Summary
El protocolo presentado aquí permite el trasplante de microglía humana derivada de células madre pluripotentes inducidas (iPSMG) en el cerebro a través de una ruta transnasal en ratones inmunocompetentes. Se muestra el método para la preparación y trasplante transnasal de células y la administración de mezcla de citoquinas para el mantenimiento de iPSMG.
Abstract
La microglía es la población especializada de células similares a los macrófagos del cerebro. Desempeñan un papel esencial en las funciones cerebrales fisiológicas y patológicas. La mayor parte de nuestra comprensión actual de la microglía se basa en experimentos realizados en el ratón. La microglía humana difiere de la microglía de ratón y, por lo tanto, la respuesta y las características de la microglía de ratón no siempre representan la de la microglía humana. Además, debido a dificultades éticas y técnicas, la investigación sobre la microglía humana se limita al sistema de cultivo in vitro , que no capitula las características in vivo de la microglía. Para superar estos problemas, se desarrolla un método simplificado para trasplantar de forma no invasiva microglía humana derivada de células madre pluripotentes (iPSMG) en el cerebro de ratones inmunocompetentes a través de una vía transnasal en combinación con el agotamiento farmacológico de la microglía endógena utilizando un antagonista del receptor del factor 1 estimulante de colonias (CSF1R). Este protocolo proporciona una forma de trasplantar células de forma no invasiva en el cerebro del ratón y, por lo tanto, puede ser valioso para evaluar el papel in vivo de la microglía humana en las funciones cerebrales fisiológicas y patológicas.
Introduction
La microglía es una población especializada de células similares a los macrófagos en el sistema nervioso central (SNC) y desempeña un papel esencial en el control de diversas funciones cerebrales como el desarrollo del circuito neuronal, la modulación de la neurotransmisión y el mantenimiento de la homeostasis cerebral 1,2,3. Aunque la microglía murina comparte muchas funciones con las de los humanos, muestran diferencias específicas de la especie. Por lo tanto, la respuesta de la microglía del ratón a diversos estímulos no siempre puede representar la de la microglía humana 4,5,6. Aunque muchos estudios han analizado la microglía humana, esos experimentos se limitan a estudios in vitro. Las microglías humanas cultivadas in vitro muestran características morfológicas y de expresión génica muy diferentes a las in vivo. Por lo tanto, los experimentos in vitro no siempre pueden capitular las características in vivo de la microglía humana. Por lo tanto, se necesita un sistema experimental para estudiar la microglía humana in vivo.
Recientemente, para estudiar las características in vivo de la microglía humana, las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) generadas in vitro o la microglía humana derivada de células madre embrionarias se trasplantan quirúrgicamente en el cerebro de ratones 7,8,9,10,11,12,13,14. Utilizando este enfoque, se han caracterizado varias características in vivo de la microglía humana. Sin embargo, el uso generalizado de este método es limitado por dos razones. El primero es el requisito de ratones inmunodeficientes. Por lo tanto, para estudiar el papel de la microglía humana en diversas enfermedades neurodegenerativas, los ratones portadores de mutaciones de enfermedades deben cruzarse a ratones inmunodeficientes, lo que requiere mucho tiempo y esfuerzo. Además, en diversos trastornos neurológicos, las células inmunes periféricas, como las células T, pueden modular las funciones microgliales 15,16,17. Por lo tanto, los experimentos realizados en ratones inmunodeficientes pueden no representar características de buena fe de la microglía humana in vivo. En segundo lugar, las cirugías invasivas para trasplantar microglía requieren equipo y capacitación adicionales. Además, la lesión cerebral durante el trasplante invasivo puede cambiar los fenotipos microgliales.
En este protocolo se describe el trasplante transnasal no invasivo (Tsn) de iPSMG en ratones inmunocompetentes de tipo salvaje18. Combinando ON/OFF farmacológico de un antagonista de CSF1R PLX5622 que agota la microglía endógenade ratón 19 y Tsn, iPSMG puede ser trasplantado de forma no invasiva en el cerebro del ratón. Además, con la aplicación de citoquinas humanas exógenas, el iPSMG trasplantado sigue siendo viable durante 60 días de una manera específica de la región sin ningún inmunosupresor.
Protocol
Todos los animales utilizados en este estudio fueron obtenidos, alojados, cuidados y utilizados de acuerdo con los "Principios Rectores en el Cuidado y Uso de Animales en el Campo de las Ciencias Fisiológicas" publicados por la Sociedad Fisiológica de Japón20, y con la aprobación previa del Comité de Cuidado Animal de la Universidad de Yamanashi (Yamanashi, Japón).
1. Preparación del medio celular, medio de trasplante y mezcla de anestesia
- Prepare el medio celular agregando 10% de suero fetal bovino y 0.1% de penicilina / estreptomicina en DMEM.
- Preparar el medio de trasplante añadiendo hCSF1 (250 ng/mL) y hTGF-β1 (100 ng/mL) al medio celular.
- Prepare la mezcla de anestesia para inyección intraperitoneal mezclando 0,45 ml de clorhidrato de medetomidina, 1,2 ml de midazolam y 1,5 ml de tartrato de butorfanol en 11,8 ml de solución salina normal.
2. Preparación de iPSMG
NOTA: Los iPSMG (Tabla de Materiales) congelados se mantuvieron a -80 °C hasta su uso.
- Descongele las células congeladas rápidamente en un baño de agua a 37 °C. Gire las muestras hasta que todo el hielo visible se haya derretido.
- Añadir el iPSMG descongelado al medio de cultivo calentado a 37 °C. Añadir 1 ml de células descongeladas que contengan medio (1 × 106 células) a 10 ml del medio de cultivo.
- Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min para obtener un pellet celular.
- Después de la centrifugación, retire todo el sobrenadante sin perturbar la bolita celular. La eliminación completa del sobrenadante es deseable para reducir la dilución de la concentración de citoquinas en el medio de trasplante.
- Añadir el medio de trasplante para obtener una concentración celular de 1 x 105 células/μL.
- Coloque el iPSMG en hielo e inmediatamente proceda al trasplante.
NOTA: La preparación de iPSMG para trasplante se realiza en un banco limpio para evitar la contaminación.
3. Preparación del ratón para el trasplante transnasal (Tsn)
- Alimente a los ratones machos de tipo salvaje (C57BL / 6J, 8 semanas de edad) con PLX5622 que contenga una dieta durante 7 días.
- Al final del7º día, suspenda la dieta PLX y alimente a los ratones con una dieta normal hasta el final del estudio.
NOTA: La dieta que contiene PLX5622 se prepara agregando 1.2 g de PLX5622 en 1 kg de AIN-93G (Tabla de Materiales).
4. Trasplante transnasal de células
- 24 h después del cese de la alimentación con PLX, pesar los ratones y anestesiarlos mediante una inyección intraperitoneal de la mezcla de anestesia (0,2 mL/20 g).
- Después de que los ratones estén completamente anestesiados según lo evaluado por la falta de respuesta al reflejo de abstinencia del pedaleo (pellizco firme del dedo del pie), administre 2.5 μL de hialuronidasa en PBS (100 U / mL) a 1 h antes de Tsn de iPSMG a cada fosa nasal dos veces usando una punta de pipeta de 10 μL para aumentar la permeabilidad de la mucosa nasal.
- Después de la aplicación de hialuronidasa, coloque a los ratones en posición supina.
- Repita el paso 4.2 10 min antes del trasplante transnasal de iPSMG.
- Aplique 2,5 μL de suspensión celular en una fosa nasal del ratón utilizando una punta de pipeta de 10 μL.
- Coloque el ratón en posición supina durante 5 minutos antes de la administración de suspensión celular a la otra fosa nasal.
- Repita los pasos 4.5 y 4.6 cuatro veces, aplicando un volumen total de 20 μL por animal.
- Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla térmica de 37 °C hasta la recuperación de la anestesia.
- A las 48 h después del cese de la alimentación plX, repita los pasos 4.1-4.7 en los mismos ratones una vez más.
NOTA: Cabe señalar que los iPSMG se colocan en hielo durante el trasplante.
5. Aplicación de citoquinas
- Anestesiar a los ratones mediante una inyección intraperitoneal de mezcla de anestesia (0,2 mL/20 g).
- Aplique 2,5 μL del medio de trasplante en una fosa nasal del ratón utilizando una punta de pipeta de 10 μL.
- Coloque el ratón en posición supina durante 5 minutos antes de administrar el medio de trasplante a la otra fosa nasal.
- Repita los pasos 5.2 y 5.3 cuatro veces, aplicando un volumen total de 20 μL por animal.
NOTA: Cabe señalar que se requiere la administración transnasal de medio de trasplante (citoquinas humanas) cada 12 h para la viabilidad de iPSMG trasplantado hasta el final del estudio.
Representative Results
Esta técnica permite al investigador trasplantar iPSMG de forma no invasiva en el hipocampo y el cerebelo, pero no en la corteza del cerebro del ratón. Después de completar el estudio, los ratones anestesiados fueron sometidos a perfusión transcárdica de PBS helado (−), seguido de paraformaldehído helado al 4% (p / v) en PBS. Los cerebros fueron aislados, posfijados durante la noche en paraformaldehído al 4% (p/v) y crioprotegidos en un PBS que contenía 30% (p/v) de sacarosa. Además, los cerebros se congelaron en un compuesto de incrustación y se seccionaron (secciones coronales de 20 μm de espesor) en un criostato. Las secciones se lavaron tres veces en PBS(−) (10 min cada una) y se permeabilizaron y bloquearon con 0,5% (v/v) Tritón X-100 en suero de cabra normal al 10% durante 1 h. Las secciones se incubaron con el marcador de citoplasma específico antihumano, STEM121 (1:100) y anti Iba1 (1:1000) durante 5 días. A continuación, las secciones se lavaron tres veces con PBS(−) durante 10 min cada una y se incubaron con anticuerpos secundarios: Alexa Fluor 488-, o 546-conjugado de ratón, o conejo IgGs (1:1000) durante 2 h a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS(-) tres veces, las secciones se montaron en diapositivas utilizando un medio de montaje antifade. Se utilizó un microscopio confocal equipado con una lente de objetivo 40x para adquirir imágenes de fluorescencia. La viabilidad de iPSMG a los 2 meses después del trasplante en el hipocampo y la corteza se muestran en la Figura 1. El número de células trasplantadas se puede determinar contando las células que son positivas tanto para anticuerpos específicos humanos como para marcadores pan-microgliales/monocitos, mientras que la microglía endógena de ratón es positiva para el marcador pan-microglial/monocitos solo como se describió anteriormente18. Los iPSMG trasplantados reemplazan la microglía del ratón, muestran morfologías ramificadas en el hipocampo y no se detectan en la corteza18.
Figura 1: Viabilidad de iPSMG en la corteza y el hipocampo a los 2 meses después de Tsn. El panel izquierdo muestra la inmunotinción con un marcador pan-microglial/monocitos, Iba1 (verde). El panel central muestra inmunotinción con el marcador de citoplasma específico humano STEM121 (rojo). El panel derecho muestra una imagen combinada de la inmunotinción Iba1 y STEM121. (A) En ratones control, solo se detectó microglía de ratón (Iba1+/STEM121-) tanto en la corteza como en el hipocampo. (B) En ratones trasplantados con iPSMG, en la corteza, solo se detectó microglía de ratón (Iba1+/STEM121-), mientras que en el hipocampo se detectó iPSMG (Iba1+/STEM121+). Las flechas de la imagen muestran la microglía del ratón, mientras que las puntas de flecha muestran iPSMG. Se utilizó un microscopio confocal equipado con una lente de objetivo 40x para la adquisición de imágenes de fluorescencia. Tamaño máximo de la imagen: 1024 x 1024 píxeles. Factor de zoom: 2. Barras de escala = 50 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El protocolo aquí describe el trasplante no invasivo de iPSMG en el cerebro del ratón. La singularidad del protocolo actual es que al combinar los métodos farmacológicos PLX ON / OFF y el trasplante intranasal, iPSMG puede trasplantarse de forma no invasiva en el cerebro de ratón inmunocompetente. La iPSMG trasplantada formó la mayoría de la microglía en el hipocampo y el cerebelo al ocupar el nicho vacante durante un máximo de 60 días, pero no en la corteza.
Los puntos críticos para el Tsn eficiente de iPSMG son (i) la eficiencia de agotamiento de la microglía endógena de ratón (ii) la administración de citoquinas humanas cada 12 h. Las microglías mantienen su propio territorio en el cerebro. Se requiere un agotamiento eficiente de la microglía del ratón para proporcionar un nicho para el injerto de iPSMG trasplantado. Cuando el agotamiento de la microglía endógena del ratón es insuficiente, no se observa la colonización del hipocampo y el cerebelo del ratón por iPSMG. La viabilidad de la microglía depende de la señalización CSF1R y TGFBR 19,21,22. Se ha informado que hCSF1 aumenta selectivamente la viabilidad de la microglía humana, y se requiere hTGF-β1 para la viabilidad de la microglía, así como amortigua la inflamación cuando se administra cada 12 h 21,23,24. En ausencia de citoquinas humanas exógenas, iPSMG no se observan en el cerebro del ratón. Además, se debe tener cuidado de no activar mecánicamente iPSMG por pipeteo excesivo o por cualquier otro medio antes de Tsn, ya que altera irrevocablemente las características de iPSMG, así como la eficiencia del trasplante. Si no se observa el Tsn satisfactorio de iPSMG, se debe determinar la viabilidad de iPSMG antes del trasplante, así como el agotamiento de la microglía endógena. Si el agotamiento de la microglía endógena del ratón no es superior al 90%, el tiempo de alimentación de PLX5622 puede modificarse para aumentar el agotamiento.
En comparación con un método de trasplante quirúrgico convencional que es invasivo y requiere equipo y capacitación adicionales, Tsn permite el trasplante de una manera no invasiva, simple, estable y fácil. Además, este método permite el trasplante de iPSMG en cerebros de ratones inmunocompetentes; por lo tanto, los ratones modelo de enfermedad inmunocompetente se pueden utilizar para estudiar la respuesta de iPSMG.
La mayor desventaja del método actual es la heterogeneidad regional en el injerto de iPSMG. Si se requiere el trasplante de iPSMG específico de la región cerebral, el protocolo actual no es adecuado ya que el iPSMG trasplantado permanece injertado durante 60 días solo en el hipocampo y el cerebelo, pero no en la corteza. Además, la necesidad de administrar citoquinas humanas exógenas por vía intranasal cada 12 h también es una limitación del protocolo actual, ya que requiere una mano de obra extensa y es costosa.
En conclusión, se proporciona un protocolo detallado para Tsn de iPSMG en los cerebros de ratones inmunocompetentes. Cuando se combina con ON/OFF farmacológico de microglia de ratón por PLX5622, este protocolo permite el injerto exitoso de iPSMG. Como las células trasplantadas se pueden observar en el hipocampo y el cerebelo durante un período sostenido de tiempo cuando se aplican citoquinas exógenas, el método actual puede ser valioso para evaluar el papel de la microglía humana en los estados fisiológicos y patológicos en esas regiones.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Patrocinadores de la subvención: Este estudio fue apoyado por JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), Mitsubishi Science Foundation (SK), Takeda Science Foundation (SK) y una frontier Brain Science Grant de la Universidad de Yamanashi (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10566 | |
| AIN 93G | Oriental Yeast Co | ||
| Anti-Iba1 antibody | FUJIFILM | 019–19741 | |
| Anti-STEM121 antibody | Takara Bioscience | Y40410 | |
| Butorphanol tartrate | Kyoritsu Seiyaku | 8019 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | |
| Frozen iPSMG | Shionogi & Co., Ltd | Laboratory for Drug Discovery and Disease Research | |
| Human colony stimulating factor 1 (hCSF1) | PeproTech | 300-25 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 | |
| Medetomidine hydrochloride | Meiji Seika | VETLI5 | |
| Midazolam | Astellas | 18005A2 | |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 162-16065 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Pipette tip | Eppendorf | 30076028 | |
| PLX5622 | Amadis Chemical | A930097 | |
| Transforming growth factor-β1 (Tgf-b1) | PeproTech | 100-21 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400-10 | antifade mounting medium |
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