Summary
Vi præsenterer en protokol for isolering og frysefrakturering af ekstracellulære vesikler (EV'er), der stammer fra kræftformige urotelceller. Frysebrudsteknikken afslørede elbilernes diameter og form og - som et unikt træk - den interne organisering af EV-membranerne. Disse er af enorm betydning for at forstå, hvordan elbiler interagerer med modtagermembranerne.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV'er) er membranbegrænsede strukturer frigivet fra cellerne ind i det ekstracellulære rum og er impliceret i intercellulær kommunikation. Elbiler består af tre populationer af vesikler, nemlig mikrovesikler (PV'er), exosomer og apoptotiske kroppe. Den begrænsende membran i elbiler er afgørende involveret i interaktionerne med modtagercellerne, hvilket kan føre til overførsel af biologisk aktive molekyler til modtagercellerne og følgelig påvirke deres adfærd. Frysefrakturelektronmikroskopiteknikken bruges til at studere den interne organisation af biologiske membraner. Her præsenterer vi en protokol for MV-isolering fra dyrkede kræfturotelceller og frysefraktur af MV'er i trinene til hurtig frysning, frakturering, fremstilling og rengøring af replikaerne og analyse af dem med transmissionselektronmikroskopi. Resultaterne viser, at protokollen for isolering giver en homogen population af elbiler, som svarer til formen og størrelsen af EV'er. Intramembranpartikler findes hovedsageligt i den protoplasmatiske overflade af den begrænsende membran. Derfor er frysefraktur den valgte teknik til at karakterisere MW'ernes diameter, form og fordeling af membranproteiner. Den fremlagte protokol gælder for andre populationer af elbiler.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (EV'er) er membranbegrænsede vesikler frigivet fra celler ind i det ekstracellulære rum. De tre vigtigste populationer af elbiler er exosomer, mikrovesikler (MF'er) og apoptotiske legemer, som adskiller sig i deres oprindelse, størrelse og molekylære sammensætning 1,2,3. Sammensætningen af elbiler afspejler donorcellens molekylære profil og dens fysiologiske status (dvs. sund eller syg)4,5. Dette giver elbiler et enormt potentiale i diagnosticering, prognose og terapi af menneskelige sygdomme, og de har lovende medicinske anvendelser til brug i personlig medicin 6,7,8.
Elbiler er mediatorer af intercellulær kommunikation. De indeholder biologisk aktive proteiner, lipider og RNA'er, som forstyrrer biologiske processer i modtagercellen og kan ændre dens adfærd 9,10. Sammensætningen af EV-begrænsende membran er imidlertid afgørende for interaktionen med modtagercellemembranen.
Kilderne til elbiler er kropsvæsker og betingede kulturmedier. For at isolere en EV-population skal der anvendes en passende isolationsteknik. For eksempel giver centrifugering ved 10.000 × g en fraktion beriget i MF'er, mens centrifugalkræfter på ≥100.000 × g giver en fraktion beriget i exosomer11,12. Den isolerede del af elbiler skal valideres med hensyn til renhed, størrelse og form. Til dette formål anbefalede International Society for Extracellular Vesicles 2018 tre klasser af billeddannelsesteknikker med høj opløsning: elektronmikroskopi, atomkraftmikroskopi og lysmikroskopibaseret superopløsningsmikroskopi13. Ingen af disse teknikker kan give oplysninger om EV-membranens interiør.
Frysefrakturelektronmikroskopi er en teknik til at bryde frosne prøver for at afsløre deres indre strukturer, især ved at give et billede af membranens indre. Trinene i prøveforberedelsen er (1) hurtig frysning, (2) frakturering, (3) fremstilling af replikaen og (4) rengøring af replikaen14. I trin 1 fastgøres prøven (valgfrit) kemisk, kryobeskyttet med glycerol og fryses i flydende freon. I trin 2 brydes den frosne prøve i en frysefrakturenhed, som udsætter det indre af membrandobbeltlaget. I trin 3 skygges de eksponerede brudte ansigter med platin (Pt) og kulstof (C) for at producere replikaer. I trin 4 fjernes det organiske materiale. Replikaen analyseres i transmissionselektronmikroskopet (TEM). For nøjagtig fortolkning af mikrograferne skal man følge retningslinjer for deres korrekte orientering14,15. Kort fortalt er skyggeretningen i mikrografen en henvisning til at orientere mikrografen (dvs. at bestemme retningen af Pt-skygge) og følgelig at bestemme konvekse og konkave former (figur 1). To indvendige visninger kaldet brudte flader af membrandobbeltlaget kan ses som et resultat af opdeling af membranen ved frysefrakturering: det protoplasmatiske ansigt (P-ansigt) og det eksoplasmatiske ansigt (E-ansigt). P-ansigtet repræsenterer membranfolderen ved siden af celleprotoplasmaet, mens E-ansigtet repræsenterer membranfolderen ved siden af det ekstracellulære rum. Integrerede membranproteiner og deres foreninger ses som fremspringende intramembranpartikler 14,15.
Her er målet at anvende frysefrakturteknikken til at karakterisere MV'er med hensyn til størrelse, form og strukturen af deres begrænsende membran. Her præsenterer vi en protokol for isolering og frysefrakturering af MV'er, der stammer fra humane invasive blærekræft urotelceller.
Protocol
1. Dyrkning af kræftceller og isolering af elbiler
BEMÆRK: En protokol til opnåelse af elbiler fra en human invasiv blærekræft urotelial (T24) cellelinje præsenteres. Dyrkningsbetingelserne skal dog optimeres for at bruge andre celletyper.
- Plade T24-celler med en massefylde på 3 × 104 celler/cm2 i tre kolber (voksende overflade på 75 cm2) og starter med at dyrke cellerne i en CO2-inkubator i 3 dage ved 37 °C og en 5 % CO2 (figur 2A).
- Brug et dyrkningsmedium til T24-celler i en 1: 1 (v / v) blanding af A-DMEM og F12 suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 4 mM glutamax, 100 mg / ml streptomycin og 100 U / ml penicillin.
BEMÆRK: Følgende isolering giver elbiler beriget med MV'er. Før isoleringen påbegyndes, skal du inspicere cellerne med et lysmikroskop for at bekræfte levedygtighed og sammenløb (figur 2B). Begynd at indsamle elbilerne fra de konditionerede kulturmedier, når T24-cellerne er ved 70% sammenløb.
- Brug et dyrkningsmedium til T24-celler i en 1: 1 (v / v) blanding af A-DMEM og F12 suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 4 mM glutamax, 100 mg / ml streptomycin og 100 U / ml penicillin.
- Kulturmediet opsamles med PV'er med en pipette fra kolber (T75) i koniske centrifugerør (figur 2C). Centrifuger ved 300 × g i 10 minutter ved 4 °C (figur 2D).
- Supernatanten opsamles forsigtigt i et nyt centrifugerør med pipetten (figur 2E).
- Supernatanten centrifugeres ved 2.000 × g i 20 minutter ved 4 °C.
- Saml forsigtigt supernatanten med pipetten i et nyt centrifugerør.
- Centrifuger ved 10.000 × g i 40 minutter ved 4 °C. Se efter tilstedeværelsen af en hvidlig pille i bunden af røret.
BEMÆRK: Skift om nødvendigt centrifugerotoren for at nå den krævede g-kraft. EV-pelleten ses som en hvid pille i bunden af centrifugerøret (figur 2F); marker dens placering for at undgå at miste pelleten under pipettering (figur 2G). - Kassér forsigtigt supernatanten med en pipette. Til pelleten tilsættes 1,5 ml PBS og genanvendes pelleten indeholdende PV'er.
- Centrifuger ved 10.000 × g i 40 minutter ved 4 °C, og se efter tilstedeværelsen af en hvid pille i bunden af røret.
BEMÆRK: EV-pelleten ses som en hvid plet i bunden af centrifugerøret; marker dens placering for at undgå at miste pelleten under pipettering. - Kassér forsigtigt supernatanten med en pipette. Der tilsættes forsigtigt det fikserende middel, 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumcacodylatbuffer (pH 7,2). Lad stå i 20 minutter ved 4 °C (figur 2H).
FORSIGTIG: Glutaraldehyd og natriumcacodylat er giftige. Arbejd i en røghætte, brug beskyttelseshandsker, og kassér dem korrekt. - Fjern forsigtigt fikseringsmidlet med en pipette. Tilsæt vaskebuffer (0,1 M natriumcacodylatbuffer) til pelleten. Lad det stå i 10 minutter ved 4 °C uden at genoplive pellets.
2. Frysning af elbiler
BEMÆRK: Før frysning skal du først kryobeskytte prøverne med glycerol.
- Forbered 0,1 M natriumcacodylatbuffer. Vaskebufferen fjernes, og der tilsættes 50 μL 30 % glycerol i 0,1 M cacodylatbuffer. Resuspender forsigtigt elbilerne for at gøre opløsningen homogen. Inkuberes i 30 minutter ved 4 °C.
- Rengør kobberbærerne med en central pit i ultralydbadet med chloroform i 5 minutter (figur 3A). Lufttør dem og markér dem med farver, hvis du bruger flere prøver (figur 3B). Indtil brug skal bæreselerne opbevares på et tørt, rent sted (f.eks. på linsepapir i en petriskål). Rør ikke ved bærerne med bare hænder.
- Forbered pipetter, opløsninger, filterpapir, pincet, et stereomikroskop, en Dewar-kolbe med freon og flydende nitrogen (LN2), en metalstang og kryoviraler. Køl det ned med LN2.
FORSIGTIG: Brug beskyttelsesudstyr, og arbejd i overensstemmelse hermed, når du håndterer LN2 og afkølet freon.
- Forbered pipetter, opløsninger, filterpapir, pincet, et stereomikroskop, en Dewar-kolbe med freon og flydende nitrogen (LN2), en metalstang og kryoviraler. Køl det ned med LN2.
- Resuspend elbilerne igen inden frysning. Undgå dannelse af luftbobler.
BEMÆRK: Udfør trin 2.4-2.7 hurtigt. - Arbejde under et stereomikroskop (figur 3C). 1,5-1,7 μL af prøven overføres til kobberbærerens centrale grube for at opnå et konvekst fald, der når højere end kobberbærerkanten, mens prøven ikke spildes ud over kanten (figur 3D). I tilfælde af overspild skal du bruge filterpapir til at tørre bærerens ydre ring.
- Bland størknet freon med en metalstang for at flydende den igen (figur 3E).
- Tag fat i kobberbærerens ydre ring med pincet og nedsænk den i afkølet freon med en blid omrystning af pincet i 8 s (figur 3F). Efter 8 s overføres transportøren hurtigt til en anden Dewar-kolbe fyldt med LN2.
- Der fortsættes straks med frakturering eller opbevaring af prøverne i LN2. I sidstnævnte tilfælde skal du markere en kryofil og afkøle hætteglasset og pincetspidserne ved at nedsænke dem i LN2 (figur 3G). Under LN2 opsamles frosne kobberbærere i hætteglasset, lukkes det og opbevares i LN2-beholderen (figur 3H), indtil de fryser frakturering.
3. Frakturering af elbiler og fremstilling af replikaer
BEMÆRK: Forbered frysefraktureringsenheden i henhold til producentens betjeningsvejledning. (Figur 4A). Rengør enhedens kammer. Placer platinkanoner (Pt/C) og kulstofkanoner (C) i vinkler på henholdsvis 45° og 90° (figur 4B).
- Start enhedens vakuumsystem. Når trykket på 6,6 × 10-2 Pa (5 × 10-4 Torr) er nået, afkøles enhedskammeret til -150 °C.
- Kobberbærerne med frosne prøver overføres til en frysefraktureringsenhed ved hjælp af tør pincet (figur 4C). Brug kryooverførsel eller arbejd hurtigt for at undgå optøning af prøven og aflejring af iskrystallerne. Fastgør bærerne på prøvebordet.
- Vent, indtil vakuumet igen når 6,6 × 10-2 Pa (5 × 10-4 Torr), og indstil derefter knivtemperaturen til -100 ° C (figur 4D).
- Vent, indtil vakuumet når 1,0 × 10-3 Pa (8 × 10-6 Torr).
- Overhold prøven med kikkert og henvend forsigtigt kniven (figur 4E).
- Begynd sektionering af prøven ved at tænde knivens motoriserede bevægelse (figur 4F) og sektion, indtil prøvens overflade er glat (figur 4G).
- Til frakturering skal du slukke for knivens motoriserede bevægelse og fortsætte med langsom manuel styring af kniven og derved frakturere prøven (figur 4H). For at beskytte den brudte overflade mod dannelse af iskrystaller og snavs indtil skygge, skal du flytte kniven over den brudte prøve.
- Fortsæt med Pt-skygge ved 45° (figur 4I, J).
- Forbered et stopur og / eller tænd kvartskrystalmonitoren på frysefraktureringsenheden, hvilket gør det muligt at overvåge tykkelsen af Pt på prøven. Den anbefalede tykkelse af Pt-laget målt på kvartskrystalmonitoren er 2,5 nm, hvilket svarer til 4 s skygge ved en given højspænding og strøm (dvs. hastigheden af Pt-skygge er 0,63 nm / s).
- Før du starter skyggen, skal du flytte kniven væk fra prøven. Påfør højspænding på Pt/C-pistolen (1.600 V), og øg strømmen til 60 mA. Gnister af Pt skal vises og skal begynde at skygge prøven. På dette tidspunkt skal du starte 4 s nedtællingen og / eller observere og lokalisere positionen af Pt på kvartskrystalmonitoren.
BEMÆRK: Den anbefalede tykkelse af C-laget er 2,5 nm, hvilket svarer til 10 s skygge ved en given højspænding og strøm. - Sluk for strømmen og højspændingen, når den ønskede tykkelse af Pt opnås.
- Fortsæt med C-skygge ved 90 ° (dvs. hastigheden af C-skygge er 0,25 nm / s).
- Påfør højspænding på C-pistolen (1.900 V), øg strømmen til 90 mA, og gnister af C skal vises og begynde at skygge prøven; i det øjeblik skal du starte 10 s nedtællingen. Sluk for strømmen og højspændingen, når den ønskede tykkelse af C opnås.
4. Rengøring af replikaer og replikaanalyse
- Brug kobberbærerne fra prøvebordet og overfør dem med pincet til destilleret vand ved stuetemperatur i en porcelænsplade med 12 brønde (figur 4K). Replikaerne flyder på vandoverfladen, mens bærerne synker (figur 4L).
- Overfør replikaerne med en trådsløjfe fra destilleret vand til en brønd med natriumhypochlorit. Dæk og lad natten over ved stuetemperatur i en røghætte.
FORSIGTIG: Natriumhypochlorit er giftigt. Arbejd i en røghætte, brug beskyttelseshandsker, og kassér dem korrekt. - Overfør kopierne til ddH2O og vask i 30 min. Gentag 3 gange.
- Overfør replikaerne med en trådsløjfe til et mesh kobber TEM-gitter (f.eks. Firkantet eller honeycomb 100+ mesh). Lufttør gitterene i 2 timer, og opbevar dem derefter i en gitteropbevaringsboks, indtil mikroskopi.
BEMÆRK: Generelt kan gitre opbevares i flere måneder under mørke, tørre, stuetemperaturforhold. - Brug et TEM-mikroskop til at afbilde replikaerne og få mikrografer.
- For at gøre dette skal du indsætte et TEM-gitter med en replika og starte TEM-billeddannelsen i henhold til producentens betjeningsvejledninger. Arbejde ved 80 kV eller 100 kV.
- Undersøg prøven, og anskaf mikrografer ved lavere og højere forstørrelser med et kamera på TEM.
- Analyser mikrograferne på MV'erne. Til måling af MV-diametrene skal du bruge Fiji/ImageJ software16. Diameteren af MV'er er 4/π gange målingen på mikrograferne ifølge Hallett et al.17.
Representative Results
MV'er blev isoleret fra det konditionerede medium af kræft urotelial T24-celler efter differentielle centrifugeringer. Efter protokollen blev EV-fraktionen først detekteret efter centrifugering ved 10.000 × g , da den blev set som en hvid pellet (figur 2G).
Dernæst blev elbilerne behandlet i henhold til ovennævnte protokol og undersøgt under TEM. Pt/C-skygger frembragte (figur 4L) relativt store kopier, der ofte brød op i mindre fragmenter under rengøringstrinnet. Store replikaer og deres mindre fragmenter blev plukket på TEM-gitteret og sammenlignet under mikroskopet. Resultaterne viste ingen forskelle i kvaliteten af replikaoverfladerne uanset deres størrelse, og de kan derfor alle bruges. Undersøgelser med lav forstørrelse viste regioner af replikaen med i) en homogen overflade (baggrund), ii) konkave og konvekse sfæriske profiler (vesikler) og iii) regioner med beskadiget overflade (artefakter; Figur 5A). Typiske artefakter blev set som brud, folder og uregelmæssige svagere skygger (dvs. replikaer af iskrystalaflejringer på prøven). Det er også vigtigt at bemærke, at der ikke blev set celleaffald eller cellulære organeller, hvilket bekræfter renheden af prøven (figur 5B).
De isolerede vesikler blev almindeligvis samlet enten i klynger på tre eller flere eller var individuelt fordelt (figur 5B). Vesiklerne var sfæriske, hvilket peger på god bevarelse af ultrastrukturen under isolering, fiksering og frysning (figur 5C). "Flat-ball" og aflange vesikler (figur 5C), som blev set lejlighedsvis, var formodentlig artefakter af forberedelse og blev ikke inkluderet i de efterfølgende målinger af vesikeldiameter. Diameteren af de synlige profiler var 238,5 nm (±8,0 nm, n = 190), hvilket under hensyntagen til korrektionsfaktoren foreslået af Hallett et al.17 svarer til den gennemsnitlige vesikeldiameter på 304 nm (±10 nm; Figur 5D). Størrelsen korrelerer med et diameterområde af MV'er mellem 100 nm og 1000 nm og beviser effektiviteten af den anvendte isolationsprotokol. Billederne af vesiklerne sammen med diameterbestemmelse bekræftede utvetydigt, at elbilerne i isolatet var beriget med MV'er.
Analysen af replikaerne afslørede organiseringen af P-face og E-face af MV-begrænsende membraner. MV'er blev observeret som konkave og konvekse runde former (figur 5C, E, F), hvilket afspejler brudplanet. De konvekse former repræsenterer E-ansigter (dvs. brudt eksoplasmatisk folder af membranerne; Figur 5E). Elbilernes eksoplasmatiske ansigter havde et glat, ensartet udseende. De konkave former svarer til P-flader (figur 5F). I P-ansigterne blev der set nogle få fremspringende intramembranpartikler i glatte membraner (figur 5C, F). Dette indebærer, at PV'er isoleret fra kræft urotelial T24-celler kun indeholder en lav mængde membranproteiner.
Figur 1: Skematisk præsentation af membranbestemmelse efter frysefrakturering. (A) Mikrovesikler knop fra plasmamembranen ind i det ekstracellulære rum. (B) Microvesicle er begrænset med P- og E-membranbrochure indtil frysefraktionering, som opdeler folderne og udsætter det indre af brochurer, kaldet brudte ansigter. (C) Efter Pt / C-skygge er to brudte ansigter synlige: det protoplasmatiske ansigt (P-ansigt) med en konveks form, der vender mod cytoplasmaet (protoplasma) og et eksoplasmatisk ansigt (E-ansigt) med en konkav form, der vender mod det ekstracellulære rum. Figur 1 blev oprettet ved hjælp af Biorender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Isolering af elbiler. (A) T24-celler dyrket i en CO2 -inkubator undersøges med (B) et lysmikroskop for at bekræfte deres levedygtighed og sammenløb inden MV -isolering. (C) Cellekulturmediet opsamles og (D) centrifugeres fortløbende ved 300 × g og ved 2.000 × g (E), hver gang supernatanten opsamles. (F,G) Efter centrifugeringen ved 10.000 × g er en hvid plet, der angiver en pellet, synlig og markeret. Supernatanten fjernes, og (H) fikseringsmiddel tilsættes forsigtigt til pelleten uden at genoplive den. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Frysning af elbiler. (A) Lufttørrede rene kobberbærere med en central grube er (B) mærket inden forarbejdning. Mikrovesikler resuspenderes i glycerol for at få en homogen prøve og (C) tilsættes til en central pit af en cooperbærer under et stereomikroskop. (D) Man skal tilføje et volumen af prøven, så den danner en konveks dråbe i den centrale pit. (E) Umiddelbart før frysning blandes LN2-afkølet freon med en metalstang for at gøre freonen flydende. (F) Prøven fryses ved at nedsænke den i freon, og derefter overføres (G) til LN2. (H) Bærere med den frosne prøve kan opsamles i kryovirale stoffer og opbevares i en LN2 Dewar-beholder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Frysefrakturering og fremstilling af en kopi. (A) Frysefraktureringsenhed. Inde i enhedskammeret (B) er en platin (Pt) og carbon (C) elektronpistol, en kniv og prøvetabellen. (C) For at starte frakturering overføres bærere med prøven til prøvetabellen, (D) frysefraktureringsenheden afkøles, og der etableres et vakuum. (E) Sektionering udføres ved motoriseret (F) bevægelse af kniven, men brud udføres fortrinsvis manuelt. (G) Prøve før sektionering og (H) efter frakturering. (I) Umiddelbart efter frakturering fremstilles replikaen. (J) Under denne proces skygges Pt på prøven. Platinskygge ses som et stærkt lys (gnister) i kammeret. (K) Prøvebærere opsamles i en porcelænsbrønd fyldt med vand. (L) Replika (pil), der flyder i natriumhypochloritopløsningen under rengøringstrinnet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Elektronmikrografer af frysebrudte og Pt/C-skyggede MV'er. (A) En oversigt over den frysebrudte og skyggede EV-pille (i) ved lavere forstørrelse. Den homogene overflade er baggrund (ii), lyse områder er brud i replikaerne (iii), mørkere områder er folder af replikaer (stjerne), og uregelmæssige svagere skygger skyldes iskrystaller (to stjerner). (B) Klynge af rundformede elbiler med konkave og konvekse overflader. (C) Høj forstørrelse af elbiler. I konvekse brud, der udviser P-ansigt af EV-membranerne, ses intramembranpartikler (pile) og pletter af en glat overflade (pilespidser). Ekstracellulære vesikler med aflange (stjerne) og flade kugleformer (to stjerner) findes. (D) Den gennemsnitlige diameter af isolerede urotel-PV'er er 304 nm ± 10 nm i henhold til størrelsesmålingerne som foreslået af Hallett et al.17. Data præsenteres som middel ± SEM. (E,F) E-face og P-face af PV'er. Legende: pile = intramembranpartikler i P-face, omkransede pile = retningen af Pt/C-skygge. Skalastænger: A = 10 μm, B-F = 400 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Karakteriseringen af MV'er eller enhver anden population af isolerede elbiler er af største betydning til at begynde med, før man starter downstream-analyser som "omics" -undersøgelser eller funktionelle undersøgelser11,18. Heri blev elbiler fra humane invasive blærekræft urotelial T24-celler isoleret ved centrifugering, og efter den medfølgende protokol til analyse ved frysefrakturelektronmikroskopi demonstrerede vi, at den isolerede fraktion blev beriget i MF'er11,13. Isolatet af MV'er var blottet for celleaffald eller organeller, hvilket bekræftede en vellykket isolerings- og rensningsprotokol.
Kombinationen af kemisk fiksering og frysning, som er kritiske trin i protokollen, bevarede den sfæriske form afelbilerne 12. Der er dog behov for forholdsregler ved vurdering af EV-diameter vedfrysefrakturering 17. Da bruddet passerer tilfældigt gennem prøven, opdeles MV-membraner i deres ækvatoriale og ikke-ækvatoriale planer. For at give en streng metode til analyse af billederne af frysebrudte og skyggede prøver viste Hallett et al., at den gennemsnitlige vesikeldiameter er 4/π gange den faktiske størrelse af vesikulær diameter på billedet17. Når man tager højde for det, blev elbiler fra T24-celler beregnet til at have en diameter på 304 nm, hvilket passer i MV's teoretiske størrelsesfordelingsområde på 100-1000 nm19.
Frysefrakturering kan supplere negativ farvning, den mest anvendte TEM-teknik til at visualisere elbiler. Ved negativ farvning fastgøres prøven almindeligvis kemisk, tørres og fastgøres til et TEM-gitter og kontrasteres med uranylopløsning. Uden understøttende medier har elbiler en tendens til at kollapse, hvilket giver dem et kopformet udseende. Ved frysefrakturering viser vi, at MV'er er kugler, som afspejler deres form i ekstracellulære rum og kropsvæsker12. Dermed stemmer vores resultater også overens med observationer af elbiler i kryo-ultratynde afsnit20.
En afgørende fordel ved frysefrakturteknikken er dens evne til at løse den interne organisering af den begrænsende membran, hvilket er en nøglefaktor i forståelsen af, hvordan elbiler er målrettet mod og interagerer med modtagermembraner. Her analyserede vi membranerne i ELBILER, men frysefrakturering kunne afsløre membranorganisationen for enhver anden population af elbiler. MV'er er dannet af plasmamembranspiring; derfor forventes plasmamembranproteiner og proteinklynger at blive fundet i MV-membranen. Vores resultater understøttede, at MV'erne fra T24-celler indeholdt intramembranpartikler, der præsenterede integrerede membranproteiner. Baseret på partikelfordeling mellem E-face og P-face er det rimeligt at forvente, at de partikler, der observeres i MF'er, er transmembranproteiner uroplakiner, som er urotelcellespecifikke21,24. De observerede partikler var sparsomme, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der rapporterer en reduktion i uroplakiner under urotelial carcinogenese 21,22,23. For yderligere at undersøge proteinsammensætningen af MV-membraner anbefales det imidlertid at anvende frysefraktur replika immunmærkning (FRIL) teknik. FRIL er en opgradering af den præsenterede frysefrakturteknik og er dedikeret til at afsløre identiteten af proteiner i replikaer ved antistofgenkendelse24,25. Sammenfattende er frysefrakturteknikken en elektronmikroskopiteknik, der er egnet til karakterisering af EV-begrænsende membran samt formen, størrelsen og renheden af de isolerede EV-fraktioner. Den fremlagte protokol kan også bruges til vurdering af andre populationer af isolerede elbiler; derfor fortjener frysefraktureringsteknikken optagelse i International Society for Extracellular Vesicles retningslinjer for undersøgelser, der undersøger organisationen af EV-begrænsende membraner.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af det slovenske forskningsagentur (forskningskernefinansiering nr. P3-0108 og projekt J7-2594) og MRIC UL IP-0510 Infrastrukturprogrammet. Dette arbejde bidrager til COST-aktionen CA17116 International Network for Translating Research on Perinatal Derivatives into Therapeutic Approaches (SPRINT), støttet af COST (European Cooperation in Science and Technology). Forfatterne vil gerne takke Linda Štrus, Sanja Čabraja, Nada Pavlica Dubarič og Sabina Železnik for teknisk hjælp med celledyrkning og forberedelse af prøverne og Marko Vogrinc, Ota Širca Roš og Nejc Debevec for teknisk hjælp til at forberede videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A-DMEM | ThermoFisher Scientific, USA | 12491015 | |
| Balzers freeze-fracture device | Balzers AG, Liechtenstein | Balzers BAF 200 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | model 5810R | |
| CO2 incubator HeraCell | Heraues, Germany | ||
| Copper carriers | Balzers | BB 113 142-2 | 100+ mesh |
| Copper grids | SPI, United States | 2010C | |
| Culture flask T75 | TPP, Switzerland | growing surface 75 cm2 | |
| F12 (HAM) | Sigma-Aldrich, Germany | 21765029 | |
| FBS | Gibco, Life Technologies, USA | 10500064 | |
| Glazed Porcelain Plate 6 Well | Fischer Sientific, United States | 50-949-072 | |
| Glycerol | Kemika, Croatia | 711901 | final concentration 30 % (v/v) |
| Glutaradehyde | Serva, Germany | 23114.01 | final concentration 2.5 % (v/v) |
| GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 35050-079 | final concentration 4 mM |
| Penicillin | Gibco, Life Technologies | 15140163 | final concentration 100 U/ml |
| Phase-contast inverted microscope | Nikon, Japan | model Eclipse | |
| Rotor | Eppendorf, Germany | A 4-44 | |
| Rotor | Eppendorf, Germany | F-34-6-38 | |
| Serological pipetts | TPP, Switzerland | 50mL volume | |
| Sodium hypochloride solution in water | Carlo Erba, Italy | 481181 | |
| Stereomicroscope | Leica, Germany | ||
| Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 35050038 | final concentration 100 mg/mL |
| Transmission electron microscope | Philips, The Netherlands | model CM100 | working at 80 kV |
| Tweezers | SPI, United States |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Willms, E., Cabanas, C., Mager, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
- Cocucci, E., Racchetti, G., Meldolesi, J. Shedding microvesicles: Artefacts no more. Trends in Cell Biology. 19 (2), 43-51 (2009).
- Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 29-39 (2020).
- Tricarico, C., Clancy, J., D'Souza-Schorey, C. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
- Georgantzoglou, N., Pergaris, A., Masaoutis, C., Theocharis, S. Extracellular vesicles as biomarkers carriers in bladder cancer: Diagnosis, surveillance, and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2744 (2021).
- Słomka, A., Urban, S. K., Lukacs-Kornek, V., Żekanowska, E., Kornek, M. Large extracellular vesicles: Have we found the holy grail of inflammation. Frontiers in Immunology. 9, 2723 (2018).
- Han, L., Lam, E. W. F., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: Old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., Clancy, J. W., Sedgwick, A., D'Souza-Schorey, C. Microvesicles: Mediators of extracellular communication during cancer progression. Journal of Cell Science. 123, 1603-1611 (2010).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Severs, N. J.
- Severs, N. J., Robenek, H.
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Hallett, F. R., Nickel, B., Samuels, C., Krygsman, P. H. Determination of vesicle size distributions by freeze-fracture electron microscopy. Journal of Electron Microscopy Technique. 17 (4), 459-466 (1991).
- Nigro, A., et al. Selective loss of microvesicles is a major issue of the differential centrifugation isolation protocols. Scientific Reports. 11, 3589 (2021).
- Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1153 (2017).
- Iliev, D., et al. Stimulation of exosome release by extracellular DNA is conserved across multiple cell types. The FEBS Journal. 285 (16), 3114-3133 (2018).
- Zupančič, D., Zakrajšek, M., Zhou, G., Romih, R. Expression and localization of four uroplakins in urothelial preneoplastic lesions. Histochemistry and Cell Biology. 136 (4), 491-500 (2011).
- Wu, X. R., Manabe, M., Yu, J., Sun, T. T. Large scale purification and immunolocalization of bovine uroplakins I, II, and III. Molecular markers of urothelial differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 19170-19179 (1990).
- Kreft, M. E., Hudoklin, S., Jezernik, K., Romih, R. Formation and maintenance of blood-urine barrier in urothelium. Protoplasma. 246 (1-4), 3-14 (2010).
- Kreft, M. E., Robenek, H. Freeze-fracture replica immunolabelling reveals urothelial plaques in cultured urothelial cells. PLoS One. 7 (6), 38509 (2012).
- Robenek, H., et al. Topography of lipid droplet-associated proteins: Insights from freeze-fracture replica immunogold labeling. Journal of Lipids. 2011, 409371 (2011).
