-8 μm)으로 절단한다.
- 주사전자현미경(SEM) 분석을 위한 조직을 제조하기 위해, 4°C에서 하룻밤 동안 4°C에서 하룻밤 동안 1x PBS(pH=7.4) 중의 2.5% 글루타르알데히드 용액 30 mL에 기관을 고정시켰다. 그 후, 아래의 단계에 따라 SEM에 대해 고정된 기관 조직을 탈수시킨다.
- 고정 후, 기관 조직을 10 mL의 1x PBS로 헹구십시오. 가위를 사용하여 기관 조직을 세로 방향으로 작은 반 실린더 섹션 (길이 : ~ 5mm)으로 자르고 조직 섹션을 카세트에 삽입하십시오.
- 일련의 IPA 용액 (35 %, 50 %, 70 %, 85 %, 95 % 및 100 %)에서 절편을 각 용액의 30 mL에서 10 분 동안 탈수시킵니다. 다음 솔루션을 추가하기 전에 이전 솔루션을 제거하십시오.
- 조직을 다음 용액에 침수하여 헥사메틸디실라잔(HMDS) 기반 건조 방법을 수행합니다: 100% IPA: HMDS(2:1; v/v)를 10분 동안 유지한 후 10분 동안 100% IPA: HMDS(1:2; v/v)를 10분 동안 그리고 마지막으로 100% HMDS로 하룻밤 동안 HMDS를 가합니다.
참고: HMDS는 독성이 있습니다. 모든 건조 단계에서 흄 후드 아래에서 작업하십시오. - HMDS 용액에서 조직을 제거하고 흄 후드 아래에서 1 시간 동안 건조시킵니다. SEM 이미징을 위해 카본 양면 전도성 테이프 또는 실버 전도성 페이스트를 사용하여 알루미늄 핀 스터브에 섹션을 장착합니다.
5. 외인성 세포를 뾰족한 기관 내강으로의 균질한 분포
- 단계 3에서 프로토콜을 사용하여 탈상피화된 기관지 래트를 제조한다. 냉동 중간엽 줄기 세포 (MSCs)를 37°C 수조에서 30 s 동안 해동시킨다.
참고 :이 연구에서, 우리는 모델 세포로 중간엽 줄기 세포 (MSCs)를 사용하여 탈상피화 된 기관 상으로의 외인성 세포의 분포를 보여주었습니다. 이상적으로는, 일차 기도 상피 세포, 기저 세포, 또는 유도-인간 다능성 세포 (iPSCs)가 상피 재생 목적을 위해 사용될 수 있다. - 혈구세포계로 세포를 계수하고 5 x 106 cells/mL의 농도로 세포 용액을 준비하십시오. 세포를 실온에서 15분 동안 2 mL의 CFSE 용액 (농도: 100 μM)으로 인큐베이션함으로써 세포를 형광으로 표지한다. 세포를 3x 동안 5 mL의 1x PBS로 헹구고 세포를 3 x 107 cells/mL의 최종 농도로 신선한 배지에 재현탁시킨다.
- 하이드로겔 프리겔 용액을 세포 전달을 위한 비히클로서 준비한다. 이 연구를 위해 콜라겐 I을 MSC 세포의 전달 비히클로 사용하고 제조업체의 지침에 따라 프리 젤을 준비하십시오. 예를 들어, 3.6 mg/mL 콜라겐 프리젤을 얻으려면 냉각된 중화 용액의 한 부분을 1.5 mL 멸균 튜브에서 쥐 꼬리 콜라겐의 아홉 부분과 섞는다. 그런 다음 적절한 혼합을 위해 혼합물을 위아래로 부드럽게 피펫하십시오.
참고: 연구 및 사용자의 필요에 따라 콜라겐 I 대신 다른 생체적합성 하이드로젤을 사용할 수 있다. - 하이드로겔 용액이 제조되면, 세포를 원하는 농도(예를 들어, 5 x 10 6 세포/mL)로 용액에 신속하게 첨가한다. 균일한 세포-하이드로겔 혼합물을 수득하기 위해, 마이크로피펫으로 부드럽게 피펫팅함으로써 세포 및 겔 용액을 혼합한다.
- 생물반응기 내의 기관지의 한쪽 끝을 Luer 커넥터를 통해 프로그래밍 가능한 시린지 펌프에 부착하십시오. 37°C에서 5mL의 신선한 배양액을 생물반응기 챔버에 전달하여 5mL/min의 유속으로 시린지 펌프를 사용하여 기관지 외부 표면을 덮습니다.
- 세포-하이드로겔 혼합물의 10 μL 볼루스를 5 mL/min의 유속으로 시린지 펌프를 사용하여 생물반응기 내의 탈상피화된 기관지에 투여하여 기관 내강에 세포-하이드로겔 층을 생성한다(그림 4).
- 세포 주입 후, 생물반응기를 겔화를 위해 37°C 및 5%CO2 의 멸균 세포 배양 인큐베이터에 놓는다. 콜라겐 I의 경우, 겔화는 30분 내에 발생한다.
- 이식된 세포의 분포를 시각화하려면 70% IPA 또는 에탄올로 닦아 GRIN 렌즈를 멸균하고 이미징 단계에 생물반응기를 놓습니다. 필요에 따라 밝은 필드와 형광 모드에서 사진과 비디오를 촬영하십시오.
- 세포 시딩 30분 후, 1mL/min의 유속으로 시린지 펌프를 사용하여 기관 루멘에 배양액 1mL를 주입한다.
- 세포 시딩된 기관 내 생물반응기를 원하는 시간 동안 37°C의 인큐베이터에서 배양한다. 장기 배양을 위해, 24시간마다 기관 루멘 및 생물반응기 챔버에서 배양 배지를 리프레시한다. 세포 배양 중에 루멘 내부의 배지를 정적으로 유지하고 매 24 시간마다 변경하며, 기관 외부의 배지는 5 mL / min에서 단방향 흐름을 통해 지속적으로 관류됩니다.
- 세포를 특정 기간 동안 (예를 들어, 본 연구에서 1 및 4일) 동안 배양한 후, 생물반응기로부터 기관을 제거하였다. 가위를 사용하여 기관지를 세로 방향으로 두 개의 반 실린더 섹션 (즉, 상부 및 하부 섹션)으로 절단하여 시험관 내 배양의 1 일과 4 일에 세포 성장을 모니터링하고 세포 밀도를 계산하기 위해 내부 표면을 노출시킵니다. 기존의 형광 현미경을 사용하여 내부 표면의 세포를 시각화하십시오.
- Micro-Manager 소프트웨어를 사용하여 이미지를 가져오려면 3.5단계 및 3.6단계를 수행하십시오. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 필터를 사용하여 형광 모드에서 CFSE 표지된 세포를 시각화합니다. 형광 현미경으로 촬영한 이미지를 분석하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 위쪽 및 아래쪽 섹션의 세포 밀도를 계산합니다. 셀 수와 셀 밀도를 계산하려면 아래 단계를 따르십시오.
- ImageJ 소프트웨어에서 이미지를 열고 이미지 > 유형 > 16비트를 사용하여 이미지를 이진 이미지( 16비트)로 변환합니다. [눈금 설정] 분석(Analyze > Set Scale)을 사용하여 배율 표시줄로 이미지 배율을 설정합니다.
- 이미지의 임계값을 조정하여 셀 구조를 강조 표시합니다. 이미지를 사용> 여 임계값> 조정합니다. 파티클 분석> 분석을 사용하여 셀 수를 계산합니다. 셀 수를 이미지의 표면적별로 나누어 세포의 밀도를 계산합니다.
- 세포 시딩 후 생존력을 평가하려면 세포 생존력 키트를 사용하십시오. 이 연구를 위해, 기관 조직 및 세포를 생물반응기에서 6시간 동안 37°C에서 인큐베이션하고, 세포를 실온에서 15분 동안 1x PBS 중 1 mL의 4 mM 칼세인-AM 및 2 mM 에티듐 호모다이머-1로 염색하였다.
- 1x PBS로 헹구고 난 후, 형광 현미경을 사용하여 세포를 시각화한다. 단계 5.12에 설명된 단계를 사용하여 살아있는 셀과 죽은 세포를 계수합니다. 세포 생존율을 총 세포 (살아있는 세포와 죽은 세포 모두) 당 살아있는 세포 (calcein-AM로 염색)의 백분율로 계산하십시오.
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Representative Results
GRIN 렌즈 기반의 현장 이미징 양식은 현장에서 기관 내부 루멘의 시각화를 허용 할 수 있습니다 (그림 5A). 이 이미징 방법을 사용하면 천연 및 탈상피화 기관의 밝은 필드 및 형광 이미지를 모두 얻을 수 있습니다 (그림 5B, C). CFSE 표지 이전에 천연 기관지로부터 형광 신호가 관찰되지 않았다(도 5Bii). 그러나, 기관 상피를 CFSE 염료로 표지하였을 때, 상피 전체에 걸쳐 균일한 형광 신호(녹색)가 관찰되었다(도 5Ci). SDS를 통한 탈상피화 및 진동 보조 기도 관개 후, 형광 신호의 강도가 유의하게 감소하였고(도 5Cii), 상피의 절제를 나타낸다.
탈상피화된 기관지의 H&E 이미지는 기관 내강으로부터 의사층화된 상피를 제거하고 기저 조직층에서 세포 및 ECM 미세구조를 보존하는 것을 보여주었다(도 6A). 또한, 펜타크롬(도 6B) 및 삼색 염색(도 6C)은 콜라겐 및 프로테오글리칸과 같은 기관 조직 구조 및 ECM 성분의 유지를 확인하였다. 또한, 상피 세포의 면역형광(상피 세포 부착 분자, EpCAM; 그림 6D) 및 콜라겐 I(도 6E)은 상피의 완전한 제거 및 상피하 조직 내의 콜라겐 I의 보존을 밝혀냈다. 천연 기관의 SEM 이미징은 천연 래트 기관지의 발광 표면이 주로 다중 섬모 세포 및 잔 세포로 채워져 있음을 보여주었습니다. 한편, 탈상피화된 기관 루멘의 SEM 이미지는 ECM 섬유의 메쉬 네트워크에 의해 지시된 바와 같이 기저막이 노출되었고 상피 세포의 부재를 보여주었다(도 6F).
탈상피화된 래트 기관 및 형광 표지된 세포를 사용하여, 우리는 하이드로겔을 세포 전달 비히클로 혼입하는 것이 탈상피화된 기관 내강 상으로의 균질한 세포 분포를 달성할 수 있는지 여부를 조사하였다(도 7A, B). 본 연구에서, 중간엽 줄기 세포 (MSCs)를 세포 전달 및 배양 연구를 위한 모델 세포로서 사용하였다. 프로토콜(단계 5)에 기재된 바와 같이, MSC가 로딩된 콜라겐 I 프리겔을 탈상피화된 래트 기관 내로 주입하고, GRIN 렌즈 이미징 시스템을 사용하여 기관 내강 상의 세포의 분포를 모니터링하였다. 대조군 실험으로서, 우리는 배지에 MSCs를 현탁시키고, 세포-로딩된 배양 배지를 기관 내로 주입하고, 세포의 분포를 육안으로 검사하였다. 계내 이미징 결과는 하이드로겔을 통해 전달된 형광 표지된 세포가 배양 배지를 통해 시딩된 세포보다 루멘을 가로질러 더 균일하게 부착된 채로 남아 있음을 보여주었다(도 7B). 그런 다음 세포 주입 중 전단 스트레스로 인한 잠재적 인 세포 손상 및 사망을 평가하기 위해 세포 전달 전후의 세포 생존력을 테스트했습니다. 그 결과, 세포의 90% 이상이 생존 상태로 남아 있기 때문에 세포 생존 능력이 세포 전달 과정에 의해 크게 영향을 받지 않았음을 보여주었다(도 7C).
또한, 세포 시딩된 기관을 4일 동안 배양하였다. 콜라겐 및 배양 배지(대조군) 둘 다를 통해 시딩된 세포는 기관 내강의 상반부 및 하반부 모두에서 시간에 따라 CFSE를 발현하는 세포의 증가에 의해 나타낸 바와 같이 탈상피화된 기관 루멘 표면 상에서 증식하였다(도 7D). 주목할 만하게, 콜라겐 하이드로겔 전달군에서, 상부 루멘과 하부 루멘 사이의 세포 밀도의 차이는 대조군에서의 밀도보다 작았으며, 이는 하이드로겔을 통한 세포 전달이 기관 내강 전체에 걸쳐 균질한 세포 분포를 촉진함을 나타낸다.
그림 1: 기관 생물반응기의 3차원(3D) 컴퓨터 도면 . (A) (i) 측면도, (ii) 상단도. (b) 생물반응기 챔버의 치수. (C) 투명한 아크릴 플라스틱 시트는 나사를 사용하여 주 챔버의 상단에 절단되고 부착됩니다. 단위 = mm; R = 반지름. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 쥐 기관의 현장 시각화를 위한 맞춤형 마이크로 파이버 이미징. (a) (i) 광 경로의 이미징 셋업 성분의 개략도. 약어: C = 카메라, TL = 튜브 렌즈, F = 필터, DM = 이색성 거울, OL = 대물 렌즈; (ii) 생물반응기의 Luer 커넥터에 삽입된 이미징 프로브(GRIN 렌즈)를 나타내는 이미징 셋업 성분의 사진. (b) GRIN 렌즈가 생물반응기와 통합되어 있음을 보여주는 개략도. (c) 생물반응기 내부의 기관을 시각화하기 위해 사용되는 이미징 프로브를 보여주는 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 쥐 기관지의 탈상피화를 위한 플랫폼. (A) 탈상피화 및 계내 광섬유 이미징을 위한 실험 셋업을 보여주는 사진. (B) 상피 제거를 용이하게하기 위해 사용되는 맞춤형 전자기 쉐이커의 구성 요소 및 어셈블리를 보여주는 다이어그램. ω: 주파수, a: 진폭 (C) 쥐 기관 탈상피화 절차의 워크플로우를 보여주는 개략도. PBS = 포스페이트-완충 식염수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 하이드로겔을 이용한 탈상피화된 래트 기관지 내로의 외인성 세포의 전달. 탈상피화된 래트 기관의 내강 상에 세포를 국소적으로 침착시키기 위해 전달 비히클로서 사용되는 하이드로겔 용액을 나타내는 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 탈상피화된 기관의 계내 영상화. (A) GRIN 렌즈를 통해 CFSE로 표지된 상피가 488nm 청색 레이저로 여기되는 동안 기관 내강의 형광 이미징을 보여주는 사진. (b) (i) 브라이트-필드 및 (ii) 상피 표지 전의 기관 루멘의 형광 이미지. (c) 상피가 CFSE 형광 염료로 표지된 동안 (i) 천연 및 (ii) 탈상피화된 기관지(De-Epi trachea)의 형광 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 천연 및 탈상피화된 래트 기관의 조직학, 면역형광 및 SEM 분석. (A) H&E 염색. (b) 보라색이 세포질이고, 청색이 세포핵이고, 녹색이 프로테오글리칸(예를 들어, 뮤신), 황색이 콜라겐 섬유인 펜타크롬 염색. (C) 분홍색이 세포 세포질이고, 진한 파란색이 세포 핵이고, 파란색이 콜라겐인 삼색 염색. 천연 및 탈상피화된 기관의 형광 이미지. (d) EpCAM 및 (E) 콜라겐 I. 화살촉은 기관 내강의 표면을 나타낸다. (f) 기관 내강의 SEM 현미경 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 기관 루멘에서의 외인성 MSCs의 국소 침착. (a) (i) 밝은 장 및 (ii) 탈상피화된 기관의 형광 이미지. (b) 탈상피화된 기관 루멘이 (i) PBS 및 (ii) 콜라겐 I 예비겔로 시딩되었을 때의 형광 이미지. 기관 루멘 상으로의 세포의 균질한 분포는 프리겔 콜라겐이 세포의 전달 비히클로서 사용될 때 달성된다. (c) (i) 형광 이미지 및 (ii) 프리겔 콜라겐에 의한 전달 6시간 전후의 세포의 생존력을 정량화하였다. n: 샘플 수. 세포의 생존력을 평가하기 위해 프로토콜의 단계 5.1 및 5.17을 따랐다. (d) 세포 시딩 및 배양 후 (i) 1일 및 (ii) 4일 후에 측정된 세포 시딩 밀도. 세포 밀도는 세포 번호를 조사된 표면적에 의해 분할하여 계산하였다. 모든 값은 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. 분산의 단방향 분석 (ANOVA)은 그룹 간의 통계적으로 유의미한 차이를 결정하기 위해 사용되었으며, p < 0.05는 유의한 것으로 간주되었다. 약어: CM = 배양 배지, C = 콜라겐. *p < 0.05. **p < 0.01. ns : 중요하지 않습니다. 상부 표면과 하부 표면 사이에 유의한 차이 (ns)가 없다는 것은 기관의 둘레에 걸쳐 균일 한 세포 분포를 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 작업에서, 우리는 (i) 세포 제거 및 외인성 세포 전달 후 계내에서 기관 내강의 모니터링과 (ii) 세포 시딩된 기관 조직의 장기 시험관내 배양을 허용할 수 있는 이미징 유도 생물반응기를 만들었습니다. 이 맞춤형 생물반응기를 사용하여, 우리는 (i) 세제 및 진동 보조 기도 세척을 사용하여 기관 내강으로부터 내인성 상피 세포를 선택적으로 제거하고 (ii) 세포가 로딩된 콜라겐 I 프리젤을 사용하여 외인성 세포를 탈착된 기관의 발광 표면으로 균일하게 분포시키는 것을 시연했습니다. 또한, GRIN 렌즈 기반 이미징 양식은 현장에서 상피의 제거를 확인했다. 또한 H&E, 삼색, 오각형, 면역형광염색, SEM을 포함한 추가 분석을 통해 상피의 제거와 기저 조직층의 구조와 성분의 유지를 확인하였다. 또한, 새로 이식된 외인성 중간엽 줄기세포의 GRIN 렌즈 기반 영상화는 콜라겐 I 프리젤이 전달 비히클로서 사용되었을 때 세포의 균일한 분포를 보여주었다. 마지막으로, 이식된 세포는 탈상피화된 기관 상에서 생존하고 증식하여, 세포 시딩된 기도 조직의 장기 배양에서 생물반응기의 효능을 강조한다.
탈상피화 프로토콜의 중요한 단계는 기관 내강에 얇은 세제 용액 층을 만드는 것입니다. 현재의 탈세포화 프로토콜에서는 장기간에 걸쳐 화학 물질 및 효소의 여러 사이클이 사용되어 콜라겐 섬유, 글리코사미노글리칸 (GAGs), 프로테오글리칸 및 연골세포의 수를 줄여 기도 스캐폴드19,20,21의 생물학적 및 생체 기계적 특성을 손상시킵니다. 한편, ECM은 이식된 외인성 세포(22,23)의 생존, 증식 및 분화를 위한 생화학적 및 기계적 단서 및 적합한 물리적 환경을 제공한다. 본 연구에 기술된 박막 증착 방법은 상피 절제에 소량의 세제(50 μL 미만)를 사용하면서 하부 조직층 및 상피하 세포 성분의 보존을 허용한다. 이 연구에서 입증 된 세제 노출 조직의 기계적 진동은 용해 된 세포의 분리 및 클리어런스를 허용하므로 중요한 절차입니다. 세제에 상피의 노출로 인한 세포 파편 및 부분적으로 파쇄된 세포는 기관지를 세척 용액으로 범람시킴으로써만 세척되기 어렵다. 따라서, 세척 동안 기관을 기계적으로 진동시키는 것은 기관 내강으로부터 세포 파편을 제거하기에 충분한 전단력을 제공한다.
일반적으로, 프리겔-기반 세포 시딩 접근법은 전달 속도, 프리겔의 점도(즉, 프리겔 농도와 직접적으로 관련됨), 표면 장력, 및 겔화 시간에 의해 영향을 받을 수 있다. 특히, 프리겔 제제 동안, 프리겔 농축을 튜브 내에 현탁된 프리겔을 운반할 수 있을 만큼 충분히 낮게 유지하고 기관지의 상면에 세포를 유지하기에 충분히 높게 유지하는 것이 필수적이다. 따라서 다양한 농도를 테스트하여 각 프리 젤에 대한 최적의 농도를 찾는 것이 좋습니다. 또한, 세포 로딩된 프리젤의 성공적인 전달을 보장하기 위해 덜 귀한 세포와의 전달 속도와 같은 전달 기술을 실천한다. 더욱이, 우리는 MSCs를 세포 모델로 사용하여 (i) 전달 비히클로서 프리겔을 사용한 세포의 분포 및 (ii) 탈핵된 기관 내강 상에서 새로 시딩된 세포를 배양하기 위한 생물반응기 시스템의 능력을 입증하는 반면, 향후 연구에서 줄기 세포 (예를 들어, 기저 세포) 및 일차 기도 상피 세포의 사용은 세포 분화 및 기능적 상피 세포 재생24를 연구할 수 있게 할 수 있을 것이다. 25. 또한, 미래의 연구는 기능성 상피의 생성을 위해 시딩된 세포에 생체내 유사 전단 응력을 발생시키기 위해 현재 플랫폼에 공기-액체 계면(ALI)을 추가하는 것을 포함할 수 있다. 현재 장치에 ALI를 추가하기 위해 작은 동물 인공 호흡기를 기관 입구에 연결하여 기관을 환기시킬 수 있습니다. 더욱이, ALI를 달성하기 위해, 박막 증착 방법은 배양 배지 액체 플러그를 세포 시딩된 기관 내로 주입하는데 이용될 수 있다. 액체 필름의 두께는 액체 플러그 속도26,27을 변경함으로써 변조될 수 있다. 플러그는 새로 시딩된 세포가 기관 내강 상에 단단히 부착되고 생착된 후에 개시될 수 있다.
또한, 이 프로토콜에 사용된 계내 GRIN 렌즈 기반 이미징 접근법은 탈상피화의 효능을 확인하고 새로 시딩된 세포의 분포의 품질을 평가하는 데 매우 중요하다. 분석을 위해 기관 조직에서 샘플을 해부해야하는 조직학 및 면역 형광과 같은 기존의 조직 분석 방법과 달리 우리 연구에서 개발 된 이미징 플랫폼은 상피화 및 세포 전달 동안기도 내강을 신속하고 비파괴적으로 모니터링 할 수 있습니다. 현장 이미징 중에 기관지를 멸균 상태로 유지하려면 GRIN 렌즈를 기관 내강에 도입하기 전에 70 % IPA 또는 에탄올로 닦아 멸균하십시오. 또한, GRIN 렌즈를 사용하여 세포를 이미지화하기 위해, 세포(내인성 기관 상피 세포 또는 새로 이식된 세포)는 상이한 여기/방출 파장을 갖는 다양한 형광 염료로 표지될 수 있다. 이렇게하려면 적절한 레이저 광 발생기를 사용하여 형광 표지 된 세포를 여기시키고 올바른 필터 렌즈를 이중 에지 초분해능 이색성 거울에 통합하십시오.
탈상피화, 세포 전달 및 현장 이미징 방법의 참신함과 혁신성에도 불구하고, 이 연구는 몇 가지 한계가 있다. 이 연구에 설명 된 탈상피화 및 세포 전달 방법은 표면 장력이 지배적 인 작은 기도 (직경 : 3-4mm 미만)에 적용 할 수 있습니다. 액체 플러그를 형성하고 돼지 및 인간 기관 또는 기관지와 같은 더 큰 기도에서 탈상피화 용액 또는 세포 로딩된 프리겔 현탁액의 박막을 만드는 것은 표면 장력이 다른 힘, 특히 중력에 비해 무시할 수 있기 때문에 어려울 수 있다. 또한, 박막 증착 접근법을 사용하고 시간 및 농도를 조절함으로써, 우리는 강한 세제 (SDS)로 상피를 절제하고 하부 조직 층을 보존 할 수있었습니다. 그러나 향후 연구에서는 3-[(3-콜라미도프로필)-디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS)28 또는 수산화나트륨(NaOH)29와 같은 비세제 용액과 같은 경미한 탈세포화 세제가 ECM 성분의 보존 및 새로 이식된 세포의 지지에 대해 시험될 수 있다. 또한, CFSE 표지된 세포의 형광 강도는 세포의 분열로 인해 시간이 지남에 따라 감소한다. 우리의 연구에서, 4 일 동안 탈상피화 된 기관 상에서 배양 된 MSCs의 형광 이미지는 형광 강도의 실질적인 감소를 보였다. 조직 스캐폴드 상에 시딩된 외인성 세포의 장기간 모니터링 및 추적을 위해, 세포의 장기 또는 영구적인 형광 표지를 허용할 수 있는 상이한 세포 표지 방법이 필요할 것이다.
우리는이 보고서에 설명 된 이미징 유도 생물반응기 플랫폼 및 세포 제거 및 전달 프로토콜이 생체 공학 기도 조직을 생성하는 데 사용할 수있는 탈상피화 된 기도 조직 스캐폴드의 생성을 허용 할 수 있다고 생각합니다. 이러한 시험관내 기도는 인간 기도 질환 및 약물 스크리닝의 높은 충실도의 시험관내 모델링을 제공할 수 있다. 예를 들어, 기능적 기도 상피를 확립하기 위해, 기도 기저 줄기 세포는 먼저 탈상피화된 기도 조직(30) 상에 이식될 수 있다. 이어서, 기저 줄기세포를 다양한 상피 세포로 분화시키는 데 중요한 공기-액체 계면(ALI)이 기관 내에서 생성될 수 있다. 더욱이, in situ 이미징 시스템은 폐기도 장애를 가진 환자의 호흡기를 형광으로 시각화하기 위해 변형되고 사용될 수 있다. 현장에서 기도 조직을 평가하기 위해 임상적으로 사용되기 위해, 경질 GRIN 렌즈는 기도를 탐색하기 위해 유연한 광섬유 이미징 프로브로 대체될 수 있습니다. 더욱이, 하이드로겔 기반 세포 시딩을 사용하여 호흡기 내부에 세포를 균질하게 분배하는 능력은 환자에서 손상되거나 손상된 상피를 대체할 수 있는 전례 없는 기회를 제공할 수 있다. 특히, 본 연구에서 개발되고 사용된 세포 대체 접근법은 낭포성 섬유증 및 원발성 섬모 운동이상증과 같은 호흡기 질환을 치료하기 위한 세포 기반 치료를 가속화하고, 심하게 손상된 기도 조직(31,32,33,34)으로 인해 이식을 거부된 기증자 폐를 복구할 수 있다.
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Disclosures
저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 미국 흉부 학회 재단 연구 프로그램, 뉴저지 건강 재단 및 국립 과학 재단 (CAREER Award 2143620)이 J.K.에 부분적으로 지원했습니다. 그리고 국립 보건원 (P41 EB027062)에서 G.V.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 - D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
References
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