Summary
Il protocollo qui presentato consente il trapianto di microglia umana derivata da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSMG) nel cervello attraverso una via transnasale in topi immunocompetenti. Viene mostrato il metodo per la preparazione e il trapianto transnasale di cellule e la somministrazione di miscela di citochine per il mantenimento di iPSMG.
Abstract
Le microglia sono la popolazione specializzata di cellule cerebrali simili a macrofagi. Svolgono ruoli essenziali nelle funzioni cerebrali sia fisiologiche che patologiche. La maggior parte della nostra attuale comprensione della microglia si basa su esperimenti eseguiti nel topo. Le microglia umane differiscono dalle microglia di topo, e quindi la risposta e le caratteristiche della microglia di topo potrebbero non sempre rappresentare quella della microglia umana. Inoltre, a causa di difficoltà etiche e tecniche, la ricerca sulla microglia umana è limitata al sistema di coltura in vitro , che non capitola in vivo le caratteristiche della microglia. Per superare questi problemi, viene sviluppato un metodo semplificato per il trapianto non invasivo di microglia umana derivata da cellule staminali pluripotenti (iPSMG) nel cervello dei topi immunocompetenti attraverso una via transnasale in combinazione con l'esaurimento farmacologico della microglia endogena utilizzando un antagonista del recettore del fattore 1 stimolante le colonie (CSF1R). Questo protocollo fornisce un modo per trapiantare in modo non invasivo le cellule nel cervello del topo e può quindi essere prezioso per valutare il ruolo in vivo della microglia umana nelle funzioni cerebrali fisiologiche e patologiche.
Introduction
Le microglia sono una popolazione specializzata di cellule simili a macrofagi nel sistema nervoso centrale (SNC) e svolgono ruoli essenziali nel controllo di varie funzioni cerebrali come lo sviluppo del circuito neurale, la modulazione della neurotrasmissione e il mantenimento dell'omeostasi cerebrale 1,2,3. Sebbene le microglia murine condividano molte funzioni con quelle degli esseri umani, mostrano differenze specie-specifiche. Pertanto, la risposta della microglia di topo a vari stimoli potrebbe non sempre rappresentare quella della microglia umana 4,5,6. Sebbene molti studi abbiano analizzato la microglia umana, questi esperimenti sono limitati a studi in vitro. Le microglia umane coltivate in vitro mostrano caratteristiche morfologiche ed espressione genica molto diverse da quelle in vivo. Pertanto, gli esperimenti in vitro potrebbero non sempre capitolare le caratteristiche in vivo della microglia umana. Pertanto, è necessario un sistema sperimentale per studiare la microglia umana in vivo.
Recentemente, per studiare le caratteristiche in vivo della microglia umana, le cellule staminali pluripotenti indotte generate in vitro (iPSC) o le microglia umane derivate da cellule staminali embrionali vengono trapiantate chirurgicamente nel cervello dei topi 7,8,9,10,11,12,13,14. Utilizzando questo approccio, sono state caratterizzate varie caratteristiche in vivo della microglia umana. Tuttavia, l'uso diffuso di questo metodo è limitato per due motivi. Il primo è il requisito di topi immunodeficienti. Pertanto, per studiare il ruolo della microglia umana in varie malattie neurodegenerative, i topi portatori di mutazioni della malattia devono essere incrociati in topi immunodeficienti, il che richiede tempo e sforzi significativi. Inoltre, in vari disturbi neurologici, le cellule immunitarie periferiche, come le cellule T, possono modulare le funzionimicrogliali 15,16,17. Pertanto, gli esperimenti condotti su topi immunodeficienti potrebbero non rappresentare le caratteristiche in buona fede della microglia umana in vivo. In secondo luogo, gli interventi chirurgici invasivi per trapiantare la microglia richiedono attrezzature e formazione aggiuntive. Inoltre, la lesione cerebrale durante il trapianto invasivo può cambiare i fenotipi microgliali.
In questo protocollo, il trapianto transnasale non invasivo (Tsn) di iPSMG in topi wild-type immunocompetenti è descritto18. Combinando ON/OFF farmacologico di un antagonista CSF1R PLX5622 che esaurisce la microgliaendogena di topo 19 e Tsn, iPSMG può essere trapiantato in modo non invasivo nel cervello del topo. Inoltre, con l'applicazione di citochine umane esogene, l'iPSMG trapiantato rimane vitale per 60 giorni in modo specifico per regione senza immunosoppressori.
Protocol
Tutti gli animali utilizzati in questo studio sono stati ottenuti, ospitati, curati e utilizzati in conformità con i "Principi guida nella cura e nell'uso degli animali nel campo delle scienze fisiologiche" pubblicati dalla Physiologic Society of Japan20 e con la previa approvazione del Comitato per la cura degli animali dell'Università di Yamanashi (Yamanashi, Giappone).
1. Preparazione del mezzo cellulare, del mezzo di trapianto e della miscela di anestesia
- Preparare il mezzo cellulare aggiungendo il 10% di siero bovino fetale e lo 0,1% di penicillina/streptomicina nel DMEM.
- Preparare il mezzo di trapianto aggiungendo hCSF1 (250 ng/mL) e hTGF-β1 (100 ng/mL) al mezzo cellulare.
- Preparare la miscela di anestesia per iniezione intraperitoneale mescolando 0,45 mL di medetomidina cloridrato, 1,2 mL di midazolam e 1,5 mL di butorfanolo tartrato in 11,8 mL di soluzione salina normale.
2. Preparazione di iPSMG
NOTA: gli iPSMG congelati (Table of Materials) sono stati mantenuti a -80 °C fino all'uso.
- Scongelare rapidamente le cellule congelate a bagnomaria a 37 °C. Ruotare i campioni fino a quando tutto il ghiaccio visibile si è sciolto.
- Aggiungere l'iPSMG scongelato al terreno di coltura riscaldato a 37 °C. Aggiungere 1 mL di cellule scongelate contenenti terreno (1 × 106 cellule) a 10 mL del terreno di coltura.
- Centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti per ottenere un pellet cellulare.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere tutto il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. La rimozione completa del surnatante è auspicabile per ridurre la diluizione della concentrazione di citochine nel mezzo di trapianto.
- Aggiungere il mezzo di trapianto per ottenere una concentrazione cellulare di 1 x 105 cellule/μL.
- Posizionare l'iPSMG sul ghiaccio e procedere immediatamente al trapianto.
NOTA: La preparazione di iPSMG per il trapianto viene eseguita su un banco pulito per evitare la contaminazione.
3. Preparazione del topo per il trapianto transnasale (Tsn)
- Nutrire i topi maschi wild-type (C57BL/6J, 8 settimane di età) con plx5622 contenente dieta per 7 giorni.
- Alla fine del 7° giorno, cessare la dieta PLX e nutrire i topi con una dieta normale fino alla fine dello studio.
NOTA: la dieta contenente PLX5622 viene preparata aggiungendo 1,2 g di PLX5622 in 1 kg di AIN-93G (Tabella dei materiali).
4. Trapianto transnasale di cellule
- 24 ore dopo la cessazione dell'alimentazione PLX, pesare i topi e anestetizzarli con un'iniezione intraperitoneale della miscela di anestesia (0,2 ml / 20 g).
- Dopo che i topi sono stati completamente anestetizzati come valutato dalla mancata risposta al riflesso di astinenza del pedale (pizzico fermo della punta), somministrare 2,5 μL di ialuronidasi in PBS (100 U / mL) a 1 ora prima di Tsn di iPSMG a ciascuna narice due volte usando una punta di pipetta da 10 μL per aumentare la permeabilità della mucosa nasale.
- Dopo l'applicazione della ialuronidasi, posizionare i topi in posizione supina.
- Ripetere il passaggio 4.2 10 minuti prima del trapianto transnasale di iPSMG.
- Applicare 2,5 μL di sospensione cellulare in una narice del mouse utilizzando una punta della pipetta da 10 μL.
- Posizionare il mouse in posizione supina per 5 minuti prima della somministrazione della sospensione cellulare all'altra narice.
- Ripetere i passaggi 4.5 e 4.6 quattro volte, applicando un volume totale di 20 μL per animale.
- Posizionare il mouse in posizione supina su un termoforo a 37 °C fino al recupero dall'anestesia.
- A 48 ore dopo la cessazione dell'alimentazione PLX, ripetere ancora una volta i passaggi 4.1-4.7 sugli stessi topi.
NOTA: Va notato che gli iPSMG sono posti su ghiaccio durante il trapianto.
5. Applicazione di citochine
- Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di miscela di anestesia (0,2 ml / 20 g).
- Applicare 2,5 μL del mezzo di trapianto in una narice del mouse utilizzando una punta della pipetta da 10 μL.
- Posizionare il topo in posizione supina per 5 minuti prima di somministrare il mezzo di trapianto all'altra narice.
- Ripetere i passaggi 5.2 e 5.3 quattro volte, applicando un volume totale di 20 μL per animale.
NOTA: Va notato che la somministrazione transnasale di mezzo di trapianto (citochine umane) è necessaria ogni 12 ore per la vitalità di iPSMG trapiantato fino alla fine dello studio.
Representative Results
Questa tecnica consente allo sperimentatore di trapiantare in modo non invasivo iPSMG nell'ippocampo e nel cervelletto, ma non nella corteccia del cervello del topo. Dopo aver completato lo studio, i topi anestetizzati sono stati sottoposti a perfusione transcardica di PBS ghiacciato (−), seguito da paraformaldeide ghiacciata del 4% (p / v) in PBS. I cervelli sono stati isolati, postfissa durante la notte in paraformaldeide al 4% (p/v) e crioprotetta in un PBS contenente il 30% (p/v) di saccarosio. Inoltre, i cervelli sono stati congelati in un composto incorporante e sezionati (sezioni coronali spesse 20 μm) su un criostato. Le sezioni sono state lavate tre volte in PBS(−) (10 minuti ciascuna) e permeabilizzate e bloccate con lo 0,5% (v/v) di Triton X-100 in siero di capra normale al 10% per 1 ora. Le sezioni sono state poi incubate con marcatore citoplasma anti-umano-specifico, STEM121 (1:100) e anti Iba1 (1:1000) per 5 giorni. Successivamente, le sezioni sono state lavate tre volte con PBS(−) per 10 minuti ciascuna e sono state incubate con anticorpi secondari: Alexa Fluor 488-, o topo coniugato 546, o IgG di coniglio (1:1000) per 2 ore a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con PBS(-) tre volte, le sezioni sono state montate su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio antideflagrante. Un microscopio confocale dotato di una lente obiettivo 40x è stato utilizzato per acquisire immagini a fluorescenza. La vitalità di iPSMG a 2 mesi dopo il trapianto nell'ippocampo e nella corteccia è mostrata nella Figura 1. Il numero di cellule trapiantate può essere determinato contando le cellule che sono positive sia per gli anticorpi specifici dell'uomo che per i marcatori pan-microgliali/monociti, mentre le microglia endogene di topo sono positive per il marcatore pan-microgliale/monocitario solo come precedentemente descritto18. Gli iPSMG trapiantati sostituiscono le microglia di topo, mostrano morfologie ramificate nell'ippocampo e non vengono rilevati nella corteccia18.
Figura 1: Vitalità di iPSMG nella corteccia e nell'ippocampo a 2 mesi dopo Tsn. Il pannello di sinistra mostra l'immunocolorazione con un marcatore pan-microgliale/monocitario, Iba1 (verde). Il pannello centrale mostra l'immunocolorazione con il marcatore del citoplasma specifico per l'uomo STEM121 (rosso). Il pannello di destra mostra un'immagine unita dell'immunocolorazione Iba1 e STEM121. (A) Nei topi di controllo, solo microglia di topo (Iba1+/STEM121-) sono state rilevate sia nella corteccia che nell'ippocampo. (B) Nei topi trapiantati iPSMG, nella corteccia, sono state rilevate solo microglia di topo (Iba1+/STEM121-), mentre nell'ippocampo sono state rilevate iPSMG (Iba1+/STEM121+). Le frecce nell'immagine mostrano la microglia del mouse, mentre le punte di freccia mostrano iPSMG. Un microscopio confocale dotato di una lente obiettivo 40x è stato utilizzato per l'acquisizione di immagini a fluorescenza. Dimensione massima dell'immagine: 1024 x 1024 pixel. Fattore di zoom: 2. Barre di scala = 50 μm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il protocollo qui descrive il trapianto non invasivo di iPSMG nel cervello del topo. L'unicità del protocollo attuale è che combinando i metodi farmacologici PLX ON / OFF e il trapianto intranasale, iPSMG può essere trapiantato in modo non invasivo nel cervello del topo immunocompetente. L'iPSMG trapiantato ha formato la maggior parte delle microglia nell'ippocampo e nel cervelletto occupando la nicchia libera per un massimo di 60 giorni ma non nella corteccia.
I punti critici per l'efficiente Tsn di iPSMG sono (i) l'efficienza di esaurimento delle microglia endogene di topo (ii) la somministrazione di citochine umane ogni 12 ore. Le microglia mantengono il proprio territorio nel cervello. È necessario un efficiente esaurimento della microglia di topo per fornire una nicchia per l'attecchimento di iPSMG trapiantato. Quando l'esaurimento della microglia di topo endogena è insufficiente, non si osserva la colonizzazione dell'ippocampo e del cervelletto del topo da parte di iPSMG. La vitalità della microglia dipende dalla segnalazione CSF1R e TGFBR 19,21,22. è stato segnalato che hCSF1 aumenta selettivamente la vitalità della microglia umana e hTGF-β1 è necessario per la vitalità della microglia e smorza l'infiammazione quando somministrato ogni 12 ore 21,23,24. In assenza di citochine umane esogene, iPSMG non sono osservati nel cervello dei topi. Inoltre, si deve fare attenzione a non attivare meccanicamente iPSMG con pipettaggio eccessivo o con qualsiasi altro mezzo prima di Tsn, in quanto altera irrevocabilmente le caratteristiche di iPSMG e l'efficienza del trapianto. Se non si osserva il Tsn soddisfacente di iPSMG, è necessario determinare la vitalità di iPSMG prima del trapianto e l'esaurimento della microglia endogena. Se l'esaurimento della microglia di topo endogena non è superiore al 90%, il tempo di alimentazione di PLX5622 può essere modificato per aumentare l'esaurimento.
Rispetto a un metodo di trapianto chirurgico convenzionale che è invasivo e richiede attrezzature e formazione aggiuntive, Tsn consente il trapianto in modo non invasivo, semplice, stabile e facile. Inoltre, questo metodo consente il trapianto di iPSMG in cervelli di topi immunocompetenti; pertanto, i topi modello di malattia immunocompetente possono essere utilizzati per studiare la risposta di iPSMG.
Il più grande svantaggio del metodo attuale è l'eterogeneità regionale nell'attecchimento di iPSMG. Se è richiesto il trapianto di iPSMG specifico della regione del cervello, il protocollo attuale non è adatto in quanto l'iPSMG trapiantato rimane innestato per 60 giorni solo nell'ippocampo e nel cervelletto ma non nella corteccia. Inoltre, la necessità di somministrare citochine umane esogene per via intranasale ogni 12 ore è anche una limitazione del protocollo attuale in quanto richiede un lavoro esteso ed è costoso.
In conclusione, viene fornito un protocollo dettagliato per Tsn di iPSMG nel cervello di topi immunocompetenti. Se combinato con ON/OFF farmacologico della microglia di topo di PLX5622, questo protocollo consente un efficace attecchimento di iPSMG. Poiché le cellule trapiantate possono essere osservate nell'ippocampo e nel cervelletto per un periodo di tempo prolungato quando vengono applicate citochine esogene, il metodo attuale può essere prezioso per valutare il ruolo della microglia umana in stati sia fisiologici che patologici in quelle regioni.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Sponsor della sovvenzione: Questo studio è stato supportato da JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), Mitsubishi Science Foundation (SK), Takeda Science Foundation (SK) e una frontier brain science grant dell'Università di Yamanashi (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10566 | |
| AIN 93G | Oriental Yeast Co | ||
| Anti-Iba1 antibody | FUJIFILM | 019–19741 | |
| Anti-STEM121 antibody | Takara Bioscience | Y40410 | |
| Butorphanol tartrate | Kyoritsu Seiyaku | 8019 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | |
| Frozen iPSMG | Shionogi & Co., Ltd | Laboratory for Drug Discovery and Disease Research | |
| Human colony stimulating factor 1 (hCSF1) | PeproTech | 300-25 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 | |
| Medetomidine hydrochloride | Meiji Seika | VETLI5 | |
| Midazolam | Astellas | 18005A2 | |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 162-16065 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Pipette tip | Eppendorf | 30076028 | |
| PLX5622 | Amadis Chemical | A930097 | |
| Transforming growth factor-β1 (Tgf-b1) | PeproTech | 100-21 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400-10 | antifade mounting medium |
References
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