Summary
Denne protokollen beskriver en brukervennlig metode for å undersøke substratoksidasjon ved å spore 14CO2 produksjonsintro.
Abstract
Mitokondrier er vert for maskineriet for trikarboksylsyre (TCA) syklus og elektron transportkjede (ETC), som genererer adenosintrifosfat (ATP) for å opprettholde energi homeostase. Glukose, fettsyrer og aminosyrer er de viktigste energisubstratene som driver mitokondrie respirasjon i de fleste somatiske celler. Bevis viser at forskjellige celletyper kan ha en tydelig preferanse for visse substrater. Substratutnyttelse av ulike celler i skjelettet er imidlertid ikke studert i detalj. Videre, ettersom cellulær metabolisme er tilpasset fysiologiske og patofysiologiske endringer, kan direkte vurderinger av substratavhengighet i skjelettceller gi viktig innsikt i patogenesen av beinsykdommer.
Følgende protokoll er basert på prinsippet om karbondioksidfrigjøring fra substratmolekyler etter oksidativ fosforylering. Ved å bruke substrater som inneholder radioaktivt merkede karbonatomer (14C), gir metoden en sensitiv og brukervennlig analyse for substratoksidasjonsraten i cellekulturen. En casestudie med primære calvariale preosteoblaster versus benmargsavledede makrofager (BMMer) viser forskjellig utnyttelse av hovedsubstratene mellom de to celletypene.
Introduction
Oksidativ fosforylering (OXPHOS) i eukaryoter er prosessen der næringsstoffer brytes ned inne i mitokondrier for å frigjøre kjemisk energi i form av ATP gjennom forbruk av oksygen. Katabolisme av ulike substrater inne i mitokondrier gjennom trikarboksylsyre (TCA) syklusen genererer få ATP molekyler direkte, men lagrer heller energi gjennom reduksjon av elektron bærere nikotinamid adenin dinucleotide (NAD +) og flavin adenine dinucleotide (FAD +). De reduserte bærerne oksideres deretter av ETC plassert på den indre membranen av mitokondrier for å generere en protonkonsentrasjonsgradient over membranen. Protonene strømmer til slutt ned gradienten tilbake til mitokondriematrisen gjennom ATP-syntase for å produsere ATP. OXPHOS er den mest effektive måten å produsere ATP på fra energisubstrater og generelt foretrekkes i aerobe miljøer. Tidligere ble aerob glykolyseproduksjon av laktat fra glukose mens oksygen er tilstede- antatt å være patofysiologisk, ofte et kjennetegn på kreftceller. Mer og mer blir det oppdaget at noen normale celletyper bruker aerob glykolyse av grunner som ennå ikke er fullstendig dechiffrert.
Metabolsk fleksibilitet er kapasiteten for celler eller organismer til å tilpasse seg endrede energibehov og tilgjengelige drivstoffkilder. For eksempel blir den energiske etterspørselen av skjelettmuskulatur hovedsakelig møtt av OXPHOS ved steady state, men av anaerob glykolyse under høyintensitets trening1. Etter hvert som treningsvarigheten øker, bidrar glukose og fettsyreoksidasjon mer til den totale energiproduksjonen2. Substratbruk er imidlertid ikke bare avhengig av tilgjengelighet, da substrater antagonistisk konkurrerer under oksidasjon. Spesielt har fettsyreoksidasjon vist seg å hemme glukoseutnyttelse ved skjelettmuskulatur i et fenomen kjent som Randle-effekten3. En gjensidig effekt ble demonstrert ved senere studier 4,5. I tillegg er mange sykdommer forbundet med en endring i substratpreferanse og utvikling av metabolsk ufleksibilitet i celler. For eksempel reduseres fettsyreoksidasjon i skjelettmuskelen til type II diabetikerpasienter sammenlignet med normale kontrollpersoner6. De metabolske endringene i sykdomsmiljøer er gjenstand for intens undersøkelse, da de kan bidra til patogenese.
Energimetabolismen i skjelettcelletyper er relativt undervurdert, men har fått oppmerksomhet de siste årene7. Tidligere arbeid har vist at aerob glykolyse er den dominerende energiveien i kalori osteoblaster, mens glukoseoksidasjon gjennom TCA-syklusen spiller en rolle i osteoklastdannelse 8,9. Andre har gitt bevis for fettsyrer som energikilde for osteoblaster10. Glutamin katabolisme har også vist seg å støtte osteoblast differensiering fra forfedrene11,12. Imidlertid mangler en omfattende forståelse av substratutnyttelse av ulike skjelettcelletyper fortsatt. I tillegg forventes endringer i cellulær metabolisme under celledifferensiering eller som svar på patologiske signaler å endre bruken av drivstoffsubstrat. Beskrevet nedenfor er en brukervennlig protokoll for analyse av substratoksidasjonsintro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruk av radioaktivt materiale (RAM) krever forhåndsgodkjenning av en utpekt sikkerhetskomité ved hver institusjon. RAMs som brukes i denne protokollen er godkjent av Environmental Health &Radiation Safety (EHRS) ved University of Pennsylvania. Bruk av dyr krever forhåndsgodkjenning fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved hjemmeinstitusjonen. Følgende studie ble godkjent av IACUC ved The Children's Hospital of Philadelphia.
1. Utarbeidelse av lagerløsninger for 14C-merkede substrater
- Lag 4 mM bovint serumalbumin (BSA) lagerløsning ved å blande 11 g BSA og 33,1 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) og rist den forsiktig ved romtemperatur i ~ 3 timer til BSA er fullstendig oppløst. Varm BSA-lagerløsningen i et vannbad på 70 °C før bruk.
- Lufttørk 50 μCi 14C-oleat (50 μCi/μmol i etanol) i hetteglasset med lokket av i 8 timer i en utpekt RAM-arbeidshette. Tilsett 312,5 μL H2O og deretter 3,5 mg natrium oleat. Bland grundig.
- Varm den resulterende løsningen til 70 °C i et vannbad. Tilsett 0,9375 ml av den forhåndsvarslede BSA-lagerløsningen for å gi 10 mM varm oleat lagerløsning (som inneholder et 1:11,5-forhold på 14C-oleat til umerket oleat). Aliquot lagerløsningen og oppbevar den ved -20 °C for langvarig bruk.
- Bruk 14C-glukose og 14C-glutamin rett etter opptining.
2. Fremstilling av medium som inneholder 14C-merkede substrater
MERK: For å sikre pålitelige konsentrasjoner av energisubstrater i mediet, må skreddersydde medier brukes med ferske substrater tilsatt kort tid før bruk. Her brukes et skreddersydd Minimum Essential Medium (MEMα) uten glukose, pyruvat, glutamin, fenolrød eller natriumbikarbonat. Et optimalt medium bør imidlertid bestemmes for hver celletype.
- Rekonstituer 8,67 g av middels pulver i 1 L renset vann. Tilsett 2,2 g natriumbikarbonat for å oppnå en pH på 7,4 og filtrer oppløsningen ved hjelp av 0,22 μm vakuumfiltrering.
- Tilsett ferske ingredienser for å oppnå hele mediet (cMEMα) med endelige konsentrasjoner på 5,5 mM glukose, 2 mM glutamin, 1 mM pyruvat og 10% foster bovint serum (FBS). Ytterligere supplement cMEMα med 100 mM L-karnitin og 10 μM HEPES for å lette fettsyreoksidasjon.
- Umiddelbart før bruk, legg til 14C-merkede substrater til nylagde cMEMα for å lage varme medier. For å gjøre oleate varmt medium, legg til 10 mM varm oleat lagerløsning til cMEMα for en endelig konsentrasjon på 100 μM oleat (1:100 fortynning, endelig radioaktivitet 0,4 μCi / ml).
MERK: Den 10 mM varme oleatbestanden som inneholder et 1:11,5-forhold mellom varmt:kaldt oleat (se trinn 1.3) brukes til å oppnå et fysiologisk nivå på 100 μM totalt oleat i media samtidig som mengden radioaktivt materiale minimeres. - Lag 10 mM umerket oleat lager ved å tilsette 24,36 mg natrium oleat til 2 ml H2O i et vannbad ved 70 °C i ~20 minutter til det er helt oppløst før det blandes raskt med 6 ml av 4 mM BSA-lagerløsningen forhåndsvarslet til 70 °C. Overfør til et 37 °C vannbad i 1 time og filtrer gjennom et filter på 0,22 μm. Aliquot og oppbevar ved -20 °C for langvarig bruk.
- For å gjøre glukose varmt medium, tilsett 14C-glukose til en endelig konsentrasjon på 1.333 μM (1:4,125 fortynning, endelig radioaktivitet 0,4 μCi / ml). For å gjøre glutamin varmt medium, tilsett 14C-glutamin til den endelige konsentrasjonen på 2 μM (1:1,000 fortynning, endelig radioaktivitet 0,4 μCi / ml).
- Suppler glukose og glutamin varmt medium med en 10 mM lagerløsning av umerket oleat fra trinn 2.4 for å oppnå den endelige konsentrasjonen på 100 μM oleat, det samme som i oleate varmt medium.
3. Forberedelse av celler
MERK: Calvarial preosteoblaster og benmargsmakrofager brukes som eksempler her. Brukere bør forberede sin celle type valg i henhold til passende protokoller. Optimaliser konsentrasjonen av kollagen II som skal brukes til fordøyelse i pilotforsøk, da den enzymatiske aktiviteten kan variere mellom forskjellige tomter.
- Isolasjon og kultur av calvarial preosteoblaster
- Ofre barseldag 3-5 (P3-5) valper ved halshugging og overfør dem til iskalde DPBS som inneholder Penicillin-Streptomycin (P / S).
- Utsett calvaria ved å fjerne huden og bløtvevet. Samle den midterste regionen ved å kutte bort det omkringliggende vevet fra baksiden til forsiden i DPBS (figur 1A). Skrap de indre og ytre overflatene på calvaria forsiktig ved hjelp av pinsett for å frigjøre cellene ved etterfølgende fordøyelse.
- Forbered en 2 mg/ml og en 4 mg/ml oppløsning av kollagenalisse type II i DPBS og filtrer hver oppløsning med et friskt 0,22 μm filter. Fordøye den rensede calvaria først med 2 mg / ml kollagenaseoppløsning i 15 min og kast fordøyelsesoppløsningen. Fordøye de rensede prøvene i 4 mg / ml kollagenaseoppløsning 3 ganger i 15 minutter hver gang, samle og lagre fordøyelsesløsningen.
- Filtrer fordøyelsesløsningen gjennom 70 μm cellesiler og sentrifuger filtratet ved 300 × g i 5 min. Resuspend cellepellet i cMEMα (se trinn 2.2) som inneholder 10% FBS og P / S.
- Tell og frø cellene på 4 × 104 celler / cm2 i 10 cm plater. Kultur cellene i en 37 °C inkubator med 5% CO2 i 3 dager.
- Fjern cellene ved 37 °C med 0,25 % trypsin-EDTA. Tell og frø cellene i 24-brønns cellekulturplater med cMEMα som inneholder 10% FBS og P / S ved 7,5 × 105 / cm2. Frø minst 4 brønner per celletype per substrat og minst tre ekstra brønner for hver celletype for celletelling før analysen.
- Kultur cellene ved 37 °C over natten før substratet oksidasjonsanalyser.
- Isolering og kultur av BMMer
MERK: Kultur av BMMs krever makrofag kolonistimulerende faktor (M-CSF), som kan kjøpes kommersielt som et rekombinant protein. Kondisjonert medium fra cellelinjen CMG14-12 konstruert for å uttrykke M-CSF er et økonomisk alternativ som brukes her13.- Samle lårben og tibias fra 8 uker gamle mus etter å ha fjernet muskelen og bindevevet. Klipp og kast begge ender av beinene med skarp saks.
- Skyll benmargen fra en lårben og en tibia i en 10 cm Petri-tallerken med en sprøyte utstyrt med en 23 G nål som inneholder 15 ml cMEMα med 10% FBS, P / S og 10% CMG14-12 betinget medium (BMM-medium). Kultur cellene i Petri parabolen i en 37 °C inkubator med 5% CO2.
- Etter 3 dager, kast kulturmediet og skyll med DPBS. Fjern de vedlagte cellene ved 37 °C med 0,25 % trypsin-EDTA i 5 minutter. Sentrifuger og resuspender cellepellet i BMM-mediet.
- Tell og frø cellene i 24-brønns cellekulturplater på 7,5 × 105/cm2 på samme måte som beskrevet i 3.1.6. Kultur ved 37 °C over natten i BMM-mediet før analysene startes.
4. Substratoksidasjonsanalyse med CO2-felle
MERK: En passende såingstetthet bør bestemmes for hver celletype for å oppnå 80-90% samløp før starten av analysen. Legg merke til at celletetthet kan påvirke cellenes metabolske tilstand.
- Vask cellene i de ekstra brønnene to ganger med DPBS. Fjern cellene med 0,25% trypsin-EDTA og blandede 20 μL celler resuspendert i DPBS med 20 μL acridine oransje / propidiumjodid (AO / PI) klar til bruk kommersiell fargestoffløsning. Bestem antall aktive celler med en automatisert celleteller, og registrer tallet for endelige beregninger.
- Vask cellene i analysebrønnene to ganger med DPBS. Tilsett 500 μL varmt medium til hver analyse godt i den RAM-utpekte vevskulturhetten. Forsegle platene med parafilm og inkuber cellene i en RAM-utpekt inkubator ved 37 °C i 4 timer.
- Under inkubasjon kutter du filterpapiret i sirkulære deler som er litt større enn området inne i hetten på 1,5 ml mikrosentrifugerør og setter papiret godt inn i hetten (figur 1B). Tilsett 200 μL 1 M perklorsyre til hvert rør og 20 μL natriumhydroksid til filterpapiret som er montert inne i hetten.
- Etter inkubasjon av cellene, overfør 400 μL kulturmedium fra hver brønn til de forberedte rørene og lukk hettene umiddelbart. La rørene ligge i et rørstativ ved romtemperatur i 1 time.
- Under inkubasjon, sett opp et scintillation hetteglass for hvert rør og fyll det med 4 ml scintillasjonsvæske. Overfør hvert stykke filterpapir til et scintillation hetteglass og inkuber ved romtemperatur i 30 min.
- Utfør tørketester på vevskulturhetten, vannbadet (brukes til 14C-oleatpreparat), kjøleskap, inkubator, vask, bakken og andre arbeidsområder for potensiell RAM-forurensning. Sett papirservietter i scintillation hetteglass som inneholder scintillation væske.
- Mål 14C radioaktivitet i hetteglassene med scintillasjon. Registrer leseresultatene. Dekontaminer arbeidsmiljøet i henhold til retningslinjene for strålesikkerhet om nødvendig.
5. Dataanalyse
MERK: Forutsatt at hvert substrat er fullstendig oksidert for å frigjøre CO2, kan substratoksidasjonshastigheten beregnes ut fra fanget CO2-radioaktivitet .
- Beregn substratoksidasjonshastigheten ved hjelp av Eq (1) og X-, Y- og Z-verdiene som er angitt i tabell 1 for forskjellige substrater.
Substratoksidasjonshastighet (μmol/celle/t) =
(1)- Beregn de totale oppløsningene per min (DPM) for hver reaksjon godt. For X, bruk DPM-verdien (scintillation counter reading) fra 0,4 ml av reaksjonsmediet som brukes til CO2-fangst ut av 0,5 ml av det totale reaksjonsmediet. Derfor er den totale DPM fra hver reaksjonsbrønn X × 1,25.
- Del den totale DPM med en faktor på 2 220 000 for å konvertere til μCi.
- Konverter radioaktiviteten i μCi til antall 14C-merkede molekyler. Del μCi-verdien med den spesifikke aktiviteten (Y) for hvert merkede substrat. Bruk følgende Y-verdier (tabell 1): 14C-glukose: 300 mCi/mmol; 14 C-glutamin: 200 mCi/mmol; 14 C-oleat: 50 mCi/mmol.
- Beregn det totale antallet oksiderte molekyler fra de oksiderte 14C-merkede molekylene ved å multiplisere sistnevnte med den varme til totale fortynningsfaktoren (Z). Bruk følgende Z-verdier (tabell 1): Glukose: 4 125; glutamin: 1000; oleate: 12.5.
- Del det resulterende produktet etter cellenummer (celle#) og 4 (for reaksjonstiden på 4 timer) for å bestemme substratoksidasjonshastigheten per celle. Bruk cellenummeret som er bestemt i parallellbrønnene i begynnelsen av analysen.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette eksemplet brukes CO2-overlappingsmetoden til å sammenligne substratoksidasjon ved henholdsvis primære kaloripreosteoblaster versus BMMer, som ofte brukes til henholdsvis in vitro osteoblast eller osteoklastdifferensiering. Etter at primærcellene er passeret og dyrket i cMEMα over natten, når de vanligvis 80-90% av samløpet og viser sin karakteristiske morfologi. De kaloriprevariale preosteoblastene er merkbart større enn BMMer (figur 2). Hver celletype utsettes for oksidasjonsanalyser for glukose, glutamin og oleat ved å følge trinn 4.1 til 4.7. Resultatene analyseres ved hjelp av Eq (1).
Resultatene viser at oksidasjonshastigheten for hvert substrat er betydelig høyere i kaloripreosteoblaster enn BMMer, noe som sannsynligvis indikerer større energiproduksjon av OXPHOS i preosteoblastene (figur 3). Tidligere studier med Seahorse-teknologi har vist at OXPHOS står for ~ 60% av ATP-produksjonen i preosteoblaster, men reduserer markant i modne osteoblaster, hvor aerob glykolyse er ansvarlig for ~ 80% av energien9. De nåværende resultatene viser at alle de tre store substratene bidrar til OXPHOS i preosteoblaster. Videre undersøkelser er imidlertid nødvendig for å avgjøre om utnyttelsen av ett eller alle substratene reduseres i de modne osteoblastene.
Figur 1: Diagrammer for CO2-fangstanalyse og calvaria-disseksjon. (A) Den midterste delen av calvaria, indikert av den oransje stiplede trekanten, høstes for celleisolasjon. (B) 1,5 ml mikrosenterrør brukes til CO2-overlapping (trinn 1). Filterpapir (blått papir til illustrasjonsformål) kuttes for å passe inn i rørhettene (trinn 2). Tilsett 200 μL 1 M perklorsyre til 400 μL varme medier fra cellekulturen i hvert rør og 20 μL NaOH til filterpapiret (trinn 3) før du lukker lokket (trinn 4). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Typisk morfologi for BMMer og kaloripreosteoblaster. (A, B) Representative bilder ved lavere forstørrelse. (C, D) Representative bilder med høyere forstørrelse. Skalastenger = 400 μm (A, B), 100 μm (C, D). Forkortelser: BMMs = benmargsavledede makrofager; preOBer = preosteoblaster. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Substratoksidasjonshastigheter i kaloripreosteoblaster og BMMer. (A) Glukose. (B) Glutamin. (C) Oleate. Beregningene forutsetter at hvert substratmolekyl er fullstendig oksidert. Forkortelser: BMM = benmarg-avledet makrofag; preOB = preosteoblast. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Substrat | Radioaktivitet (X) | Spesifikk aktivitet (Y), mCi/mmol | Fortynningsfaktor (Z) |
| Glukose | DPM1 | 300 | 4,125 |
| Glutamin | DPM2 | 200 | 1,000 |
| Oleate | DPM3 | 50 | 12.5 |
Tabell 1: Parametere som brukes i dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen gir en brukervennlig metode for å bestemme oksidasjonshastigheten til store energisubstrater. Det er et enklere alternativ til andre protokoller som bruker kolber som inneholder en sentral brønn og avkortet med gummipropper 14,15,16. Selv om eksempelstudien her utføres med cellekultur, kan metoden enkelt tilpasses vevseksempler eller vevshomogenater som inneholder intakt mitokondrier, som tidligere beskrevet17.
Noen viktige trinn å vurdere i denne protokollen innebærer utarbeidelse av reagenser og oppsett av rørene for 14CO2-fangst . Å sikre passende konjugering av oleat til BSA er avgjørende for å forhindre at frie fettsyrer (FFAer) skader cellemembranene og tillater effektivt opptak av cellen for metabolisme. Inkuber BSA-løsningen akkurat lenge nok til fullstendig oppløsning, da lange inkubasjoner med BSA ved 70 °C fører til irreversibel størkning.
Fersk cMEMα må gjøres for hvert eksperimentelt oppsett på grunn av kort halvering av substrater som L-glutamin. Til slutt skal filterpapiret være stort nok til å passe godt inn i hetten for å unngå feilaktige avlesninger. Et utilsiktet fall av filterpapiret i reaksjonsvæsken vil føre til unormalt høye DPM-verdier, som bør utelates fra videre analyse. Fire til fem replikerte brønner kan settes ved potensiell kontaminering. Hvis de endelige DPM-verdiene er for lave, for eksempel mindre enn 100, kan det være nyttig å øke mengden radioaktivt substrat eller inkubasjonstiden.
Det er forbehold for bruk av oleat som surrogatsubstrat for fettsyreoksidasjon. Oleat er den mest tallrike enumettede, langkjedede fettsyren som utgjør 32% av alle fettsyrer i sirkulasjon og vev. Imidlertid er andre langkjedede fettsyrer, som palmitat (28%) og linoleat (14%), også store substrater i vivo 18,19. Derfor kan tilskudd av cellekulturmediene med oleat alene ikke nøyaktig gjenspeile oksidasjonshastigheten til fettsyrer når andre arter også er til stede. Når du utfører analysen, kan denne bekymringen forbedres ved å inkludere de andre fettsyrene i kulturmediene.
Det skal bemerkes at cellemetabolismen er svært kontekstavhengig og kan vise stor plastisitet avhengig av blant annet substrattilgjengelighet og oksygenspenning. Det er derfor viktig å evaluere in vitro resultater i sammenheng med fysiologiske forhold. Likevel er det stadig tydeligst at celler har en tendens til å opprettholde minst noen aspekter av deres metabolske egenskaper in vitro, sannsynligvis på grunn av cellespesifikk metabolsk programmering og minne. Dermed tilbyr enkle in vitro-metoder , som denne, et viktig verktøy for å få innsikt i ikke bare det metabolske mangfoldet blant celletyper, men også potensiell dysregulering i sykdomstilstander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Arbeidet ble delvis støttet av NIH grant R01 AR060456 (FL). Vi takker Dr. Michael Robinson og Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) for deres generøse hjelp med scintillation counter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
References
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
- Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
- Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
- Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
- Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
- Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
- Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
- Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
- Oba, M., Baldwin, R. L. 4th, Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).
