Summary
हम स्तनधारी कोशिकाओं में एक विशिष्ट सब्सट्रेट और एक ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज के सर्वव्यापी परख के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। एचईके 293 टी सेल लाइनों का उपयोग प्रोटीन ओवरएक्सप्रेशन के लिए किया गया था, पॉलीयूबिक्युइटिलेटेड सब्सट्रेट को इम्यूनोप्रेसिपिटेशन द्वारा सेल लाइसेट्स से शुद्ध किया गया था, और एसडीएस-पेज में हल किया गया था। इम्यूनोब्लॉटिंग का उपयोग इस पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन की कल्पना करने के लिए किया गया था।
Abstract
सर्वव्यापीता एक पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जो यूकेरियोटिक कोशिकाओं में होता है जो कोशिका अस्तित्व, प्रसार और भेदभाव सहित कई जैविक मार्गों के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है। यह एक प्रतिवर्ती प्रक्रिया है जिसमें कम से कम तीन अलग-अलग एंजाइमों की कैस्केड प्रतिक्रिया के माध्यम से सब्सट्रेट के लिए यूबिक्विटिन का एक सहसंयोजक लगाव होता है, जो ई 1 (यूबिक्विटिन-सक्रियण एंजाइम), ई 2 (यूबिक्विटिन-संयुग्मित एंजाइम), और ई 3 (यूबिक्विटिन-लिगेज एंजाइम) से बना होता है। ई 3 कॉम्प्लेक्स सब्सट्रेट मान्यता और सर्वव्यापीता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यहां, एक प्रोटोकॉल का वर्णन स्तनधारी कोशिकाओं में सब्सट्रेट सर्वव्यापीता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है, जिसमें चयनित सब्सट्रेट, एक ई 3 सर्वव्यापी लिगेज और एक टैग किए गए यूबिक्विटिन को एन्कोडिंग करने वाले प्लास्मिड के क्षणिक सह-अभिकर्मक का उपयोग किया गया है। लाइसिस से पहले, सब्सट्रेट प्रोटियासोमल गिरावट से बचने के लिए ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं को प्रोटियासोम अवरोधक एमजी 132 (कार्बोबेंजॉक्सी-ल्यू-ल्यूसिनल) के साथ इलाज किया जाता है। इसके अलावा, सेल निकालने को छोटे पैमाने पर इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (आईपी) को प्रस्तुत किया जाता है ताकि यूबिक्विटिन टैग के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता (डब्ल्यूबी) द्वारा बाद में पता लगाने के लिए पॉलीयूबिक्युइटिलेटेड सब्सट्रेट को शुद्ध किया जा सके। इसलिए, स्तनधारी कोशिकाओं में सर्वव्यापी परख के लिए एक सुसंगत और सरल प्रोटोकॉल विशिष्ट सब्सट्रेट और ई 3 सर्वव्यापी लिगेज के सर्वव्यापीता को संबोधित करने में वैज्ञानिकों की सहायता करने के लिए वर्णित है।
Introduction
पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) प्रोटीन विनियमन के बारे में एक महत्वपूर्ण तंत्र है, जो सेल होमियोस्टेसिस के लिए आवश्यक है। प्रोटीन सर्वव्यापीता एक गतिशील और जटिल संशोधन है जो विभिन्न संकेतों का वर्गीकरण बनाता है जिसके परिणामस्वरूप यूकेरियोटिक जीवों में कई सेलुलर परिणाम होते हैं। सर्वव्यापीता एक प्रतिवर्ती प्रक्रिया है जिसमें सब्सट्रेट में 76 अमीनो एसिड युक्त एक सर्वव्यापी प्रोटीन का लगाव होता है, जो तीन अलग-अलग प्रतिक्रियाओं द्वारा रचित एंजाइमी कैस्केड में होता है1. पहला चरण यूबिक्विटिन सक्रियण की विशेषता है, जो यूबिक्विटिन सी-टर्मिनस और ई 1 एंजाइम की सक्रिय साइट में मौजूद सिस्टीन अवशेषों के बीच एक उच्च ऊर्जा थायोस्टर-लिंक्ड यूबिक्विटिन बनाने के लिए एटीपी हाइड्रोलिसिस पर निर्भर करता है। इसके बाद, यूबिक्विटिन को ई 2 एंजाइम में स्थानांतरित कर दिया जाता है जो यूबिक्विटिन के साथ एक थायोस्टर-पसंद वाले परिसर का निर्माण करता है। बाद में, सर्वव्यापी ई 2 द्वारा सब्सट्रेट से सहसंयोजक रूप से जुड़ा हुआ है, या अधिक बार, ई 3 एंजाइम द्वारा, जो सब्सट्रेट 2,3 के साथ पहचानता है और बातचीत करता है। कभी-कभी, मल्टीयूबिक्विटिन श्रृंखला असेंबली को बढ़ावा देने के लिए ई 4 एंजाइम (यूबिक्विटिन-चेन बढ़ाव कारक) आवश्यकहैं 3.
यूबिक्विटिन में सात लाइसिन अवशेष (के 6, के 11, के 27, के 2 9, के 33, के 48 और के 63) हैं, जो पॉलीयूबिक्विटिन श्रृंखलाओं के गठन की अनुमति देते हैं जो विभिन्न त्रिआयामी संरचनाओं का उत्पादन करने के लिए अलग-अलग लिंकेज उत्पन्न करते हैं जिन्हें कई प्रभावकारी प्रोटीन 4,5 द्वारा पहचाना जा रहा है। इसलिए, सब्सट्रेट में पेश की गई पॉलीयूबिक्विटिन श्रृंखला का प्रकार इसके सेल भाग्य 6,7,8 को तय करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, सब्सट्रेट को एन-डीग्रोन नामक एन-टर्मिनल अवशेषों के माध्यम से भी सर्वव्यापी किया जा सकता है। विशिष्ट ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज एन-डिग्रॉन मान्यता के लिए जिम्मेदार हैं, जिससे पास के लाइसिन अवशेषों के पॉलीयूबिक्विटाइलेशन की अनुमति मिलती है9.
आजकल, 40 से अधिक विभिन्न एससीएफ-विशिष्ट सब्सट्रेट की विशेषता है। उनमें से, कोशिका भेदभाव और विकास के साथ-साथ कोशिका अस्तित्व और मृत्यु सहित कई जैविक मार्गों के प्रमुखनियामक10,11,12,13 पाए जा सकते हैं। इस प्रकार, विभिन्न जैविक घटनाओं का एक व्यापक नक्शा तैयार करने के लिए प्रत्येक ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज के विशिष्ट सब्सट्रेट की पहचान आवश्यक है। भले ही सच्चे सब्सट्रेट की पहचान जैव रासायनिक रूप से चुनौतीपूर्ण है, जैव रसायन-आधारित विधियों का उपयोग श्रृंखला विशिष्टता और मोनो- और पॉलीयूबिक्विटाइलेशन14 के बीच अंतर का मूल्यांकन करने के लिए बहुत उपयुक्त है। यह अध्ययन स्तनधारी सेल लाइन एचईके 293 टी का उपयोग करके सर्वव्यापी परख के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो सब्सट्रेट यूएक्सटी-वी 2 (सर्वव्यापी रूप से व्यक्त प्रीफोल्डिन-जैसे चैपरोन आइसोफॉर्म 2) को ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज कॉम्प्लेक्स एससीएफ (एफबीएक्सओ 7) के साथ अतिरंजित करता है। यूएक्सटी-वी 2 एनएफ-κबी सिग्नलिंग के लिए एक आवश्यक सह-कारक है, और एक बार जब यह प्रोटीन कोशिकाओं में खटखटाया जाता है, तो यह टीएनएफ-α-प्रेरित एनएफ-οबी सक्रियण11 को रोकता है। इस प्रकार, पॉलीयूबिक्यूटाइलेटेड यूएक्सटी-वी 2 का पता लगाने के लिए, प्रोटियासोम अवरोधक एमजी 132 का उपयोग किया जाता है क्योंकि इसमें प्रोटियासोम कॉम्प्लेक्स15 के 26 एस सबयूनिट की प्रोटियोलिटिक गतिविधि को अवरुद्ध करने की क्षमता होती है। इसके अलावा, सेल निकालने को सब्सट्रेट को शुद्ध करने के लिए एक छोटे पैमाने पर आईपी में प्रस्तुत किया जाता है, चयनित एंटीबॉडी का उपयोग करके डब्ल्यूबी द्वारा बाद में पता लगाने के लिए एगरोज़ राल के लिए स्थिर एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। यह प्रोटोकॉल सेलुलर वातावरण में सब्सट्रेट सर्वव्यापीता को मान्य करने के लिए बहुत उपयोगी है, और इसे विभिन्न प्रकार के स्तनधारी कोशिकाओं और अन्य ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज परिसरों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, इन विट्रो सर्वव्यापी परख के माध्यम से परीक्षण किए गए सब्सट्रेट को मान्य करना आवश्यक है, क्योंकि दोनों प्रोटोकॉल सच्चे सब्सट्रेट की पहचान के बारे में एक दूसरे के पूरक हैं।
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Protocol
नोट: स्तनधारी कोशिकाओं में सर्वव्यापी परख प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्रा 1 में दर्शाया गया है।
चित्र 1. सर्वव्यापी परख प्रक्रिया का अवलोकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
1. सेल संस्कृति
- विकास मीडिया में 80% -90% संगम के लिए 100 मिमी टीसी-उपचारित संस्कृति पकवान में एचईके 2 9 3 टी सेल लाइन बढ़ाएं (डलबेको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) उच्च ग्लूकोज 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और पेनिसिलिन (100 इकाइयों), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg) और एल-ग्लूटामाइन (0.292 मिलीग्राम / 5% सीओ2 पर एक आर्द्र सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते हैं।
- कोशिकाओं पारित करने के लिए, एक सीरोलॉजिकल विंदुक का उपयोग संस्कृति पकवान से मीडिया की आकांक्षा। निष्फल 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस 1x) के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को एक बार धो लें।
- ईडीटीए (एथिलीनेडियामाइनटेट्राएसेटिक एसिड) समाधान के 1 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को अलग करें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान सेते हैं। विकास मीडिया के 2 मिलीलीटर में एक सीरोलॉजिकल विंदुक का उपयोग कर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
- कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 500 एक्स जी पर एक ताजा और साफ 15 एमएल ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण। सतह पर तैरनेवाला इसे ध्यान से बाहर डालकर निकालें। धीरे-धीरे एक समरूप सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग करके विकास मीडिया के 3 मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
- सेल निलंबन के 1 एमएल को 100 मिमी टीसी-उपचारित संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें जिसमें 9 एमएल विकास मीडिया होता है।
नोट: यदि कोशिकाएं अच्छी परिस्थितियों में हैं, तो एचईके 2 9 3 टी की प्रत्येक संस्कृति पकवान, जिसमें संगम 80% -90% है, पारित होने के 2 दिन बाद 80% संगम के साथ तीन संस्कृति व्यंजन उत्पन्न कर सकता है।
2. सेल अभिकर्मक
नोट: यदि संगम 80% से कम है तो सेल संस्कृति को ट्रांसफेक्ट करने की अनुशंसा नहीं की जाती है।
- अभिकर्मक से पहले, प्रमाणित करें कि क्या कोशिकाएं संदूषण से मुक्त हैं और क्षणिक अभिकर्मकों के लिए पर्याप्त संगम पर हैं।
- प्रत्येक अभिकर्मक नमूने के लिए, डीएनए-पॉलीथीनिमाइन (पीएच 7.2 पर पीईआई 1 μg / μL) परिसरों को निम्नानुसार तैयार करें:
- ऑप्टी-एमईएम के 100 μL में प्रत्येक प्लास्मिड के 3 μg को पतला करें मैंने पूरकता के बिना सीरम माध्यम को कम कर दिया और समाधान को ऊपर और नीचे पाइप करके इसे धीरे से मिलाएं।
नोट: यहां, कोशिकाओं को प्रत्येक प्लास्मिड के 4 μg के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था: खाली वेक्टर (पीसीडीएनए 3) या फ्लैग-एफबीएक्सओ 7 निर्माण और यूएक्सटी-वी 2-एचए, 6 एक्स-माइक-यूबिक्विटिन के साथ या बिना। कुल डीएनए सामग्री 12 μg थी। - आरटी पर पीईआई को पिघलाएं और डीएनए के प्रति 1 μg पीईआई के 3 μL के अनुपात के बाद इसे समाधान में जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके समाधान को समरूप करें। फिर डीएनए-पीईआई परिसरों के गठन की अनुमति देने के लिए आरटी पर 15 मिनट के लिए इसे सेते हैं।
नोट: डीएनए मात्रा प्रति पीईआई मात्रा का इष्टतम अनुपात चयनित सेल लाइन के अनुसार भिन्न होता है।
- ऑप्टी-एमईएम के 100 μL में प्रत्येक प्लास्मिड के 3 μg को पतला करें मैंने पूरकता के बिना सीरम माध्यम को कम कर दिया और समाधान को ऊपर और नीचे पाइप करके इसे धीरे से मिलाएं।
- सेल संस्कृति युक्त प्रत्येक डिश में डीएनए-पीईआई परिसरों की कुल मात्रा जोड़ें और प्लेट को आगे और पीछे रॉक करके इसे धीरे से मिलाएं। 5% सीओ2 पर एक आर्द्र सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।
- 5 घंटे के बाद विकास माध्यम को बदलें, क्योंकि लंबे समय तक पीईआई एक्सपोजर एचईके 2 9 3 टी कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकता है। 36 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर एक आर्द्र सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।
3. सेल लिसिस और इम्यूनोप्रेसिपिटेशन
- इनक्यूबेशन अवधि के बाद और सेल लिसिस से 6 घंटे पहले, प्रोटियासोम अवरोधक एमजी -132 के 10 μM के साथ ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं का इलाज करें। एक बार फिर, 5% सीओ2 पर एक आर्द्र सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।
- एक सीरोलॉजिकल विंदुक का उपयोग कर प्रत्येक संस्कृति पकवान से मीडिया की आकांक्षा और 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ एक बार धो लें। ट्रिप्सिन के 1 एमएल जोड़ने और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान सेते द्वारा कोशिकाओं को अलग करें। विकास मीडिया के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
- सेल निलंबन को एक ताजा और साफ 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और आरटी पर 5 मिनट के लिए 500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र करें।
- सतह पर तैरनेवाला इसे ध्यान से बाहर डालकर निकालें। बर्फ-ठंडा एनपी -40 लाइसिस बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.2, 225 एमएम केसीएल, और 1% एनपी -40) के 200 μL में सेल गोली को धीरे-धीरे फिर से निलंबित करें, प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल (10 एमएम एनएएफ और 1 एमएम ना3वीओ4) के साथ पूरक, और समाधान को एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
- बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेल लाइसेट सेते हैं। इनक्यूबेशन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेल लाइसेट्स को 16,900 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेट करें।
- इस बीच, बर्फ-ठंडे एनपी -40 लाइसिस बफर के साथ एगरोज़-एंटी-एचए मोतियों को संतुलित करें। प्रत्येक नमूने के लिए एगरोज़-एंटी-एचए मोती के 15 μL का उपयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 3,000 एक्स जी पर एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्पंदन करके एनपी -40 लाइसिस बफर के 200 μL के साथ मोती धो लें। एक पिपेट के साथ, एस्पिरेट करें और सतह पर तैरनेवाला को बहुत सावधानी से त्यागें; इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं। बाद में, मोतियों को उपयोग होने तक बर्फ पर संतुलित रखें।
- सेल लाइसेट्स को सेंट्रीफ्यूज करने के बाद, सतह पर तैरनेवाला पुनर्प्राप्त करें। ब्रैडफोर्ड विधि16 का उपयोग करके कुल लाइसेट में प्रोटीन सामग्री की मात्रा निर्धारित करें।
- सुनिश्चित करें कि इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के अधीन प्रत्येक नमूना प्रोटीन की समान मात्रा प्रस्तुत करता है। 4 घंटे के लिए संतुलित एगरोज़-एंटी-एचए मोतियों के साथ सेल लाइसेट की आवश्यक मात्रा सेते हैं, धीरे-धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर घूर्णन इनक्यूबेटर में घूर्णन करते हैं, जो यूएक्सटी-वी 2-एचए को एगरोज़-एंटी-एचए मोतियों से बांधने की अनुमति देता है।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 3,000 एक्स जी पर एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्पंदन करके एगरोज़-एंटी-एचए मोती इकट्ठा करें। ध्यान से एस्पिरेट करें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। बर्फ-ठंडे एनपी -40 सेल लिसिस बफर के साथ मोतियों को तीन बार और बर्फ-ठंडा फ्लैग / एचए बफर (10 एमएम हेप्स पीएच 7.9, 15 एमएम एमजीसीएल 2, 225 एमएम केसीएल, और 0.1% एनपी -40) के साथ दो बार धोएं।
- अंतिम धोने के बाद, एक पिपेट का उपयोग करके सभी सतह पर तैरनेवाला को सावधानीपूर्वक हटा दें और फ्लैग / एचए बफर पर पतला एचए पेप्टाइड (300 μg / एमएल) के साथ पॉलीयूबिकुइटाइलेटेड प्रोटीन को हटा दें। एक कमाल शेकर मंच में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एचए पेप्टाइड के साथ एगरोज़-एंटी-एचए मोती सेते हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 3,000 एक्स जी पर मोती नीचे स्पिन और ध्यान से पॉलीयूबिक्विटिनेटेड प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला विंदुक। यदि आवश्यक हो, तो -20 डिग्री सेल्सियस पर एक ताजा और साफ माइक्रोट्यूब में एलुएट स्टोर करें।
- 10% एसडीएस-पेज (सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन) 17 और इम्यूनोब्लोटिंग में एलुएट्स और सेल लाइसेट्स को हल करें।
- इस अध्ययन में, एक गीला हस्तांतरण डब्ल्यूबी किया गया था। इस तरह के हस्तांतरण के लिए, जेल को फिल्टर पेपर-जेल-झिल्ली-फिल्टर पेपर से बने स्थानांतरण सैंडविच में रखें, इसे पैड के साथ कुशन करें, और इसे एक समर्थन ग्रिड द्वारा एक साथ दबाएं। इस प्रणाली को स्थानांतरण बफर से भरे टैंक में और स्टेनलेस स्टील / प्लैटिनम तार इलेक्ट्रोड के बीच लंबवत रखें। हस्तांतरण गीला हस्तांतरण बफर (ग्लाइसिन 192 एमएम, ट्रिस-बेस 25 एमएम, 0.025% एसडीएस, 20% मेथनॉल) में 150 वी पर 90 मिनट के लिए होता है।
नोट: चूंकि सेल अर्क की मात्रा निर्धारित की गई थी (चरण 3.7), प्रत्येक नमूने के लिए प्रोटीन की समान मात्रा के साथ एक एसडीएस-पेज चलाएं। इसके अलावा, एल्यूएट को हल करने के लिए, प्रत्येक नमूने के बराबर वॉल्यूम चलाएं। - चयनित एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोब्लोट झिल्ली की जांच करें 11. सुनिश्चित करें कि जंगली प्रकार के ई 3 लिगेज, सब्सट्रेट और माइक-यूबी वाले नमूनों में एंटी-माइक एंटीबॉडी का उपयोग करके आईपी प्रक्रिया में खींचे गए पॉलीयूबिक्युइटेटेड सब्सट्रेट से एलुएट में एक स्मीयर सिग्नल का पता लगाया जाता है। सेल लाइसेट (इनपुट) में, सुनिश्चित करें कि चुने हुए सब्सट्रेट, एफबीएक्सओ 7 प्रोटीन, सर्वव्यापी प्रोटीन, और एक हाउसकीपिंग प्रोटीन (जैसे, जीएपीडीएच और β-एक्टिन) से सिग्नल प्रत्येक लेन में प्रोटीन की समान मात्रा की गारंटी देने के लिए पता लगाया जाता है।
नोट: उपयोग किए गए प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए कमजोर पड़ने निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार किया गया था।
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Representative Results
यूएक्सटी (सर्वव्यापी रूप से व्यक्त प्रतिलेख) एक प्रीफोल्डिन जैसा प्रोटीन है जो माउस और मानव ऊतकों जैसे हृदय, मस्तिष्क, कंकाल की मांसपेशियों, प्लेसेंटा, अग्न्याशय, गुर्दे और यकृत18 में सर्वव्यापी रूप से व्यक्त प्रोटीन-तह परिसरों का निर्माण करता है। यूएक्सटी के दो स्प्लिसिंग आइसोफॉर्म, जिन्हें यूएक्सटी-वी 1 और यूएक्सटी-वी 2 नाम दिया गया है, को अलग-अलग कार्यों और उपकोशिकीय स्थानों का प्रदर्शन करने का वर्णन किया गया है। यूएक्सटी-वी 1 मुख्य रूप से साइटोप्लाज्म में और माइटोकॉन्ड्रिया के अंदर स्थानीयकृत है, और यह टीएनएफ-α-प्रेरित एपोप्टोसिस और एंटीवायरल सिग्नलोसोम गठन19,20 में फंसा हुआ है। अधिकांश शोधों ने यूएक्सटी-वी 2 पर ध्यान केंद्रित किया है जो मुख्य रूप से नाभिक में स्थानीयकृत है और सेल प्रसार विनियमन, भेदभाव और भड़काऊ मार्गों में शामिल कई ट्रांसक्रिप्शनल कारकों के लिए सह-कारक के रूप में कार्य करता है। यूएक्सटी-वी 2 एनएफ-κबी सिग्नलिंग मार्ग में शामिल है जो एनएफ-κबी एन्हांसोसोम21 में एक आवश्यक कोएक्टिवेटर के रूप में काम कर रहा है। यह प्रदर्शित किया गया था कि यूएक्सटी-वी 2 ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज एससीएफ (एफबीएक्सओ 7) का एक विहित सब्सट्रेट है, जो प्रोटियासोम द्वारा इसके पॉलीयूबिक्विटाइलेशन और गिरावट की मध्यस्थता करता है, और परिणामस्वरूप एनएफ-κबी सिग्नलिंग मार्ग11 को बाधित करता है।
कोशिकाओं में एफबीएक्सओ 7 द्वारा मध्यस्थता वाले यूएक्सटी-वी 2-एचए के विशिष्ट पॉलीयूबिकिटाइलेशन को एंटी-माइक एंटीबॉडी के साथ एंटी-एचए आईपी से एलुएट की जांच करने के बाद देखा गया था, जो सब्सट्रेट (चित्रा 2) के लिए संयुग्मित माइक-यूबी का पता लगाता है। पॉलीयूबिकुइटाइलेटेड सब्सट्रेट के लिए एंटी-माइक की विशिष्टता को लेन 1 और 2 (चित्रा 2) में देखा गया था, जिसमें पॉलीयूबिक्युइटिलेटेड प्रोटीन के स्मीयर का पता नहीं चला था जब कोशिकाओं को यूएक्सटी-वी 2-एचए प्लास्मिड (चित्रा 2, लेन 1) की अनुपस्थिति में एफबीएक्सओ 7 और माइक-यूबी के साथ सह-संक्रमित किया गया था। इसके अतिरिक्त, माइक-यूबी प्लास्मिड (चित्रा 2, लेन 2) के बिना एफबीएक्सओ 7 और यूएक्सटी-वी 2-एचए के संयोजन में प्रोटीन पॉलीयूबिक्विटिनेशन के अनुरूप कोई धब्बा कल्पना नहीं की गई थी। यह साबित करने के लिए कि यूएक्सटी-वी 2 पॉलीयूबिक्विटाइलेशन एफबीएक्सओ 7 द्वारा मध्यस्थता की गई थी, एक खाली वेक्टर पीसीडीएनए 3, जंगली प्रकार एफबीएक्सओ 7 या एफबीएक्सओ 7-ΔF-बॉक्स उत्परिवर्ती, जो एफ-बॉक्स डोमेन की अनुपस्थिति के कारण सक्रिय एससीएफ कॉम्प्लेक्स को इकट्ठा करने में असमर्थ है जो एसकेपी 1 के साथ बातचीत के लिए जिम्मेदार है, यूएक्सटी-वी 2-एचए और माइक-यूबी के संयोजन में ट्रांसफेक्ट किया गया था। पॉलीयूबिक्युइटाइलेटेड यूएक्सटी-वी 2 का एक मजबूत धब्बा संकेत केवल जंगली प्रकार के एफबीएक्सओ 7 (चित्रा 2, लेन 4) की उपस्थिति में देखा गया था, यह सुझाव देते हुए कि यूएक्सटी-वी 2 नियंत्रण (चित्रा 2, लेन 3 और 5) की तुलना में कोशिकाओं में एससीएफ (एफबीएक्सओ 7) कॉम्प्लेक्स द्वारा पॉलीयूबिकुइटाइलेटेड था। इन नकारात्मक नियंत्रणों की उपस्थिति में पॉलीयूबिकुइटाइलेटेड यूएक्सटी-वी 2 के बेहोश स्मीयर सिग्नल की उपस्थिति अंतर्जात एफबीएक्सओ 7 या अन्य ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज गतिविधि की कार्रवाई का संकेत दे सकती है।
चित्र 2. कोशिकाओं में सर्वव्यापी परख: संकेत प्लास्मिड के साथ एचईके 293 टी कोशिकाओं का क्षणिक अभिकर्मक। सेल लिसिस के बाद, सेल अर्क (इनपुट) को एगरोज़-एंटी-एचए मोतियों के साथ इम्यूनोप्रेसिपिटेट किया गया था। एल्यूटेड और इनपुट नमूनों को एसडीएस-पेज द्वारा हल किया गया था, और पश्चिमी धब्बा विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ जांच की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
सर्वव्यापीता एक आवश्यक पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जो कई प्रोटीनों के स्तर को नियंत्रित करता है और कई सिग्नलिंग मार्गों और जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, एक स्वस्थ इंट्रासेल्युलर वातावरण सुनिश्चित करता है। यूबिक्विटिन-प्रोटियासोम सिस्टम (यूपीएस) हाल के फार्मास्युटिकल अनुसंधान के मुख्य केंद्रों में से एक है, जो ट्यूमर सप्रेसर्स को स्थिर करने या ऑन्कोजेनिक उत्पादों के क्षरण को प्रेरित करने की संभावना प्रदान करताहै 22. उदाहरण के लिए, मल्टीपल मायलोमा (एमएम) में मोनोक्लोनल इम्युनोग्लोबुलिन स्राव के लिए जिम्मेदार प्लाज्मा सेल नियोप्लाज्म का विपथन प्रसार एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) 23 में गलत और / एक बार जब यह ईआर तनाव होता है, तो यह कई प्रक्रियाओं को सक्रिय करता है, जिसमें सर्वव्यापी-प्रोटियासोम प्रणाली की सक्रियता भी शामिल है। प्रोटीन संचय को प्रेरित करने के लिए प्रोटियासोम इनहिबिटर (बोर्टेज़ोमिब, कार्फिलज़ोमिब और इक्साज़ोमिब) का उपयोग और कई मायलोमा उपचार के लिए परिणामी कोशिका मृत्यु ने उच्च जोखिम वाले रोगियों24,25 में रोग की प्रगति को कम करके एंटी-ट्यूमर दवा के रूप में आशाजनक परिणाम दिखाए। इसके अलावा, प्रोटीन स्थिरता पर केंद्रित अन्य प्रयासों का उद्देश्य है, जैसे कि ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज एमडीएम 2 के लिए अवरोधक जो पी 53 की सर्वव्यापीता से बचने में बड़ी क्षमता दिखाते हैं, इसलिए प्रोटियासोम26 के माध्यम से इसकी गिरावट को रोकते हैं। इस प्रकार, बीमारी से निपटने के लिए एक विधि के रूप में यूपीएस को समझने और नियंत्रित करने पर केंद्रित फार्मास्यूटिकल / बायोमेडिकल अनुसंधान का एक नया युग उत्पन्न हुआ है।
यह अध्ययन सेलुलर वातावरण में किसी दिए गए ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज द्वारा एक विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन की सर्वव्यापीता का विश्लेषण करने की एक विधि का वर्णन करता है। इस परख में, कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या क्षणिक रूप से एक टैग प्रोटीन सब्सट्रेट, एक ई 3 लिगेज, और एक टैग किए गए सर्वव्यापी के लिए चयनित प्लास्मिड एन्कोडिंग के साथ सह-ट्रांसफेक्टेड होती है। लाइसिस से पहले, कोशिकाओं को प्रोटियासोम अवरोधक के साथ इलाज किया जाना चाहिए ताकि पॉलीयूबिकुइटाइलेटेड प्रोटीन के संचय की अनुमति मिल सके जो प्रोटियासोम में गिरावट से गुजरेंगे। कम जटिल नमूना प्राप्त करने के लिए, लक्ष्य प्रोटीन को प्रतिरक्षावर्षित किया गया था, और यूबिक्विटिन टैग के आधार पर विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके डब्ल्यूबी द्वारा इसके पॉलीयूबिक्विटाइलेशन का विश्लेषण किया गया था।
प्रत्येक नमूने और एगारोज़ मोतियों में प्रोटीन की मात्रा को उन नमूनों के बीच डेटा तुलना की अनुमति देने के लिए सामान्यीकृत किया जाना चाहिए। जंगली प्रकार के ई 3 यूबिक्विटिन-लिगेज की उपस्थिति में यूएक्सटी-वी 2 पॉलीयूबिक्विटाइलेशन के एक उच्च तीव्रता वाले स्मीयर सिग्नल का पता चला था। भले ही लक्ष्य प्रोटीन, ई 3 लिगेज और यूबिक्विटिन से प्राप्त संकेत अंतर्जात मूल से हो सकता है, पुनः संयोजक प्रोटीन के उपयोग से डब्ल्यूबी विश्लेषण में उच्च उपज और सिग्नल का पता लगाने का लाभ होता है। इसके अलावा, जंगली प्रकार ई 3 लिगेज और इसके उत्परिवर्ती का उपयोग सब्सट्रेट में उनकी गतिविधि के विशिष्ट विश्लेषण की अनुमति देता है, जो इस प्रयोग के लिए एक आवश्यक नियंत्रण है। यह देखा गया कि एफबीएक्सओ 7 उत्परिवर्ती (एफबीएक्सओ 7-ΔF-बॉक्स) यूएक्सटी-वी 2 के पॉलीयूबिक्विटाइलेशन को बढ़ावा नहीं दे सका, यह सुझाव देते हुए कि जंगली प्रकार के एफबीएक्सओ 7 की उपस्थिति में पाया गया स्मीयर सिग्नल विशिष्ट था। इसके अलावा, यह देखना महत्वपूर्ण है कि टैग किए गए सब्सट्रेट या माइक-यूबी की अनुपस्थिति में, पॉलीयूबिकुइटाइलेटेड स्मीयर का पता नहीं चला था, जो उपयोग किए गए एगरोज़-एंटी-एचए की विशिष्टता को दर्शाता है। सब्सट्रेट आईपी से एलुएट की जांच करने के लिए एंटी-यूबिक्विटिन एंटीबॉडी का उपयोग नकारात्मक नियंत्रणों में भी पॉलीयूबिक्युइटिलेटेड स्मीयर सिग्नल का पता लगा सकता है, क्योंकि लक्ष्य के अविशिष्ट प्रोटीन या अप्रत्यक्ष प्रोटीन भागीदारों को सब्सट्रेट के साथ भी जोड़ा जा सकता है। एक बार जब ये अविशिष्ट प्रोटीन पॉलीयूबिकुइटाइलेटेड हो सकते हैं, तो एंटी-यूबिक्विटिन की उच्च संवेदनशीलता उनका पता लगा सकती है।
प्लास्मिड अभिकर्मक, सेल लाइसिस बफर, इम्यूनोप्रेसिपिटेशन एंटीबॉडी और डब्ल्यूबी जांच के बारे में इस प्रोटोकॉल के लिए कुछ भिन्नताएं भी हैं। यहां प्रस्तुत आईपी को सब्सट्रेट को अवक्षेपित करने के लिए एंटी-एचए एंटीबॉडी के साथ विकसित किया गया था, और यूबिक्विटिन सिग्नल की कल्पना करने के लिए एंटी-माइक एंटीबॉडी के साथ डब्ल्यूबी झिल्ली की जांच की गई थी। एंटी-सब्सट्रेट या एंटी-सब्सट्रेट टैग के साथ झिल्ली की जांच करने वाले एंटी-एचए और डब्ल्यूबी के साथ यूबिक्विटिन-एचए और आईपी का अभिकर्मक भी इस पद्धति के लिए एक विकल्प है। हालांकि, यूबिक्विटिन का इम्यूनोप्रेसिपिटेशन यूबिक्विटिन-बाइंडिंग प्रोटीन के अलावा बड़ी संख्या में अविशिष्ट पॉलीयूबिक्युइटिलेटेड प्रोटीन ला सकता है। इस मामले में, इन अवांछित प्रोटीन27 को कम करने के लिए सेल लाइसिस के दौरान आरआईपीए बफर (रेडियोइम्यूनोप्रेसिपिटेशन परख बफर) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, यह मूल्यांकन करना आवश्यक है कि आईपी प्रोटोकॉल आरआईपीए बफर के साथ संगत है या नहीं। इसके अलावा, सब्सट्रेट पॉलीयूबिक्विटाइलेशन विरूपण एपिटोप को अवरुद्ध करके इस विशिष्ट लक्ष्य के लिए एंटीबॉडी के बंधन को खराब कर सकता है। इस प्रकार, एंटी-टैग के साथ एंटीबॉडी का अनुप्रयोग अधिक विश्वसनीय है।
हालांकि यह दृष्टिकोण घुलनशील प्रोटीन शोधन के लिए बहुत उपयोगी है, यह कुछ सीमाओं को प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, अविशिष्ट अंतर्जात ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज की कार्रवाई देखी जा सकती है। इस मुद्दे को दूर करने और कोशिकाओं में लक्ष्य सर्वव्यापीता की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए, ई 1 और ई 2 एंजाइमों, यूबिक्विटिन, यूबिक्विटिन बफर और एटीपी के अलावा शुद्ध ई 3 लिगेज कॉम्प्लेक्स और चयनित सब्सट्रेट का उपयोग करके इन विट्रो सर्वव्यापी परख भी करना आवश्यक है, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इस पद्धति की एक और सीमा तब होती है जब लक्ष्य प्रोटीन की अधिकता एक साइटोटॉक्सिक प्रभाव का कारण बनती है जो कम सेलुलर व्यवहार्यता में समाप्त होती है। इस स्थिति में, इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के लिए अंतर्जात प्रोटीन लक्ष्य का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इसके अतिरिक्त, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, यह प्रोटोकॉल घुलनशील प्रोटीन निष्कर्षण के लिए उपयुक्त है; इसलिए, यह झिल्ली-बाध्य प्रोटीन नहीं निकाल सकता है, उदाहरण के लिए। चाहे परीक्षण किया गया सब्सट्रेट एक झिल्ली प्रोटीन है, आरआईपीए बफर यहां वर्णित एनपी -40 लाइसिस बफर को प्रतिस्थापित कर सकता है यदि आईपी प्रोटोकॉल इसके द्वारा समझौता नहीं किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में, प्रोटीन निकासी का फोकस सर्वव्यापी-प्रोटियासोम प्रणाली है, जो बताता है कि केवल प्रोटियासोम अवरोधक का उपयोग किया गया था। हालांकि, लाइसोसोम में ऑटोफैगी के माध्यम से कई घुलनशील प्रोटीन गिरावट से गुजरते हैं। नतीजतन, एक लाइसोसोम अवरोधक का उपयोग करना, जैसे कि बाफिलोमाइसिन ए 1, रिक्तिका एच +-एटीपीस28 के कारण देर से चरण ऑटोफैगी को अवरुद्ध करने के लिए भी आवश्यक हो सकता है।
चूंकि सर्वव्यापीता एक प्रतिवर्ती प्रक्रिया है, इसलिए सर्वव्यापी को सब्सट्रेट से ड्यूबिक्विटिनेज (डीयूबी) की उत्प्रेरक गतिविधि द्वारा हटाया जा सकता है; यह ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज सब्सट्रेट29 की विशेषता होने पर प्रमुख बाधाओं में से एक है। डीयूबी की कार्रवाई इस तरह के प्रयोग में सब्सट्रेट भेदभाव को बढ़ाती है एक बार जब यह कुछ लक्ष्यों30 पर पॉलीयूबिक्विटिलेशन निवास समय को कम कर देता है। इसलिए, इस समस्या से बचने के लिए ड्यूबिक्विटिनेज इनहिबिटर के साथ कोशिकाओं का इलाज करना फायदेमंद होगा। सकारात्मक या नकारात्मक क्रॉसस्टॉक एक विशिष्ट सब्सट्रेट के भाग्य को भी प्रभावित कर सकता है। यह पहले से ही स्थापित है कि पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) विभिन्न परिदृश्यों में क्रॉसस्टॉक कर सकते हैं, और फॉस्फोराइलेशन, उदाहरण के लिए, ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज गतिविधि के मॉड्यूलेशन द्वारा सर्वव्यापीता को विनियमित कर सकता है, ई 3 लिगेज द्वारा सब्सट्रेट मान्यता को बढ़ावा दे सकता है या इसके सेलुलर स्थानीयकरण को प्रभावित करके सब्सट्रेट और ई 3 लिगेज इंटरैक्शन को विनियमित कर सकता है। . सेल लाइन चुनते समय यह एक मुद्दा हो सकता है जिसमें प्रयोग निष्पादित किया जाएगा। यदि वांछनीय सेल लाइन में सर्वव्यापीता के लिए आवश्यक संकेत अनुपस्थित हैं, तो विश्लेषण करने या चयनित सेल लाइन में सिग्नल को प्रेरित करने के लिए एक वैकल्पिक सेल लाइन का चयन करना आवश्यक है। कोशिकाओं में किए गए सर्वव्यापी परख में होने वाली एक आम समस्या एमजी 132 उपचार के बाद बड़े पैमाने पर कोशिका मृत्यु है, जो ज्यादातर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की पीढ़ी के कारण होती है जो एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु को प्रेरित करती है। प्रोटोकॉल को मानकीकृत करने के लिए कई परीक्षणों के बाद, यह एचईके 2 9 3 टी कोशिकाओं के लिए एक आदर्श एमजी 132 उपचार पाया गया था जो एकाग्रता के 10 μM पर लाइसिस से पहले 6 घंटे से अधिक नहीं था। यह प्रोटोकॉल सब्सट्रेट-ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज जोड़े की पहचान करने के लिए अन्य स्तनधारी सेल प्रकारों के लिए भी उपयुक्त है; हालांकि, अभिकर्मक में उपयोग की जाने वाली पीईआई की मात्रा और चुने हुए सेल लाइन के लिए एमजी 132 उपचार अवधि को मानकीकृत करना महत्वपूर्ण है।
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Disclosures
लेखकों ने घोषणा की है कि हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
एफ.आर.टी. एफएपीईएसपी अनुदान संख्या 2020/15771-6 और सीएनपीक्यू यूनिवर्सल 405836/2018-0 द्वारा समर्थित है। पीएमएसपी और वीएस सीएपीएस द्वारा समर्थित हैं। सी.आर.एस.टी.बी.सी. को एफएपीईएसपी छात्रवृत्ति संख्या 2019/23466-1 द्वारा समर्थित किया गया था। हम सामग्री समर्थन के लिए सैंड्रा आरसी मारुयामा (एफएपीईएसपी 2016/20258-0) को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL tube | Corning | 430766 | |
| 96-well plate | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA beads | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Mouse antibody | Seracare | 5220-0341 | Goat anti-Mouse IgG |
| Anti Rabbit antibody | Seracare | 5220-0337 | Goat anti-Rabbit IgG |
| Anti-Actin antibody | Sigma-Aldrich | A3853 | Dilution used: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antibody | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H3663 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-Myc antibody | Cell Signalling | 2272 | Dilution used: 1:1000 |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Bovine Serum Albumin |
| Cell incubator | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g for 5 min |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Digital pH meter | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | 10-017-CRV | High glucose |
| Fetal bovine serum | Gibco | F4135 | Filtrate prior use |
| HA peptide | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optical microscope | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | For mammalian expression |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Phosphate buffered saline 10x | AccuGENE | 51226 | To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Rocking Shaker | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE system | BioRad | 165-8004 | |
| Solution Homogenizer | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Trypsine (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
References
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Callis, J.
- Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
- French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T.
- Komander, D., et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143 (5), 682-685 (2010).
- Davies, B. A., et al. Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).
- Raasi, S., Wolf, D. H. Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome. Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).
- Pan, M., et al. Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination. Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).
- Raducu, M., et al. SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development. The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).
- Spagnol, V., et al. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754 (2021).
- Teixeira, F. R., et al. Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease. Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).
- Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover. Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).
- van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M.
- Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates. Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).
- Bradford, M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 228, 726-734 (1970).
- Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue. Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria. The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).
- Huang, Y., et al. UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).
- Sun, S., et al. UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome. The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).
- Huang, X., Dixit, V. M. Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).
- Rajkumar, S. V. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).
- Hideshima, T., et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells. Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).
- Tietsche, V., et al. New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Kuiken, H. J., et al. Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).
- Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
- Iconomou, M., Saunders, D. N. Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates. Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).
- Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER. Cell. 154 (3), 609-622 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
