Summary
Questo articolo descrive un metodo per sterilizzare picconi di vermi, spatole e bisturi utilizzando un micro-inceneritore al posto di una fiamma aperta.
Abstract
Caenorhabtidis elegans (C. elegans) è un organismo modello ottimale per la ricerca e l'istruzione presso istituzioni principalmente universitarie. Gli studenti universitari possono imparare rapidamente la tecnica sterile necessaria per mantenere le culture di C. elegans . La sterilizzazione dei picconi di platino utilizzati per trasferire i vermi da una piastra all'altra viene tradizionalmente eseguita tenendo il plettro in una fiamma da un bruciatore Bunsen o da una lanterna a etanolo. Tuttavia, i bruciatori Bunsen richiedono una fonte di gas ed entrambi i pezzi di equipaggiamento presentano il rischio di incendio accidentale associato a una fiamma aperta. Qui è dimostrata una tecnica per sterilizzare picconi di vermi, spatole e bisturi utilizzando un micro-inceneritore a circuito batteriologico a infrarossi. Questa apparecchiatura richiede solo una presa elettrica e riduce al minimo i potenziali rischi di incendio. Riducendo il rischio e i requisiti di gas, questa tecnica è adatta per la ricerca e l'insegnamento in un ambiente universitario.
Introduction
L'organismo modello C. elegans è adatto sia per la ricerca che per l'istruzione presso istituzioni principalmente universitarie (PUI) a causa del basso costo, della facilità di manutenzione e della gamma di applicazioni 1,2,3,4. Per gestire i vermi - ad esempio, per spostare un verme da una piastra all'altra, gli sperimentatori possono usare un worm pick. Una varietà di scelte può essere fatta o acquistata per l'uso con C. elegans. I plettri sono più comunemente realizzati utilizzando una punta in platino o platino / iridio, montata in un manico di vetro, metallo o legno. Le maniglie in vetro possono essere realizzate internamente fondendo una pipetta Pasteur attorno a un filo di platino fino a quando il filo non è sicuro. Ulteriori informazioni sull'allevamento di C. elegans, incluso come coltivare e mantenere i vermi e le loro fonti di cibo, possono essere trovate in WormBook5 e altre fonti 6,7,8.
Quando si lavora con C. elegans, le tecniche asettiche sono tipicamente utilizzate per prevenire la contaminazione con microbi e funghi. Esempi di tecniche asettiche includono la sterilizzazione degli strumenti, l'autoclave dei reagenti e la conduzione di lavori in campi sterili. I plettri di vermi sono in genere sterilizzati utilizzando una fiamma aperta9. Inoltre, la sterilizzazione del worm pick incenerisce i vermi, prevenendo così confusioni accidentali di ceppi quando si lavora con più ceppi di vermi. I metodi tipici per sterilizzare i worm picks prevedono una fiamma aperta da un bruciatore Bunsen, una lanterna a etanolo o un accendino standard (Tabella 1). Siamo stati motivati a cercare alternative più sicure ai metodi esistenti in laboratorio quando uno studente universitario ha inconsapevolmente versato etanolo mentre riempiva una lanterna a etanolo e ha accidentalmente appiccato un piccolo incendio quando ha acceso la lanterna. Sfortunatamente, molti incidenti sono stati segnalati utilizzando lanterne a etanolo 10,11,12. Fortunatamente, i metodi di sterilizzazione alternativi sono stati convalidati per l'uso in microbiologia e lo scopo di questo articolo è dimostrare come utilizzare questa apparecchiatura per sterilizzare gli strumenti per l'uso con C. elegans.
Nei laboratori di microbiologia, anche la tecnica asettica è critica. Gli anelli sierologici e i fili di platino vengono sterilizzati utilizzando un13 a fiamma libera o un microinceneritore 14,15,16. Altri nomi per micro-inceneritori includono micro-sterilizzatori o bacto-inceneritori. I vantaggi del micro-inceneritore rispetto ai metodi di fiamma tradizionali includono la riduzione del rischio di incendio, l'eliminazione degli schizzi di materiali inceneriti e la capacità di lavorare in una cappa a flusso laminare / armadio di biosicurezza 16,17,18. Infatti, sia l'American Society of Microbiology che l'Organizzazione Mondiale della Sanità raccomandano l'uso di micro-inceneritori rispetto all'uso di una fiamma aperta 17,19,20. Rispetto ai bruciatori Bunsen, anche i micro-inceneritori non richiedono una linea del gas, che alcuni laboratori potrebbero non avere, o potrebbero non avere situato in ogni banco per gli studenti. Ispirato da questi vantaggi, è stato sviluppato un protocollo per sostituire l'uso della fiamma con micro-inceneritori per la sterilizzazione di strumenti di uso comune come picconi, spatole e bisturi nel laboratorio di C. elegans. Questo metodo può essere appropriato per istruttori e ricercatori che cercano di migliorare la sicurezza e / o la flessibilità quando lavorano con C. elegans.
Protocol
1. Preparare il micro-inceneritore
- Collegare una guida accessoria per il supporto del loop al micro-inceneritore agganciandola alla canna esterna.
- Collegare il micro-inceneritore a una presa elettrica standard da 120 V o 230 V, a seconda dei casi.
NOTA: Questo può essere fatto su un piano di lavoro o in una cappa a flusso laminare. - Ruotare il micro-inceneritore con l'impostazione alta e lasciarlo riscaldare per 10-20 minuti a seconda delle istruzioni del produttore per raggiungere una temperatura ottimale di 800-825 oC.
NOTA: se si tiene acceso l'inceneritore per più di 3 ore, l'impostazione della temperatura inferiore (500 oC) può essere utilizzata come impostazione di standby. Secondo i manuali d'uso dei produttori, questo prolunga la vita utile dell'apparecchiatura.
2. Sterilizzare il plettro, la spatola o il bisturi
- Inserire lo strumento nell'area di sterilizzazione cilindrica senza toccare i lati facendo scorrere lungo la guida21.
NOTA: Se si sterilizza un bisturi, è fondamentale evitare di toccare la parete ceramica con la lama. Raschiare la parete ceramica può compromettere l'integrità dell'unità di riscaldamento. - Tenere lo strumento nell'area di sterilizzazione per 5-7 s.
- Rimuovere lo strumento senza toccare i lati facendo scorrere all'indietro lungo la guida.
- Per i plettri, lasciare raffreddare lo strumento per 3-5 s prima di toccare un verme per evitare di bruciarlo.
NOTA: Bisturi o spatole che non sono autorizzati a raffreddare canteranno l'agar. - Dopo aver raccolto i vermi, reinserire il plettro nella camera per 5-7 s per incenerire eventuali vermi sul piccone.
3. Metodo comparativo - sterilizzazione di strumenti utilizzando un bruciatore Bunsen
- Collegare il bruciatore Bunsen alla linea del gas utilizzando tubi di gomma. Assicurarsi di fissare saldamente il tubo e posizionare il bruciatore lontano da oggetti aerei.
- Accendere il gas ruotando la manopola sulla linea del gas.
- Accendere il bruciatore usando un percussore o un accendino.
- Regolare la fiamma utilizzando la manopola del gas e la presa d'aria fino a quando non è visibile un cono blu.
- Tieni il plettro, la spatola o il bisturi nella fiamma fino a quando non si illumina di rosso.
- Per i plettri, lasciare raffreddare lo strumento per 3-5 secondi prima di toccare un verme per evitare di bruciarlo.
NOTA: Bisturi o spatole che non sono autorizzati a raffreddare canteranno l'agar. - Dopo aver raccolto i vermi, reinserire il raccoglitore nella fiamma per incenerire eventuali vermi sul piccone.
4. Esperimento
- Coltura OP50 Escherichia coli (E. coli) batteri in Luria Brodo22 durante la notte su uno shaker 37 oC.
- Dopo la coltura durante la notte, diluire la coltura in acqua sterile in un rapporto di 1:100.
NOTA: Questo fattore di diluizione è stato scelto per garantire la separazione delle colonie dopo la placcatura. - Immergere un worm pick sterilizzato con un bruciatore Bunsen nella soluzione batterica, ri-sterilizzare con il bruciatore Bunsen e ruotarlo in 100 ml di acqua sterile.
- Placcare i 100 μL di acqua su una capsula di Petri lb agar22,23 da 10 cm, distribuire l'acqua usando uno spandicelle sterile e incubare a temperatura ambiente per 24 ore con il coperchio acceso.
- Eseguire i passaggi 4.3-4.4 utilizzando un worm pick sterilizzato utilizzando un microinceneritore.
- Come controllo positivo, eseguire i passaggi 4.3-4.4 senza risterilizzare.
- Come controllo negativo, eseguire i passaggi 4.3-4.4 utilizzando acqua sterile al posto della soluzione batterica.
- Contare le colonie manualmente dopo il periodo di incubazione.
Representative Results
Un semplice esperimento (sezione 4) è stato ideato per dimostrare i tassi di contaminazione relativi utilizzando un micro-inceneritore rispetto a una fiamma (Figura 1, Tabella 2). Sebbene questi risultati rappresentino i tassi di contaminazione tra i metodi, non sarebbe necessario ripetere questo metodo per utilizzare la tecnica del microinceneritore. L'esperimento è stato eseguito in triplice copia. Il controllo negativo era l'acqua sterile senza batteri. Il controllo positivo non ha utilizzato nessuna delle due tecniche di sterilizzazione: il plettro è stato immerso nella coltura OP50 diluita e poi trasferito direttamente all'acqua sterile. Tutte le repliche e le condizioni sono state eseguite in parallelo lo stesso giorno. In tutte e tre le piastre di controllo negative, sono state contate zero colonie. Un conteggio medio di 4,7 (± 0,3 SEM) colonie è stato ottenuto quando il bruciatore Bunsen è stato utilizzato per sterilizzare i picconi. Nella condizione di micro-inceneritore è stato osservato un conteggio medio di 3,3 (±1,2 SEM) colonie. Tuttavia, un conteggio medio di 298,3 (±17,9 SEM) colonie è stato ottenuto nella condizione di controllo positivo. Un t-test a 2 code che assume la stessa varianza confrontando il bruciatore Bunsen con il micro-inceneritore non ha prodotto alcuna differenza statisticamente significativa, p = 0,35. Pertanto, il micro-inceneritore ha ottenuto risultati di sterilità ugualmente efficaci per il bruciatore Bunsen.
Figura 1: Conteggi batterici attraverso i metodi di sterilizzazione. I picconi sono stati immersi nella coltura 1:100 OP50 in acqua sterile e poi sterilizzati utilizzando un bruciatore Bunsen o un micro-inceneritore. I picconi sono stati poi immersi in acqua sterile, placcati su LB agar22,23 e incubati per 24 ore a temperatura ambiente, e le colonie sono state contate manualmente. Il controllo positivo non aveva sterilizzazione e il controllo negativo utilizzava acqua sterile senza batteri. n = 3 repliche per condizione. Nota: l'asse y è rotto per consentire la separazione dei punti dati nelle parti pertinenti del grafico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Metodo di sterilizzazione | Costo | Requisiti di laboratorio | Vantaggi | Difetto | |||
| Micro-inceneritore | $ 365-530 | Uscita 120 V o 230 V | • Portatile • Nessun elemento riscaldante a fiamma libera o esposto • Utilizzabile in cappe a flusso laminare e armadi di sicurezza biologica |
• Tempo di riscaldamento • Costi più elevati |
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| Bruciatore Bunsen | $ 24-169 | Linea Gas | • Configurazione rapida • Basso costo |
• Fiamma aperta • Non raccomandato per l'uso in cappa a flusso laminare o armadio di sicurezza biologica |
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| Lampada a etanolo | 11 dollari | Nessuno | • Configurazione rapida • Basso costo • Ricaricabile |
• Fiamma aperta • Pericolo per la sicurezza durante la ricarica • Non raccomandato per l'uso in cappa a flusso laminare o armadio di sicurezza biologica • Non consentito in alcune istituzioni |
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| Accendino | $ 5-8 | Nessuno | • Basso costo • Accessibile • Monouso • Ricaricabile |
• Fiamma aperta • Azionato a mano • Non raccomandato per l'uso in cappa a flusso laminare o armadio di sicurezza biologica |
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Tabella 1: Confronto dei metodi per la sterilizzazione degli strumenti. Sono stati confrontati quattro metodi per la sterilizzazione degli strumenti in base a vantaggi, svantaggi, costi e requisiti di laboratorio.
| Replicare | Condizione | |||
| Micro-inceneritore | Bruciatore Bunsen | Controllo negativo | Controllo Positve | |
| 1 | 1 | 5 | 0 | 278 |
| 2 | 4 | 4 | 0 | 334 |
| 3 | 5 | 5 | 0 | 283 |
| Significare | 3.3 | 4.7 | 0.0 | 298.3 |
| SEM | 1.2 | 0.3 | 0.0 | 17.9 |
Tabella 2: Dati grezzi della conta batterica attraverso i metodi di sterilizzazione. I picconi sono stati immersi nella coltura 1:100 OP50 in acqua sterile e poi sterilizzati utilizzando un bruciatore Bunsen o un micro-inceneritore. I picconi sono stati poi immersi in acqua sterile, placcati su LB agar22,23 e incubati per 24 ore a temperatura ambiente, e le colonie sono state contate manualmente. Il controllo positivo non aveva sterilizzazione e il controllo negativo utilizzava acqua sterile senza batteri. n = 3 repliche per condizione. Media e SEM riportati al di sotto dei conteggi individuali.
Discussion
C. elegans è un organismo modello adatto per esercizi in laboratori didattici universitari. L'uso di micro-inceneritori al posto delle fiamme libere offre benefici sia nei laboratori di ricerca che nei laboratori in aula. In effetti, i corsi di laboratorio universitari possono comportare un rischio maggiore di incendi accidentali dato il numero di scienziati di nuova formazione nella stanza. Inoltre, il rischio di incendio aumenta quando l'etanolo viene utilizzato per sterilizzare gli strumenti vicino alla fonte di fiamma poiché i vapori di etanolo sono infiammabili. La portabilità conferisce anche un vantaggio per le aule in cui le linee del gas non sono installate in ogni banco. Questo metodo è stato impiegato nei laboratori di insegnamento e ricerca presso la nostra istituzione, con conseguente aumento della contaminazione e zero incidenti di sicurezza in laboratorio dalla sua incorporazione nel 2016.
Per garantire la compatibilità con i microinceneritori, è stata testata una gamma di picconi con diversi supporti, composizioni di fili e calibri di filo. La composizione del filo includeva il 100% di platino e il 90% di platino / 10% di iridio con uno spessore del filo di 30-32 G e, indipendentemente dallo spessore e dalla composizione, il metodo di riscaldamento non comprometteva l'integrità del filo. I montaggi includevano due diversi tipi di maniglie di prelievo disponibili in commercio e supporti in vetro realizzati internamente dalle pipette Pasteur. Si noti che i plettri non si illuminano rovente come fanno nella fiamma. Tuttavia, si ottiene ancora una sterilizzazione sufficiente finché lo sterilizzatore ha raggiunto la temperatura corretta. Pertanto, è fondamentale consentire al microinceneritore di riscaldarsi per 10 o 20 minuti, come indicato nelle istruzioni del produttore. Anche tenere lo strumento nella camera per almeno 5 secondi per ottenere la sterilizzazione è fondamentale. Lasciare lo strumento nella camera più a lungo di 7 s non causerà danni allo strumento, ma non è necessario. Mentre questa è una procedura relativamente semplice con passaggi minimi ed è improbabile che abbia bisogno di risoluzione dei problemi, potrebbe essere necessaria una certa pratica per imparare a fissare lo strumento nella canna senza toccare i lati.
Per sostituire una fiamma libera, un metodo di sterilizzazione deve coprire tutte le applicazioni utilizzate in laboratorio. Oltre agli strumenti di sterilizzazione, i laboratori C. elegans possono anche utilizzare i bruciatori Bunsen per creare un campo sterile per svolgere altri compiti come versare piastre o inoculare colture13. Tuttavia, se questo crea un campo sterile o attira contaminanti ancora vitali rimane controverso14. Sebbene non sia un'opzione in tutte le istituzioni, un armadio di biosicurezza o una cappa a flusso laminare possono essere utilizzati per questi scopi, consentendo a un laboratorio di funzionare senza l'uso di fiamme libere. I manuali di istruzioni per la maggior parte dei microinceneritori sconsigliano l'uso per la sterilizzazione delle lame del bisturi perché la raschiatura delle pareti interne danneggia lo sterilizzatore. Tuttavia, se si utilizza attentamente una guida, è possibile sterilizzare una lama di bisturi o una spatola senza toccare le pareti interne. Ciò estende l'uso della tecnica per consentire la spezzettatura senza l'uso di una fiamma e consente a un laboratorio C. elegans di funzionare senza passare dalle tecniche di sterilizzazione tra oggetti diversi.
Come indicato nella Tabella 1, i microinceneritori offrono una maggiore sicurezza, una maggiore compatibilità con le cappe a flusso laminare e una maggiore portabilità rispetto ai metodi a fiamma, ma presentano limitazioni. Sono più costosi degli altri metodi e richiedono un tempo di riscaldamento prima di raggiungere le temperature di sterilizzazione. In conclusione, questo metodo, che viene abitualmente utilizzato in molti laboratori di microbiologia, può essere applicabile in alcuni laboratori di ricerca e insegnamento di C. elegans che cercano di migliorare la sicurezza del laboratorio senza compromettere la sterilità.
Disclosures
Non sono stati divulgati conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Suzanne Howard e Justin Finne. Questo lavoro è stato finanziato dal Wellesley College Neuroscience Department. I worm N2 sono stati forniti dal CGC che è finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Le spese di pubblicazione per questo articolo sono state sostenute dal Wellesley College Library and Technology Services Open Access Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
| Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
| Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
| Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
| Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
| Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
| N2 worms | CGC | N2 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
| OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
| Petri dish | Fisher | 08-772B | |
| Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
| Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
| Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
| Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
| Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
| Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |
References
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