Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Evaluering af substratubiquitylation af E3 Ubiquitin-ligase i pattedyrcellelysater

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63561
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1,2
1Department of Genetic and Evolution, Federal University of São Carlos, 2Department of Biochemistry and Immunology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Vi leverer en detaljeret protokol til et allestedsnærværende assay af et specifikt substrat og en E3 ubiquitin-ligase i pattedyrceller. HEK293T-cellelinjer blev anvendt til proteinoverekspression, det polyubiquitylerede substrat blev oprenset fra cellelysater ved immunoprecipitation og løst i SDS-PAGE. Immunoblotting blev brugt til at visualisere denne posttranslationelle modifikation.

Abstract

Ubiquitylation er en posttranslationel modifikation, der forekommer i eukaryote celler, der er kritisk for flere biologiske vejes regulering, herunder celleoverlevelse, proliferation og differentiering. Det er en reversibel proces, der består af en kovalent binding af ubiquitin til substratet gennem en kaskadereaktion af mindst tre forskellige enzymer, sammensat af E1 (Ubiquitin-aktiveringsenzym), E2 (Ubiquitin-konjugerende enzym) og E3 (Ubiquitin-ligaseenzym). E3-komplekset spiller en vigtig rolle i substratgenkendelse og allestedsnærværende. Her beskrives en protokol til evaluering af substratubiquitylation i pattedyrceller ved anvendelse af forbigående co-transfektion af et plasmid, der koder for det valgte substrat, en E3 ubiquitin ligase og et mærket ubiquitin. Før lysis behandles de transinficerede celler med proteasomhæmmeren MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) for at undgå substrat proteasomal nedbrydning. Desuden underkastes celleekstraktet til småskala immunoprecipitation (IP) for at rense det polyubiquitylerede substrat til efterfølgende påvisning ved western blotting (WB) ved anvendelse af specifikke antistoffer til ubiquitinmærke. Derfor beskrives en konsistent og ukompliceret protokol til allestedsnærværende assay i pattedyrceller for at hjælpe forskere med at adressere allestedsnærværende substrater og E3 ubiquitin-ligaser.

Introduction

Posttranslationelle modifikationer (PTM'er) er en vigtig mekanisme vedrørende proteinregulering, hvilket er afgørende for cellehomeostase. Protein allestedsnærværende er en dynamisk og indviklet modifikation, der skaber et udvalg af forskellige signaler, hvilket resulterer i flere cellulære resultater i eukaryote organismer. Ubiquitylation er en reversibel proces bestående i binding af et ubiquitinprotein indeholdende 76 aminosyrer til substratet, der forekommer i en enzymatisk kaskade sammensat af tre forskellige reaktioner1. Det første trin er kendetegnet ved ubiquitinaktivering, som afhænger af en ATP-hydrolyse for at danne et højenergi-thioesterbundet ubiquitin mellem ubiquitin C-terminalen og cysteinresten til stede i det aktive sted af E1-enzymet. Derefter overføres ubiquitin til E2-enzymet, der danner et thioester-lignende kompleks med ubiquitin. Derefter bindes ubiquitin kovalent til substratet af E2 eller oftere af E3-enzymet, som genkender og interagerer med substratet 2,3. Lejlighedsvis er E4-enzymer (Ubiquitin-kædeforlængelsesfaktorer) nødvendige for at fremme multiubiquitinkædesamling3.

Ubiquitin har syv lysinrester (K6, K11, K27, K29, K33, K48 og K63), hvilket gør det muligt at danne polyubiquitinkæder, der genererer forskellige forbindelser til at producere forskellige tridimensionelle strukturer, der vil blive genkendt af flere effektorproteiner 4,5. Derfor er den slags polyubiquitinkæde, der introduceres i substratet, afgørende for at bestemme dens celle skæbne 6,7,8. Desuden kunne substratet også være allestedsnærværende gennem dets N-terminale rester kaldet N-degroner. Specifikke E3 ubiquitin-ligaser er ansvarlige for N-degrongenkendelse, hvilket muliggør polyubiquitylation af nærliggende lysinrester9.

I dag er der mere end 40 forskellige SCF-specifikke substrater karakteriseret. Blandt disse kan nøgleregulatorer af flere biologiske veje, herunder celledifferentiering og udvikling samt celleoverlevelse og død, findes 10,11,12,13. Således er identifikationen af specifikke substrater af hver E3 ubiquitin-ligase afgørende for at designe et omfattende kort over forskellige biologiske begivenheder. Selvom identifikationen af sande substrater er biokemisk udfordrende, er brugen af biokemibaserede metoder meget velegnet til at evaluere kædespecificitet og sondringen mellem mono- og polyubiquitylation14. Denne undersøgelse beskriver en komplet protokol til allestedsnærværende assay ved hjælp af pattedyrcellelinjen HEK293T, der overudtrykker substratet UXT-V2 (allestedsnærværende udtrykt præfoldinlignende chaperone isoform 2) med E3 ubiquitin-ligasekomplekset SCF (Fbxo7). UXT-V2 er en væsentlig co-faktor for NF-κB-signalering, og når dette protein er slået ned i celler, hæmmer det TNF-α-induceret NF-κB-aktivering11. For at detektere polyubiquityleret UXT-V2 anvendes proteasomhæmmeren MG132 således, da den har evnen til at blokere den proteolytiske aktivitet af 26S-underenheden af proteasomkomplekset15. Desuden underkastes celleekstraktet til en lille IP for at rense substratet ved anvendelse af et specifikt antistof immobiliseret til agaroseharpiks til efterfølgende påvisning af WB ved anvendelse af udvalgte antistoffer. Denne protokol er meget nyttig til at validere substrat allestedsnærværende i det cellulære miljø, og den kan også tilpasses til forskellige typer pattedyrceller og andre E3 ubiquitin-ligasekomplekser. Det er imidlertid nødvendigt også at validere substratet testet gennem et in vitro ubiquitylationsassay, da begge protokoller supplerer hinanden med hensyn til identifikation af sande substrater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: En oversigt over ubiquitylation assay protocol i pattedyrceller er repræsenteret i figur 1.

Figure 1
Figur 1. Oversigt over allestedsnærværende assayprocedure. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Cellekultur

  1. Dyrk HEK293T-cellelinje i en 100 mm TC-behandlet kulturskål til 80% -90% sammenløb i vækstmedier (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) høj glucose suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin (100 enheder), streptomycin (100 μg) og L-glutamin (0,292 mg / ml)). Kulturen inkuberes ved 37 °C i en befugtet cellekulturinkubator ved 5 % CO2.
  2. For at passere cellerne skal du aspirere mediet fra kulturskålen ved hjælp af en serologisk pipette. Cellerne vaskes én gang med 1 ml steriliseret 1x fosfatbufferet saltvand (PBS 1x).
  3. Cellerne løsnes ved tilsætning af 1 ml trypsin/EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre) opløsning. Inkuber fadet ved 37 °C i 5 min. Resuspender cellerne ved hjælp af en serologisk pipette i 2 ml vækstmedier.
  4. Cellesuspensionen overføres til et friskt og rent 15 ml rør og centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Fjern supernatanten ved at hælde den forsigtigt ud. Resuspender forsigtigt cellepillen i 3 ml vækstmedier ved at pipettere op og ned for at opnå en homogen cellesuspension.
  5. Overfør 1 ml af cellesuspensionen til en 100 mm TC-behandlet kulturskål indeholdende 9 ml vækstmedier.
    BEMÆRK: Hvis cellerne er i gode forhold, kan hver kulturskål af HEK293T, hvor sammenløbet er 80% -90%, generere tre kulturretter med 80% sammenløb 2 dage efter passagen.

2. Celletransfektion

BEMÆRK: Det anbefales ikke at transfektere cellekulturen, hvis sammenløbet er mindre end 80%.

  1. Før transfektion skal det attesteres, om cellerne er fri for kontaminering og ved et tilstrækkeligt sammenløb til forbigående transfektioner.
  2. For hver transfektionsprøve fremstilles DNA-polyethyleniminkomplekserne (PEI 1 μg/μL ved pH 7,2) som følger:
    1. 3 μg af hvert plasmid fortyndes i 100 μL opti-MEM I reduceret serummedium uden tilskud og blandes forsigtigt ved at pipettere opløsningen op og ned.
      BEMÆRK: Her blev cellerne transficeret med 4 μg af hvert plasmid: Tom vektor (pcDNA3) eller FLAG-Fbxo7 konstruktioner og UXT-V2-HA, med eller uden 6xHis-myc-ubiquitin. Det samlede DNA-indhold var 12 μg.
    2. Optø PEI ved RT og tilsæt det i opløsningen efter en andel på 3 μL PEI pr. 1 μg DNA. Homogeniser opløsningen ved at pipettere op og ned. Derefter inkuberes det i 15 minutter ved RT for at tillade dannelse af DNA-PEI-komplekser.
      BEMÆRK: Den optimale andel af PEI-volumen pr. DNA-mængde varierer afhængigt af den valgte cellelinje.
  3. Tilsæt det samlede volumen af DNA-PEI-komplekser til hver skål, der indeholder cellekulturen, og bland den forsigtigt ved at rokke pladen frem og tilbage. Cellerne inkuberes ved 37 °C i en befugtet cellekulturinkubator ved 5 % CO2.
  4. Udskift vækstmediet efter 5 timer, da langvarig PEI-eksponering kan være giftig for HEK293T-celler. Cellerne inkuberes ved 37 °C i en befugtet cellekulturinkubator ved 5 % CO2 i 36 timer.

3. Cellelyse og immunprecipitation

  1. Efter inkubationsperioden og 6 timer før cellelyse skal de transinficerede celler behandles med 10 μM af proteasomhæmmeren MG-132. Endnu en gang inkuberes cellerne ved 37 ° C i en befugtet cellekulturinkubator ved 5% CO2.
  2. Opsuge mediet fra hver kulturskål med en serologisk pipette og vask det en gang med 1 ml 1x PBS. Løsrive cellerne ved at tilsætte 1 ml trypsin og inkubere skålen ved 37 °C i 5 min. Resuspend cellerne i 1 ml vækstmedier.
  3. Cellesuspensionen overføres til et friskt og rent 15 ml rør, og centrifuger det ved 500 x g i 5 minutter ved RT.
  4. Fjern supernatanten ved at hælde den forsigtigt ud. Resuspender forsigtigt cellepillen i 200 μL iskold NP-40 lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 225 mM KCl og 1% NP-40), suppleret med protease- og fosfatasehæmmercocktailen (10 mM NaF og 1 mM Na3VO4), og overfør opløsningen til et rent 1,5 ml mikrorør.
  5. Inkuber cellelyset i 30 minutter på is. Efter inkubation centrifugeres cellelysaterne ved 16.900 x g i 20 minutter ved 4 °C.
  6. I mellemtiden afbalanceres agarose-anti-HA perlerne med iskold NP-40 lysisbuffer. Brug 15 μL agarose-anti-HA perler til hver prøve. Perlerne vaskes med 200 μL NP-40 lysisbuffer ved at pulsere dem i et mikrocentrifugerør ved 3.000 x g i 1 minut ved 4 °C. Med en pipette, aspirere og kassere supernatanten meget omhyggeligt; gentag denne proces tre gange. Opbevar derefter perlerne ækvilibreret på is indtil brug.
  7. Efter centrifugering af cellelysene genvindes supernatanten. Kvantificer proteinindholdet i det samlede lysat ved hjælp af Bradford-metoden16.
  8. Sørg for, at hver prøve, der udsættes for immunprecipitation, præsenterer en lige stor mængde protein. Inkuber det nødvendige volumen cellelysat med de ekvilibrerede agarose-anti-HA perler i 4 timer, forsigtigt roterende i en roterende inkubator ved 4 ° C, hvilket gør det muligt for UXT-V2-HA at binde til agarose-anti-HA perlerne.
  9. Agarose-anti-HA perlerne opsamles ved at pulsere dem i et mikrocentrifugerør ved 3.000 x g i 1 minut ved 4 °C. Aspirer forsigtigt og kassér supernatanten. Perlerne vaskes tre gange med iskold NP-40 celle lysis buffer og to gange med iskold FLAG/HA buffer (10 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl og 0,1% NP-40).
  10. Efter den sidste vask fjernes hele supernatanten forsigtigt med en pipette, og det polyubiquitylerede protein elueres med HA-peptid (300 μg/ml) fortyndet på FLAG/HA-buffer. Agarose-anti-HA perlerne inkuberes med HA-peptid i 1 time ved 4 °C i en gyngende rysteplatform.
  11. Centrifuger perlerne ned ved 3.000 x g i 2 minutter ved 4 °C, og pipetter forsigtigt supernatanten indeholdende de polyubiquitinerede proteiner. Om nødvendigt opbevares eluatet i et friskt og rent mikrorør ved -20 °C.
  12. Opløsning af eluaterne og cellelysaterne i 10% SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese)17 og immunoblotting.
  13. I denne undersøgelse blev der udført en våd overførsel WB. Til denne form for overførsel skal du placere gelen i en overførselssandwich sammensat af filterpapir-gel-membran-filterpapir, dæmpe det med puder og trykke det sammen med et støttegitter. Placer dette system lodret i en tank fyldt med overførselsbuffer og mellem rustfrit stål / platintrådelektroder. Overførslen sker i 90 minutter ved 150 V i vådoverførselsbuffer (glycin 192 mM, tris-base 25 mM, 0,025% SDS, 20% methanol).
    BEMÆRK: Da celleekstrakterne blev kvantificeret (trin 3.7), skal du køre en SDS-PAGE med en lige stor mængde protein for hver prøve. For at løse eluatet skal du også køre lige store mængder af hver prøve.
  14. Undersøg immunblotmembranen ved hjælp af udvalgte antistoffer 11. Sørg for, at der detekteres et udtværingssignal i eluatet fra det polyubiquitylerede substrat, der trækkes i IP-processen ved anvendelse af anti-myc-antistof i prøverne indeholdende vildtype E3-ligase, substratet og myc-ub. I cellelyset (input) skal du sikre dig, at signalet fra det valgte substrat, Fbxo7-proteinet, ubiquitylerede proteiner og et husholdningsprotein (f.eks. GAPDH og β-actin) detekteres for at garantere den samme mængde proteiner i hver bane.
    BEMÆRK: Fortyndingen for hvert anvendt antistof blev fremstillet i henhold til producentens anvisninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

UXT (allestedsnærværende udtrykt transkript) er et præfoldinlignende protein, der danner allestedsnærværende udtrykte proteinfoldningskomplekser i muse- og humant væv såsom hjerte, hjerne, skeletmuskulatur, placenta, bugspytkirtel, nyre og lever18. To splejsningsisoformer af UXT, der hedder UXT-V1 og UXT-V2, er blevet beskrevet, der udfører forskellige funktioner og subcellulære placeringer. UXT-V1 er overvejende lokaliseret i cytoplasmaet og inde i mitokondrierne, og det er impliceret i TNF-α-induceret apoptose og antiviral signalosomdannelse19,20. De fleste undersøgelser har fokuseret på UXT-V2, der hovedsageligt er lokaliseret i kernen og fungerer som en co-faktor for flere transkriptionelle faktorer involveret i celleproliferationregulering, differentiering og i inflammatoriske veje. UXT-V2 er involveret i NF-κB-signalvejen, der fungerer som en væsentlig medaktivator i NF-κB-enhanceosome21. Det blev påvist, at UXT-V2 er et kanonisk substrat af E3 ubiquitin-ligase SCF(Fbxo7), der medierer dets polyubiquitylation og nedbrydning af proteasomet og følgelig hæmmer NF-κB-signalvejen11.

Den specifikke polyubiquitylation af UXT-V2-HA medieret af Fbxo7 i celler blev observeret efter undersøgelse af eluatet fra anti-HA IP med et anti-myc-antistof, som detekterer myc-ub konjugeret til substratet (figur 2). Specificiteten af anti-myc for polyubiquityleret substrat blev visualiseret i bane 1 og 2 (figur 2), hvor udtværing af polyubiquitylerede proteiner ikke blev påvist, når celler blev co-transficeret med Fbxo7 og myc-ub i fravær af UXT-V2-HA plasmid (figur 2, bane 1). Derudover blev der ikke visualiseret udtværing svarende til proteinpolyubiquitination i kombinationen af Fbxo7 og UXT-V2-HA uden myc-ub-plasmidet (figur 2, bane 2). For at bevise, at UXT-V2 polyubiquitylation blev medieret af Fbxo7, blev en tom vektor pcDNA3, vildtype Fbxo7 eller Fbxo7-ΔF-box mutant, som ikke er i stand til at samle aktivt SCF-kompleks på grund af fraværet af F-box-domænet, der er ansvarlig for interaktion med SKP1, transficeret i kombination med UXT-V2-HA og myc-ub. Et stærkt smøresignal af polyubiquityleret UXT-V2 blev kun observeret i nærværelse af vildtype Fbxo7 (figur 2, bane 4), hvilket tyder på, at UXT-V2 blev polyubiquityleret af SCF (Fbxo7) -komplekset i celler sammenlignet med kontrollerne (figur 2, baner 3 og 5). Tilstedeværelsen af et svagt smøresignal af polyubiquityleret UXT-V2 i nærvær af disse negative kontroller kan indikere virkningen af endogen Fbxo7 eller anden E3 ubiquitin-ligaseaktivitet.

Figure 2
Figur 2. Ubiquitylation assay i celler: Transient transfektion af HEK293T celler med de angivne plasmider. Efter cellelysis blev celleekstrakterne (input) immunudforskudt med agarose-anti-HA perler. De eluterede og inputprøver blev løst af SDS-PAGE, og western blot blev undersøgt med specifikke antistoffer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ubiquitylation er en væsentlig posttranslationel modifikation, der regulerer niveauerne af flere proteiner og spiller en afgørende rolle i mange signalveje og biologiske processer, hvilket sikrer et sundt intracellulært miljø. Det ubiquitin-proteasomsystem (UPS) er et af hovedfokuserne for nyere farmaceutisk forskning, hvilket giver mulighed for at stabilisere tumorundertrykkere eller fremkalde nedbrydning af onkogene produkter22. For eksempel fremmer den afvigende proliferation af plasmacelleneoplasmer, der er ansvarlige for monoklonal immunoglobulinsekretion i myelomatose (MM), en patofysiologisk vej på grund af misfoldet og / eller udfoldet proteinakkumulering i det endoplasmatiske retikulum (ER)23. Når denne ER-stress sker, aktiverer den flere processer, herunder aktiveringen af ubiquitin-proteasomsystemet. Anvendelsen af proteasomhæmmere (bortezomib, carfilzomib og ixazomib) til at inducere proteinakkumulering og deraf følgende celledød til behandling med myelomatose viste lovende resultater som et antitumorlægemiddel ved at reducere sygdomsprogression hos højrisikopatienter24,25. Desuden er andre bestræbelser med fokus på proteinstabilitet rettet mod, såsom hæmmere til E3 ubiquitin-ligase MDM2, der viste stor evne til at undgå allestedsnærværende p53 og dermed forhindre dets nedbrydning gennem proteasomet26. Således er der opstået en ny æra af farmaceutisk / biomedicinsk forskning centreret om forståelse og kontrol af UPS som en metode til bekæmpelse af sygdommen.

Denne undersøgelse beskriver en metode til at analysere ubiquitylationen af et specifikt målprotein af en given E3 ubiquitin-ligase i et cellulært miljø. I dette assay er et betydeligt antal celler forbigående co-transficeret med udvalgte plasmider, der koder for et mærket proteinsubstrat, en E3-ligase og et mærket ubiquitin. Før lysis skal cellerne behandles med en proteasomhæmmer for at tillade akkumulering af polyubiquitylerede proteiner, der ville gennemgå nedbrydning i proteasomet. For at opnå en mindre kompleks prøve blev målproteinet immunudslettet, og dets polyubiquitylation blev analyseret af WB under anvendelse af specifikke antistoffer baseret på ubiquitin-mærket.

Mængden af protein i hver prøve og agaroseperler skal normaliseres for at gøre det muligt at sammenligne data mellem disse prøver. Et højintensivt smøresignal af UXT-V2 polyubiquitylation i nærværelse af vildtype E3 ubiquitin-ligase blev detekteret. Selvom signalet opnået fra målproteinet, E3-ligasen og ubiquitinen kunne være fra en endogen oprindelse, har brugen af rekombinante proteiner fordelen ved højere udbytte og signaldetektion i WB-analyse. Desuden tillader anvendelse af vildtype E3 ligase og dens mutant den specifikke analyse af deres aktivitet i substratet, hvilket er en væsentlig kontrol for dette eksperiment. Det blev observeret, at Fbxo7-mutanten (Fbxo7-ΔF-box) ikke kunne fremme polyubiquitylationen af UXT-V2, hvilket tyder på, at smøresignalet detekteret i nærværelse af vildtypen Fbxo7 var specifikt. Derudover er det vigtigt at bemærke, at i fravær af det mærkede substrat eller myc-ub blev det polyubiquitylerede smear ikke påvist, hvilket indikerer specificiteten af anvendt agarose-anti-HA. Brug af et anti-ubiquitin-antistof til at undersøge eluatet fra substrat IP kan detektere et polyubiquityleret smøresignal selv i de negative kontroller, da uspecifikke proteiner eller indirekte proteinpartnere af målet også kan elueres sammen med substratet. Når disse uspecifikke proteiner kan være polyubiquitylerede, kan anti-ubiquitins høje følsomhed detektere dem.

Der er også nogle variationer for denne protokol vedrørende plasmidtransfektion, cellelyselbuffer, immunoprecipitationsantistof og WB-sondering. IP'en, der præsenteres her, blev udviklet med anti-HA-antistof til udfældning af substratet, og WB-membranen blev undersøgt med anti-myc-antistof for at visualisere ubiquitinsignalet. Transfektionen af ubiquitin-HA og IP med anti-HA og WB, der undersøger membranen med et antisubstrat eller antisubstratmærke, er også et alternativ til denne metode. Imidlertid kan immunoprecipitation af ubiquitin medføre et stort antal uspecifikke polyubiquitylerede proteiner ud over ubiquitinbindende proteiner. I dette tilfælde anbefales det at anvende RIPA-buffer (radioimmunoprecipitation assay buffer) under cellelyse for at minimere disse uønskede proteiner27. Det er dog vigtigt at vurdere, om IP-protokollen er kompatibel med RIPA-buffer. Desuden kan substratpolyubiquitylation forringe bindingen af antistoffet til dette specifikke mål ved at blokere den konformationelle epitop. Således er anvendelsen af antistoffer med anti-tag mere pålidelig.

Selvom denne tilgang er meget nyttig til opløselig proteinrensning, præsenterer den nogle begrænsninger. For det første kunne virkningen af uspecifikke endogene E3 ubiquitin-ligaser observeres. For at overvinde dette problem og for at bekræfte specificiteten af målubiquitylationen i celler er det vigtigt også at udføre et in vitro ubiquitylationsassay ved hjælp af renset E3 ligasekompleks og udvalgt substrat ud over E1- og E2-enzymer, ubiquitin, ubiquitinbuffer og ATP, som er kommercielt tilgængelige. En anden begrænsning af denne metode opstår, når overekspressionen af målproteinet forårsager en cytotoksisk virkning, der kulminerer i reduceret cellulær levedygtighed. I denne situation anbefales det at anvende det endogene proteinmål til immunoprecipitation. Derudover er denne protokol som nævnt ovenfor egnet til opløselig proteinekstraktion; derfor kan det ikke ekstrahere membranbundne proteiner, for eksempel. Uanset om det testede substrat er et membranprotein, kan RIPA-bufferen erstatte NP-40 lysis-bufferen, der er beskrevet her, hvis IP-protokollen ikke kompromitteres af den. I denne protokol er fokus for proteinclearance ubiquitin-proteasomsystemet, hvilket forklarer, at kun proteasomhæmmeren blev anvendt. Imidlertid gennemgår talrige opløselige proteiner nedbrydning gennem autofagi i lysosomet. Følgelig kan anvendelse af en lysosomhæmmer, såsom bafilomycin A1, også være nødvendig for at blokere senfase autofagi på grund af vakuolær H + -ATPase 28.

Da allestedsnærværende er en reversibel proces, kan ubiquitin fjernes fra substratet ved katalytisk aktivitet af deubiquitinaser (DUB'er); dette er en af de største hindringer, når man karakteriserer E3 ubiquitin-ligase substrater29. Virkningen af DUB'er øger substratdiskriminationen i denne form for eksperiment, når den reducerer polyubiquitylationsdyberne på nogle mål30. Derfor ville det være gavnligt at behandle cellerne med deubiquitinasehæmmere for at undgå dette problem. Positiv eller negativ krydstale kan også påvirke skæbnen for et bestemt substrat. Det er allerede fastslået, at posttranslationelle modifikationer (PTM'er) kan krydstale i forskellige scenarier, og phosphorylering kan for eksempel regulere allestedsnærværende ved modulering af E3 ubiquitin-ligaseaktivitet, fremme substratgenkendelse af E3-ligagasser eller gennem regulering af substrat- og E3-ligaseinteraktion ved at påvirke dets cellulære lokalisering31 . Dette kan være et problem, når du vælger den cellelinje, hvor eksperimentet skal udføres. Hvis de signaler, der er forudsætninger for allestedsnærværende, er fraværende i den ønskede cellelinje, er det nødvendigt at vælge en alternativ cellelinje for at udføre analysen eller inducere signalet i den valgte cellelinje. Et almindeligt problem, der kan forekomme i allestedsnærværende assays udført i celler, er massiv celledød efter MG132-behandling, som for det meste er forårsaget af dannelsen af reaktive iltarter (ROS), der inducerer apoptotisk celledød. Efter flere tests for at standardisere protokollen blev det fundet en ideel MG132-behandling for HEK293T-celler, der ikke oversteg 6 timer før lysis ved 10 μM koncentration. Denne protokol er også velegnet til andre pattedyrcelletyper til at identificere substrat-E3 ubiquitin-ligasepar; selvom det er afgørende at standardisere mængden af PEI, der anvendes i transfektionen og MG132-behandlingsperioden for den valgte cellelinje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

F.R.T er støttet af FAPESP-tilskudsnummer 2020/15771-6 og CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P og V.S understøttes af CAPES. C.R.S.T.B.C blev støttet af FAPESP-stipendienummer 2019/23466-1. Vi takker Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) for den materielle støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microtube Axygen PMI110-06A
100 mm TC-treated culture dish Corning 430167
15 mL tube Corning 430766
96-well plate Cralplast 655111
Agarose-anti-HA beads Sigma-Aldrich E6779
Anti Mouse antibody Seracare 5220-0341 Goat anti-Mouse IgG
Anti Rabbit antibody Seracare 5220-0337 Goat anti-Rabbit IgG
Anti-Actin antibody Sigma-Aldrich A3853 Dilution used: 1:2000
Anti-Fbxo7 antibody Sigma-Aldrich SAB1407251 Dilution used: 1:1000
Anti-HA antibody Sigma-Aldrich H3663 Dilution used: 1:1000
Anti-Myc antibody Cell Signalling 2272 Dilution used: 1:1000
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916-500ML
BSA Sigma-Aldrich A9647-100G Bovine Serum Albumin
Cell incubator Nuaire NU-4850
Centrifuge Eppendorf 5804R 500 x g for 5 min
ChemiDoc BioRad
Digital pH meter Kasvi K39-2014B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Corning 10-017-CRV High glucose
Fetal bovine serum Gibco F4135 Filtrate prior use
HA peptide Sigma-Aldrich I2149
HEK293T cells ATCC CRL-3216
Hepes Gibco 15630080
KCl VWR Life Science 0365-500G
Kline rotator Global Trade Technology GT-2OIBD
MG-132 Boston Biochem I-130
Microcentrifuge Eppendorf 5418R
Na3VO4 (Ortovanadato)
NaF
Nitrocellulose blotting membrane GE Healthcare 10600016
NP40 (IGEPAL CA-630) Sigma-Aldrich I8896-100ML
Optical microscope OPTIKA microscopes SN510768
Opti-MEM Gibco 31985-070
pcDNA3 Invitrogen V79020 For mammalian expression
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367
pcDNA3-UXTV2-HA  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI
pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI
Pen Strep Glutamine 100x Gibco 10378-016
Phosphate buffered saline 10x AccuGENE 51226 To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 9002-98-6
Ponceau S VWR Life Science 0860-50G
Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST Sigma-Aldrich S8820
Rocking Shaker Kasvi 19010005
SDS-PAGE system BioRad 165-8004
Solution Homogenizer Phoenix Luferco AP-22
Trizma base Sigma-Aldrich T6066-500G
Trypsine (TrypLe Express) Gibco 12605-028
Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotechnology SC-2048

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  2. Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174 (2014).
  3. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  4. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7 (1), 6 (2021).
  5. Komander, D., et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).
  6. Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143 (5), 682-685 (2010).
  7. Davies, B. A., et al. Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).
  8. Raasi, S., Wolf, D. H. Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome. Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).
  9. Pan, M., et al. Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination. Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).
  10. Raducu, M., et al. SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development. The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).
  11. Spagnol, V., et al. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754 (2021).
  12. Teixeira, F. R., et al. Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease. Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).
  13. Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover. Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).
  14. van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. Visualizing ubiquitination in mammalian cells. EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).
  15. Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates. Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).
  16. Bradford, M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  17. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 228, 726-734 (1970).
  18. Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue. Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).
  19. Huang, Y., et al. UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria. The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).
  20. Huang, Y., et al. UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).
  21. Sun, S., et al. UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome. The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).
  22. Huang, X., Dixit, V. M. Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).
  23. Rajkumar, S. V. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).
  24. Hideshima, T., et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells. Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).
  25. Tietsche, V., et al. New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).
  26. Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
  27. Kuiken, H. J., et al. Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).
  28. Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
  29. Iconomou, M., Saunders, D. N. Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates. Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).
  30. Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER. Cell. 154 (3), 609-622 (2013).
  31. Hunter, T. The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).

Tags

Biokemi udgave 183
Evaluering af substratubiquitylation af E3 Ubiquitin-ligase i pattedyrcellelysater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

dos Passos, P. M. S., Spagnol, V.,… More

dos Passos, P. M. S., Spagnol, V., de Correia, C. R. S. T. B., Teixeira, F. R. Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates. J. Vis. Exp. (183), e63561, doi:10.3791/63561 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter