Summary
このプロトコルは、インビトロで14CO2産生を追跡することによって基板酸化を調べるための使いやすい方法を記載している。
Abstract
ミトコンドリアは、エネルギー恒常性を維持するためにアデノシン三リン酸(ATP)を生成するトリカルボン酸(TCA)サイクルと電子輸送鎖(ETC)の機構をホストします。グルコース、脂肪酸、およびアミノ酸は、ほとんどの体細胞においてミトコンドリア呼吸を促進する主要なエネルギー基質である。証拠は、異なる細胞型が特定の基質に対して明確な選好を有し得ることを示している。しかしながら、骨格中の各種細胞による基質利用は詳細に検討されていない。さらに、細胞代謝は生理学的および病態生理学的変化に順応しているため、骨格細胞における基質依存性の直接評価は、骨疾患の病因に関する重要な洞察を提供する可能性がある。
以下のプロトコールは、酸化的リン酸化に続く基質分子からの二酸化炭素放出の原理に基づいている。放射性標識された炭素原子(14C)を含む基質を使用することにより、この方法は、細胞培養における基質酸化速度について、高感度で使いやすいアッセイを提供する。原発性頭蓋骨前骨芽細胞と骨髄由来マクロファージ(BMM)とのケーススタディは、2つの細胞型間で主要な基質の利用率が異なることを示しています。
Introduction
真核生物における酸化的リン酸化(OXPHOS)は、栄養素がミトコンドリア内で分解され、酸素の消費を通じてATPの形で化学エネルギーを放出するプロセスである。 トリカルボン酸(TCA)サイクルを介したミトコンドリア内部の様々な基質の異化作用は、少数のATP分子を直接生成するが、むしろ電子伝達体ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)およびフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD+)の還元によってエネルギーを貯蔵する。次いで、還元された担体は、ミトコンドリアの内膜に位置するETCによって酸化され、膜を横切ってプロトン濃度勾配を生成する。プロトンは最終的にATP合成酵素を介してミトコンドリアマトリックスに勾配を流れ込み、ATPを生成する。OXPHOSは、エネルギー基質からのATP生産の最も効率的な手段であり、好気性環境で一般的に好ましい。以前は、好気性解糖系 - 酸素が存在する間にグルコースから乳酸を生成する - は病態生理学的であると考えられており、しばしば癌細胞の特徴である。いくつかの正常な細胞型が、まだ完全に解読されていない理由で好気性解糖系を使用することがますます発見されています。
代謝の柔軟性は、細胞または生物が変化するエネルギー需要および利用可能な燃料源に適応する能力である。例えば、骨格筋のエネルギー需要は、主に定常状態ではOXPHOSによって満たされるが、高強度運動中の嫌気性解糖系によって満たされる1。運動時間が長くなるにつれて、グルコースと脂肪酸の酸化は全体的なエネルギー生産に大きく寄与します2。しかしながら、基質の使用は、基質が酸化中に拮抗的に競合するため、入手可能性にのみ依存するものではない。最も顕著なのは、脂肪酸酸化が、ランドル効果3として知られる現象において骨格筋によるグルコース利用を阻害することが示されている。相反効果は、その後の研究4、5によって実証された。さらに、多くの疾患は、基質嗜好の変化および細胞における代謝不柔軟性の発症と関連している。例えば、脂肪酸酸化は、正常対照被験者6と比較してII型糖尿病患者の骨格筋において減少している。疾患設定における代謝変化は、病因に寄与する可能性があるため、激しい調査の対象となっている。
骨格細胞型におけるエネルギー代謝は比較的研究されていないが、近年注目されている7。これまでの研究は、好気性解糖系が歯蓋骨芽細胞における支配的なエネルギー経路であり、TCAサイクルを介したグルコース酸化が破骨細胞形成において役割を果たすことを示している8,9。その他は、骨芽細胞のエネルギー源としての脂肪酸の証拠を提供している10。グルタミン異化作用はまた、前駆細胞11、12からの骨芽細胞分化を支持することが示されている。しかしながら、様々な骨格細胞型による基質利用の包括的な理解は、依然として欠けている。さらに、細胞分化中または病理学的シグナルに応答した細胞代謝の変化は、燃料基質の利用率を変化させると予想される。以下に説明するのは、インビトロで基質酸化をアッセイするための使いやすいプロトコールです。
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Protocol
放射性物質(RAM)の使用には、各機関の指定安全委員会による事前の承認が必要です。このプロトコルで使用されるRAMは、ペンシルベニア大学のEnvironmental Health & Radiation Safety(EHRS)によって承認されています。動物の使用には、在宅施設の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)による事前の承認が必要です。以下の研究は、フィラデルフィア小児病院でIACUCによって承認された。
1. 14種類のC標識基質用原液の調製
- 11 gのBSAと33.1 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を混合し、BSAが完全に溶解するまで室温で約3時間穏やかに振とうすることにより、4 mMのウシ血清アルブミン(BSA)ストック溶液を作ります。使用前にBSA原液を70°Cの水浴中で温めてください。
- バイアル瓶内の50μCi 14C-オレイン酸塩(エタノール中50μCi/μmol)を空気乾燥し、指定されたRAM作業フードで蓋を8時間外します。312.5 μLのH2Oを加え、次に3.5 mg (11.5 μmol) のオレイン酸ナトリウムを加える。徹底的に混ぜる。
- 得られた溶液を水浴中で70°Cに加温する。予温したBSA原液0.9375mLを加えて、10mMの熱いオレイン酸原液(非標識オレイン酸塩に対する1:11.5の比 の14C-オレイン酸を含む)を得た。原液をアリコートし、長期間使用するために-20°Cで保存する。
- 解凍直後に14 C-グルコースと14C-グルタミンを使用してください。
14C標識基質を含む培地の調製
注:媒体中のエネルギー基質の信頼できる濃度を確保するために、カスタムメイドの媒体は、使用直前に新鮮な基質を添加して使用する必要があります。ここでは、グルコース、ピルビン酸、グルタミン、フェノールレッド、または炭酸水素ナトリウムを含まないカスタムメイドの最小必須培地(MEMα)が使用される。しかしながら、最適な培地は、細胞タイプごとに決定されるべきである。
- 培地粉末8.67gを精製水1Lで再構成する。2.2gの炭酸水素ナトリウムを加えてpH7.4を達成し、0.22μm真空濾過を用いて溶液を濾過する。
- 新鮮な成分を加えて、最終濃度5.5 mMグルコース、2 mMグルタミン、1 mMピルビン酸、および10%ウシ胎児血清(FBS)を含む完全培地(cMEMα)を得た。さらに、cMEMαに100 mM L-カルニチンと10 μM HEPESを補給して脂肪酸酸化を促進します。
- 使用直前に、新しく調製したcMEMαに 14個のC標識基質を加えてホットメディアを作ります。オレイン酸ホット培地を作るには、10 mMホットオレイン酸ストック溶液をcMEMαに添加し、終濃度100 μMのオレイン酸塩(1:100希釈、最終放射能0.4 μCi/mL)にします。
注:1:11.5のホット:コールドオレイン酸塩の比率を含む10mMのホットオレイン酸塩ストック(ステップ1.3を参照)は、放射性物質の量を最小限に抑えながら、媒体中の100μMの総オレイン酸塩の生理学的レベルを達成するために使用されます。 - 70°Cのウォーターバス中で2mLのH2Oに24.36mgのオレイン酸ナトリウムを加えて10mMの非標識オレイン酸ストックを作り、完全に溶解するまで約20分間、70°Cに予温した6mLの4mM BSAストックと素早く混合する。 37°Cの水浴に1時間移し、0.22μmのフィルターでろ過します。アリコートし、長期間使用するために-20°Cで保存してください。
- グルコースを高温培地にするには、終濃度1.333 μM(1:4,125希釈、最終放射能0.4 μCi/mL)に 14C-グルコースを加えます。グルタミンを高温培地にするには、 14C-グルタミンを終濃度2μM(1:1,000希釈、最終放射能0.4μCi/mL)まで加える。
- グルコースおよびグルタミン高温培地に、ステップ2.4からの非標識オレイン酸塩の10 mMストック溶液を補充し、オレイン酸ホット培地と同じ100μMオレイン酸塩の最終濃度を達成する。
3. 細胞の作製
注:歯槽骨前芽細胞および骨髄マクロファージがここで例として使用されている。ユーザーは、適切なプロトコルに従って選択した細胞タイプを準備する必要があります。酵素活性が異なるロット間で異なる可能性があるため、パイロット実験で消化に使用するコラゲナーゼIIの濃度を最適化します。
- 頭蓋骨前骨芽細胞の単離と培養
- 出生後3-5日目(P3-5)の仔犬を断頭して犠牲にし、ペニシリン - ストレプトマイシン(P / S)を含む氷冷DPBSに移す。
- 皮膚および軟部組織を除去することによって頭蓋骨を露出させる。DPBSで周囲の組織を後ろから前へ切り取って中央領域を収集します(図1A)。ピンセットを使用して頭蓋骨の内面と外面を優しく傷つけ、その後の消化時に細胞を解放するのを助けます。
- DPBS中のコラゲナーゼII型2mg/mLおよび4mg/mL溶液を調製し、各溶液を新鮮な0.22μmフィルターで濾過する。洗浄した頭蓋骨をまず2mg/mLのコラゲナーゼ溶液で15分間消化し、消化液を捨てる。洗浄したサンプルを4mg/mLのコラゲナーゼ溶液で3回、15分間消化し、消化液をプールして保存します。
- 消化液を70 μmのセルストレーナーでろ過し、ろ液を300 × g で5分間遠心分離します。細胞ペレットを、10%FBSおよびP/Sを含むcMEMα(ステップ2.2参照)に再懸濁する。
- 10 cmプレートに4×104 cells /cm2で細胞を数えて播種する。細胞を5%CO2 と共に37°Cのインキュベーター内で3日間培養する。
- 0.25%トリプシン-EDTAで37°Cで細胞を解離させる。細胞を数え、10%FBSおよびP/Sを含むcMEMαを7.5 × 105/cm2で含む24ウェル細胞培養プレートに細胞を播種する。基質当たり細胞タイプ当たり少なくとも4ウェルをシードし、アッセイ前の細胞計数のために各細胞タイプについて少なくとも3つの余分なウェルを播種する。
- 基質酸化アッセイの前に一晩37°Cで細胞を培養する。
- BMMの単離と培養
注:BMMの培養にはマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)が必要であり、これは組換えタンパク質として商業的に購入することができる。M-CSFを発現するように操作された細胞株CMG14-12からの馴化培地は、ここで使用される経済的な代替手段である13。- 筋肉および結合組織を除去した後、8週齢のマウスから大腿骨および脛骨を採取する。骨の両端を鋭いはさみで切って捨てます。
- 10% FBS、P/S、および10% CMG14-12馴化培地(BMM培地)を含む15mLのcMEMαを含む23G針を取り付けたシリンジを備えた10cmペトリ皿に骨髄を10cmペトリ皿に洗い流す。シャーレ内の細胞を5%CO2を有する37°Cのインキュベーター内で培養する。
- 3日後、培養培地を捨て、DPBSですすいでください。付着した細胞を0.25%トリプシン-EDTAで37°Cで5分間解離させる。遠心分離機により、細胞ペレットをBMM培地に再懸濁する。
- 3.1.6に記載したのと同じ方法で、7.5×105/cm2で24 ウェル細胞培養プレートに細胞をカウントし、播種する。アッセイを開始する前にBMM培地中で37°Cで一晩培養した。
4.CO2 トラップによる基質酸化アッセイ
注: アッセイの開始前に 80 ~ 90% の合流点を達成するために、細胞タイプごとに適切な播種密度を決定する必要があります。細胞密度は、細胞の代謝状態に影響を与え得ることに留意されたい。
- 余分なウェル内の細胞をDPBSで2回洗浄する。細胞を0.25%トリプシン-EDTAで解離させ、20 μLの細胞をDPBSに再懸濁し、20 μLのアクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)すぐに使用できる市販の色素溶液と混合する。自動セルカウンターで生細胞の数を決定し、最終的な計算のためにその数を記録します。
- アッセイウェル内の細胞をDPBSで2回洗浄する。RAM指定の組織培養フード内の各アッセイウェルに500μLの高温培地を加える。プレートをパラフィルムでシールし、RAM指定のインキュベーター内で細胞を37°Cで4時間インキュベートする。
- インキュベーション中は、ろ紙を1.5ml微量遠心チューブのキャップ内の面積よりわずかに大きい円形に切り、紙をキャップにぴったりと挿入します(図1B)。各チューブに200 μLの1 M過塩素酸を加え、キャップの内側に取り付けたろ紙に20 μLの水酸化ナトリウムを加えます。
- 細胞のインキュベーション後、各ウェルから調製したチューブに400 μLの培養培地を移し、直ちにキャップを閉じる。チューブを室温でチューブラックに1時間放置する。
- インキュベーション中に、各チューブにシンチレーションバイアルをセットアップし、4mLのシンチレーション液で満たします。ろ紙の各片をシンチレーションバイアルに移し、室温で30分間インキュベートする。
- 組織培養フード、ウォーターバス( 14C-オレイン酸塩調製に使用)、冷蔵庫、インキュベーター、シンク、地面、および潜在的なRAM汚染のための他の作業領域でワイプテストを実行します。紙ワイプをシンチレーション液を含むシンチレーションバイアルに入れます。
- シンチレーションバイアル内の 14C放射能をシンチレーションカウンターで測定する。読み取り結果を記録します。必要に応じて、放射線安全ガイドラインに従って作業環境を除染してください。
5. データ解析
注:各基質がCO2を放出するために完全に酸化されていると仮定すると、基質酸化速度は、捕捉されたCO2放射能から計算することができる。
- Eq(1)と、異なる基板について表1に示すX、Y、Z値を用いて基板酸化速度を計算する。
基板酸化速度(μmol/cell/h)=
(1)- 各反応ウェルの1分あたりの総崩壊量(DPM)を計算する。Xについては、全反応媒体の0.5mLのうちCO2 トラップに使用した反応媒体の0.4mLからのDPM値(シンチレーションカウンター読み取り値)を使用する。したがって、各反応ウェルからの総DPMはX×1.25である。
- DPMの合計を2,220,000倍で割ってμCiに変換します。
- μCi単位の放射能を 14個のC標識分子の数に変換します。μCi値を各標識基質の比活性(Y)で割る。次のY値を使用してください(表1): 14C-グルコース:300 mCi/mmol; 14名C-グルタミン: 200 ミリシー/ミリモル; 14名C-オレイン酸塩:50ミリシー/ミリモル。
- 酸化された 14個のC標識分子から、後者に高温から全希釈係数(Z)を掛けることによって、酸化された分子の総数を計算する。以下のZ値を使用する(表1):グルコース:4,125;グルタミン:1,000;オレエート:12.5。
- 得られた生成物を細胞数(cell#)および4(反応時間4時間の場合)で除算し、細胞当たりの基質酸化速度を求めた。アッセイの開始時に平行ウェルで決定した細胞#を使用する。
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Representative Results
この例では、CO2 トラップ法を使用して、原発性頭蓋骨前骨芽細胞による基質酸化と、それぞれ in vitro 骨芽細胞または破骨細胞分化に頻繁に使用されるBMMを比較する。初代細胞を継代し、cMEMα中で一晩培養した後、それらは典型的にはコンフルエントの80〜90%に達し、その特徴的な形態を示す。頭蓋骨前骨芽細胞はBMMよりも顕著に大きい(図2)。各細胞型は、ステップ4.1〜4.7に従ってグルコース、グルタミン、およびオレイン酸塩の酸化アッセイに供される。結果は、Eq(1)を用いて分析される。
結果は、各基質の酸化速度がBMMよりも頭蓋骨前骨芽細胞において有意に高く、骨前芽細胞におけるOXPHOSによるより大きなエネルギー産生を示す可能性が高いことを示している(図3)。タツノオトシゴ技術を用いた以前の研究では、OXPHOSが骨芽細胞前部ではATP産生の約60%を占めるが、好気性解糖系がエネルギーの約80%を占める成熟骨芽細胞では顕著に減少することが示されている9。現在の結果は、3つの主要な基質すべてが骨芽細胞前部におけるOXPHOSに寄与することを示している。しかしながら、成熟骨芽細胞において1つまたは全ての基質の利用率が低下しているかどうかを決定するためには、さらなる調査が必要である。
図1:CO2トラップアッセイおよび頭蓋骨解剖のための図。 (a)オレンジ色の破線の三角形で示す頭蓋骨の中央領域を、細胞イソラトンについて採取する。(B)CO2トラップに1.5mLの微量遠心チューブを使用する(工程1)。ろ紙(説明用の青い紙)は、チューブキャップに収まるように切断されます(ステップ2)。蓋を閉める前に、各チューブ内の細胞培養物からの400 μLのホットメディアに200 μLの1 M過塩素酸と20 μLのNaOHをろ紙に加える(ステップ3)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:BMMおよび頭蓋骨前骨芽細胞の典型的な形態。(C, D)より高い倍率での代表的な画像。スケールバー = 400 μm (A, B), 100 μm (C, D).略語: BMM = 骨髄由来マクロファージ;前OBs=前骨芽細胞。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:頭蓋骨前骨芽細胞およびBMMにおける基質酸化速度。 (a)グルコース。(B)グルタミン。(C)オレエート。計算では、各基質分子が完全に酸化されていると仮定しています。略語:BMM =骨髄由来マクロファージ;プレOB = 前骨芽細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 基板 | 放射能(X) | 比活性(Y)、ミリシー/ミリモル | 希釈倍率(Z) |
| グルコース | DPM1 | 300 | 4,125 |
| グルタミン | ティッカー2 | 200 | 1,000 |
| オレイン酸塩 | DPM3 | 50 | 12.5 |
表 1: データ分析で使用されるパラメーター
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Discussion
このプロトコルは、主要なエネルギー基板の酸化速度を決定するための使いやすい方法を提供します。これは、中央ウェルを含むフラスコを使用し、ゴム栓14、15、16で蓋をする他のプロトコルに代わるより簡単な代替手段である。ここでの実施例研究は細胞培養を用いて行われるが、この方法は、先に説明したように、無傷のミトコンドリアを含む組織外植体または組織ホモジネートに対して容易に適合させることができる17。
このプロトコルで考慮すべきいくつかの重要なステップには、試薬の調製および14CO2トラップ用のチューブのセットアップが含まれる。オレイン酸塩からBSAへの適切な結合を確実にすることは、遊離脂肪酸(FFA)が細胞膜を損傷するのを防ぎ、代謝のための細胞による効率的な取り込みを可能にするために極めて重要である。BSA溶液を完全な溶解に十分な長さだけインキュベートし、70°CでBSAと長時間インキュベートすると不可逆的な凝固がもたらされます。
新鮮なcMEMαは、L-グルタミンなどの基質の半減期が短いため、実験セットアップごとに作成する必要があります。最後に、ろ紙は、誤った読み取りを避けるために、キャップにしっかりと収まるのに十分な大きさにする必要があります。濾紙が反応液に誤って落下すると、DPM値が異常に高くなるため、さらなる分析から除外する必要があります。4 ~ 5 個の複製ウェルは、汚染の可能性がある場合に備えて設定できます。最終的なDPM値が低すぎる場合、例えば100未満である場合、放射性基質の量またはインキュベーション時間を増加させることが有用であり得る。
脂肪酸酸化の代理基質としてオレイン酸塩を使用する場合には注意点があります。オレイン酸塩は、循環および組織中のすべての脂肪酸の32%を構成する最も豊富な一価不飽和の長鎖脂肪酸である。しかし、パルミテート(28%)やリノール酸(14%)などの他の長鎖脂肪酸も、インビボでの主要な基質である18,19。したがって、オレイン酸塩のみによる細胞培養培地の補充は、他の種も存在する場合の脂肪酸の酸化速度を正確に反映しない可能性がある。アッセイを行う場合、この懸念は、それらの他の脂肪酸を培地に含ませることによって改善することができる。
細胞代謝は文脈依存性が高く、基質の利用可能性および酸素張力、とりわけ他の要因に依存して大きな可塑性を示すことができることに留意すべきである。したがって、生理学的状態の文脈 においてインビトロ の結果を評価することが重要である。それにもかかわらず、細胞は、おそらく細胞特異的な代謝プログラミングおよび記憶のために、 インビトロでそれらの代謝特性の少なくともいくつかの側面を維持する傾向があることがますます明らかになっている。したがって、このような単純な インビトロ 法は、細胞型間の代謝多様性だけでなく、疾患状態における潜在的な調節不全についての洞察を得るための重要なツールを提供する。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
この作業は、NIH助成金R01 AR060456(FL)によって部分的に支援されました。マイケル・ロビンソン博士とエリザベス・クリズマン博士(フィラデルフィア小児病院)がシンチレーションカウンターを惜しみなく助けてくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
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