Summary
Este protocolo describe un método fácil de usar para examinar la oxidación del sustrato mediante el seguimiento de la producción de 14CO2 in vitro.
Abstract
Las mitocondrias albergan la maquinaria para el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y la cadena de transporte de electrones (ETC), que generan trifosfato de adenosina (ATP) para mantener la homeostasis energética. La glucosa, los ácidos grasos y los aminoácidos son los principales sustratos energéticos que alimentan la respiración mitocondrial en la mayoría de las células somáticas. La evidencia muestra que los diferentes tipos de células pueden tener una clara preferencia por ciertos sustratos. Sin embargo, la utilización del sustrato por varias células en el esqueleto no se ha estudiado en detalle. Además, como el metabolismo celular está en sintonía con los cambios fisiológicos y fisiopatológicos, las evaluaciones directas de la dependencia del sustrato en las células esqueléticas pueden proporcionar información importante sobre la patogénesis de las enfermedades óseas.
El siguiente protocolo se basa en el principio de liberación de dióxido de carbono de las moléculas de sustrato después de la fosforilación oxidativa. Mediante el uso de sustratos que contienen átomos de carbono marcados radiactivamente (14C), el método proporciona un ensayo sensible y fácil de usar para la tasa de oxidación del sustrato en el cultivo celular. Un estudio de caso con preosteoblastos calvariales primarios versus macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) demuestra una diferente utilización de los sustratos principales entre los dos tipos de células.
Introduction
La fosforilación oxidativa (OXPHOS) en eucariotas es el proceso por el cual los nutrientes se descomponen dentro de las mitocondrias para liberar energía química en forma de ATP a través del consumo de oxígeno. El catabolismo de varios sustratos dentro de las mitocondrias a través del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) genera pocas moléculas de ATP directamente, pero más bien almacena energía a través de la reducción de los portadores de electrones nicotinamida adenina dinucleótido (NAD +) y flavina adenina dinucleótido (FAD +). Los portadores reducidos son oxidados por ETC ubicado en la membrana interna de las mitocondrias para generar un gradiente de concentración de protones a través de la membrana. Los protones eventualmente fluyen por su gradiente de regreso a la matriz mitocondrial a través de la ATP sintasa para producir ATP. OXPHOS es el medio más eficiente de producción de ATP a partir de sustratos energéticos y generalmente se prefiere en entornos aeróbicos. Anteriormente, se pensaba que la glucólisis aeróbica (producción de lactato a partir de glucosa mientras el oxígeno está presente) era fisiopatológica, a menudo un sello distintivo de las células cancerosas. Cada vez más, se está descubriendo que algunos tipos de células normales utilizan la glucólisis aeróbica por razones que aún no se han descifrado por completo.
La flexibilidad metabólica es la capacidad de las células u organismos para adaptarse a las cambiantes demandas de energía y las fuentes de combustible disponibles. Por ejemplo, la demanda energética del músculo esquelético es satisfecha principalmente por OXPHOS en estado estacionario, pero por glucólisis anaeróbica durante el ejercicio de alta intensidad1. A medida que aumenta la duración del ejercicio, la glucosa y la oxidación de ácidos grasos contribuyen más a la producción general de energía2. Sin embargo, el uso del sustrato no depende solo de la disponibilidad, ya que los sustratos compiten antagónicamente durante la oxidación. En particular, se ha demostrado que la oxidación de ácidos grasos inhibe la utilización de glucosa por el músculo esquelético en un fenómeno conocido como el efecto Randle3. Un efecto recíproco fue demostrado por estudios posteriores 4,5. Además, muchas enfermedades se asocian con un cambio en la preferencia de sustrato y el desarrollo de inflexibilidad metabólica en las células. Por ejemplo, la oxidación de ácidos grasos se reduce en el músculo esquelético de los pacientes diabéticos tipo II en comparación con los sujetos de control normales6. Los cambios metabólicos en los entornos de la enfermedad son objeto de una intensa investigación, ya que pueden contribuir a la patogénesis.
El metabolismo energético en los tipos de células esqueléticas está relativamente poco estudiado, pero ha ganado atención en los últimos años7. Trabajos previos han demostrado que la glucólisis aeróbica es la vía de energía dominante en los osteoblastos calvariales, mientras que la oxidación de la glucosa a través del ciclo TCA juega un papel en la formación de osteoclastos 8,9. Otros han proporcionado evidencia de ácidos grasos como fuente de energía para los osteoblastos10. También se ha demostrado que el catabolismo de glutamina apoya la diferenciación osteoblástica de los progenitores11,12. Sin embargo, todavía falta una comprensión integral de la utilización del sustrato por varios tipos de células esqueléticas. Además, se espera que los cambios en el metabolismo celular durante la diferenciación celular o en respuesta a señales patológicas alteren la utilización del sustrato de combustible. A continuación se describe un protocolo fácil de usar para evaluar la oxidación del sustrato in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El uso de materiales radiactivos (RAM) requiere la aprobación previa de un comité de seguridad designado en cada institución. Las RAM utilizadas en este protocolo han sido aprobadas por Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) en la Universidad de Pensilvania. El uso de animales requiere la aprobación previa del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la institución de origen. El siguiente estudio fue aprobado por IACUC en el Hospital de Niños de Filadelfia.
1. Preparación de soluciones madre para 14sustratos marcados con C
- Haga 4 mM de solución madre de albúmina sérica bovina (BSA) mezclando 11 g de BSA y 33.1 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco y agite suavemente a temperatura ambiente durante ~ 3 h hasta que BSA se disuelva por completo. Caliente la solución madre de BSA en un baño de agua a 70 °C antes de su uso.
- Secado al aire de 50 μCi 14C-oleato (50 μCi/μmol en etanol) en el vial con la tapa apagada durante 8 h en una campana de trabajo RAM designada. Agregue 312.5 μL de H2O y luego 3.5 mg (11.5 μmol) de oleato de sodio. Homogeneizar.
- Caliente la solución resultante a 70 °C en un baño de agua. Agregue 0.9375 ml de la solución madre BSA precalentada para producir una solución madre de oleato caliente de 10 mM (que contiene una relación 1: 11.5 de 14C-oleato a oleato sin etiquetar). Alícuota la solución madre y guárdela a -20 °C para su uso a largo plazo.
- Use 14C-glucosa y 14C-glutamina directamente después de la descongelación.
2. Preparación de un medio que contenga 14sustratos marcados con C
NOTA: Para garantizar concentraciones confiables de sustratos de energía en el medio, se deben usar medios personalizados con sustratos frescos agregados poco antes de su uso. Aquí, se utiliza un Medio Esencial Mínimo (MEMα) hecho a medida sin glucosa, piruvato, glutamina, rojo fenol o bicarbonato de sodio. Sin embargo, se debe determinar un medio óptimo para cada tipo de célula.
- Reconstituir 8,67 g del polvo medio en 1 L de agua purificada. Añadir 2,2 g de bicarbonato de sodio para lograr un pH de 7,4 y filtrar la solución mediante filtración al vacío de 0,22 μm.
- Agregue ingredientes frescos para obtener el medio completo (cMEMα) con concentraciones finales de 5,5 mM de glucosa, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato y 10% de suero fetal bovino (FBS). Suplementar aún más cMEMα con 100 mM L-carnitina y 10 μM HEPES para facilitar la oxidación de ácidos grasos.
- Inmediatamente antes de su uso, agregue 14sustratos marcados con C a cMEMα recién preparado para hacer medios calientes. Para hacer el medio caliente de oleato, agregue la solución madre de oleato caliente de 10 mM a cMEMα para una concentración final de oleato de 100 μM (dilución 1:100, radiactividad final 0.4 μCi/mL).
NOTA: La cepa de oleato caliente de 10 mM que contiene una relación 1:11.5 de oleato caliente:frío (ver paso 1.3) se utiliza para alcanzar un nivel fisiológico de 100 μM de oleato total en el medio mientras se minimiza la cantidad de material radiactivo. - Haga 10 mM de oleato sin etiquetar agregando 24.36 mg de oleato de sodio a 2 mL de H2O en un baño de agua a 70 °C durante ~20 min hasta que se disuelva completamente antes de mezclar rápidamente con 6 mL de la solución madre de BSA de 4 mM precalentada a 70 °C. Transfiera a un baño de agua de 37 °C durante 1 h y filtre a través de un filtro de 0,22 μm. Alícuota y conservar a -20 °C para uso a largo plazo.
- Para hacer que la glucosa sea media caliente, agregue 14C-glucosa a una concentración final de 1.333 μM (dilución 1: 4,125, radiactividad final 0.4 μCi / ml). Para hacer medio caliente de glutamina, agregue 14C-glutamina a la concentración final de 2 μM (dilución 1: 1,000, radiactividad final 0.4 μCi / ml).
- Complemente el medio caliente de glucosa y glutamina con una solución madre de 10 mM de oleato sin etiquetar del paso 2.4 para lograr la concentración final de oleato de 100 μM, la misma que en el medio caliente de oleato.
3. Preparación de las células
NOTA: Los preosteoblastos calvariales y los macrófagos de la médula ósea se utilizan como ejemplos aquí. Los usuarios deben preparar su tipo de célula de elección de acuerdo con los protocolos apropiados. Optimizar la concentración de colagenasa II para ser utilizada para la digestión en experimentos piloto, ya que la actividad enzimática puede variar entre diferentes lotes.
- Aislamiento y cultivo de preosteoblastos calvariales
- Sacrifice a los cachorros postnatales del día 3-5 (P3-5) por decapitación y transfiéralos a DPBS helados que contengan penicilina-estreptomicina (P / S).
- Exponga la calvaria extirpando la piel y los tejidos blandos. Recoja la región media cortando los tejidos circundantes de atrás hacia adelante en DPBS (Figura 1A). Rasque las superficies internas y externas de la calvaria suavemente usando pinzas para ayudar a liberar las células en la digestión posterior.
- Prepare una solución de 2 mg/ml y 4 mg/ml de colagenasa tipo II en DPBS y filtre cada solución con un filtro fresco de 0,22 μm. Digiera la calvaria limpia primero con la solución de colagenasa de 2 mg/ml durante 15 min y deseche la solución de digestión. Digiera las muestras limpias en 4 mg / ml de solución de colagenasa 3 veces durante 15 minutos cada vez, agrupando y guardando la solución de digestión.
- Filtrar la solución de digestión a través de coladores celulares de 70 μm y centrifugar el filtrado a 300 × g durante 5 min. Resuspend el pellet celular en cMEMα (ver paso 2.2) que contiene 10% fbs y P/S.
- Cuente y sembra las células a 4 × 104 células/cm2 en placas de 10 cm. Cultive las células en una incubadora de 37 °C con 5% de CO2 durante 3 días.
- Disociar las células a 37 °C con tripsina-EDTA al 0,25%. Contar y sembrar las células en placas de cultivo celular de 24 pocillos con cMEMα que contengan 10% de FBS y P/S a 7,5 × 105/cm2. Sembrar al menos 4 pocillos por tipo de célula por sustrato y al menos tres pocillos adicionales para cada tipo de célula para el conteo celular antes del ensayo.
- Cultive las células a 37 °C durante la noche antes de los ensayos de oxidación del sustrato.
- Aislamiento y cultivo de BMM
NOTA: El cultivo de BMM requiere un factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), que se puede comprar comercialmente como una proteína recombinante. El medio acondicionado de la línea celular CMG14-12 diseñado para expresar M-CSF es una alternativa económica utilizada aquí13.- Recolecte fémures y tibias de ratones de 8 semanas de edad después de extirpar el músculo y los tejidos conectivos. Cortar y desechar ambos extremos de los huesos con tijeras afiladas.
- Enjuague la médula ósea de un fémur y una tibia en una placa de Petri de 10 cm con una jeringa equipada con una aguja de 23 G que contiene 15 ml de cMEMα con 10% de FBS, P / S y 10% de CMG14-12 medio acondicionado (medio BMM). Cultiva las células en la placa de Petri en una incubadora de 37 °C con 5% de CO2.
- Después de 3 días, deseche los medios de cultivo y enjuague con DPBS. Disociar las células adheridas a 37 °C con tripsina-EDTA al 0,25% durante 5 min. Centrifugar y resuspendir el pellet celular en el medio BMM.
- Contar y sembrar las células en placas de cultivo celular de 24 pocillos a 7,5 × 105/cm2 de la misma manera que se describe en 3.1.6. Cultivo a 37 °C durante la noche en el medio BMM antes de comenzar los ensayos.
4. Ensayo de oxidación de sustrato con trampa de CO2
NOTA: Se debe determinar una densidad de siembra adecuada para cada tipo de célula para lograr una confluencia del 80-90% antes del inicio del ensayo. Tenga en cuenta que la densidad celular puede afectar el estado metabólico de las células.
- Lave las células en los pocillos adicionales dos veces con DPBS. Disociar las células con tripsina-EDTA al 0,25% y células mixtas de 20 μL resuspendidas en DPBS con 20 μL de solución de colorante comercial lista para usar de naranja acridina/yoduro de propidio (AO/PI). Determine el número de células vivas con un contador de celdas automatizado y registre el número para los cálculos finales.
- Lave las células en los pocillos de ensayo dos veces con DPBS. Agregue 500 μL de medio caliente a cada ensayo bien en la campana de cultivo de tejidos designada por RAM. Selle las placas con parafilm e incube las células en una incubadora designada por RAM a 37 °C durante 4 h.
- Durante la incubación, corte el papel de filtro en trozos circulares ligeramente más grandes que el área dentro de la tapa de 1,5 ml de tubos de microcentrífuga e inserte el papel cómodamente en la tapa (Figura 1B). Añadir 200 μL de ácido perclórico 1 M a cada tubo y 20 μL de hidróxido de sodio al papel de filtro instalado dentro de la tapa.
- Después de la incubación de las células, transfiera 400 μL de medio de cultivo de cada pozo a los tubos preparados y cierre las tapas inmediatamente. Deje los tubos en un estante de tubos a temperatura ambiente durante 1 h.
- Durante la incubación, coloque un vial de centelleo para cada tubo y llénelo con 4 ml de líquido de centelleo. Transfiera cada trozo de papel de filtro a un vial de centelleo e incube a temperatura ambiente durante 30 min.
- Realice pruebas de limpieza en la campana de cultivo de tejidos, el baño de agua (utilizado para la preparación de 14C-oleato), refrigerador, incubadora, fregadero, suelo y cualquier otra área de trabajo para detectar una posible contaminación de RAM. Coloque las toallitas de papel en viales de centelleo que contengan líquido de centelleo.
- Mida 14C de radiactividad en los viales de centelleo con un contador de centelleo. Registre los resultados de la lectura. Descontaminar el ambiente de trabajo de acuerdo con las pautas de seguridad radiológica si es necesario.
5. Análisis de datos
NOTA: Suponiendo que cada sustrato está completamente oxidado para liberar CO2, la tasa de oxidación del sustrato se puede calcular a partir de la radiactividad de CO2 atrapada.
- Calcule la tasa de oxidación del sustrato utilizando Eq (1) y los valores X, Y y Z dados en la Tabla 1 para diferentes sustratos.
Velocidad de oxidación del sustrato (μmol/célula/h) =
(1)- Calcule las desintegraciones totales por minuto (DPM) para cada pozo de reacción. Para X, utilice el valor DPM (lectura del contador de centelleo) de 0,4 ml del medio de reacción utilizado para atrapar CO2 de 0,5 ml del medio de reacción total. Por lo tanto, el DPM total de cada pozo de reacción es X × 1.25.
- Divida el DPM total por un factor de 2.220.000 para convertirlo a μCi.
- Convertir la radiactividad en μCi al número de 14moléculas marcadas con C. Divida el valor de μCi por la actividad específica (Y) de cada sustrato etiquetado. Utilice los siguientes valores Y (Tabla 1): 14C-glucosa: 300 mCi/mmol; 14 C-glutamina: 200 mCi/mmol; 14 C-oleato: 50 mCi/mmol.
- Calcule el número total de moléculas oxidadas a partir de las 14moléculas oxidadas marcadas con C multiplicando estas últimas con el factor de dilución caliente a total (Z). Utilice los siguientes valores Z (Tabla 1): Glucosa: 4.125; glutamina: 1.000; oleato: 12.5.
- Divida el producto resultante por número de celda (número de celda) y 4 (para el tiempo de reacción de 4 h) para determinar la tasa de oxidación del sustrato por célula. Utilice la celda# determinada en los pozos paralelos al comienzo del ensayo.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En este ejemplo, el método de captura de CO2 se utiliza para comparar la oxidación del sustrato por preosteoblastos calvariales primarios versus BMM, que se utilizan con frecuencia para la diferenciación in vitro de osteoblastos u osteoclastos, respectivamente. Después de que las células primarias se pasan y se cultivan en cMEMα durante la noche, generalmente alcanzan el 80-90% de la confluencia y exhiben su morfología característica. Los preosteoblastos calvariales son notablemente más grandes que los BMM (Figura 2). Cada tipo de célula se somete a ensayos de oxidación para glucosa, glutamina y oleato siguiendo los pasos 4.1 a 4.7. Los resultados se analizan mediante Eq (1).
Los resultados muestran que la tasa de oxidación para cada sustrato es significativamente mayor en los preosteoblastos calvariales que en losBM, lo que probablemente indica una mayor producción de energía por OXPHOS en los preosteoblastos (Figura 3). Estudios previos con tecnología Seahorse han demostrado que OXPHOS representa ~ 60% de la producción de ATP en preosteoblastos, pero disminuye notablemente en osteoblastos maduros, donde la glucólisis aeróbica es responsable de ~ 80% de la energía9. Los resultados actuales demuestran que los tres sustratos principales contribuyen a OXPHOS en preosteoblastos. Sin embargo, se necesita más investigación para determinar si la utilización de uno o todos los sustratos se reduce en los osteoblastos maduros.
Figura 1: Diagramas para el ensayo de captura de CO2 y la disección de calvarias. (A) La región media de la calvaria, indicada por el triángulo discontinuo naranja, se cosecha para la aislación celular. (B) Se utilizan tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para la captura de CO2 (paso 1). Los papeles de filtro (papel azul para fines ilustrativos) se cortan para que quepan en tapas de tubo (paso 2). Añadir 200 μL de ácido perclórico 1 M a 400 μL de medios calientes del cultivo celular en cada tubo y 20 μL de NaOH al papel de filtro (paso 3) antes de cerrar la tapa (paso 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Morfología típica de BMM y preosteoblastos calvariales. (A, B) Imágenes representativas a menor aumento. (C, D) Imágenes representativas a mayor aumento. Barras de escala = 400 μm (A, B), 100 μm (C, D). Abreviaturas: BMM = macrófagos derivados de la médula ósea; preOB = preosteoblastos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Tasas de oxidación del sustrato en preosteoblastos calvariales y BMM. (A) Glucosa. (B) Glutamina. C) Oleato. Los cálculos asumen que cada molécula de sustrato está completamente oxidada. Abreviaturas: BMM = macrófago derivado de la médula ósea; preOB = preosteoblasto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Sustrato | Radiactividad (X) | Actividad específica (Y), mCi/mmol | Factor de dilución (Z) |
| Glucosa | DPM1 | 300 | 4,125 |
| Glutamina | DPM2 | 200 | 1,000 |
| Oleato | DPM3 | 50 | 12.5 |
Tabla 1: Parámetros utilizados en el análisis de datos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El protocolo proporciona un método fácil de usar para determinar la tasa de oxidación de los principales sustratos energéticos. Es una alternativa más sencilla a otros protocolos que utilizan matraces que contienen un pozo central y están tapados con tapones de goma 14,15,16. Aunque el estudio de ejemplo aquí se realiza con cultivo celular, el método se puede adaptar fácilmente para explantes de tejido u homogeneizados de tejido que contienen mitocondrias intactas, como se describió anteriormente17.
Algunos pasos clave a considerar en este protocolo implican la preparación de los reactivos y la configuración de los tubos para la captura de 14CO2 . Asegurar la conjugación adecuada de oleato a BSA es crucial para evitar que los ácidos grasos libres (FFA) dañen las membranas celulares y para permitir una absorción eficiente por parte de la célula para el metabolismo. Incubar la solución de BSA el tiempo suficiente para la disolución completa, ya que las incubaciones largas con BSA a 70 °C conducen a una solidificación irreversible.
Se debe hacer cMEMα fresco para cada configuración experimental debido a la corta vida media de sustratos como la L-glutamina. Finalmente, el papel de filtro debe ser lo suficientemente grande como para caber de forma segura en la tapa para evitar lecturas erróneas. Una caída accidental del papel de filtro en el líquido de reacción dará lugar a valores de DPM anormalmente altos, que deben omitirse en un análisis posterior. Se pueden establecer de cuatro a cinco pozos replicados en caso de posible contaminación. Si los valores finales de DPM son demasiado bajos, por ejemplo, menos de 100, puede ser útil aumentar la cantidad de sustrato radiactivo o el tiempo de incubación.
Hay advertencias para el uso de oleato como sustrato sustituto para la oxidación de ácidos grasos. El oleato es el ácido graso monoinsaturado de cadena larga más abundante que constituye el 32% de todos los ácidos grasos en la circulación y los tejidos. Sin embargo, otros ácidos grasos de cadena larga, como el palmitato (28%) y el linoleato (14%), también son sustratos principales in vivo18,19. Por lo tanto, la suplementación de los medios de cultivo celular con oleato solo puede no reflejar con precisión la tasa de oxidación de los ácidos grasos cuando otras especies también están presentes. Al realizar el ensayo, esta preocupación se puede mejorar mediante la inclusión de esos otros ácidos grasos en los medios de cultivo.
Cabe destacar que el metabolismo celular es altamente dependiente del contexto y puede exhibir una gran plasticidad dependiendo de la disponibilidad de sustrato y la tensión de oxígeno, entre otros factores. Por lo tanto, es importante evaluar los resultados in vitro en el contexto de las condiciones fisiológicas. Sin embargo, es cada vez más claro que las células tienden a mantener al menos algunos aspectos de sus características metabólicas in vitro, probablemente debido a la programación metabólica y la memoria específicas de la célula. Por lo tanto, los métodos in vitro sencillos, como este, ofrecen una herramienta importante para obtener información no solo sobre la diversidad metabólica entre los tipos de células, sino también sobre la desregulación potencial en condiciones de enfermedad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
El trabajo fue apoyado en parte por la subvención R01 AR060456 (FL) de los NIH. Agradecemos al Dr. Michael Robinson y Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) por su generosa ayuda con el mostrador de centelleo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
References
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
- Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
- Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
- Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
- Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
- Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
- Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
- Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
- Oba, M., Baldwin, R. L. 4th, Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).
