Summary
Protokol, endojen epitelin sıçan trakeasından seçici olarak çıkarılmasına ve lümen yüzeyindeki eksojen hücrelerin homojen dağılımına izin veren, ardından hücre dokusu yapısının uzun süreli in vitro kültürüne izin veren görüntüleme özellikli bir biyoreaktörü tanımlar.
Abstract
Hava yolu dokusunda tekrarlanan yaralanmalar akciğer fonksiyonunu bozabilir ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi kronik akciğer hastalığına neden olabilir. Rejeneratif tıp ve biyoreaktör teknolojilerindeki ilerlemeler, ilaçları taramak, hastalıkları modellemek ve doku replasmanlarını mühendislik yapmak için kullanılabilecek laboratuarda yetiştirilen fonksiyonel doku ve organ yapıları üretme fırsatları sunmaktadır. Burada, minyatür bir biyoreaktör, in vitro doku manipülasyonu ve kültürü sırasında ekşi sıçan trakeasının iç lümeninin in situ olarak görselleştirilmesini sağlayan bir görüntüleme yöntemi ile birlikte tanımlanmıştır. Bu biyoreaktörü kullanarak, protokol, endojen hücresel bileşenlerin görüntüleme rehberliğinde seçici olarak çıkarılmasını gösterirken, hava yolu doku matrisinin içsel biyokimyasal özelliklerini ve ultrayapısını korur. Ayrıca, desellülarize hava yolu lümenindeki eksojen hücrelerin in situ optik izleme ile verilmesi, homojen dağılımı ve daha sonra uzamış kültürü gösterilmiştir. Sonuçlar, görüntüleme rehberliğindeki biyoreaktörün, fonksiyonel in vitro hava yolu dokularının oluşumunu kolaylaştırmak için potansiyel olarak kullanılabileceğini vurgulamaktadır.
Introduction
Solunum yolunun luminal yüzeyi, esas olarak çok siliyerli, kulüp, kadeh ve bazal kök hücrelerden oluşan bir epitel tabakası ile kaplıdır 1,2. Epitel tabakası, akciğerin birincil savunma mekanizması olarak işlev görür ve altta yatan hava yolu dokusunu solunan patojenlere, partiküllere veya kimyasal gazlara karşı koruyan biyofiziksel bir bariyer görevi görür. Hava yolu dokusunu, hücreler arası sıkı bağlantı oluşumu, mukosiliyer klirens ve antimikrobiyal ve antioksidan sekresyon 3,4 dahil olmak üzere çoklu mekanizmalarla korur. Kusurlu hava yolu epiteli, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH)5, primer siliyer diskinezi (PCD)6 ve kistik fibroz (KF)7 gibi yıkıcı solunum yolu hastalıkları ile ilişkilidir.
Çip üzerinde akciğer (LOC) teknolojisindeki ilerlemeler, insan akciğer gelişimini incelemek, çeşitli akciğer hastalıklarını modellemek ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş in vitro ortamlarda yeni terapötik materyaller geliştirmek için bir fırsat sunmaktadır. Örneğin, hava yolu epiteli ve endotel, akciğer dokusunu değiştiren gazı taklit etmek için ince, gözenekli bir zarın zıt taraflarında kültürlenebilir, bu da sadık hastalık modellemesine ve ilaç testine izin verir8. Benzer şekilde, KOAH9 ve kistik fibroz10 gibi in vitro hava yolu hastalıklarını modellemek için in vitro hastalık modelleri oluşturulmuştur. Bununla birlikte, LOC cihazlarının en büyük zorluğu, akciğer dokusunun karmaşık üç boyutlu (3D) mimarisini ve in vitro11 dinamik hücre-doku matris etkileşimlerini özetlemektir.
Son zamanlarda, ex vivo akciğer dokularının manipülasyonuna izin veren yenilikçi doku mühendisliği metodolojileri geliştirilmiştir12. Bu metodolojiler kullanılarak, endojen hücrelerin akciğer dokusundan kimyasal, fiziksel ve mekanik işlemlerle çıkarılmasıyla reddedilen allojenik veya ksenojenik doku greftleri hazırlanabilir13. Ek olarak, desellülarize akciğer iskelelerindeki korunmuş doğal doku hücre dışı matrisi (ECM), implante edilmiş hücrelerin14,15'i bağlaması, çoğalması ve ayırt etmesi için fizyo-mimetik yapısal, biyokimyasal ve biyomekanik ipuçları sağlar.
Burada, in vitro doku manipülasyonuna ve ekşimiş sıçan trakeal dokularının kültürüne izin vermek için LOC ve doku mühendisliği teknolojilerinin birleştirilmesiyle oluşturulan görüntüleme rehberliğinde bir biyoreaktör sistemi bildirilmiştir. Bu hava yolu doku biyoreaktörünü kullanarak, protokol, hava yolu dokusunun altta yatan subepitelyal hücresel ve biyokimyasal bileşenlerini bozmadan endojen epitel hücrelerinin seçici olarak çıkarılmasını gösterir. Daha sonra, mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) gibi yeni tohumlanmış eksojen hücrelerin, hücre yüklü kollajen I jel öncesi çözeltisini aşılayarak inkar edilmiş hava yolu lümeni üzerindeki homojen dağılımını ve anlık birikimini göstereceğiz. Ayrıca biyoreaktöre entegre mikro-optik görüntüleme cihazı kullanılarak epitel çıkarılması ve endojen hücre iletimi sırasında trakea lümeninin görselleştirilmesi de yapılmaktadır. Ayrıca, trakea ve yeni implante edilen hücrelerin, 4 gün boyunca gözle görülür hücre ölümü ve doku bozulması olmadan biyoreaktörde kültürlenebileceği gösterilmiştir. Bu çalışmada kullanılan görüntüleme özellikli biyoreaktör platformunun, ince film bazlı deepitelizasyon tekniğinin ve hücre dağıtım yönteminin, in vitro hastalık modellemesi ve ilaç taraması için hava yolu dokularının oluşturulmasında yararlı olabileceğini öngörüyoruz.
Biyoreaktör, izole sıçan trakeasını kültürlemek için programlanabilir bir şırınga pompasına, perfüzyon pompasına ve vantilatöre bağlı dikdörtgen bir oda içerir. Biyoreaktör, trakeanın iç ve dış boşluklarına ayrı ayrı reaktifler (örneğin, kültür ortamı) beslemek için trakeaya veya doku kültürü odasına bağlı giriş ve çıkışlara sahiptir (Şekil 1). Özel yapım bir görüntüleme sistemi, in vitro kültürlü sıçan trakeasının içini hücresel düzeyde görselleştirmek için kullanılabilir (Şekil 2). Trakeanın endojen epiteli, deterjan bazlı bir desellülarizasyon çözeltisinin damlatılması ve ardından titreşim destekli hava yolu yıkama ile çıkarılır (Şekil 3). Tip I kollajen gibi hidrojel çözeltisi, eksojen hücrelerin denuded trakea lümeni boyunca düzgün ve anında tohumlanması için bir dağıtım aracı olarak kullanılır (Şekil 4). Biyoreaktörü inşa etmek ve deneyleri yürütmek için kullanılan tüm malzemeler Malzeme Tablosunda verilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki hayvan dokusu protokolü, Stevens Teknoloji Enstitüsü'ndeki Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi Enstitüsü'nün (IACUC) hayvan refahı kılavuzu ve düzenlemeleri tarafından onaylanmıştır ve deney hayvanlarının kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) kılavuzlarına uygundur.
1. Görüntüleme kılavuzlu sıçan trakea biyoreaktörünün tasarımı ve yapımı
- Sıçan trakea biyoreaktörünün tasarımı ve imalatı
- CAD jeneratör yazılımını kullanarak girişler, çıkışlar ve doku kültürü odası gibi ilgili tasarıma sahip biyoreaktör odasının bilgisayar destekli tasarım (CAD) modelini oluşturun. Bu etüt için, Şekil 1A-C'de sunulan geometriyi ve ölçümlendirmeleri kullanın. CAD jeneratör yazılımının öğreticisi16,17'de bulunabilir.
- Oluşturulan CAD modelini bir bilgisayar sayısal kontrol (CNC) denetleyici yazılımına aktarın ve biyoreaktör odasını oluşturmak için bir CNC makinesi kullanarak politetrafloroetilen (PTFE) plastiğini kesin. CNC kontrolör yazılımının öğreticisi18'de bulunabilir.
NOT: PTFE'ye ek olarak, kültür odasını imal etmek için ultra yüksek moleküler ağırlıklı polietilen (UHMWPE) ve polieterimid gibi diğer plastik malzemeler de kullanılabilir. - Cihazda kültürlenen doku ve hücrelerin kirlenmesini önlemek için Luer adaptörleri ve vidaları gibi tüm biyoreaktör bileşenlerini sterilize edin. Tüm biyoreaktör bileşenlerini temiz bir ortamda ana doku kültürü odasına monte edin (Şekil 1A).
- Degrade indeksi (GRIN) lens tabanlı görüntüleme cihazının yapımı
- Yerinde görüntüleme aygıtını oluşturmak için, istiflenebilir bir lens tüpüne bir tüp lens yerleştirin ve bir tutma halkası kullanarak sabitleyin. Lens tüpü düzeneğini bir C montaj adaptörü aracılığıyla bilimsel bir CMOS kameraya monte edin.
- Kamerayı çalıştırmak ve fotoğraf ve video almak için Micro-Manager gibi bir yazılım kullanın. Uzun bir mesafede (örneğin, kameradan 10 m uzaklıkta) bulunan bir nesneyi hedefleyin ve kullanılan görüntüleme yazılımı tarafından bilgisayar ekranında nesnenin odaklanmış bir görüntüsü oluşturulana kadar tüp lensi ile kameranın görüntüleme sensörü arasındaki mesafeyi ayarlayın.
- Çift kenarlı süper çözünürlüklü dikroik aynaya bir filtre lensi ve montaj çubuğu, dişli kafes plakası ve kafes küpü dahil olmak üzere optik kafes sistemi bileşenlerini kullanarak cihaza bir lazer takın.
- Hedef lensi (20x) cihaza bağlayın. XY çevirici aracılığıyla objektif tüpünün distal ucuna bir GRIN lens (çap = 500 μm) takın. Odaklanmış mikroskobik görüntüler oluşturmak için GRIN lens ile objektif lens arasındaki mesafeyi ayarlayın (Şekil 2A,B).
2. Sıçan trakeasının izolasyonu
- Cerrahi bölgeyi sterilize edin ve ameliyattan önce 30 dakika boyunca 121 ° C'de bir otoklav kullanarak cerrahi aletleri sterilize edin.
- İndüksiyon odasına bir sıçan yerleştirin ve hayvanı anestezik için küçük bir buharlaştırıcı kullanarak 15 dakika boyunca% 2.5 izofluran verin. Anestezi derinliğini pedal refleksi ile değerlendirin. Bunu yapmak için, ayak parmağını sıkıca sıkıştırın ve hayvanın ayak parmağı sıkışmasına cevap vermediğini onaylayın.
- Anesteziden sonra, izofluranı odadan çıkarın ve pulmoner vaskülatürde kanın pıhtılaşmasını önlemek için lateral kuyruk damarından 1 mL 1.000 ünite / mL heparin uygulayın.
- Hayvanı ötenazi yapmak için, hayvanı 15-20 dakika daha% 5 izoflurana maruz bırakın. Hayvanı indüksiyon odasından çıkarın ve cerrahi tahtaya yüzü yukarı bakacak şekilde sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
- Yapışkan bant kullanarak bacakları ve kuyruğu hareketsiz hale getirerek sıçanı cerrahi tahtaya sabitleyin. Daha sonra, sıçanın boyun ve göğüs bölgelerini% 70 izopropil alkol (IPA) kullanarak sterilize edin. Deride makas kullanarak 3-4 cm'lik bir kesi yaparak karın boşluğunu açın.
NOT: Makasın uçlarını yukarı doğru işaret ederek cildi derin kesmemeye dikkat edin. - İnferior vena kavayı (IVC) makas kullanarak transekte edin ve eksanguinasyon ile ötenaziyi onaylayın.
- Boynun orta hattında makas kullanarak bir kesi yaparak ve trakeayı açığa çıkararak trakeotomi yapın. Göğüs duvarında bir kesi yaparak ve akciğere bağlı trakea ucuna ulaşmak için kaburgalar arasında keserek orta hat torakotomi yapın. Daha sonra, trakeanın her iki ucunu kesmek ve trakeayı izole etmek için bir biseps ve makas kullanın.
- İzolasyondan sonra, trakeayı 20 mL 1x fosfat tamponlu salin (1x PBS) kullanarak durulayın. Trakeayı sterilize edilmiş biseps kullanarak biyoreaktöre aktarın. Trakeanın iki ucunu 4-0 dikiş ipliği kullanarak Luer konektörüne sabitleyin.
- Programlanabilir şırınga pompasını kullanarak biyoreaktör odasına 5 mL/dak akış hızında biyoreaktör odasına 5 mL kültür ortamı verin.
NOT: Kültür ortamı, Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM), rekombinant insan FGF-bazik (0.1 ng / mL), fetal sığır serumu (FBS,% 10) ve antibiyotik-antimikotik (% 1) 'den oluşur. - Biyoreaktör kapağını akrilik plastik kapak ve vidalarla sıkıca kapatın. Kültür ortamının boru içindeki akışını önlemek için biyoreaktör haznesi boru bağlantılarını erkek/dişi Luer tapalarıyla kapatın.
3. Trakea epitelinin görüntüleme eşliğinde çıkarılması
- Trakea lümenini parlak alanda veya floresanda görselleştirmek için, biyoreaktörü görüntüleme aşamasına yerleştirin (Şekil 3A).
- CFSE çözeltisini 1x PBS ile seyrelterek CFSE hücre etiketleme kitinde karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE) çözeltisi (konsantrasyon: 100 μM) hazırlayın.
NOT: Orijinal CFSE çözeltisinin konsantrasyonu 10 mM'dir (dimetil sülfoksit (DMSO)). - CFSE çözeltisinin 500 μL'sini, trakea kanülüne bağlı borudan şırınga pompası aracılığıyla trakeadan 5 mL / dak akış hızında infüze edin. CFSE çözeltisi trakeayı doldurduğunda pompayı durdurun. 10 dakika bekleyin ve ardından artık dahil edilmemiş CFSE reaktifini çıkarmak için şırınga pompasını kullanarak 10 mL 1x PBS infüzyonu ile trakea lümenini yıkayın.
- GRIN lensin distal görüntüleme ucunu, trakeanın bir ucuna takılı Luer konektörü aracılığıyla trakeaya yerleştirin. Ardından, trakea yüzeyi odaklanana kadar GRIN lensi trakeanın içinde yavaşça hareket ettirin ve 20x büyütmede parlak alanda veya floresanda fotoğraf ve video çekin.
- Micro-Manager yazılımında parlak alan görüntüleri yakalamak için aşağıdaki adımları izleyin.
- Trakea lümenini aydınlatmak için kafes küpünden beyaz ışık sokun. Trakeanın aydınlık yüzeyini gerçek zamanlı olarak göstermek için Canlı simgesine tıklayın. Pozlama süresini istenen değere değiştirmek için Görüntüleme Ayarı> Pozlama (ms) özelliğini kullanın. Bu çalışmada kullanılan maruz kalma süresi 10 ms ile 50 ms aralığındadır.
- Görüntülerin kontrastını ve parlaklığını ayarlamak için, etkileşimli histogram ekranının uç noktasında siyah beyaz okları taşımak üzere Histogram ve Yoğunluk Ölçeklendirme penceresini kullanın. Alternatif olarak, yazılımın parlaklığı ve kontrastı otomatik olarak optimum seviyelere ayarlamasını sağlayan Otomatik Esnetme seçeneğini kullanın.
- Görüntüyü dondurmak için Tutturma simgesine tıklayın. Ardından, görüntüleri istenen biçimde kaydetmek için Görüntüleri Yer Değiştirmiş Olarak Dışa Aktar > Ayarla'yı kullanın. Alternatif olarak, görüntüyü doğrudan ImageJ yazılımına dışa aktarmak ve kaydetmek için ImageJ > Ayarı özelliğini kullanın.
- Floresan modunda fotoğraf ve video elde etmek için, trakea lümenini kafes küpü boyunca CFSE'ye özgü lazer ışığıyla (CFSE: uyarma dalga boyu: 488 nm, emisyon dalga boyu: 515 nm) aydınlatın. Görüntüleri almak için 3.5.2-3.5.3 adımlarını izleyin. Fotoğraf ve video çektikten sonra, GRIN lensi trakeadan yavaşça çıkarın.
- Aşağıda açıklandığı gibi deepitelizasyon gerçekleştirin.
- Damıtılmış (DI) suda %2 sodyum dodesil sülfat (SDS) desellülarizasyon çözeltisi hazırlayın. Trakea lümeni üzerinde ince bir deterjan çözeltisi filmi oluşturmak için trakea kanülünden şırınga pompasını kullanarak, trakeadan 6.3 mL / dak akış hızında 50 μL SDS damlatın.
- Erkek/dişi Luer tıkaçlarını kullanarak biyoreaktörün boru bağlantılarını kapatın ve biyoreaktörü bir inkübatöre aktarın. SDS'nin trakea içinde 37 ° C'de 10 dakika beklemesine izin verin. Trakea boyunca başka bir 50 μL SDS çözeltisi damlatın ve 10 dakika boyunca inkübe edin.
- Trakea lümenini şırınga pompası aracılığıyla 500 μL 1x PBS ile 3x için 10 mL / dak akış hızında sulayarak lize epitel ve SDS'yi çıkarın. Biyoreaktörü bir çalkalayıcıya yerleştirin ve SDS ile muamele edilen epitel hücrelerinin trakea lümeninden ayrılmasını fiziksel olarak teşvik etmek için biyoreaktörü 20 Hz frekansta ve yaklaşık 0.3 mm'lik yer değiştirme genliğinde mekanik olarak titreştirin.
NOT: Bu çalışmada, çalkalayıcı bir subwoofer hoparlörü, bir subwoofer plaka amplifikatörü ve bir ivmeölçer monte edilerek özel olarak üretilmiştir. Bir bilgisayar tarafından sinüzoidal bir dalga formu üretildi ve yükselteç aracılığıyla çalkalayıcıya beslenirken, çalkalayıcının tepkisi ivmeölçer aracılığıyla izlendi (Şekil 3B). Ek olarak, elektromanyetik ve atalet çalkalayıcıları gibi geleneksel çalkalayıcılar, hücrelerin ayrılmasını teşvik etmek için kullanılabilir. Bunu yapmak için, çalkalayıcının frekansını ve ivmesini sırasıyla 20 Hz ve 0,5 g'ye ayarlayın (0,3 mm yer değiştirme genliğine eşdeğer). - Trakea mekanik olarak titreştirilirken kalan SDS ve hücre kalıntılarını gidermek için trakea lümeninden iki kez 500 μL 1x PBS aşılayın. Epitel çıkarma prosedürünü takiben, adım 3.6'da olduğu gibi GRIN lens görüntüleme cihazını kullanarak CFSE'nin yoğunluğunu ölçerek epitel tabakasının klerensini değerlendirin (Şekil 3C).
4. Daha ileri analizler için trakea dokusu hazırlığı
- Epitelin çıkarılmasını doğrulamak için, hematoksilin ve eozin (H & E) boyama, trikrom, pentakrom ve immün boyama gibi daha ileri doku analizleri yapın. Bunu yapmak için, trakeayı biyoreaktörden çıkarın ve gece boyunca 4 ° C'de 1x PBS'de (pH = 7.4) 30 mL% 4 nötr tamponlu paraformaldehit çözeltisine sabitleyin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek sabit trakea dokusunu kurutun ve gömün.
- Fiksasyondan sonra, trakea dokusunu 10 mL 1x PBS ile yıkayın, trakeayı 30 mL% 70 alkole aktarın ve gece boyunca 4 ° C'de tutun. Trakeayı keskin bir bıçak kullanarak küçük silindirik kesitler (~5 mm) halinde kesin ve doku bölümlerini doku gömme kasetlerine yerleştirin (uzunluk x genişlik x yükseklik: 4 cm x 2,5 cm x 0,5 cm). Her kasette iki trakea bölümü bulundurun.
- Bölümleri bir dizi izopropil alkol (IPA) çözeltisinde -% 85,% 90,% 95,% 100 - her çözeltinin 30 mL'sinde 1 saat boyunca dehidre edin. Sonraki çözümü eklemeden önce önceki çözümü kaldırın.
- Tamamlandığında, IPA çözeltisini doku kesitlerinden tamamen çıkarmak için kasetleri 2 saat boyunca 30 mL temizleme maddesine (örneğin ksilen) batırın. Bu adımı uygun havalandırma ile bir duman davlumbazında gerçekleştirin.
- Kasetleri 2 saat boyunca parafine batırın ve daha sonra gece boyunca 4 ° C'de parafin içine yerleştirin. Daha sonra, parafine gömülü dokuları H & E, trikrom, pentakrom ve immün boyama için bir mikrotom cihazı kullanarak ince bölümlere (5-8 μm) kesin.
- Dokuları taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizine hazırlamak için, trakeayı gece boyunca 4 ° C'de 1x PBS'de (pH = 7.4) 30 mL% 2.5 glutaraldehit çözeltisinde sabitleyin. Ardından, aşağıdaki adımları izleyerek SEM için sabit trakea dokusunu dehidre edin.
- Fiksasyondan sonra, trakea dokusunu 10 mL 1x PBS ile durulayın. Trakea dokusunu makas kullanarak uzunlamasına küçük yarı silindirli kesitler halinde (uzunluk: ~5 mm) kesin ve doku bölümlerini kasetlere yerleştirin.
- Bölümleri bir dizi IPA çözeltisinde -% 35,% 50,% 70,% 85,% 95 ve% 100 - her çözeltinin 30 mL'sinde 10 dakika boyunca dehidre edin. Sonraki çözümü eklemeden önce önceki çözümü kaldırın.
- Dokuları aşağıdaki çözeltilere batırarak hekzametildisilazan (HMDS) bazlı kurutma yöntemini uygulayın: 10 dakika boyunca %100 IPA: HMDS (2:1; v/v), ardından 10 dakika boyunca %100 IPA: HMDS (1:2; v/v) ve son olarak gece boyunca %100 HMDS.
NOT: HMDS zehirlidir. Tüm kurutma adımları sırasında bir duman davlumbazının altında çalışın. - Dokuları HMDS çözeltisinden çıkarın ve duman başlığının altında 1 saat kurumasını bekleyin. SEM görüntüleme için karbon çift taraflı iletken bant veya gümüş iletken macun kullanarak bölümü alüminyum pim saplamalarına monte edin.
5. Eksojen hücrelerin denuded trakeal lümen üzerine homojen dağılımı
- Adım 3'teki protokolü kullanarak epitelize edilmiş bir sıçan trakeası hazırlayın. Dondurulmuş mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler) 37 °C su banyosunda 30 sn boyunca çözün.
NOT: Bu çalışmada, eksojen hücrelerin deepitelize trakea üzerine dağılımını göstermek için model hücre olarak mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) kullanıldı. İdeal olarak, primer hava yolu epitel hücreleri, bazal hücreler veya indüklenmiş insan pluripotent hücreleri (iPSC'ler) epitel rejenerasyonu amacıyla kullanılabilir. - Hücreleri bir hemositometre ile sayın ve 5 x 106 hücre / mL konsantrasyonunda bir hücre çözeltisi hazırlayın. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 2 mL CFSE çözeltisi (konsantrasyon: 100 μM) ile inkübe ederek floresan olarak etiketleyin. Hücreleri 3x için 5 mL 1x PBS ile durulayın ve hücreleri taze kültür ortamında 3 x 107 hücre / mL'lik son konsantrasyonda yeniden askıya alın.
- Hidrojel ön jel çözeltisini hücre dağıtımı için bir araç olarak hazırlayın. Bu çalışma için, MSC hücreleri için bir dağıtım aracı olarak kollajen I kullanın ve ön jeli hazırlamak için üreticinin talimatlarını izleyin. Örneğin, 3.6 mg / mL kollajen ön jeli elde etmek için, soğutulmuş nötralizasyon çözeltisinin bir kısmını, 1.5 mL'lik steril bir tüpte sıçan kuyruğu kollajeninin dokuz kısmı ile karıştırın. Ardından, yeterli karıştırma için karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.
NOT: Çalışmaya ve kullanıcı ihtiyaçlarına göre kollajen I yerine biyouyumlu diğer hidrojeller kullanılabilir. - Hidrojel çözeltisi hazırlandıktan sonra, hücreleri istenen konsantrasyonda çözeltiye hızlı bir şekilde ekleyin (örneğin, 5 x 106 hücre / mL). Düzgün bir hücre-hidrojel karışımı elde etmek için, hücreleri ve jel çözeltisini bir mikropipetle hafifçe pipetleyerek karıştırın.
- Biyoreaktör içindeki trakeanın bir ucunu bir Luer konektörü aracılığıyla programlanabilir bir şırınga pompasına takın. Şırınga pompasını kullanarak trakeanın dış yüzeyini 5 mL/dak akış hızında kaplamak için biyoreaktör odasına 37 °C'de 5 mL taze kültür ortamı sağlayın.
- Trakea lümeni üzerinde bir hücre-hidrojel tabakası oluşturmak için şırınga pompasını kullanarak biyoreaktör içindeki de-epitelinize trakeaya hücre-hidrojel karışımının 10 μL'lik bir bolusunu uygulayın (Şekil 4).
- Hücre enjeksiyonundan sonra, biyoreaktörü steril bir hücre kültürü inkübatörüne 37 ° C'de ve% 5 CO2'de jelasyon için yerleştirin. Kollajen I için jelleşme 30 dakika içinde gerçekleşir.
- İmplante edilen hücrelerin dağılımını görselleştirmek için, GRIN lensi% 70 IPA veya etanol ile silerek sterilize edin ve biyoreaktörü görüntüleme aşamasına yerleştirin. Gerektiğinde hem parlak alan hem de floresan modlarında fotoğraf ve video çekin.
- 30 dakikalık hücre tohumlamasından sonra, 1 mL / dak akış hızında bir şırınga pompası kullanarak trakea lümenine 1 mL kültür ortamı enjekte edin.
- Biyoreaktör içindeki hücre tohumlu trakeayı istenen süre boyunca 37 ° C'de bir inkübatörde kültürleyin. Uzun süreli kültür için, trakea lümenindeki ve biyoreaktör odasındaki kültür ortamını her 24 saatte bir yenileyin. Hücre kültürü sırasında, medyayı lümen statik içinde tutun ve her 24 saatte bir değiştirin, trakea dışındaki ortam ise 5 mL / dak'da tek yönlü bir akış yoluyla sürekli olarak perfüze edilir.
- Hücreleri belirli bir süre boyunca (örneğin, bu çalışmada 1 ve 4 gün) kültürledikten sonra, trakeayı biyoreaktörden çıkarın. Hücre büyümesini izlemek ve hücre yoğunluğunu hesaplamak için iç yüzeyleri açığa çıkarmak için trakeayı in vitro kültürün 1. ve 4. günlerinde uzunlamasına iki yarı silindirli bölüme (yani üst ve alt bölümlere) kesmek için makas kullanın. İç yüzeylerdeki hücreleri görselleştirmek için geleneksel bir floresan mikroskop kullanın.
- Micro-Manager yazılımını kullanarak görüntüleri elde etmek için 3.5 ve 3.6 numaralı adımları izleyin. CFSE etiketli hücreleri floresan modunda görselleştirmek için bir floresein izotiyosiyanat (FITC) filtresi kullanın. Floresan mikroskop tarafından çekilen görüntüleri analiz edin ve ImageJ yazılımını kullanarak üst ve alt bölümlerdeki hücre yoğunluklarını hesaplayın. Hücre sayısını ve hücre yoğunluğunu hesaplamak için aşağıdaki adımları izleyin.
- ImageJ yazılımında bir görüntü açın ve Image > Type > 16 bit kullanarak görüntüyü ikili görüntüye (16 bit) dönüştürün. Ölçek çubuğunu kullanarak görüntü ölçeğini Analiz > Ayarla'yı kullanarak ayarlayın.
- Sayılacak hücrelerin yapılarını vurgulamak için görüntünün eşiğini ayarlayın. > eşiğini ayarlamak > resim kullanın. Hücre sayısını saymak için Analiz Et > Parçacıkları Analiz Et'i kullanın. Hücre sayısını görüntünün yüzey alanına bölerek hücrelerin yoğunluğunu hesaplayın.
- Hücre tohumlamasından sonra canlılığı değerlendirmek için, bir hücre canlılığı kiti kullanın. Bu çalışma için, trakea dokusunu ve biyoreaktördeki hücreleri 6 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve hücreleri 15 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 mL 1x PBS'de 4 mM kalsein-ve 2 mM ethidyum homodimer-1 ile lekeleyin.
- 1x PBS ile duruladıktan sonra, bir floresan mikroskop kullanarak hücreleri görselleştirin. Adım 5.12'de açıklanan adımları kullanarak canlı ve ölü hücreleri sayın. Hücre canlılığını, toplam hücreler (hem canlı hem de ölü hücreler) başına canlı hücrelerin (kalsein-ile boyanmış) yüzdesi olarak hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GRIN lens tabanlı in situ görüntüleme yöntemi, trakeal iç lümenin in situ olarak görüntülenmesini sağlayabilir (Şekil 5A). Bu görüntüleme yöntemi kullanılarak doğal ve deepitelize trakeaların hem parlak alan hem de floresan görüntüleri elde edilebilir (Şekil 5B,C). CFSE etiketlemesinden önce doğal trakeadan floresan sinyal gözlenmedi (Şekil 5Bii). Bununla birlikte, trakea epiteli CFSE boyası ile etiketlendiğinde, epitel boyunca düzgün bir floresan sinyali (yeşil) gözlenmiştir (Şekil 5Ci). SDS ve titreşim destekli hava yolu irrigasyonu yoluyla deepitelizasyonu takiben, floresan sinyalin yoğunluğu önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 5Cii), epitelin ablasyonunu göstermektedir.
Deepitelize trakeanın H&E görüntüleri, psödostratifiye epitelin trakea lümeninden çıkarıldığını ve altta yatan doku katmanlarındaki hücrelerin ve ECM mikroyapısının korunduğunu göstermiştir (Şekil 6A). Ayrıca, pentakrom (Şekil 6B) ve trikrom boyama (Şekil 6C), trakea doku mimarisinin ve kollajen ve proteoglikanlar gibi ECM bileşenlerinin korunmasını doğruladı. Ayrıca, epitel hücrelerinin immünofloresansı (epitel hücre adezyon molekülü, EpCAM; Şekil 6D) ve kollajen I (Şekil 6E) epitelin tamamen çıkarıldığını ve subepitel dokusu içindeki kollajen I'in korunduğunu ortaya koydu. Doğal trakeanın SEM görüntülemesi, doğal sıçan trakeasının luminal yüzeyinin esas olarak çok siliyer hücreler ve kadeh hücreleri ile doldurulduğunu göstermiştir. Öte yandan, de-epitelinize trakea lümeninin SEM görüntüleri, bazal membranın, ECM liflerinin bir ağ ağı ve epitel hücrelerinin yokluğu ile belirtildiği gibi maruz kaldığını göstermiştir (Şekil 6F).
De-epitelize sıçan trakeaları ve floresan olarak etiketlenmiş hücreleri kullanarak, bir hidrojelin hücre dağıtım aracı olarak dahil edilmesinin, de-epitelize trakeal lümen üzerine homojen hücre dağılımı sağlayıp sağlayamayacağını araştırdık (Şekil 7A, B). Bu çalışmada, hücre iletimi ve kültür çalışmasında model hücre olarak mezenkimal kök hücreler (MSC) kullanılmıştır. Protokolde (adım 5) açıklandığı gibi, MSC yüklü kollajen I pre-jelini deepitelize edilmiş bir sıçan trakeasına aşıladık ve GRIN lens görüntüleme sistemini kullanarak trakeal lümen üzerindeki hücrelerin dağılımını izledik. Bir kontrol deneyi olarak, MSC'leri kültür ortamında askıya aldık, hücre yüklü kültür ortamını trakeaya aşıladık ve hücrelerin dağılımını görsel olarak inceledik. In situ görüntüleme sonuçları, hidrojel yoluyla verilen floresan etiketli hücrelerin, kültür ortamı yoluyla tohumlananlardan daha düzgün bir şekilde lümen boyunca yapışmış halde kaldığını göstermiştir (Şekil 7B). Daha sonra, hücre infüzyonu sırasında kesme stresine bağlı potansiyel hücre hasarını ve ölümünü değerlendirmek için hücre doğumundan önce ve sonra hücre canlılığını test ettik. Sonuç, hücre canlılığının, hücrelerin% 90'ından fazlasının canlı kalması nedeniyle hücre dağıtım prosedüründen önemli ölçüde etkilenmediğini göstermiştir (Şekil 7C).
Ayrıca, hücre tohumlu trakeaları 4 gün boyunca kültürledik. Hem kollajen hem de kültür ortamı (kontrol) yoluyla tohumlanan hücreler, trakeal lümenin hem üst hem de alt yarısında zamanla CFSE eksprese eden hücre sayısının artmasıyla gösterildiği gibi, de-epitelize trakea lümen yüzeyinde çoğaldı (Şekil 7D). Özellikle, kollajen hidrojel dağıtım grubunda, üst ve alt lümenler arasındaki hücrelerin yoğunluğundaki fark, kontrol grubundakinden daha küçüktü, bu da hidrojel yoluyla hücre iletiminin trakea lümeni boyunca homojen hücre dağılımını desteklediğini gösteriyor.
Resim 1: Trakea biyoreaktörünün üç boyutlu (3B) bilgisayar çizimi . (A) (i) yan görünüm, (ii) üstten görünüm. (B) Biyoreaktör odasının boyutları. (C) Şeffaf bir akrilik plastik levha kesilir ve vidalar kullanılarak ana haznenin üstüne tutturulur. Birim = mm; R = yarıçap. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sıçan trakeasının yerinde görselleştirilmesi için özel yapım mikrofiber görüntüleme. (A) (i) Işık yolunun görüntüleme kurulum bileşenlerinin şeması. Kısaltmalar: C = kamera, TL = tüp lens, F = filtre, DM = dikroik ayna, OL = objektif lens; (ii) görüntüleme probunu (GRIN lens) gösteren görüntüleme kurulum bileşenlerinin fotoğrafı, biyoreaktörün Luer konektörüne yerleştirilir. (B) GRIN lensin biyoreaktörle entegre olduğunu gösteren şematik. (C) Biyoreaktörün içindeki trakeayı görselleştirmek için görüntüleme probunu gösteren bir fotoğraf kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sıçan trakeasının deepitelizasyonu için platform . (A) Deepitelizasyon ve in situ optik fiber görüntüleme için deneysel kurulumu gösteren fotoğraf. (B) Epitelin çıkarılmasını kolaylaştırmak için kullanılan özel yapım elektromanyetik çalkalayıcının bileşenini ve montajını gösteren diyagram. ω: frekans, a: genlik (C) Sıçan trakea de-epitelizasyon prosedürünün iş akışını gösteren şematik. PBS = fosfat tamponlu salin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Eksojen hücrelerin hidrojel kullanılarak deepitelize sıçan trakeasına verilmesi. Hidrojel çözeltisini gösteren şematik, hücreleri topikal olarak epitelize sıçan trakeasının iç lümenine yatırmak için bir dağıtım aracı olarak kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Deepitelize trakeanın in situ görüntülenmesi. (A) CFSE etiketli epitel GRIN lens aracılığıyla 488 nm mavi lazer ile uyarılırken trakea lümeninin floresan görüntülemesini gösteren fotoğraf. (B) (i) Epitel etiketlemeden önce trakea lümeninin parlak alan ve (ii) floresan görüntüleri. (C) Epitel CFSE floresan boya ile etiketlenirken (i) doğal ve (ii) de-epitelize trakeanın (De-Epi trakea) floresan görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Doğal ve deepitelize sıçan trakealarının histolojisi, immünofloresan ve SEM analizleri. (A) H&E boyama. (B) Morun hücre sitoplazması, mavinin hücre çekirdeği, yeşilin proteoglikanlar (örneğin, müsin) ve sarının kollajen lifleri olduğu pentakrom boyaması. (C) Pembenin hücre sitoplazması, koyu mavinin hücre çekirdeği ve mavinin kollajen olduğu trikrom boyama. Doğal ve deepitelize trakeaların floresan görüntüleri. (D) EpCAM ve (E) kollajen I. Ok uçları trakea lümeninin yüzeyini gösterir. (F) trakea lümeninin SEM mikrografları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Trakea lümeninde eksojen MSC'lerin topikal birikimi. (A) (i) Parlak alan ve (ii) epitelden arındırılmış trakeanın floresan görüntüleri. (B) (i) PBS ve (ii) kollajen I pre-jel ile tohumlandığında epitelize trakea lümeninin floresan görüntüleri. Hücrelerin trakea lümeni üzerindeki homojen dağılımı, jel öncesi kollajen hücreler için bir dağıtım aracı olarak kullanıldığında elde edilir. (C) (i) Floresan görüntüler ve (ii) jel öncesi kollajen ile 6 saatlik doğumdan önce ve sonra hücrelerin canlılığını ölçtü. n: örnek sayısı. Hücrelerin yaşayabilirliğini değerlendirmek için protokolün 5.1 ve 5.17 adımları izlendi. (D) (i) 1 gün ve (ii) hücre tohumlama ve kültüründen 4 gün sonra ölçülen hücre tohumlama yoğunluğu. Hücre yoğunluğu, hücre sayılarının incelenen yüzey alanına bölünmesiyle hesaplandı. Tüm değerler ortalama ± standart sapmayı temsil eder. Gruplar arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları belirlemek için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanıldı, p < 0.05 anlamlı kabul edildi. Kısaltmalar: CM = kültür ortamı, C = kolajen. *p 0,05 <. **p 0,01 <. ns: önemli değil. Üst ve alt yüzeyler arasında anlamlı bir fark (ns) olmaması, trakeanın çevresi boyunca eşit hücre dağılımı anlamına gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, (i) hücre çıkarılması ve eksojen hücre iletiminden sonra trakea lümeninin in situ olarak izlenmesine ve (ii) hücre tohumlu trakea dokusunun uzun süreli in vitro kültürüne izin verebilen görüntüleme rehberliğinde bir biyoreaktör oluşturduk. Bu özel yapım biyoreaktörü kullanarak, (i) deterjan ve titreşim destekli hava yolu yıkama kullanarak endojen epitel hücrelerinin trakea lümeninden seçici olarak çıkarıldığını ve (ii) hücre yüklü kollajen I pre-jeli kullanılarak eksojen hücrelerin inkar edilmiş trakeanın luminal yüzeyine eşit dağılımını gösterdik. Ayrıca, GRIN lens tabanlı görüntüleme yöntemi, epitelin in situ olarak çıkarılmasını doğruladı. Ayrıca, H&E, trikrom, pentakrom, immünofloresan boyama ve SEM dahil olmak üzere daha ileri analizlerle, epitelin çıkarılmasını ve altta yatan doku katmanlarının mimarisinin ve bileşenlerinin korunmasını doğruladık. Ek olarak, yeni implante edilen eksojen MSC'lerin GRIN lens tabanlı görüntülemesi, kollajen I pre-jeli bir dağıtım aracı olarak kullanıldığında hücrelerin düzgün dağılımını göstermiştir. Son olarak, implante edilen hücreler de-epitelize trakea üzerinde hayatta kaldı ve çoğaldı, bu da biyoreaktörün hücre tohumlu hava yolu dokularının uzun vadeli kültüründeki etkinliğini vurguladı.
Deepitelizasyon protokolündeki kritik adım, trakea lümeninde ince bir deterjan çözeltisi tabakası oluşturmaktır. Mevcut desellülarizasyon protokollerinde, uzun bir süre boyunca çoklu kimyasal ve enzim döngüleri kullanılmakta, kollajen liflerinin, glikozaminoglikanların (GAG'lar), proteoglikanların ve kondrositlerin sayısını azaltmakta ve hava yolu iskelesinin biyolojik ve biyomekanik özelliklerinden ödün vermektedir 19,20,21. Öte yandan, ECM, implante edilmiş eksojen hücrelerin hayatta kalması, çoğalması ve farklılaşması için biyokimyasal ve mekanik ipuçları ve uygun fiziksel ortamlar sağlar22,23. Bu çalışmada açıklanan ince film biriktirme yöntemi, epitel ablasyonu için az miktarda deterjan (50 μL'den az) kullanırken, altta yatan doku tabakasının ve subepitelyal hücresel bileşenlerin korunmasına izin verir. Bu çalışmada gösterilen deterjana maruz kalan dokunun mekanik titreşimi, lize hücrelerin ayrılması ve temizlenmesine izin verdiği için önemli bir prosedürdür. Epitelin deterjana maruz kalmasından kaynaklanan hücre kalıntıları ve kısmen bozulmuş hücrelerin, sadece trakeaya yıkama çözeltisi ile su basmasıyla yıkanması zordur. Bu nedenle, yıkama sırasında trakeayı mekanik olarak titreştirmek, hücre kalıntılarını trakeal lümenden temizlemek için yeterli kesme kuvvetleri sağlar.
Genel olarak, jel öncesi hücre tohumlama yaklaşımı, teslimat hızından, ön jelin viskozitesinden (doğrudan jel öncesi konsantrasyonla ilgilidir), yüzey geriliminden ve jelleşme süresinden etkilenebilir. Özellikle, jel öncesi preparasyon sırasında, jel öncesi konsantrasyonun, hücre süspansiyonlu pre-jeli boru içinde taşıyacak kadar düşük ve trakeanın üst yüzeyindeki hücreleri koruyacak kadar yüksek tutulması esastır. Bu nedenle, çeşitli konsantrasyonları test ederek her bir ön jel için optimum konsantrasyonun bulunması şiddetle tavsiye edilir. Ek olarak, hücre yüklü ön jelin başarılı bir şekilde teslim edilmesini sağlamak için daha az değerli hücrelerle teslimat hızı gibi dağıtım tekniğini uygulayın. Ayrıca, MSC'leri (i) bir dağıtım aracı olarak pre-jel ile hücrelerin dağılımını ve (ii) biyoreaktör sisteminin yeni tohumlanmış hücreleri inkar edilmiş trakea lümeni üzerinde kültürleme kabiliyetini göstermek için bir hücre modeli olarak kullanırken, kök hücrelerin (örneğin, bazal hücreler) ve birincil hava yolu epitel hücrelerinin gelecekteki çalışmalarda kullanılması, hücre farklılaşmasının ve fonksiyonel epitel hücresi rejenerasyonunun incelenmesine izin verebilir24, 25. Ek olarak, gelecekteki çalışmalar, fonksiyonel epitel üretimi için tohumlanmış hücreler üzerinde in vivo benzeri kesme stresi oluşturmak için mevcut platforma bir hava-sıvı arayüzü (ALI) eklemeyi içerebilir. Mevcut cihaza ALI eklemek için, trakeayı havalandırmak için trakea girişine küçük bir hayvan ventilatörü bağlanabilir. Ayrıca, ALI'yi elde etmek için, ince film biriktirme yöntemi, hücre tohumlu trakeaya bir kültür ortamı sıvı tıkacı aşılamak için kullanılabilir. Sıvı filmin kalınlığı, sıvı tapa hızı26,27 değiştirilerek modüle edilebilir. Fiş, yeni tohumlanmış hücreler trakea lümenine sıkıca yapıştıktan ve aşılandıktan sonra başlatılabilir.
Ek olarak, bu protokolde kullanılan in situ GRIN lens tabanlı görüntüleme yaklaşımı, de-epitelizasyonun etkinliğini doğrulamak ve yeni tohumlanan hücrelerin dağılım kalitesini değerlendirmek için kritik öneme sahiptir. Histoloji ve immünofloresan gibi analiz için trakea dokusundan alınan örneklerin diseksiyonunu gerektiren geleneksel doku analiz yöntemlerinden farklı olarak, çalışmamızda geliştirilen görüntüleme platformu, epitelizasyon ve hücre teslimi sırasında hava yolu lümeninin hızlı ve tahribatsız izlenmesini sağlar. İn situ görüntüleme sırasında trakeayı sterilize etmek için, GRIN lensi trakea lümenine sokmadan önce% 70 IPA veya etanol ile silerek sterilize ettiğinizden emin olun. Ayrıca, GRIN lensini kullanarak hücreleri görüntülemek için, hücreler (endojen trakeal epitel hücreleri veya yeni implante edilmiş hücreler), farklı uyarma / emisyon dalga boylarına sahip çeşitli floresan boyalarla etiketlenebilir. Bunu yapmak için, floresan etiketli hücreleri uyarmak ve doğru filtre lenslerini çift kenarlı süper çözünürlüklü dikroik aynaya entegre etmek için uygun lazer ışık jeneratörünü kullandığınızdan emin olun.
Epitelizasyonun kaldırılması, hücre teslimi ve in situ görüntüleme yöntemlerinin yeniliği ve yenilikçiliğine rağmen, bu çalışmanın çeşitli sınırlamaları vardır. Bu çalışmada açıklanan deepitelizasyon ve hücre dağıtım yöntemleri, yüzey geriliminin baskın olduğu küçük hava yollarına (çap: 3-4 mm'den az) uygulanabilir. Bir sıvı tıkaç oluşturmak ve domuz ve insan trakeası veya bronşlar gibi daha büyük hava yollarında de-epitelizasyon çözeltisinin veya hücre yüklü jel öncesi süspansiyonun ince bir filmini oluşturmak, yüzey gerilimi diğer kuvvetlerle, özellikle de yerçekimiyle karşılaştırıldığında ihmal edilebilir hale geldiğinden zor olabilir. Ayrıca, ince film biriktirme yaklaşımını kullanarak ve zaman ve konsantrasyonu modüle ederek, epiteli güçlü bir deterjanla (SDS) ablate edebildik ve altta yatan doku tabakasını koruyabildik. Bununla birlikte, gelecekteki çalışmalarda, 3-[(3-kolamidopropil)-dimetilammonio]-1-propan sülfonat (CHAPS)28 gibi daha hafif desellülarizasyon deterjanları veya sodyum hidroksit (NaOH)29 gibi deterjansız çözelti, ECM bileşenlerinin korunması ve yeni implante edilen hücrelerin desteklenmesi için test edilebilir. Ayrıca, CFSE etiketli hücrelerin floresan yoğunluğu, hücrelerin bölünmesi nedeniyle zamanla azalır. Çalışmamızda, 4 gün boyunca de-epitelize trakealarda kültürlenen MSC'lerin floresan görüntüleri, floresan yoğunluklarında önemli bir azalma göstermiştir. Doku iskelelerine tohumlanan eksojen hücrelerin uzun süreli izlenmesi ve izlenmesi için, hücrelerin uzun süreli veya kalıcı floresan etiketlemesine izin verebilecek farklı hücre etiketleme yöntemleri gerekli olacaktır.
Bu raporda açıklanan görüntüleme rehberliğindeki biyoreaktör platformu ve hücre çıkarma ve dağıtım protokollerinin, biyomühendislik hava yolu dokularını üretmek için kullanılabilecek epitelize edilmiş hava yolu doku iskelelerinin oluşturulmasına izin verebileceğini öngörüyoruz. Bu tür in vitro hava yolları, insan hava yolu hastalıklarının in vitro modellemesi ve ilaç taraması için yüksek doğruluk sağlayabilir. Örneğin, fonksiyonel hava yolu epiteli oluşturmak için, hava yolu bazal kök hücreleri ilk önce de-epitelize hava yolu dokusuna implante edilebilir30. Daha sonra, bazal kök hücrelerin çeşitli epitel hücrelerine farklılaşması için kritik olan hava-sıvı arayüzü (ALI), trakea içinde üretilebilir. Ayrıca, in situ görüntüleme sistemi, akciğer hava yolu bozukluğu olan hastaların solunum yollarını floresan olarak görselleştirmek için modifiye edilebilir ve kullanılabilir. Hava yolu dokularını in situ olarak değerlendirmek için klinik olarak kullanılmak üzere sert GRIN lens, hava yollarında gezinmek için esnek optik fiber görüntüleme probları ile değiştirilebilir. Ayrıca, hidrojel bazlı hücre tohumlaması kullanarak solunum yolu içindeki hücreleri homojen bir şekilde dağıtma yeteneği, hastalarda hasarlı veya yaralı epitelin yerini almak için benzeri görülmemiş bir fırsat sağlayabilir. Özellikle, bu çalışmada geliştirilen ve kullanılan hücre replasman yaklaşımı, kistik fibroz ve primer siliyer diskinezi gibi solunum bozukluklarının tedavisinde hücre bazlı tedaviyi hızlandırabilir ve ciddi şekilde yaralanan hava yolu dokuları nedeniyle transplantasyon için reddedilen donör akciğerleri onarabilir31,32,33,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu araştırma kısmen Amerikan Toraks Derneği Vakfı Araştırma Programı, New Jersey Sağlık Vakfı ve Ulusal Bilim Vakfı (KARİYER Ödülü 2143620) tarafından J.K.'ya desteklenmiştir; ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (P41 EB027062) G.V.N.'ye
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 - D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
References
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
- Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
- Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
- De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
- Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
- Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
- Planchard, D. Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , SDC Publications. (2022).
- Coward, C. A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , No Starch Press. (2019).
- Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
- Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
- Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
- O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
- Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
- Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
- O'Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
- Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
- Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
- Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).
