Summary
在这里，我们描述了脊椎动物非洲 爪蟾 胚胎中具有已知组织命运的细胞谱系的基于质谱的蛋白质组学表征。
Abstract
当细胞产生组织和器官时，分子事件的表征提高了更好地了解正常发育和设计有效的疾病疗法的潜力。能够准确鉴定和定量各种类型和大量蛋白质的技术将提供关于在空间和时间上协调组织和生物体发育的分子机制的信息。在这里，我们提出了一种基于质谱的方案，该协议能够测量非洲 爪 蟾（青蛙）胚胎中已鉴定细胞谱系中的数千种蛋白质。该方法建立在可重复的细胞命运图谱和既定方法的基础上，以从这种脊椎动物发育模型中鉴定，荧光标记，跟踪和采样细胞及其后代（克隆）。使用微量采样或通过解剖或荧光激活细胞分选分离细胞收集细胞内容物后，提取并处理蛋白质以进行自下而上的蛋白质组学分析。液相色谱和毛细管电泳用于通过高分辨率质谱（HRMS）为蛋白质检测和定量提供可扩展的分离。为神经组织命运细胞的蛋白质组学表征提供了代表性的例子。细胞谱系引导的HRMS蛋白质组学适用于不同的组织和生物体。它具有足够的灵敏度、特异性和定量性，可以窥探脊椎动物发育过程中蛋白质组的时空动态。
Introduction
我们对细胞分化以及组织和器官起源的理解是数十年来精心设计的基因及其产物靶向筛选的结果。在重要的细胞事件中，增加我们对所有生物分子及其数量的了解将有助于解开控制脊椎动物身体计划的空间和时间模式的分子机制。能够进行分子扩增和测序的技术现在能够定期报告大量基因和转录本，支持基础生物学和转化研究中的假设驱动研究。为了理解发展中的系统，转录和翻译之间的复杂关系主张直接分析多种蛋白质及其翻译后修饰。使用 体外 生物系统（如诱导多能干细胞）的全球蛋白质组学开始描绘组织诱导的机制1，2。在复杂的生物中，例如脊椎动物胚胎，发育依赖于空间和时间背景下的形态原梯度3。因此，随着细胞分化形成专门的组织（如神经组织），获得蛋白质组学变化的知识，为解锁控制正常和缺陷发育的分子程序和指导下一代疗法提供了一把钥匙。
脊椎动物南非爪蛙（非洲爪蟾）是细胞和发育、神经和再生生物学的成熟模型。约翰·戈登爵士（Sir John Gurdon）因发现体细胞核的多能性而获得2012年诺贝尔生理学或医学奖4，5，强调了该模型对基础和转化研究发现的重要性。非洲爪蟾胚胎在母体外部发育，从而促进细胞、细胞克隆和基因表达在不同发育阶段的直接操作。不对称的色素沉着和刻板的细胞分裂使得能够绘制出来自 16-6 和 32 细胞7，8 期胚胎的可重复命运图。对于基于高分辨率质谱（HRMS）的蛋白质组学，该模型的其他优点包括相对较大的尺寸（直径~1毫米），这会产生丰富的蛋白质含量进行分析（早期切割阶段胚胎~130μg，16细胞胚胎的单细胞中~10μg蛋白质含量）9，10。
目前，HRMS是检测蛋白质的首选领先技术。该技术能够直接、灵敏、特异性地检测和定量多种（通常是数百到数千种不同的蛋白质）11。HRMS自下而上的蛋白质组学涉及一系列相互关联的步骤。从细胞/组织样品中提取后，用蛋白水解酶（如胰蛋白酶（自下而上的蛋白质组学））消化蛋白质。所得肽根据其不同的物理化学性质进行分离，包括疏水性（反相液相色谱，LC），净电荷（离子交换色谱），大小（尺寸排阻色谱）或电泳迁移率（毛细管电泳，CE）。然后对肽进行充电（电离），通常使用电喷雾电离（ESI），并通过串联HRMS通过气相碎裂检测和测序肽离子。所得肽数据映射到所研究生物体的蛋白质组。由于蛋白质特异性（蛋白型）肽离子信号强度与浓度相关，蛋白质定量可以无标记或基于标记（多重定量）进行。HRMS蛋白质组学产生了有关所研究系统分子状态的丰富信息资源，允许生成假设和后续功能研究。
图 1：时空可扩展的蛋白质组学，使细胞谱系引导发育（青蛙）胚胎中的 HRMS 蛋白质组学成为可能。 （A）在平移阶段（4）的控制下，使用体视显微镜（2）注射已识别的细胞（插图）的样品（1）用于注射已识别的细胞（插图）。（B）对16细胞胚胎中鉴定的左D11细胞进行亚细胞采样。（C）从16细胞胚胎中解剖整个D11细胞。（D）从32细胞胚胎中对左右D111后代进行荧光（绿色）示踪，以指导解剖原肠胚中的神经外胚层（NE）（第10阶段），并使用FACS从蝌蚪中分离后代组织。比例尺：胚胎200μm，小瓶1.25mm。数字经参考文献15，19，21，59许可改编。请点击此处查看此图的大图。
这里介绍的方案能够基于HRMS对发育中的X. laevis胚胎中鉴定的细胞/组织中的大量蛋白质进行定量。该方法建立在准确的细胞鉴定、可重复的细胞命运图谱和在该生物模型中跟踪细胞谱系的既定方法之上6，7，8。如图1所示，我们通过采用全细胞解剖或毛细管微量采样来抽吸细胞内容物来研究来自单细胞的蛋白质组。监测细胞的谱系使我们能够研究蛋白质组的时空演变，因为细胞在原肠胚形成过程中形成组织。通过注射与惰性葡聚糖或mRNA偶联的荧光团来标记细胞后代，以用于荧光蛋白（例如，绿色荧光蛋白或GFP）。标记的后代在所需的发育时间点分离。在原肠胚形成过程中，可以通过解剖分离紧密聚集的细胞克隆。原肠胚形成后，由于迁移运动，细胞克隆可能分布在胚胎内，并且可以通过荧光激活细胞分选（FACS）从解离组织中分离出来。这些细胞和组织中的蛋白质通过自下而上的蛋白质组学进行测量，采用HPLC或CE进行分离，ESI串联HRMS进行鉴定。细胞谱系引导的HRMS蛋白质组学可扩展到胚胎内的不同细胞大小和谱系，并且具有特异性、灵敏度和定量性。通过此处显示的精选示例，我们还证明了该协议具有可扩展性，并且广泛适用于不同类型的细胞和细胞谱系。
图 2：生物分析工作流程。 显微解剖和毛细管抽吸，或FACS有助于细胞和克隆蛋白含量的采样。使用电喷雾电离 （ESI） 高分辨率质谱 （HRMS） 去除丰度蛋黄蛋白并通过毛细管电泳 （CE） 或纳流液相色谱 （LC） 增强鉴定 （ID） 灵敏度进行分离。量化揭示了失调，结合基因本体（GO）提供的信息，为假设驱动的研究提供了新的信息。数字经参考文献15许可改编。 请点击此处查看此图的大图。
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Protocol
确保非洲 爪蟾 成年蛙的人道维护和处理的所有协议均已获得马里兰大学帕克分校机构动物护理和使用委员会的批准（批准号R-DEC-17-57和R-FEB-21-07）。
1. 准备解决方案
- 用于胚胎学
- 准备1x，0.5x和0.2x斯坦伯格溶液（SS），然后按照标准方案12将它们高压灭菌（120°C20分钟）至无菌。
- 按照标准方案在灭菌的 1x SS 中制备 3% （w/v） Ficoll12。
- 对于脱果冻，新鲜制备2%（w / v）半胱氨酸溶液，并通过滴加10M氢氧化钠溶液将其pH调节至8。
注意：接触半胱氨酸会导致皮肤和呼吸系统损伤。氢氧化钠是一种腐蚀性物质，直接接触会对皮肤和眼睛造成严重伤害。处理这些化学品时，请使用适当的个人防护设备 （PPE），例如手套和实验室外套。 - 对于谱系示踪剂，在无菌去离子水中制备 0.5% （v/v） 的荧光葡聚糖。或者，在无菌去离子水（例如GFP）中制备0.2μg/μL荧光蛋白的mRNA溶液。
- 要解离细胞，请制备含有0.1 M羟乙基磺酸钠，20 mM焦磷酸钠和10 mM CAPS的Newport 2.0缓冲液，然后将其pH值降至10.513。
注意：接触焦磷酸钠会引起皮肤和眼睛刺激。处理这些化学品时，请使用适当的个人防护用品。
- 用于自下而上的蛋白质组学
- 制备细胞裂解缓冲液，包括：250 mM 蔗糖、1% 非内酯 P-40 替代品 （w/v）、20 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、10 μM 细胞松弛素 D 和 10 μM 康布他他汀 4A。准备 10% （w/v） 十二烷基硫酸钠14，15 的储备液。
注意：选择Tris-HCl是为了在纳流LC（nanoLC）-HRMS期间最大限度地减少HEPES污染。
注意：接触非尼特P-40替代品会引起皮肤刺激。如果食用细胞松弛素 D 具有致畸性，而康布他汀在直接暴露时具有剧毒。处理这些化学品时，请使用适当的个人防护用品。 - 要通过CE分离肽，请制备以下溶剂（v / v）：样品溶剂，含有0.05%乙酸（AcOH）的75%乙腈（ACN）水溶液;护套溶液，含0.05%AcOH的10%乙腈水溶液;背景电解质（BGE），25%乙腈含有1M甲酸（FA）的水溶液。
注意：AcOH和FA在吸入或食用时有毒，直接接触会导致严重的皮肤和眼睛损伤。处理这些化学品时，请使用适当的个人防护用品。 - 要通过反相nanoLC分离肽，制备（v / v）：流动相A（水溶液），含0.1%FA的水;流动相B（有机），0.1%FA乙腈溶液。
注意：所有混合物均应使用LC-MS级溶剂制备，以尽量减少HRMS检测过程中的化学干扰。
- 制备细胞裂解缓冲液，包括：250 mM 蔗糖、1% 非内酯 P-40 替代品 （w/v）、20 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、10 μM 细胞松弛素 D 和 10 μM 康布他他汀 4A。准备 10% （w/v） 十二烷基硫酸钠14，15 的储备液。
2.准备显微注射和解剖工具
- 为了轻轻移动和定向胚胎，通过将干净的头发固定在巴斯德移液管中来制作发环，如其他地方所述16.
- 对于显微注射，通过使用移液器拉拔器拉拔硼硅酸盐毛细管（1 mm / 500 μm外径/内径）来制造针头，如其他地方所述16。
注意：在这里，具有以下设置的P-1000移液器拉拔器用于制造针头：加热，495;拉力，30，速度，60;时间，150;压力，200。 - 在体视显微镜下观察，使用一对锋利的镊子切割毛细管的尖端，将毛细管基本上制成（微）针（例如，Dumont #5）16。
注意：拉动的毛细血管非常锋利，应小心处理。
注意：针尖应足够锋利（外径10-15μm），以便能够以对细胞膜的最小损伤刺穿细胞，以便细胞内内容物不会泄漏出来，细胞可以愈合并继续存活。 - 要在显微注射期间保持胚胎，请在粘土填充的培养皿中准备孔。在15毫米培养皿中，将~1毫米直径x ~0.5毫米深的孔压印到无毒橡皮泥粘土中，如其他地方所述16。
- 对于显微切割，准备琼脂糖包被的培养皿。在1x SS中制作2%琼脂糖并将其高压灭菌以灭菌溶液（120°C20分钟）。将60毫米培养皿填充一半，让板凝固。如前所述，使用球状巴斯德移液器工具制作~1 mm直径x ~0.5 mm深的孔16。
3. 分离细胞谱系
注意：执行以下步骤以分离鉴定的单细胞和/或其后代细胞谱系。通常，将胚胎培养到16或32细胞阶段，其中每个细胞的组织命运可重复映射6，7，17。胚胎细胞是根据形态、位置和参考它们的命运图来识别的。对于单细胞分析，通过手动解剖分离鉴定的细胞，或将其细胞内内容物收集到毛细管移液管中并沉积在 5 μL 的 0.5 mM 碳酸氢铵中。将所得样品储存在-80°C直至分析（图1）18，19，20，21。对于细胞谱系分析，将鉴定的细胞注射谱系示踪剂，并在发育的关键阶段（例如，在原肠胚形成期间研究组织诱导，在神经形成后研究组织承诺）分离其后续克隆。在下文中，概述了通过解剖或FACS对已鉴定细胞谱系进行荧光标记的步骤。
- 培养胚胎
- 按照既定方案通过自然交配或 体外 受精 （IVF） 获得胚胎12.
注意：自然交配在逻辑上更简单，保留成年雄性青蛙，并在不同的发育阶段产生胚胎，而IVF为需要准确分期的实验提供发育同步的胚胎。 - 将胚胎脱果冻。通过用脱果冻溶液处理去除胚胎周围的果冻涂层，如其他地方12，16所述。
注意：显微注射和解剖需要进入细胞和组织，需要在 X. laevis 胚胎中进行脱冻。 - 选择具有刻板色素沉着的 2 细胞胚胎16，22。
注意：此步骤对于确保细胞及其谱系鉴定的准确性和可重复性非常重要。 - 将胚胎培养到所需的发育阶段。将脱冻胚胎转移到含有1x SS的培养皿中，并在14-25°C之间孵育以控制发育速度。
注意：显影的温度依赖性是可重现的，并在Xenbase23（www.xenbase.org）上提供X. laevis的图表。在不同温度下培养成批的胚胎可以进入交错的发育阶段。这样做有助于分配给定时间可用于实验的胚胎数量。 - 监测胚胎的切割模式，并选择具有刻板色素沉着和切割模式的胚胎进行显微注射16.
注意：选择16细胞和32细胞胚胎时，请确保细胞切割对称，以实现可重复的谱系追踪。
- 按照既定方案通过自然交配或 体外 受精 （IVF） 获得胚胎12.
- 标记感兴趣的单元格
- 设置含有谱系示踪剂溶液的注射针。将显微注射针安装到由多轴显微操纵器控制的微量移液器支架中。
- 将微量移液器支架连接到微量进样器。如其他地方所述，通过施加负压来用谱系示踪剂填充针头16。 图1A 举例说明了设置。
- 校准针头。调整针尖的大小和注射时间，以提供~1nL的谱系示踪剂溶液，按照其他地方可用的方案在（矿物）油中测量16。
注意：尖端较宽的毛细血管往往会损坏细胞膜，导致亚细胞内容物和注射的谱系示踪剂泄漏，而尖端较小的毛细血管容易堵塞。针尖外径为 ~10 μm 的毛细管是理想的，需要在 ~300 ms 内使用 40 psi 的压力脉冲才能提供 ~1 nL。 - 用3%Ficoll溶液淹没显微注射粘土培养皿，并使用移液管将~10个胚胎转移到粘土培养皿中。使用毛环将每个胚胎引导到孔中并轻轻定位它们，使感兴趣的目标细胞与微针成直角。
- 根据 X. laevis 组织命运图鉴定感兴趣的谱系的前体细胞。例如， 图1 展示了基于在32细胞胚胎（左和右D111 细胞）中注射其前体细胞的神经外胚层克隆的标记。
注意：16-6和32细胞7，8胚胎的详细命运图可通过Xenbase23在交互式平台上获得。在使用胚胎进行谱系追踪实验时，确保胚胎上的刻板色素沉着和切割非常重要。 - 如前所述，向感兴趣的细胞注射~1nL的荧光葡聚糖或~200pg的mRNA。
注意：使用10，000-40，000 MW的葡聚糖偶联物。较小的葡聚糖偶联物可以通过间隙连接，而较大的葡聚糖偶联物可能无法均匀地扩散到注射的细胞中。计划在~10个胚胎中注射细胞，以获得足够的组织进行蛋白质组学分析。 - 在体视显微镜下确认细胞标记的成功。确保仅注入预期的细胞。按照机构政策丢弃含有受伤或错误标记细胞的胚胎。
注意：由于 X. laevis 在许多非自然环境中具有侵入性，因此在丢弃胚胎之前，可以冷冻胚胎以确保致命性。
- 分离标记的细胞后代
- 将注射的胚胎转移到培养皿中的0.5x SS中，并在14-25°C之间培养，直到达到所需的发育阶段。
注意：请查阅Xenbase上报告的胚胎分期的既定协议。 - 将3-5个胚胎转移到带有0.2x SS溶液的琼脂培养皿中进行显微切割。
注意：将SS溶液的盐浓度从0.5x降低到0.2x有助于在解剖过程中分离细胞。 - 使用两个锋利的镊子轻轻去除胚胎周围的卵黄碱膜。
注意：为使感兴趣的克隆免受损坏，请从荧光标记克隆的另一侧剥离膜。 - 通过手动解剖（步骤3.3.5-3.3.6）或FACS（步骤3.3.7-3.3.8）分离标记的克隆，如下所示。
- 使用镊子从胚胎中解剖标记的克隆。
注意：其他工具，如显微手术剪刀、钨针或眉毛刀，可用于解剖标记的克隆，详见其他部分 16。 - 用0.5-10μL移液管收集解剖的组织，并将其放入微量离心瓶中。使用移液器吸出收集的组织周围的培养基以限制样品中的盐分，这会干扰后续步骤中的HRMS分析。
注意：在工作流程的后续步骤中，使用可最大限度地减少蛋白质吸附到塑料表面上的样品瓶，以最大程度地减少样品瓶表面上的蛋白质损失。 - 要通过 FACS 进行分离，将 ~5-8 个脱梧胚胎转移到含有 ~5 mL Newport 2.0 缓冲液的 12 孔板的每个孔中。通过在室温下以80rpm的转速将板章动20-30分钟来解离胚胎13。
注意：年龄超过22期的胚胎/幼虫具有丰富的细胞外基质蛋白，使得解离成单独的细胞变得困难。如其他地方所述，可以采用其他酶法方法将组织与较老的胚胎解离，如其他部分所述24。 - 使用FACS从悬浮液中纯化荧光标记的细胞，如其他地方所述24。
- 通过离心沉淀细胞并弃去上清液。
注意：使用低离心速度（400 × g）和温度（4°C）以防止细胞裂解。如果使用牛血清白蛋白（BSA）进行FACS，请清洗细胞沉淀以减少HRMS检测过程中的BSA干扰。将细胞轻轻重悬于1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后再次离心至沉淀冲洗的细胞。除去上清液PBS液体。 - 通过将样品瓶放在干冰或液氮上来快速冷冻分离的细胞。
注意：在处理步骤中保持样品（组织或细胞）冷却（例如，在冰上）。用尽可能少的培养基冷冻细胞，以促进下游处理。 - 将样品储存在-80°C直至HRMS分析。
- 将注射的胚胎转移到培养皿中的0.5x SS中，并在14-25°C之间培养，直到达到所需的发育阶段。
4. 通过质谱分析蛋白质
分离的组织或细胞的蛋白质组学表征基于HRMS中的一系列既定步骤。 图2 说明了生物分析工作流程的步骤。此处使用的样本收集方案与蛋白质组学的自下而上的11、中间向下的 25 或自上而下的26 工作流程兼容。在下文中，描述了本研究中使用的自下而上的策略，该策略已被证明是灵敏的，定量的，并且适用于不同类型的质谱仪。提取并酶消化蛋白质后，分离所得肽，然后进行HRMS分析。
- 处理组织/单细胞
- 对于CE的单细胞分析，将样品加热至60°C~15分钟以使蛋白质变性，然后将样品平衡至室温（RT，~5分钟）18，21。
注意：与使用组织不同，跳过还原和烷基化步骤以限制单细胞样品制备过程中的蛋白质损失。可以采用过滤器辅助样品制备（FASP）27，28，其他单罐策略29和微流体方法30来最大程度地减少样品制备过程中的蛋白质损失。 - 对于 nanoLC 分析，在 50 μL 裂解缓冲液（~100 μg 总蛋白）中裂解多达 5 个解剖组织。通过上下移液几次来促进该过程。
- 将裂解物在4°C孵育10分钟，然后在4°C下以4，500× g 离心沉淀细胞碎片和卵黄血小板。 将上清液转移到干净的微量离心瓶中，并加入10%SDS，以获得裂解物中1%SDS的终浓度（v / v）。
- 对于组织，请遵循步骤4.1.5-4.1.7。
- 向裂解物中加入0.5M二硫苏糖醇以获得~25mM的终浓度（例如，2.5μL的0.5M二硫代苏糖醇到50μL裂解物中），并将裂解物在60°C下孵育30分钟以化学还原蛋白质中的二硫键。
- 加入0.5M碘乙酰胺以获得裂解物中~75mM的终浓度，并将混合物在室温下在黑暗中孵育15分钟（图2）。
- 加入与初始体积相同的 0.5 M 二硫苏糖醇（例如，将 2.5 μL 0.5 M 二硫代苏糖醇加入 50 μL 裂解物中）以淬灭烷基化反应中残留的反应物。
注意：碘乙酰胺和二硫苏糖醇在直接接触时会导致严重的皮肤和眼睛损伤。处理这些化学品时，请使用适当的个人防护用品。 - 通过沉淀纯化蛋白质。氯仿-甲醇基沉淀性能良好31.该协议也适用于其他类型的降水方法32。
注意：对于关注蛋白质损失的单细胞分析，请跳过CE-HRMS的沉淀步骤。 - 在真空浓缩器（4-37°C）中干燥蛋白质沉淀物，然后将提取的蛋白质组重悬于50μL的50mM碳酸氢铵中。使用总蛋白质比色测定法估计蛋白质浓度，以确定消化所需的酶量（例如，二辛可宁酸蛋白质测定）。
- 将蛋白质消化成肽。加入胰蛋白酶（1μg/μL储备液）以获得1：50的蛋白酶：蛋白质比例，并将混合物在37°C下孵育长达5小时对于单细胞样品和长达14小时对于组织样品。有关反应，请参阅供应商特定的建议。
注意：用胰蛋白酶消化超过14小时或更高浓度可能会引入对蛋白质序列非特异性的切割，从而挑战蛋白质鉴定33。 - 使用比色测定法定量总肽浓度。
- 可选：对于多重定量，请按照供应商特定的说明，使用不同的同量异位质量数标签标记每个样品中的肽。每个肽样品按相等比例混合条形码肽。
注意：确保准确的标记和混合，以避免定量偏差。对于数量有限的样品或单细胞样品，可以包括由混合组织/细胞组成的基于TMT的载体通道，以最大限度地减少后续分离步骤中的样品损失，并提高低丰度蛋白质的灵敏度34。 - 可选：脱盐肽，用于去除 C18 反相离心柱/尖端上的盐和污染物（例如，未反应的同量异位质量标签试剂），以保护 LC-MS 系统。
- 可选：对肽混合物进行分级分离（例如，中等或高pH反相分级分离），以便通过手动或自动平台更深入地检测蛋白质组。使用含有吸头的C18固定相分馏少量（1-10 μg）肽消化物。
- 在真空浓缩器中在60°C下干燥肽混合物。
- 将肽混合物储存在-80°C直至测量。
- 对于CE的单细胞分析，将样品加热至60°C~15分钟以使蛋白质变性，然后将样品平衡至室温（RT，~5分钟）18，21。
- 分离肽
注意：提取和酶消化蛋白质后，所得肽通过nanoLC或CE分离，并通过ESI电离，通过串联HRMS进行测序。反相 nanoLC 分离是每次分析积累 ~150 ng 至 ~1 μg 肽的理想选择。CE 为从飞克级到 <100 ng. Various custom-built and commercial CE-ESI interfaces allow for ready coupling of CE to HRMS with robust performance35 并越来越多地用于单细胞分析18,36,37.- 要使用 CE 进行分离，请执行以下步骤 4.2.2-4.2.7。
注意：下文将介绍如何使用定制的CE平台来测量肽。早期提供了构建和使用此CE仪器的协议38，以及小分子使用的可视化实验20。或者，这些测量可以在商用CE系统上进行，例如AB SCIEX CESI，安捷伦7100或同等产品。 - 将蛋白质消化物复溶在 1-2 μL 样品溶剂中，涡旋以混合样品，并以 10，000 x g 离心 2 分钟以沉淀细胞碎片。
注意：去除细胞碎片可最大程度地减少堵塞CE毛细管的可能性，从而延长分离系统的使用寿命并提高测量吞吐量。 - 通过用BGE冲洗CE毛细管来初始化CE-ESI仪器。
- 使用已知标准品（例如细胞色素 C 或 BSA 消化物、血管紧张素肽）验证仪器性能。
注意：在测量珍贵样品之前，建议从质量精度、检测灵敏度、重现性和定量的线性动态范围方面评估仪器。有关 CE-ESI-MS 性能验证和故障排除的其他说明，请参见18、20、38 等内容。 - 将~1-10 nL的样品注入CE分离毛细管中。
注意：本研究使用~1 m长的熔融石英毛细管（40/110μm内/外径）和电动泵送护套流设置。商用CE仪器通常需要在微量瓶中取出5-10 μL样品进行注射。定制的CE平台18，38 与沉积到样品加载微量瓶中的~250 nL至1 μL样品兼容。 - 将CE分离毛细管的入口端转移到BGE中。
- 通过逐渐增加CE分离电压从接地开始电泳分离（例如，在1分钟内逐步增加）。电流低于 ~10 μA 的 20-28 kV 电位可确保仪器性能稳定且可重现。
- 要使用nanoLC分离，请遵循步骤4.2.9-4.2.12。
- 将肽样品重悬于流动相A中。样品的浓度及其进样体积取决于可用的液相色谱系统和色谱柱。在本研究中，将~250 ng-1 μg蛋白质消化物注入C18填充床柱（75 μm内径，2 μm粒径，100 Å孔，25 cm长分离柱）上的1-20 μL样品体积中。
- 将样品转移到液相色谱瓶中。
注意：确保小瓶中没有气泡，这可能会损坏分析柱。带插入物的小瓶可用于小体积组织或单细胞样品。 - 将~200 ng至2 μg肽样品加载到C18分析柱上。
注意：可选择将肽加载到捕集柱上，以便在分析分离之前进行脱盐。例如，C18捕集柱内径为0.1 mm，粒径为5 μm，孔径为100 Å，长度为20 mm。在分离梯度开始之前，用100%缓冲液A以5μL/min的流速脱盐肽5分钟。 - 使用梯度洗脱分离肽。在 300 nL/min 的流速下，本研究中使用的 120 分钟梯度如下：0-5 分钟 2% B、5-85 分钟 2-35% B、86-90 分钟 70% B、91-120 分钟 2% B。
- 要使用 CE 进行分离，请执行以下步骤 4.2.2-4.2.7。
- 通过ESI电离肽
注意：CE或nanoLC毛细管通常耦合到ESI源中进行电离。用于超灵敏检测的微流（钝尖）和纳米流（锥形尖端39 和电动泵浦鞘流36 设计）CE-ESI 接口之前已经开发过。- 将分离肽供应到电喷雾离子源中，以便使用商业或定制的ESI接口进行电离。对于 非洲爪蟾 胚胎中的单细胞CE-ESI-MS分析，请使用电动泵浦低流量界面，其中CE毛细管出口被封闭在拉扯的硼硅酸盐发射器中。
- 使用相机检查通过电喷雾发射器的液体流量，并目视检查设置是否存在可能的泄漏。
- 将电喷雾电压设置为 ~2.5 kV 以启动 ESI 源（相对于接地）。
- 通过监测总离子电流，确保用于HRMS分析的纳米喷雾稳定。调整电喷雾电压和发射器到HRMS入口的距离，以实现稳定的喷雾（总强度的相对标准偏差为<15%）。
- 检测肽
注意：肽的检测遵循同量异位质量标记和未标记肽的不同仪器考虑因素，并且取决于可用质谱仪的类型。本研究根据以下步骤使用轨道三溴质谱仪。- 使用以下设置获取MS1 事件：分析仪，轨道;光谱分辨率，120，000 全宽半最大值 （FWHM）;最长注射时间 （IT），50 毫秒;自动增益控制 （AGC），4 x 105 计数;显微扫描，1.
- 要对肽进行测序，请使用以下设置在离子阱分析仪中对母离子进行片段检测：碎裂模式、高能碰撞解离（HCD）;碰撞气体、氮气;碰撞能量，32%归一化碰撞能量（NCE）;最大 IT，70 毫秒;AGC，1 x 104 计数;显微扫描，1.
- 可选：使用串联/多级HRMS （MS2/MS3）定量TMT标记的肽。对于采用同步母离子选择的MS3 ，典型的仪器设置如下。单阶段（MS1）扫描调查最丰度离子，使用以下参数通过数据依赖性采集解离：MS2 碎裂模式，碰撞诱导解离（CID）;碰撞气体、氦气;碰撞能量，35% NCE;碎片离子分析仪，离子阱以下设置：最大IT，50 ms;AGC，5 x 104 计数;显微扫描，1.选择 10 MS2 碎片离子，并用 HCD 在氮气 （65% NCE） 中碎片化。使用以下设置检测 MS3 碎片离子：轨道分辨率 15，000 FWHM，最大 IT，120 ms;AGC，1 × 105 计数 ;显微扫描，1.
注意：按照供应商的建议，可以对标记的样品使用不同的MS采集方法和参数，如其他部分11，40所述。
- 分析数据
注意：使用先进的生物信息学包对蛋白质进行鉴定和定量。识别的保真度是使用诱饵数据库计算的，以肽和蛋白质水平上的错误发现率（FDR）表示。- 使用商业或开源软件包处理数据（在参考文献41中查看）。将原始数据与通过将 非洲爪蟾 蛋白质组 9.2 与 mRNA 衍生的 PHROG 数据库42 连接起来而准备的数据库进行匹配。
注意：搜索参数为：消化酶，胰蛋白酶;漏诊解理，最多2个;可变修饰，蛋氨酸氧化;静态改性，半胱氨酸氨基甲酰甲基化;母离子质量公差，10 ppm;碎片质量公差，0.6 Da;最小肽长度，5;鉴定保真度，肽和蛋白质的 <1% FDR。在不烷基化为肽的情况下，在数据库搜索期间（例如，用于单细胞分析）排除了氨基甲酰甲基化作为静态修饰。 - 通过无标记43 或基于标记的策略44，45定量蛋白质丰度。
- 可选：注释基因本体的蛋白质。可以使用PantherDB46，Reactome47或Xenbase23 。
- 可选：使用软件包/网络工具（例如跨蛋白质组学管道48、英仙座49 和橙色50）量化细胞/组织类型之间的蛋白质丰度和蛋白质丰度差异。
注：关于实验设计和软件选项的其他考虑因素在其他地方进行了审查，41，51。 - 可选：使用知识库进一步评估结果，例如用于已知蛋白质-蛋白质相互作用的 STRING52 和 BioPlex Display53 ，以及用于磷酸化的 PhosphoSiteplus54 。要分析蛋白质组中表示的基序和域，请使用网络工具，例如简单模块化架构研究（SMART）55。
- 使用商业或开源软件包处理数据（在参考文献41中查看）。将原始数据与通过将 非洲爪蟾 蛋白质组 9.2 与 mRNA 衍生的 PHROG 数据库42 连接起来而准备的数据库进行匹配。
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Representative Results
该协议能够研究单细胞中的蛋白质及其谱系，因为它们在X. laevis胚胎中建立组织。图1说明了该方法在神经组织命运细胞和胚胎中新诱导的神经外胚层中研究蛋白质的一种应用。如图1A所示，生物分析工作流程集成了传统的细胞和发育生物学工具，用于鉴定、注射/吸出细胞和收集标本。图1B显示了使用显微注射器对体内16细胞胚胎中左背动物（D11）细胞的微量探针采样;实验结束后，胚胎成功发育成解剖结构正常的蝌蚪56。大的胚胎细胞（直径~100-250μm）也有利于手动显微切割。图1C中16细胞胚胎中右背动物中线（D11）细胞的解剖。该装置还允许通过将荧光示踪剂注入鉴定的前体来追踪克隆轨迹。如图1D所示，该方法允许通过组织解剖或荧光激活细胞分选（FACS）分离来自左右D111细胞的克隆。这里描述的样本收集策略在空间和时间上具有足够的可扩展性，可以以新的细节研究胚胎发育。
生物分析工作流程集成了HRMS技术，以提高灵敏度和定量（图2）。收集的蛋白质通过自下而上的蛋白质组学方法进行测量。基于正交化学（例如，高pH后低pH反相LC）对样品进行可选分馏，有助于提高检测灵敏度。为了分离肽，痕量样品（<<~100 ng）选择CE，有限量的材料（>>150 ng）选择nanoLC。使用ESI-HRMS对肽进行测序。使用无标记和基于标记的策略对检测到的蛋白质进行定量。简化了单细胞分析的样品处理，例如消除了还原和烷基化的典型步骤，然后进行CE分析，有助于鉴定~400-800种不同的蛋白质。在报道的蛋白质中，有许多具有重要的功能作用，例如含有TCP1亚基3（Cct3），电压依赖性离子通道（Vdac2）和肌酸激酶脑（Ckb）的伴侣蛋白。多变量和统计数据模型帮助我们10，57 和其他人9，58 使用本协议中总结的方法在选定细胞和组织的蛋白质组组成中发现了以前未知的差异。值得注意的是，这些HRMS测量不需要功能探针或提前了解标本的组成，从而支持发现。
在一系列研究中，对X. laevis发育胚胎中鉴定细胞的蛋白质组学状态进行了量化（图3）21。图3A显示了从不同胚胎10解剖的D11细胞之间的基因翻译差异的检测。微量采样CE-ESI-HRMS使我们能够鉴定和定量来自单细胞的多达~700种蛋白质21。将具有代表性的原始HRMS-MS / MS数据从胚胎中D11细胞的技术重复测量中鉴定~400个累积蛋白质存入PRIDE。该方法可扩展到来自其他模式生物（如斑马鱼21）的较小细胞和胚胎。对较小细胞大小的可扩展性使我们能够探索D11后代在活胚胎中及时发育时的时空重组。图3B显示了使用该协议对16，32，64和128细胞胚胎中鉴定的细胞进行亚细胞定量蛋白质组学。蛋白质被分成四组，在克隆发育过程中显示出不同的丰度分布21。
图 3：从亚细胞空间到 马氏弧菌 胚胎克隆组织的协议可扩展性 。 （A）测量已鉴定的整个D11 细胞之间的蛋白质组学差异，揭示细胞间异质性。显示选定蛋白质的基因名称。（B）发育中的D11细胞克隆中细胞蛋白质组的重组。蛋白质动力学的模糊C均值聚类分析（GProx），根据相似的表达模式对蛋白质进行分组。灰度数字表示在每个簇中量化的不同蛋白质的数量。数字经参考文献21，57许可改编。 请点击此处查看此图的大图。
该协议使我们能够在鉴定的发育细胞克隆中进行空间和时间蛋白质组学（图4）。 图4A 展示了标记和分离构成两个组织的细胞克隆的方法的应用，这些细胞克隆在胚胎的神经组织发育和模式化中起重要作用。通过注射荧光葡聚糖标记左右D 112和D212 细胞来追踪大多数Spemann组织者（SO）。 同时，邻近的背动物（D111）细胞被标记以标记大部分神经外胚层（NE）。解剖组织，并按照该协议分析其蛋白质含量。nanoLC-ESI-HRMS 从组织中返回多达 2，000 种不同的蛋白质，包括信号传导，例如 Wnt、Fgf 和 Tgfβ 途径。将具有代表性的原始HRMS-MS / MS数据用于从解剖SO组织的技术重复测量中鉴定~1，800个累积蛋白质，并存放给PRIDE。Wnt途径配体Wnt10a和Wntless（Wls）是一种专门用于Wnt配体分泌的膜蛋白，仅在NE蛋白质组中检测到。发现Wnt途径在SO中受到抑制，这可能解释了SO中检测到的Wnt相互作用蛋白缺乏。这些结果展示了该协议在研究胚胎内谱系特异性差异方面的适用性。
图 4：来自 X. laevis 胚胎中空间组织蛋白质组学的数据分析示例。 （A）通过在32细胞胚胎中的前身D 112和D212中分别注射荧光蛋白mRNA对Spemann组织者（SO）和神经外胚层（NE）组织进行差异标记。（B）SO（红色）和NE（绿色）蛋白质组中前5个代表性过高的生物过程显示出可检测的差异。途径过度表征分析显示了使用邦弗朗尼校正的生物过程。（C）蛋白质结构域富集分析（SMART），揭示SO中DNA和RNA结合基序蛋白的富集。（D）基于检测到的SO蛋白质组预测典型蛋白质-蛋白质相互作用的STRING分析。请点击此处查看此图的大图。
多样化的蛋白质组学数据是评估功能的宝贵信息。蛋白质组学数据可以使用规范知识库进行评估。 如图4B所示，在我们最近的研究中，失调蛋白质的通路分析在SO和NE数据集中都显示出过度代表性的翻译和能量代谢。NE蛋白质组富含与细胞中蛋白质货物的核转运相关的蛋白质，可能表明新建立的NE信号传导后的下游事件（图4C）。 图4D 中的富集分析发现蛋白酶体复合物中的翻译起始，RNA结合和结合上调，表明动态蛋白质周转发展SO的作用。细胞谱系引导的HRMS蛋白质组学在空间和时间上具有可扩展性，并且足够敏感，有助于更好地了解正常和受损发育过程中细胞的分子组织。
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Discussion
该协议能够表征 非洲爪蟾 物种胚胎中已鉴定细胞谱系中的蛋白质表达。该方法源于HRMS，结合了分子鉴定的精湛特异性，无需分子探针即可进行多蛋白检测的能力（通常是数百到数千种不同的蛋白质）以及定量能力。对细胞和发育（神经）生物学中经典工具和工作流程的适应性将HRMS蛋白质组学扩展到令人兴奋的应用，包括脊椎动物X . laevis 胚胎中干细胞分化的整体表征。
这些步骤描述了 X. laevis 胚胎中细胞谱系引导的蛋白质组学。例如，我们展示了对神经命运单细胞及其谱系的分析，并通过公共数据存储库提供相应的CE和nanoLC HRMS数据集（参见PRIDE）。这种方法很容易适应多种细胞类型（和谱系）中蛋白质的时空调控研究。发育中的胚胎中时空引导的蛋白质组学也可以扩展到转录组学和代谢组学研究，以促进分子系统生物学对细胞分化和关键器官（如神经系统）发育的理解。
该协议为生物分析增加了新的维度。细胞培养物，如诱导多能干细胞（iPSC）1，2，有助于测量细胞分化过程中的时间蛋白质组动力学。本研究中详述的方法涉及三维活胚胎中的细胞命运诱导，其中复杂的形态原梯度、平行信号通路和收敛延伸过程协同实现组织诱导和形态发生。在胚胎背景下研究蛋白质组动力学可以提供指导细胞分化的平行机制的信息，这是加深对分化和发育的理解的一个令人兴奋的方向。
这里描述的方法借用了非洲爪蟾物种的实验益处，特别是非洲爪蟾。早期16细胞和32细胞X. laevis胚胎的每个细胞都映射到成年生物体中可重复的组织命运，本质上是细胞在切割阶段胚胎中的空间投影。细胞引导蛋白质组学的可重复性建立在准确的细胞分型之上。我们通过认证胚胎进行刻板的色素沉着和切割来帮助成功，然后再进行描述细胞解剖和谱系追踪的实验16，20。重要的是要注意，卵裂期胚胎的细胞通常在不同程度上有助于不同组织类型的形成;有关它们对每种组织类型的水平贡献的详细信息，请参见 Xenbase23。因此，应根据手头的生物学问题选择要追踪谱系的胚胎阶段和前体细胞。当在较长时间（例如，>1 d）培养胚胎时，应注意去除受损/死亡的胚胎，这反过来可能会降低种群中其他胚胎的活力。
对于成功的HRMS蛋白质组学，应仔细注意细胞/组织收集，蛋白质提取和HRMS测量的分析基础。由于 非洲爪蟾 胚胎是在含有高浓度非挥发性盐的培养基中培养的，这些盐已知会降低HRMS敏感性，因此建议在收集细胞和组织进行蛋白质组学研究时减少吸出的培养基。探索脱盐以推进蛋白质的鉴定和定量是一种很好的做法。在进行HRMS测量之前，应评估CE和LC-ESI-HRMS仪器的分析性能，包括分离、电离、重现性和定量的线性动态范围。通过良好的分析指标，该协议有助于减少生物研究中的动物使用，有助于获得更强大的生化数据集的灵敏度，并增强统计数据分析解释结果的能力。默认情况下，我们使用CE或LC-HRMS分析至少3个技术重复中的每个生物学重复，用于评估技术重现性并加深可检测蛋白质组的覆盖范围。功效分析有助于估计统计功效和设计生物重复大小。建议使用不同的亲本青蛙组，以解释胚胎之间自然发生的生物变异性。
补充资料
HRMS-MS/MS蛋白质组学数据和相关处理文件通过PRIDE60 合作伙伴存储库存入蛋白质组交换联盟，数据集标识符为PXD030059。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢Jie Li（马里兰大学帕克分校）关于胚胎解离和FACS的宝贵讨论。我们感谢Vi M. Quach和Camille Lombard-Banek在先前的研究中为样品制备和数据收集提供的帮助，这些研究举例说明了本协议中强调的蛋白质组学应用。这项工作的部分内容得到了美国国家科学基金会的支持，奖励号为IOS-1832968 CAREER（授予P.N.），美国国立卫生研究院的奖励号为R35GM124755（授予P.N.），马里兰大学 - 国家癌症研究所合作计划（授予P.N.）和COSMOS俱乐部基金会研究奖（授予ABB和L.R.P.）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Scientific | A643-500 | |
| Analytical Column | Thermo Scientific | 164941 | |
| Analytical microbalance | Mettler-Toledo | XSE105DU | |
| Automatic peptide fractionation platform | Agilent | 1260 Infinity II | |
| Borosilicate Capillaries | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| C18 spin columns (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 89870 | |
| Camera ro monitor electrospray | Edmund Optics Inc. | EO-2018C | |
| Combretastatin A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| Commercial CESI system | AB SCIEX | CESI | |
| (Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) | VWR | 97061-492 | |
| Cytochalasin D | Millipore Sigma | C8273 | |
| Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | ThermoFisher Scientific | D22910 | |
| Diothiothreitol | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| Epifluorescence light source | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBing microcentrifuge tubes: protein | Fisher Scientific | 13-698-793 | |
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| Fused silica capillary | Molex | 1088150596 | |
| Heat Block | Benchmark | BSH300 | |
| High pressure liquid Chromatography System | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | |
| High-resolution Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | |
| HPLC caps | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| HPLC Vials | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122275000 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Microcapillary puller | Suttor Instruments | P-2000 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Micropippette puller | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| MS data analysis software, commercial | ProteomeDiscoverer | ||
| MS data analysis software, opensource | MaxQuant | ||
| non-idet 40 substitute | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 87782 | |
| Pierce bicinchoninic acid protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pierce quantitative colorimetric peptide assay | ThermoFisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Trypsin Protease (MS Grade) | Fisher Scientific | PI90058 | |
| Protein LoBind vials | Eppendorf | 0030108434 , 0030108442 |
|
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Refrigerated Incubator | Thermo Scientific | PR505755R/3721 | |
| sodium isethionate | Millipore Sigma | 220078 | |
| sodium pyrophosphate | Sigma Aldrich | 221368-100G | |
| Stainless steel BGE vial | Custom-Built | ||
| Stainless steel sample vials | Custom-Built | ||
| Stereomicroscope (objective 10x) | Nikon | SMZ 1270, SZX18 | |
| Sucrose | VWR | 97063-790 | |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Syringes (gas-tight): 500–1000 µL | Hamilton | 1750TTL | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Trap Column | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl (1 M solution) | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C | Labconco | 7310022 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-Built |
References
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