Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ביוריאקטור מונחה הדמיה ליצירת רקמת נתיב אוויר מהונדסת ביולוגית

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63544
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 4, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

Summary

הפרוטוקול מתאר ביוריאקטור התומך בהדמיה המאפשר הסרה סלקטיבית של האפיתל האנדוגני מקנה הנשימה של החולדה והתפלגות הומוגנית של תאים אקסוגניים על פני השטח של לומן, ולאחר מכן תרבית חוץ גופית ארוכת טווח של מבנה רקמת התא.

Abstract

פגיעה חוזרת ונשנית ברקמת דרכי הנשימה עלולה לפגוע בתפקוד הריאות ולגרום למחלות ריאה כרוניות, כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית. ההתקדמות ברפואה רגנרטיבית ובטכנולוגיות ביוריאקטורים מציעה הזדמנויות לייצר מבני רקמות ואיברים פונקציונליים שגודלו במעבדה, שניתן להשתמש בהם כדי לסנן תרופות, למדל מחלות ולהנדס תחליפי רקמות. כאן מתוארת ביוריאקטור ממוזער בשילוב עם שיטת הדמיה המאפשרת הדמיה באתרה של הלומן הפנימי של קנה הנשימה של חולדה מוסברת במהלך מניפולציה של רקמת מבחנה ותרבית. באמצעות ביוריאקטור זה, הפרוטוקול מדגים הסרה סלקטיבית מונחית הדמיה של רכיבים תאיים אנדוגניים תוך שמירה על התכונות הביוכימיות הפנימיות ומבנה האולטרה-מבנה של מטריצת רקמת דרכי הנשימה. יתר על כן, ההעברה, ההתפלגות האחידה והתרבית הממושכת שלאחר מכן של תאים אקסוגניים על לומן דרכי הנשימה נטולי התאים עם ניטור אופטי באתרו מוצגים. התוצאות מדגישות כי ניתן להשתמש בביוריאקטור מונחה ההדמיה כדי להקל על יצירת רקמות אוויריות פונקציונליות במבחנה .

Introduction

המשטח הלומינלי של דרכי הנשימה מרופד בשכבה של אפיתל המורכבת בעיקר מתאי גזע רב-ציליתיים, קלאב, גביעובזלתיים 1,2. שכבת האפיתל משמשת כמנגנון הגנה עיקרי של הריאה, ופועלת כמחסום ביופיזי המגן על רקמת דרכי הנשימה הבסיסית מפני פתוגנים, חלקיקים או גזים כימיים בשאיפה. הוא מגן על רקמת דרכי הנשימה באמצעות מנגנונים מרובים, כולל היווצרות צמתים הדוקים בין-תאיים, פינוי רירית, והפרשת מיקרוביאלית ונוגדת חמצון 3,4. אפיתל דרכי הנשימה הפגום קשור למחלות נשימה הרסניות, כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD)5, דיסקינזיה סילארית ראשונית (PCD)6, וסיסטיק פיברוזיס (CF)7.

ההתקדמות בטכנולוגיית ריאה על שבב (LOC) מייצגת הזדמנות לחקור את התפתחות הריאות האנושיות, למדל מחלות ריאה שונות ולפתח חומרים טיפוליים חדשים בסביבות במבחנה המווסתות היטב. לדוגמה, אפיתל דרכי הנשימה והאנדותל יכולים להיות תרבית בצדדים מנוגדים של קרום דק ונקבובי כדי לחקות את הגז המחליף רקמת ריאה, מה שמאפשר מודלים נאמנים של מחלות ובדיקות סמים8. באופן דומה, מודלים של מחלות חוץ גופיות נוצרו כדי למדל מחלות בדרכי הנשימה במבחנה, כגון COPD9 וסיסטיק פיברוזיס10. עם זאת, אתגר גדול של התקני LOC הוא שחזור הארכיטקטורה התלת-ממדית (התלת-ממדית) המורכבת של רקמת הריאה והאינטראקציות הדינמיות בין מטריצת תאים לרקמות במבחנה11.

לאחרונה פותחו מתודולוגיות חדשניות להנדסת רקמות המאפשרות מניפולציה של רקמות ריאה ex vivo 12. באמצעות מתודולוגיות אלה, ניתן להכין שתלי רקמות אלוגניות או קסנוגניות על ידי הסרת התאים האנדוגניים מרקמת הריאה באמצעות טיפולים כימיים, פיזיקליים ומכניים13. בנוסף, המטריצה החוץ-תאית של הרקמה המקומית שהשתמרה (ECM) בפיגומי הריאה שעברו דה-תאיזציה מספקת את הרמזים המבניים הפיזיו-מימטיים, הביוכימיים והביו-מכניים עבור תאים מושתלים כדי לחבר, להתרבות ולהבדיל14,15.

כאן מדווחת מערכת ביוריאקטור מונחית הדמיה שנוצרה על ידי שילוב של טכנולוגיות LOC והנדסת רקמות כדי לאפשר מניפולציה של רקמת חוץ גופית ותרבית של רקמות קנה הנשימה של חולדות מוסברות. באמצעות ביוריאקטור זה של רקמת דרכי הנשימה, הפרוטוקול מדגים הסרה סלקטיבית של תאי האפיתל האנדוגניים מבלי לשבש את המרכיבים התת-תאיים והביוכימיים התת-אפיתליאליים הבסיסיים של רקמת דרכי הנשימה. לאחר מכן אנו מראים את ההתפלגות ההומוגנית ואת התצהיר המיידי של התאים האקסוגניים החדשים שנזרעו, כגון תאי גזע מזנכימליים (MSCs), על לומן דרכי הנשימה הפגוע על ידי החדרת תמיסת הקולגן I הקדם-ג'לית הטעונה בתאים. בנוסף, על ידי שימוש בהתקן ההדמיה המיקרו-אופטי המשולב בביוריאקטור, נעשה גם הדמיה של לומן קנה הנשימה במהלך הסרת אפיתל והעברת תאים אנדוגניים. יתר על כן, הוא הראה כי קנה הנשימה והתאים המושתלים החדשים יכולים להיות תרבית בביוריאקטור ללא מוות תאי מורגש והתפרקות רקמות במשך 4 ימים. אנו צופים כי פלטפורמת הביוריאקטורים התומכת בהדמיה, טכניקת הדה-אפיתליזציה המבוססת על סרט דק ושיטת העברת התאים המשמשת במחקר זה יכולות להיות שימושיות ליצירת רקמות דרכי הנשימה עבור מידול מחלות במבחנה ובדיקת תרופות.

הביוריאקטור כולל תא מלבני המחובר למשאבת מזרקים הניתנת לתכנות, משאבת פרפוזיה ומכונת הנשמה לצורך קיבוץ קנה הנשימה של חולדות מבודדות. הביוריאקטור כולל פתחים ושקעים המחוברים לקנה הנשימה או לתא תרביות הרקמה כדי לספק בנפרד ריאגנטים (למשל, מדיית תרבית) למרחבים הפנימיים והחיצוניים של קנה הנשימה (איור 1). ניתן להשתמש במערכת הדמיה שנבנתה בהתאמה אישית כדי לדמיין את פנים קנה הנשימה של חולדה בתרבית חוץ גופית ברמה התאית (איור 2). האפיתל האנדוגני של קנה הנשימה מוסר באמצעות החדרת תמיסת דה-תאיזציה מבוססת דטרגנטים ולאחריה שטיפת דרכי הנשימה בסיוע רטט (איור 3). תמיסת הידרוג'ל, כגון קולגן מסוג I, משמשת ככלי אספקה לזריעה של תאים אקסוגניים באופן אחיד ומיידי על פני לומן קנה הנשימה המנוקד (איור 4). כל החומרים המשמשים לבניית הביוריאקטור ולביצוע הניסויים מסופקים בטבלת החומרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול רקמות בעלי החיים שלהלן אושר על ידי ההנחיות ותקנות רווחת בעלי החיים של המכון לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במכון סטיבנס לטכנולוגיה, והוא תואם את הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) לשימוש בבעלי חיים ניסיוניים.

1. תכנון ובנייה של ביוריאקטור של קנה הנשימה של חולדה מונחית הדמיה

  1. תכנון וייצור של ביוריאקטור קנה הנשימה של חולדה
    1. צור מודל תכנון בעזרת מחשב (CAD) של תא הביוריאקטור עם תכנון רלוונטי, כגון כניסות, שקעים ותא תרביות רקמה, באמצעות תוכנת מחולל CAD. לצורך מחקר זה, השתמש בגאומטריה ובממדים המוצגים באיור 1A-C. את המדריך של תוכנת גנרטור CAD ניתן למצוא ב 16,17.
    2. ייצא את מודל ה-CAD שנוצר לתוכנת בקר בקרה מספרית ממוחשבת (CNC) וחתוך את הפלסטיק של הפוליטטרפלואורואורואתילן (PTFE) באמצעות מכונת CNC ליצירת תא הביוריאקטור. את המדריך של תוכנת בקר CNC ניתן למצוא בשנת18.
      הערה: בנוסף ל- PTFE, ניתן להשתמש בחומרים פלסטיים אחרים, כגון פוליאתילן במשקל מולקולרי גבוה במיוחד (UHMWPE) ופוליאתרימיד כדי לייצר את תא התרבית.
    3. לעקר את כל רכיבי הביוריאקטור, כגון מתאמי Luer וברגים, כדי למנוע זיהום של הרקמות והתאים בתרבית במכשיר. הרכיבו את כל הרכיבים הביוריאקטורים לתא תרביות הרקמה הראשי בסביבה נקייה (איור 1A).
  2. בניית מכשיר הדמיה מבוסס עדשה (GRIN) המבוסס על אינדקס הדרגתי (GRIN)
    1. כדי ליצור את מכשיר ההדמיה in situ , הכנס עדשת צינור לתוך צינור עדשה הניתן לערימה ואבטח אותה באמצעות טבעת תמך. הרכיבו את מכלול שפופרת העדשה על מצלמת CMOS מדעית באמצעות מתאם C-mount.
    2. השתמש בתוכנה, כגון Micro-Manager, כדי להפעיל את המצלמה ולרכוש תמונות וסרטונים. כוון עצם הממוקם במרחק רב (למשל, 10 מ 'מהמצלמה) והתאם את המרחק בין עדשת הצינור לחיישן ההדמיה של המצלמה עד שתיווצר תמונה ממוקדת של האובייקט על מסך המחשב על ידי תוכנת ההדמיה שבה נעשה שימוש.
    3. הרכיבו עדשת מסנן על מראה דיכרואית בעלת רזולוציה גבוהה במיוחד ולייזר למכשיר באמצעות רכיבי מערכת כלובים אופטיים, כולל מוט הרכבה, לוחית כלוב מושחלת וקוביית כלוב.
    4. חבר את העדשה האובייקטיבית (20x) למכשיר. הרכיבו עדשת GRIN (קוטר = 500 מיקרומטר) בקצה הדיסטלי של שפופרת העדשה באמצעות מתרגם XY. התאם את המרחק בין עדשת GRIN לעדשה האובייקטיבית כדי ליצור תמונות מיקרוסקופיות ממוקדות (איור 2A,B).

2. בידוד קנה הנשימה של החולדה

  1. לחטא את האזור הכירורגי ולעקר את כלי הניתוח באמצעות אוטוקלאב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני הניתוח.
  2. מניחים חולדה בתא האינדוקציה ומספקים 2.5% מהאיזופלורן למשך 15 דקות באמצעות מכשיר אידוי קטן כדי להרדים את החיה. להעריך את עומק ההרדמה על ידי רפלקס הדוושה. כדי לעשות זאת, לצבוט בחוזקה את הבוהן ולאשר כי החיה אינה מגיבה לצביטת הבוהן.
  3. לאחר ההרדמה, יש להסיר את האיזופלורן מהתא ולתת 1 מ"ל של 1,000 יחידות/מ"ל הפרין דרך וריד הזנב הצדדי כדי למנוע קרישת דם בכלי הדם הריאתיים.
  4. כדי להרדים את החיה, יש לחשוף את החיה ל-5% איזופלורן למשך 15-20 דקות נוספות. מוציאים את החיה מתא האינדוקציה ומניחים אותה על לוח הניתוח בתנוחת שכיבה עם הפנים כלפי מעלה.
  5. תקן את החולדה בלוח הניתוח על ידי שיתוק הרגליים והזנב באמצעות סרט דבק. לאחר מכן, לעקר את אזורי הצוואר והחזה של החולדה באמצעות 70% אלכוהול איזופרופיל (IPA). פתח את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך 3-4 ס"מ באמצעות מספריים בעור.
    הערה: היזהר לא לחתוך את העור עמוק על ידי הפניית קצות המספריים כלפי מעלה.
  6. טרנסקט את הווריד הנבוב התחתון (IVC) באמצעות המספריים ואישר את המתת החסד על ידי אקסנגווינציה.
  7. בצעו את קנה הנשימה על ידי ביצוע חתך באמצעות מספריים בקו האמצע של הצוואר וחשיפת קנה הנשימה. בצעו את קו החזה האמצעי על ידי ביצוע חתך בדופן בית החזה וחיתוך בין הצלעות כדי להגיע לקצה קנה הנשימה המחובר לריאה. לאחר מכן, השתמש ב- bicep ובמספריים כדי לחתוך את שני הקצוות של קנה הנשימה ולבודד את קנה הנשימה.
  8. לאחר הבידוד, יש לשטוף את קנה הנשימה באמצעות 20 מ"ל של 1x מלוחים עם אגירת פוספט (1x PBS). מעבירים את קנה הנשימה לביוריאקטור באמצעות שרירי הזרוע המעוקרים. הצמידו את שני הקצוות של קנה הנשימה למחבר Luer באמצעות חוט תפר 4-0.
  9. ספק 5 מ"ל של מדיום תרבית לתא הביוריאקטור באמצעות משאבת המזרק הניתן לתכנות דרך הצינורות המחוברים לתא הביוריאקטור בקצב זרימה של 5 מ"ל לדקה.
    הערה: מדיום התרבית מורכב ממדיום הנשר המהונדס של דולבקו (DMEM), FGF-basic אנושי רקומביננטי (0.1 ננוגרם/מ"ל), סרום בקר עוברי (FBS, 10%), ואנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (1%).
  10. סגור בחוזקה את מכסה הביוריאקטור עם מכסה הפלסטיק האקרילי והברגים. סגור את חיבורי הצינורות של תא הביוריאקטור עם תקעי ה-Luer הזכריים/נקביים כדי למנוע את זרימת מדיום התרבית בצינורות.

3. הסרה מונחית הדמיה של אפיתל קנה הנשימה

  1. כדי לדמיין את לומן קנה הנשימה בשדה בהיר או פלואורסצנטי, הניחו את הביוריאקטור על שלב ההדמיה (איור 3A).
  2. הכן תמיסת קרבוקסיפלואורסצין succinimidyl ester (CFSE) (ריכוז: 100 μM) בערכת תיוג תאי CFSE על ידי דילול תמיסת CFSE עם 1x PBS.
    הערה: הריכוז של תמיסת ה-CFSE המקורית הוא 10 mM (בדימתיל סולפוקסיד (DMSO)).
  3. החדרת 500 μL של תמיסת CFSE דרך קנה הנשימה באמצעות משאבת המזרק דרך הצינורות המחוברים לצינורית קנה הנשימה בקצב זרימה של 5 מ"ל לדקה. עצרו את המשאבה כאשר תמיסת ה-CFSE ממלאת את קנה הנשימה. המתן במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף את לומן קנה הנשימה על ידי עירוי של 10 מ"ל של 1x PBS באמצעות משאבת המזרק כדי להסיר את שאריות ריאגנט CFSE לא מקורה.
  4. הכנס את קצה ההדמיה הדיסטלי של עדשת GRIN לקנה הנשימה באמצעות מחבר Luer המחובר לקצה אחד של קנה הנשימה. לאחר מכן, הזיזו בעדינות את עדשת ה-GRIN בתוך קנה הנשימה עד שמשטח קנה הנשימה יהיה ממוקד וצלמו תמונות וסרטונים בשדה בהיר או בפלואורסצנציה בהגדלה של פי 20.
  5. ללכידת תמונות בשדה בהיר בתוכנת Micro-Manager, בצע את השלבים הבאים.
    1. הכניסו אור לבן דרך קוביית הכלוב כדי להאיר את לומן קנה הנשימה. לחץ על הסמל Live כדי להציג את המשטח הזוהר של קנה הנשימה בזמן אמת. השתמש בהגדרת הדמיה > חשיפה (ms) כדי לשנות את זמן החשיפה לערך הרצוי. במחקר זה, זמן החשיפה בו נעשה שימוש היה בטווח של 10 אלפיות השנייה ו-50 אלפיות השנייה.
    2. כדי להתאים את הניגודיות והבהירות של תמונות, השתמש בחלון היסטוגרמה ו-Intensity Scaling כדי להזיז חצים בשחור-לבן בנקודת הקצה של תצוגת ההיסטוגרמה האינטראקטיבית. לחלופין, השתמש באפשרות 'מתיחה אוטומטית' המאפשרת לתוכנה לכוונן את הבהירות והניגודיות באופן אוטומטי לרמות אופטימליות.
    3. לחץ על סמל הצמד כדי להקפיא את התמונה. לאחר מכן, השתמש בהגדרה > 'ייצוא תמונות כעקורות' כדי לשמור את התמונות בתבנית הרצויה. לחלופין, השתמש בהגדרת > ImageJ כדי לייצא ישירות את התמונה לתוכנת ImageJ ולשמור אותה.
  6. כדי להשיג תמונות וסרטונים במצב פלואורסצנטי, האירו את לומן קנה הנשימה באור לייזר ספציפי ל-CFSE (CFSE: אורך גל עירור: 488 ננומטר, אורך גל פליטה: 515 ננומטר) דרך קוביית הכלוב. בצע את השלבים 3.5.2-3.5.3 כדי להשיג את התמונות. לאחר צילום תמונות וסרטונים, הסר בעדינות את עדשת ה- GRIN מקנה הנשימה.
  7. בצע דה-אפיתליזציה כמתואר להלן.
    1. מכינים 2% נתרן דודציל סולפט (SDS) תמיסת דה-תאיזציה במים מזוקקים (DI). החדרת 50 μL של SDS דרך קנה הנשימה בקצב זרימה של 6.3 מ"ל לדקה, על ידי שימוש במשאבת המזרק דרך צינורית קנה הנשימה כדי ליצור סרט דק של תמיסת חומרי הניקוי על לומן קנה הנשימה.
    2. סגור את חיבורי הצינורות של הביוריאקטור באמצעות תקעי Luer זכריים/נקביים והעביר את הביוריאקטור לחממה. אפשרו ל-SDS לשכון בתוך קנה הנשימה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. להחדיר עוד 50 μL של תמיסת SDS דרך קנה הנשימה ולדגום במשך 10 דקות.
    3. הסר אפיתל ו- SDS על ידי השקיית לומן קנה הנשימה עם 500 μL של 1x PBS באמצעות משאבת מזרק בקצב זרימה של 10 מ"ל לדקה עבור 3x. מניחים את הביוריאקטור על שייקר ורוטטים מכנית את הביוריאקטור בתדר של 20 הרץ ומשרעת תזוזה של כ-0.3 מ"מ כדי לקדם פיזית ניתוק של תאי אפיתל שטופלו ב-SDS מלומן קנה הנשימה.
      הערה: במחקר זה, השייקר נבנה בהתאמה אישית על ידי הרכבת רמקול סאב-וופר, מגבר צלחת סאב-וופר ומד תאוצה. צורת גל סינוסואידלית נוצרה על ידי מחשב והוזנה לתוך השייקר דרך המגבר, בעוד שהתגובה של השייקר הייתה מנוטרת באמצעות מד התאוצה (איור 3B). בנוסף, שייקרים קונבנציונליים, כגון שייקרים אלקטרומגנטיים ואינרציה, יכולים לשמש לקידום ניתוק התאים. לשם כך, הגדר את התדר וההאצה של השייקר ל-20 הרץ ו-0.5 גרם, בהתאמה (שווה ערך למשעת תזוזה של 0.3 מ"מ).
    4. להחדיר 500 μL של 1x PBS פעמיים דרך לומן קנה הנשימה כדי להסיר שאריות SDS ופסולת תאים בזמן קנה הנשימה רוטט מכנית. לאחר הליך הסרת האפיתל, העריכו את פינוי שכבת האפיתל על ידי מדידת עוצמת ה-CFSE באמצעות מכשיר ההדמיה של עדשת GRIN כמו בשלב 3.6 (איור 3C).

4. הכנת רקמת קנה הנשימה לניתוחים נוספים

  1. כדי לאשר את הסרת האפיתל, בצע ניתוחי רקמות נוספים, כגון צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E), טריכרום, פנטכרום ואימונוסטין. לשם כך, הסר את קנה הנשימה מהביוריאקטור, ותקן אותו ב-30 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד נייטרלית של 4% ב-1x PBS (pH = 7.4) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
  2. לייבש ולהטמיע את רקמת קנה הנשימה הקבועה על ידי ביצוע השלבים הבאים.
    1. לאחר קיבוע, לשטוף את רקמת קנה הנשימה עם 10 מ"ל של 1x PBS, להעביר את קנה הנשימה ל 30 מ"ל של 70% אלכוהול, ולשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס לילה. חותכים את קנה הנשימה למקטעים גליליים קטנים (כ-5 מ"מ) באמצעות להב חד ומחדירים את חלקי הרקמה לקלטות ההטבעה של הרקמה (אורך x רוחב x גובה: 4 ס"מ x 2.5 ס"מ x 0.5 ס"מ). שמור שני קטעי קנה הנשימה בכל קלטת.
    2. לייבש את החלקים בסדרה של תמיסות איזופרופיל אלכוהול (IPA) - 85%, 90%, 95%, 100% - עבור 1 שעה ב 30 מ"ל של כל תמיסה. הסר את הפתרון הקודם לפני הוספת הפתרון הבא.
    3. עם השלמתו, הטביעו את הקלטת ב-30 מ"ל של חומר סליקה (למשל, קסילן) במשך 2 שעות כדי לעקור לחלוטין את תמיסת ה-IPA מקטעי הרקמה. בצע שלב זה במכסה אדים עם אוורור תקין.
    4. טבלו את הקלטות בפרפין במשך 2 שעות, ולאחר מכן הטמיעו אותן בפרפין בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, חתכו את הרקמות המוטבעות בפרפין למקטעים דקים (5-8 מיקרומטר) באמצעות התקן מיקרוטום עבור H&E, טריכרום, פנטכרום ואימונוסטין.
  3. כדי להכין את הרקמות לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) ניתוח, לתקן את קנה הנשימה ב 30 מ"ל של 2.5% תמיסת glutaraldehyde ב 1x PBS (pH = 7.4) ב 4 °C בלילה. לאחר מכן, לייבש את רקמת קנה הנשימה הקבועה עבור SEM על ידי ביצוע השלבים הבאים.
    1. לאחר קיבוע, לשטוף את רקמת קנה הנשימה עם 10 מ"ל של 1x PBS. חותכים את רקמת קנה הנשימה באורך למקטעים קטנים של חצי צילינדר (אורך: כ-5 מ"מ) באמצעות מספריים ומחדירים את חלקי הרקמה לקלטות.
    2. לייבש את החלקים בסדרה של פתרונות IPA - 35%, 50%, 70%, 85%, 95%, ו-100% - למשך 10 דקות ב-30 מ"ל של כל תמיסה. הסר את הפתרון הקודם לפני הוספת הפתרון הבא.
    3. בצע את שיטת הייבוש המבוססת על הקסמתיל-די-די-לזאן (HMDS) על-ידי טבילת הרקמות בתמיסות הבאות: 100% IPA: HMDS (2:1; v/v) למשך 10 דקות, ואחריו 100% IPA: HMDS (1:2; v/v) למשך 10 דקות, ולבסוף 100% HMDS למשך הלילה.
      הערה: HMDS הוא רעיל. יש לעבוד מתחת למכסה אדים במהלך כל שלבי הייבוש.
    4. הסר את הרקמות מתמיסת HMDS ואפשר להן להתייבש מתחת למכסה המנוע של האדים במשך שעה אחת. הרכיבו את החלק על פיני אלומיניום באמצעות סרט מוליך דו-צדדי מפחמן או משחה מוליכה כסופה להדמיית SEM.

5. התפלגות הומוגנית של תאים אקסוגניים על לומן קנה הנשימה המנוקד

  1. הכינו קנה הנשימה של חולדה שעבר דה-אפיתל באמצעות הפרוטוקול בשלב 3. הפשרה של תאי גזע מזנכימליים קפואים (MSCs) במשך 30 שניות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: במחקר זה, השתמשנו בתאי גזע מזנכימליים (MSCs) כתא מודל כדי להראות את התפלגותם של תאים אקסוגניים על קנה הנשימה הדה-אפיתליאלי. באופן אידיאלי, תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה, תאי בסיס או תאים פלוריפוטנטיים מושרים-אנושיים (iPSCs) יכולים לשמש למטרות התחדשות אפיתל.
  2. ספרו את התאים עם המוציטומטר והכינו תמיסת תאים בריכוז של 5 x 106 תאים/מ"ל. סמן את התאים באופן פלואורסצנטי על ידי דגירה של התאים ב-2 מ"ל של תמיסת CFSE (ריכוז: 100 μM) בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. שטפו את התאים ב-5 מ"ל של 1x PBS במשך 3x והחזירו את התאים לתרבית טרייה בריכוז סופי של 3 x 107 תאים/מ"ל.
  3. הכן תמיסת קדם-ג'ל הידרוג'ל ככלי להעברת תאים. לצורך מחקר זה, השתמש בקולגן I ככלי אספקה לתאי MSCs ופעל לפי הוראות היצרן כדי להכין את הקדם-ג'ל. לדוגמה, כדי לקבל 3.6 מ"ג/מ"ל קולגן לפני ג'ל, יש לערבב חלק אחד של תמיסת הנטרול המצוננת עם תשעה חלקים של קולגן זנב החולדה בצינור סטרילי של 1.5 מ"ל. לאחר מכן, טפטפו בעדינות את התערובת למעלה ולמטה לערבוב הולם.
    הערה: ניתן להשתמש בהידרוג'לים אחרים הניתנים להתאמה ביולוגית במקום קולגן I בהתאם למחקר ולצרכי המשתמש.
  4. לאחר הכנת תמיסת ההידרוג'ל, הוסיפו את התאים במהירות לתמיסה בריכוז הרצוי (למשל, 5 x 106 תאים/מ"ל). כדי לקבל תערובת תא-הידרוג'ל אחידה, ערבבו את התאים ואת תמיסת הג'ל על ידי צנרת עדינה עם מיקרופיפט.
  5. חבר קצה אחד של קנה הנשימה בתוך הביוריאקטור למשאבת מזרק ניתנת לתכנות באמצעות מחבר Luer. ספק 5 מ"ל של מדיום תרבית טרי ב-37 מעלות צלזיוס לתוך תא הביוריאקטור כדי לכסות את פני השטח החיצוניים של קנה הנשימה באמצעות משאבת המזרק בקצב זרימה של 5 מ"ל לדקה.
  6. תנו בולוס של 10 μL של תערובת התאים-הידרוג'ל לתוך קנה הנשימה שעבר דה-אפיתל בתוך הביוריאקטור באמצעות משאבת המזרק בקצב זרימה של 5 מ"ל/דקה כדי ליצור שכבת תא-הידרוג'ל על לומן קנה הנשימה (איור 4).
  7. לאחר הזרקת תאים, יש למקם את הביוריאקטור בחממת תרביות תאים סטרילית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לג'לציה. עבור קולגן I, הג'לציה מתרחשת תוך 30 דקות.
  8. כדי לדמיין את התפלגות התאים המושתלים, עיקרו את עדשת ה-GRIN על ידי ניגוב עם 70% IPA או אתנול והניחו את הביוריאקטור על שלב ההדמיה. צלם תמונות וסרטונים הן במצבי שדה בהיר והן במצבי פלורסנט לפי הצורך.
  9. לאחר 30 דקות של זריעת תאים, מחדירים 1 מ"ל של מדיום תרבית לתוך לומן קנה הנשימה באמצעות משאבת מזרק בקצב זרימה של 1 מ"ל לדקה.
  10. תרבית את קנה הנשימה שנזרע בתאים בתוך הביוריאקטור באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס לזמן הרצוי. לתרבית ארוכת טווח, רעננו את מדיום התרבית בקנה הנשימה לומן ובתא הביוריאקטור כל 24 שעות. במהלך תרבית התאים, שמרו את המדיה בתוך הלומן סטטי ומשנים אותה כל 24 שעות, בעוד שהמדיה שמחוץ לקנה הנשימה מתפרצת באופן רציף באמצעות זרימה חד כיוונית של 5 מ"ל/דקה.
  11. לאחר התרבות התאים במשך פרק זמן מסוים (למשל, יום ו-4 ימים במחקר זה), הסירו את קנה הנשימה מהביוריאקטור. השתמש במספריים כדי לחתוך את קנה הנשימה באורך לשני חלקים חצי צילינדריים (כלומר, חלקים עליונים ותחתונים) בימים 1 ו -4 של תרבית במבחנה כדי לחשוף את המשטחים הפנימיים לניטור צמיחת התא וחישוב צפיפות התא. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי כדי לדמיין את התאים על המשטחים הפנימיים.
  12. כדי להשיג את התמונות באמצעות תוכנת Micro-Manager, בצע את השלבים 3.5 ו- 3.6. השתמש במסנן איזותיוציאנט פלואורסצנטי (FITC) כדי להמחיש את התאים המסומנים ב- CFSE במצב פלואורסצנטי. נתחו את התמונות שצולמו על ידי המיקרוסקופ הפלואורסצנטי וחשבו את צפיפות התאים בחלקים העליונים והתחתונים באמצעות תוכנת ImageJ. כדי לחשב את מספר התאים ואת צפיפות התאים, בצע את השלבים הבאים.
    1. פתח תמונה בתוכנת ImageJ והמר את התמונה לתמונה בינארית (16 סיביות) באמצעות סוג > תמונה > 16 סיביות. הגדר את קנה המידה של התמונה עם סרגל קנה המידה באמצעות נתח > קנה המידה של הסט.
    2. התאם את סף התמונה כדי להדגיש את המבנים של התאים לספירה. השתמש > תמונה התאם את סף >. השתמש ב-Analyze > ניתוח חלקיקים כדי לספור את מספר התאים. חשב את צפיפות התאים על ידי חלוקת מספר התאים בשטח הפנים של התמונה.
  13. כדי להעריך את הכדאיות לאחר זריעת תאים, השתמש בערכת כדאיות תאים. לצורך מחקר זה, דגירה של רקמת קנה הנשימה והתאים בביוריאקטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות והכתימו את התאים ב-4 mM calcein-AM ו-2 mM ethidium homodimer-1 ב-1 מ"ל של 1x PBS בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  14. לאחר שטיפה עם 1x PBS, דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ספור את התאים החיים והמתים באמצעות השלבים המתוארים בשלב 5.12. חשב את הכדאיות של התאים כאחוז התאים החיים (המוכתמים ב-calcein-AM) לכל סך התאים (תאים חיים ומתים כאחד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטת ההדמיה in situ המבוססת על עדשת GRIN יכולה לאפשר הדמיה של הלומן הפנימי של קנה הנשימה באתרו (איור 5A). באמצעות שיטת הדמיה זו, ניתן לקבל גם תמונות בשדה בהיר וגם תמונות פלואורסצנטיות של קנה הנשימה הטבעי ושל קנה הנשימה שעבר דה-אפיתל (איור 5B,C). לא נצפה אות פלואורסצנטי מקנה הנשימה המקומי לפני תיוג CFSE (איור 5Bii). עם זאת, כאשר אפיתל קנה הנשימה סומן בצבע CFSE, אות פלואורסצנטי אחיד (ירוק) נצפה לאורך כל האפיתל (איור 5Ci). לאחר דה-אפיתליאליזציה באמצעות SDS והשקיית דרכי הנשימה בסיוע רעידות, עוצמת האות הפלואורסצנטי ירדה באופן משמעותי (איור 5Cii), מה שמצביע על אבלציה של האפיתל.

תמונות H&E של קנה הנשימה שעבר דה-אפיתל הראו את הסרת האפיתל המדומה מלומן קנה הנשימה ושימור התאים והמיקרו-מבנה ECM בשכבות הרקמה שמתחת (איור 6A). יתר על כן, פנטכרום (איור 6B) וכתמי טריכרום (איור 6C) אישרו את השמירה על ארכיטקטורת רקמת קנה הנשימה ורכיבי ה-ECM, כגון קולגן ופרוטאוגליקנים. יתר על כן, אימונופלואורסצנציה של תאי אפיתל (מולקולת הידבקות תאי אפיתל, EpCAM; איור 6D) וקולגן I (איור 6E) חשף הסרה מלאה של האפיתל ושימור של קולגן I בתוך הרקמה התת-אפיתלית. הדמיית SEM של קנה הנשימה המקומי הראתה כי פני השטח הלומינליים של קנה הנשימה הטבעי של חולדות היו מאוכלסים בעיקר בתאים מרובי צילאים ותאי גביע. מצד שני, תמונות SEM של לומן קנה הנשימה שעבר דה-אפיתל הראו כי קרום המרתף נחשף כפי שמצוין על ידי רשת רשת של סיבי ECM והיעדר תאי אפיתל (איור 6F).

באמצעות שימוש בקנה הנשימה של חולדות שעברו דה-אפיתל ותאים המסומנים באופן פלואורסצנטי, חקרנו אם שילוב הידרוג'ל ככלי להעברת תאים יכול להשיג התפלגות תאים הומוגנית על לומן קנה הנשימה שעבר דה-אפיתל (איור 7A,B). במחקר זה, תאי הגזע המזנכימליים (MSCs) שימשו כתאי המודל לחקר העברת התאים והתרביות. כפי שתואר בפרוטוקול (שלב 5), החדירנו קולגן I קדם-ג'ל טעון MSC לקנה הנשימה של חולדות שעבר דה-אפיתל ועקבנו אחר התפלגות התאים על לומן קנה הנשימה באמצעות מערכת ההדמיה של עדשת GRIN. כניסוי בקרה, השעינו את ה-MSCs בתווך התרבית, החדירנו את מדיום התרבית הטעון בתאים לקנה הנשימה, ובדקנו באופן חזותי את התפלגות התאים. תוצאות ההדמיה באתרן הראו שהתאים המסומנים בפלואורסצנטיות המועברים באמצעות הידרוג'ל נשארו דבוקים באופן אחיד יותר על פני לומן מאשר אלה שנזרעו באמצעות מדיום תרבית (איור 7B). לאחר מכן בדקנו את יכולת הכדאיות של התא לפני ואחרי מסירת התאים כדי להעריך את הנזק והמוות הפוטנציאליים לתאים כתוצאה מלחץ גזירה במהלך עירוי תאים. התוצאה הראתה שחיוניות התאים לא הושפעה באופן משמעותי מהליך העברת התאים, שכן יותר מ-90% מהתאים נשארו בני קיימא (איור 7C).

יתר על כן, תרביתנו את קנה הנשימה של זרעי התאים במשך 4 ימים. התאים שנזרעו הן באמצעות קולגן והן באמצעות מדיום תרבית (בקרה) התרבו על פני השטח של לומן קנה הנשימה שעבר דה-אפיתל, כפי שמעיד המספר המוגבר של תאים המבטאים CFSE לאורך זמן הן בחצי העליון והן בחצי התחתון של לומן קנה הנשימה (איור 7D). יש לציין כי בקבוצת אספקת ההידרוג'ל קולגן, ההבדל בצפיפות התאים בין לומן עליון לתחתון היה קטן יותר מזה שבקבוצת הביקורת, מה שמעיד על כך שהעברת תאים באמצעות הידרוג'ל מקדמת התפלגות תאים הומוגנית לאורך לומן קנה הנשימה.

Figure 1
איור 1: ציור ממוחשב תלת-ממדי (תלת-ממדי) של הביוריאקטור של קנה הנשימה. (B) ממדי תא הביוריאקטור. (C) יריעת פלסטיק אקרילית שקופה נחתכת ומחוברת לחלק העליון של החדר הראשי באמצעות ברגים. יחידה = מ"מ; R = רדיוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הדמיית מיקרו-סיבים שנבנתה בהתאמה אישית להדמיה באתרה של קנה הנשימה של החולדה. (A) (i) שרטוט של רכיבי הגדרת ההדמיה של נתיב האור. קיצורים: C = מצלמה, TL = עדשת צינור, F = מסנן, DM = מראה דיכרונית, OL = עדשה אובייקטיבית; (ii) תצלום של רכיבי מערך ההדמיה המציגים את גשושית ההדמיה (עדשת GRIN) מוכנס למחבר Luer של הביוריאקטור. (B) סכמטית מראה שעדשת ה-GRIN משולבת עם הביו-ריאקטור. (C) תצלום המציג את גשושית ההדמיה משמש להדמיית קנה הנשימה בתוך הביוריאקטור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הפלטפורמה לדה-אפיתליאליזציה של קנה הנשימה של חולדה. (B) דיאגרמה המציגה את הרכיב וההרכבה של השייקר האלקטרומגנטי שנבנה בהתאמה אישית ומשמש להקלה על הסרת אפיתל. ω: תדירות, a: משרעת (C) סכמטית המציגה את זרימת העבודה של הליך דה-אפיתליזציה של קנה הנשימה של חולדה. PBS = מלח בעל מאגר פוספט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: העברה של תאים אקסוגניים לקנה הנשימה של חולדה שעברה דה-אפיתל באמצעות הידרוג'ל. סכמטית המציגה תמיסת הידרוג'ל המשמשת ככלי הובלה להפקדה מקומית של התאים על הלומן הפנימי של קנה הנשימה של חולדה שעבר דה-אפיתל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: הדמיה באתרה של קנה הנשימה הדה-אפיתליאלי. (A) תצלום המציג הדמיה פלואורסצנטית של לומן קנה הנשימה בזמן שהאפיתל המסומן ב-CFSE מתרגש עם לייזר כחול 488 ננומטר דרך עדשת GRIN. (B) (i) תמונות שדה בהיר ו-(ii) פלואורסצנציה של לומן קנה הנשימה לפני תיוג אפיתל. (C) תמונות פלואורסצנטיות של (i) ילידי ו-(ii) קנה הנשימה דה-אפיתליאלי (קנה הנשימה De-Epi) בעוד שהאפיתל מסומן בצבע פלואורסצנטי CFSE. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: ניתוחי היסטולוגיה, אימונופלואורסצנציה ו-SEM של קנה הנשימה של חולדות מקומיות ודה-אפיתליאליות. (א) צביעת H&E. (B) צביעת פנטכרום כאשר סגול הוא ציטופלסמה של תאים, כחול הוא גרעיני תאים, ירוק הוא פרוטאוגליקנים (למשל, מוצין), וצהוב הוא סיבי קולגן. (C) צביעת טריכרום שבה ורוד הוא ציטופלסמה של תאים, כחול כהה הוא גרעיני תאים, וכחול הוא קולגן. תמונות פלואורסצנטיות של קנה הנשימה הטבעי והדה-אפיתליאלי. (D) EpCAM ו-(E) קולגן I. ראשי חץ מראים את פני השטח של לומן קנה הנשימה. (F) מיקרוגרפי SEM של לומן קנה הנשימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: תצהיר מקומי של ה-MSCs האקסוגניים בלומן קנה הנשימה. (A) (i) שדה בהיר ו-(ii) תמונות פלואורסצנטיות של קנה הנשימה דה-אפיתל. (B) תמונות פלואורסצנטיות של לומן קנה הנשימה שעבר דה-אפיתל כאשר הוא נזרע עם (i) PBS ו-(ii) קולגן I pre-gel. ההתפלגות ההומוגנית של התאים על קנה הנשימה לומן מושגת כאשר קולגן טרום-ג'ל משמש ככלי אספקה לתאים. (C) (i) תמונות פלואורסצנטיות ו-(ii) כימות הכדאיות של התאים לפני ואחרי 6 שעות של אספקה על ידי קולגן טרום-ג'ל. n: מספר הדגימות. שלבים 5.1 ו-5.17 של הפרוטוקול בוצעו כדי להעריך את הכדאיות של התאים. (D) צפיפות זריעת התאים נמדדת לאחר (1) יום אחד ו-(ii) 4 ימים לאחר זריעת התאים ותרביתם. צפיפות התאים חושבה על ידי חלוקת מספרי התאים בשטח הפנים הנבדק. כל הערכים מייצגים סטיית תקן ממוצעת ±. ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) שימש לקביעת הבדלים מובהקים סטטיסטית בין קבוצות, כאשר p < 0.05 נחשב למשמעותי. קיצורים: CM = מדיום תרבות, C = קולגן. *עמ' < 0.05. **עמ' < 0.01. ns: לא משמעותי. היעדר הבדל משמעותי (ns) בין המשטחים העליונים והתחתונים פירושו התפלגות תאים אחידה על פני היקף קנה הנשימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעבודה זו יצרנו ביוריאקטור מונחה הדמיה שיכול לאפשר (1) ניטור של לומן קנה הנשימה באתרו לאחר הסרת התאים והעברת התאים האקסוגנית ו-(ii) תרבית חוץ גופית ארוכת טווח של רקמת קנה הנשימה הזורע בתאים. באמצעות ביוריאקטור זה שנבנה בהתאמה אישית, הדגמנו (1) הסרה סלקטיבית של תאי האפיתל האנדוגניים מלומן קנה הנשימה באמצעות שטיפת דרכי הנשימה בעזרת חומרי ניקוי ורטט, ו-(2) התפלגות אחידה של תאים אקסוגניים על פני השטח הלומינליים של קנה הנשימה המדולדל באמצעות קולגן I טרום-ג'ל טעון תאים. יתר על כן, שיטת ההדמיה מבוססת עדשת GRIN אישרה את הסרת האפיתל באתרו. יתר על כן, עם ניתוחים נוספים, כולל H&E, טריכרום, פנטכרום, צביעת אימונופלואורסצנציה ו- SEM, אישרנו את הסרת האפיתל ואת תחזוקת הארכיטקטורה והרכיבים של שכבות הרקמה הבסיסיות. בנוסף, הדמיה מבוססת עדשת GRIN של MSCs אקסוגניים שזה עתה הושתלו הראתה את ההתפלגות האחידה של התאים כאשר קולגן I pre-gel שימש ככלי משלוח. לבסוף, התאים המושתלים שרדו והתרבו על קנה הנשימה שעבר דה-אפיתל, מה שמדגיש את היעילות של הביוריאקטור בתרבית ארוכת הטווח של רקמות דרכי הנשימה שנזרעו בתאים.

השלב הקריטי בפרוטוקול הדה-אפיתליזציה הוא יצירת שכבת תמיסת דטרגנט דקה בקנה הנשימה לומן. בפרוטוקולי הדה-תאיזציה הנוכחיים, נעשה שימוש במחזורים מרובים של כימיקלים ואנזימים לאורך תקופה ארוכה, מה שמפחית את מספר סיבי הקולגן, הגליקוסמינוגליקנים (GAGs), הפרוטאוגליקנים והכונדרוציטים, ובכך פוגע בתכונות הביולוגיות והביו-מכניות של פיגומי דרכי הנשימה 19,20,21. מצד שני, ה-ECM מספק רמזים ביוכימיים ומכניים וסביבות פיזיות מתאימות להישרדות, התפשטות והתמיינות של תאים אקסוגניים מושתלים22,23. שיטת התצהיר של הסרט הדק המתוארת במחקר זה משתמשת בכמות קטנה של חומרי ניקוי (פחות מ-50 μL) עבור אבלציה של אפיתל, תוך שהיא מאפשרת שימור של שכבת הרקמה הבסיסית ורכיבים תאיים תת-פיתליאליים. רטט מכני של הרקמה החשופה לחומרי ניקוי שהוכח במחקר זה הוא הליך חשוב שכן הוא מאפשר ניתוק ופינוי של התאים החשופים. פסולת התאים והתאים שהופרעו חלקית כתוצאה מחשיפה של האפיתל לחומר הניקוי מאתגרים להישטף רק על ידי הצפת קנה הנשימה בתמיסת הכביסה. לכן, רטט מכני של קנה הנשימה במהלך הכביסה מספק מספיק כוחות גזירה כדי לנקות את פסולת התאים מלומן קנה הנשימה.

באופן כללי, גישת זריעת התאים המבוססת על קדם-ג'ל יכולה להיות מושפעת ממהירות המסירה, מהצמיגות של הקדם-ג'ל (הקשורה ישירות לריכוז טרום הג'ל), ממתח הפנים ומזמן הג'לציה. בפרט, במהלך הכנת טרום ג'ל, חיוני לשמור על ריכוז טרום ג'ל נמוך מספיק כדי להעביר את הקדם-ג'ל המרחף בתאים בצינורות וגבוה מספיק כדי לשמור על התאים על פני השטח העליונים של קנה הנשימה. לכן, מומלץ מאוד למצוא את הריכוז האופטימלי עבור כל pre-gel על ידי בדיקת ריכוזים שונים. בנוסף, תרגלו את טכניקת ההעברה כגון מהירות האספקה עם תאים פחות יקרים כדי להבטיח אספקה מוצלחת של הקדם-ג'ל הטעון בתאים. יתר על כן, בעוד שהשתמשנו ב-MSCs כמודל תאי כדי להדגים (i) את התפלגות התאים עם קדם-ג'ל ככלי אספקה ו-(ii) את היכולת של מערכת הביו-ריאקטורים לגדל את התאים החדשים שנזרעו על לומן קנה הנשימה המוזנח, השימוש בתאי גזע (למשל, תאי בסיס) ותאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה במחקרים עתידיים יכול לאפשר מחקר של התמיינות תאים והתחדשות תפקודית של תאי אפיתל24, 25. בנוסף, מחקרים עתידיים יכולים לכלול הוספת ממשק אוויר-נוזל (ALI) לפלטפורמה הנוכחית כדי ליצור לחץ גזירה דמוי in vivo על תאים שנזרעו לצורך יצירת אפיתל תפקודי. כדי להוסיף ALI למכשיר הנוכחי, ניתן לחבר מאוורר קטן לבעלי חיים למפרצון קנה הנשימה כדי לאוורר את קנה הנשימה. יתר על כן, כדי להשיג את ALI, ניתן להשתמש בשיטת התצהיר של הסרט הדק כדי להחדיר תקע נוזל בינוני תרבית לקנה הנשימה הזורע בתאים. ניתן לווסת את עובי הסרט הנוזלי על ידי שינוי מהירות התקע הנוזלי26,27. ניתן ליזום את התקע לאחר שהתאים החדשים שנזרעו נדבקים וחותכים בחוזקה על לומן קנה הנשימה.

בנוסף, גישת ההדמיה מבוססת עדשות IN SITN GRIN המשמשת בפרוטוקול זה היא קריטית לאישור היעילות של הדה-אפיתליזציה ולהערכת איכות ההפצה של תאים שנזרעו לאחרונה. בניגוד לשיטות קונבנציונליות לניתוח רקמות, כגון היסטולוגיה ואימונופלואורסצנציה, הדורשות לנתח את הדגימות מרקמת קנה הנשימה לצורך ניתוח, פלטפורמת ההדמיה שפותחה במחקר שלנו מאפשרת ניטור מהיר ולא הרסני של לומן דרכי הנשימה במהלך דה-אפיתליזציה והעברת תאים. כדי לשמור על עיקור קנה הנשימה במהלך הדמיית in situ , הקפידו לעקר את עדשת ה-GRIN על ידי ניגובה ב-70% IPA או אתנול לפני הכנסתה לקנה הנשימה לומן. יתר על כן, כדי לדמות את התאים באמצעות עדשת GRIN, התאים (תאי אפיתל קנה הנשימה האנדוגניים או תאים שהושתלו לאחרונה) יכולים להיות מסומנים בצבעים פלואורסצנטיים שונים עם אורכי גל שונים של עירור/פליטה. לשם כך, הקפידו להשתמש במחולל אורות הלייזר המתאים כדי לעורר את התאים המסומנים באופן פלואורסצנטי ולשלב את עדשות המסנן הנכונות במראה הדיכרואית בעלת הרזולוציה הגבוהה ביותר.

למרות החידוש והחדשנות של הדה-אפיתליזציה, העברת התאים ושיטות ההדמיה באתרן , למחקר זה יש מספר מגבלות. שיטות הדה-אפיתליאליזציה והובלת התאים שתוארו במחקר זה ישימות לדרכי אוויר קטנות (קוטר: פחות מ-3-4 מ"מ) שבהן מתח הפנים דומיננטי. יצירת תקע נוזלי ויצירת סרט דק של תמיסת הדה-אפיתליזציה או תרחיף קדם-ג'ל טעון תאים בדרכי אוויר גדולות יותר, כגון קנה הנשימה של חזירים וקנה הנשימה האנושי, או ברונכי, יכולים להיות מאתגרים ככל שמתח הפנים הופך זניח בהשוואה לכוחות אחרים, כוח הכבידה בפרט. יתר על כן, על ידי שימוש בגישת התצהיר של הסרט הדק ווויסות הזמן והריכוז, הצלחנו לנפח את האפיתל עם חומר ניקוי חזק (SDS) ולשמר את שכבת הרקמה הבסיסית. במחקרים עתידיים, לעומת זאת, ניתן לבדוק דטרגנטים מתונים יותר של דה-תאיזציה, כגון 3-[(3-כולמידופרופיל)-דימתילאמוניו]-1-פרופנסולפונט (CHAPS)28, או תמיסה שאינה דטרגנטית, כגון נתרן הידרוקסיד (NaOH)29, לשימור רכיבי ECM ולתמיכה בתאים שהושתלו לאחרונה. יתר על כן, עוצמת הפלואורסצנציה של תאים המסומנים ב-CFSE פוחתת עם הזמן עקב חלוקת התאים. במחקר שלנו, התמונות הפלורסנטיות של MSCs שעברו תרבית על קנה הנשימה שעבר דה-אפיתל במשך 4 ימים הראו ירידה משמעותית בעוצמת הפלואורסצנציה שלהם. לניטור ומעקב ממושך אחר תאים אקסוגניים שנזרעו על פיגומי הרקמה, יהיה צורך בשיטות שונות לסימון תאים שיכולות לאפשר תיוג פלואורסצנטי ארוך טווח או קבוע של התאים.

אנו צופים כי הפלטפורמה הביוריאקטורית מונחית ההדמיה ופרוטוקולי ההסרה וההעברה של תאים המתוארים בדו"ח זה יכולים לאפשר יצירת פיגומים של רקמות דרכי הנשימה שעברו דה-אפיתל, שניתן להשתמש בהם כדי ליצור את רקמות דרכי הנשימה המהונדסות ביולוגית. דרכי אוויר כאלה במבחנה יכולות להציע מודלים במבחנה בנאמנות גבוהה של מחלות בדרכי הנשימה האנושיות ובדיקת תרופות. לדוגמה, כדי לבסס אפיתל תפקודי של דרכי הנשימה, ניתן להשתיל תחילה תאי גזע בסיסיים של דרכי הנשימה על רקמת דרכי הנשימה שעברה דה-אפיתל30. לאחר מכן, ממשק האוויר-נוזל (ALI), שהוא קריטי להתמיינות של תאי גזע בסיסיים לתאי אפיתל שונים, יכול להיווצר בתוך קנה הנשימה. יתר על כן, ניתן לשנות את מערכת ההדמיה in situ ולהשתמש בה כדי לדמיין באופן פלואורסצנטי את דרכי הנשימה של חולים עם הפרעות בדרכי הנשימה של הריאות. כדי לשמש קלינית להערכת רקמות דרכי הנשימה באתרן, ניתן להחליף את עדשת ה-GRIN הנוקשה בבדיקות הדמיה גמישות של סיבים אופטיים כדי לנווט בדרכי הנשימה. יתר על כן, היכולת להפיץ באופן הומוגני את התאים בתוך דרכי הנשימה באמצעות זריעת תאים על בסיס הידרוג'ל יכולה לספק הזדמנות חסרת תקדים להחליף אפיתל פגום או פצוע בחולים. בפרט, גישת החלפת התאים שפותחה ונעשה בה שימוש במחקר זה יכולה להאיץ טיפול מבוסס תאים לטיפול בהפרעות נשימה, כגון סיסטיק פיברוזיס ודיסקינזיה סילארית ראשונית, ולתיקון ריאות התורם שמסורבות להשתלה עקב רקמות דרכי הנשימה שנפצעו קשה 31,32,33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר של קרן האגודה האמריקאית לרפואת החזה, קרן הבריאות של ניו ג'רזי, והקרן הלאומית למדע (פרס CAREER 2143620) לג'יי קיי; והמכונים הלאומיים לבריאות (P41 EB027062) ל- G.V.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1× PBS Gibco, Thermo Fisher Scientific 10-010-031
3-port connector World Precision Instruments 14048-20
4-port connector World Precision Instruments 14047-10
Accelerometer STMicroelectronics IIS3DWBTR
Achromatic doublet Thorlabs AC254-150-A-ML
Aluminum pin stub TED PELLA 16111
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062
Assembly rod Thorlabs ER1
Button head screws McMaster-Carr 91255A274
Cage cube Thorlabs C4W
Carbon double-sided conductive tape TED PELLA 16073
CFSE labelling kit Abcam ab113853
Citrisolv (clearing agent) Decon 1061
C-mount adapter Thorlabs SM1A9
Collagen I Advanced BioMatrix 5153
Conductive liquid silver paint TED PELLA 16034
Dichroic mirror Semrock DI03-R488 Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco, Thermo Fisher Scientific 11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapter Cole-Parmer EW-45501-30
Female luer to tubing barb Cole-Parmer EW-45508-03
Female to male luer connector Cole-Parmer ZY-45508-80
Fetal bovine serum Gibco, Thermo Fisher Scientific 10082147
Filter lens Chroma Technology Corp ET535/50m
Fluorescent microscope Nikon Eclipse E1000 - D
Fusion 360 Autodesk
Hex nut McMaster-Carr 91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS) Fisher Scientifc AC120585000
Imaging fiber SELFOC, NSG group GRIN lens
Laser Opto Engine MDL-D-488-150mW
Lens tubes Thorlabs SM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) Thermo Fisher Scientific L3224
MACH 3 CNC Control Software Newfangled Solutions
Objective lens Olympus UCPLFLN20X
Peristaltic Pump Cole Parmer L/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basic PeproTech 100-18B
Retaining ring Thorlabs SM1RR
Scientific CMOS camera PCO Panda PCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfate VWR 97064-472
Solidworks (2019) Dassault Systèmes
Stackable lens tube Thorlabs SM1L10
Subwoofer plate amplifier Dayton Audio SPA250DSP
Subwoofer speaker Dayton Audio RSS21OHO-4 Diaphragm diameter: 21 cm
Syringe Pump World Precision Instruments AL-4000
Threaded cage plate Thorlabs CP33
Threaded luer adapter Cole-Parmer EW-45513-81
Tube lens Thorlabs AC254-150-A-ML
Tygon Tubing Cole-Parmer 13-200-110
XY Translator Thorlabs CXY1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
  3. Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
  4. Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
  5. De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
  6. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  7. Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
  8. Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
  9. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  10. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
  11. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  12. Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
  13. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
  14. Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
  15. Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
  16. Planchard, D. Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , SDC Publications. (2022).
  17. Coward, C. A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , No Starch Press. (2019).
  18. Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
  19. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  20. Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
  21. Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
  22. Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
  23. Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
  24. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
  25. Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
  26. Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
  27. Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
  28. O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
  29. Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
  30. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
  31. O'Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
  32. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
  33. Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
  34. Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 182
ביוריאקטור מונחה הדמיה ליצירת רקמת נתיב אוויר מהונדסת ביולוגית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mir, S. M., Chen, J., Pinezich, M.… More

Mir, S. M., Chen, J., Pinezich, M. R., O’Neill, J. D., Guenthart, B. A., Vunjak-Novakovic, G., Kim, J. Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue. J. Vis. Exp. (182), e63544, doi:10.3791/63544 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter