Summary
نصف هنا توصيفا بروتينيا قائما على قياس الطيف الكتلي لسلالات الخلايا ذات مصائر الأنسجة المعروفة في جنين الفقاريات Xenopus laevis .
Abstract
إن توصيف الأحداث الجزيئية كخلايا تؤدي إلى ظهور الأنسجة والأعضاء يثير إمكانية فهم التطور الطبيعي بشكل أفضل وتصميم علاجات فعالة للأمراض. ومن شأن التكنولوجيات التي تمكن من التحديد الدقيق والقياس الكمي لمختلف أنواع البروتينات وأعدادها الكبيرة أن توفر معلومات لا تزال مفقودة عن الآليات الجزيئية التي تنظم تطور الأنسجة والكائنات الحية في المكان والزمان. هنا ، نقدم بروتوكولا قائما على قياس الطيف الكتلي يتيح قياس آلاف البروتينات في سلالات الخلايا المحددة في أجنة Xenopus laevis (الضفدع). يعتمد هذا النهج على خرائط مصير الخلية القابلة للتكرار والأساليب المعمول بها لتحديد الخلايا وذريتها (الحيوانات المستنسخة) وتسميتها بالفلورسنت وتتبعها وأخذ عينات منها من هذا النموذج لتطور الفقاريات. بعد جمع المحتويات الخلوية باستخدام أخذ العينات المجهرية أو عزل الخلايا عن طريق التشريح أو فرز الخلايا المنشط بالفلورة ، يتم استخراج البروتينات ومعالجتها للتحليل البروتيني من أسفل إلى أعلى. يتم استخدام الكروماتوغرافيا السائلة والرحلان الكهربائي الشعري لتوفير فصل قابل للتطوير للكشف عن البروتين والقياس الكمي باستخدام قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRMS). يتم توفير أمثلة تمثيلية للتوصيف البروتيني للخلايا المصيرية للأنسجة العصبية. بروتينات HRMS الموجهة بنسب الخلايا قابلة للتكيف مع الأنسجة والكائنات الحية المختلفة. إنه حساس ومحدد وكمي بما فيه الكفاية للنظر في الديناميات المكانية والزمانية للبروتين أثناء تطور الفقاريات.
Introduction
إن فهمنا لتمايز الخلايا ونشأة الأنسجة والأعضاء هو نتيجة عقود من الشاشات المستهدفة المعقدة للجينات ومنتجاتها. إن زيادة معرفتنا بجميع الجزيئات الحيوية وكمياتها خلال الأحداث الخلوية المهمة من شأنه أن يساعد في كشف الآليات الجزيئية التي تتحكم في الأنماط المكانية والزمانية لخطة جسم الفقاريات. أصبحت التقنيات التي تمكن من التضخيم الجزيئي والتسلسل قادرة الآن على الإبلاغ بشكل روتيني عن أعداد كبيرة من الجينات والنسخ ، مما يدعم الدراسات القائمة على الفرضيات في البحوث البيولوجية الأساسية والانتقالية. لفهم الأنظمة النامية ، تدعو العلاقة المعقدة بين النسخ والترجمة إلى التحليل المباشر للبروتينات المتعددة وتعديلاتها اللاحقة للترجمة. بدأت البروتينات العالمية التي تستخدم الأنظمة البيولوجية في المختبر ، مثل الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، في تحديد آليات تحريض الأنسجة 1,2. في الكائنات الحية المعقدة ، مثل جنين الفقاريات ، يعتمد التطور على تدرجات المورفوجين في سياق المكان والزمان3. ويترتب على ذلك أن اكتساب المعرفة بالتغيرات البروتينية مع تمايز الخلايا لتشكيل أنسجة متخصصة ، مثل الأنسجة العصبية ، يوفر مفتاحا لإطلاق البرامج الجزيئية التي تتحكم في التطور الطبيعي والمعيب وتوجيه علاجات الجيل التالي.
الضفدع ذو المخالب الفقارية في جنوب إفريقيا (Xenopus laevis) هو نموذج راسخ في البيولوجيا الخلوية والتنموية والعصبية والتجديدية. سلطت جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاءأو الطب 4,5 لعام 2012 التي حصل عليها السير جون جوردون لاكتشاف تعدد قدرات النواة الجسدية الضوء على أهمية هذا النموذج للاكتشافات في الدراسات الأساسية والانتقالية. تتطور أجنة Xenopus خارجيا إلى الأم ، مما يسهل التلاعب المباشر بالخلايا واستنساخ الخلايا والتعبير الجيني على مراحل مختلفة من التطور. مكن التصبغ غير المتماثل وانقسامات الخلايا النمطية من رسم خرائط المصير القابلة للتكرار من الجنين المكون من 16-6 و 32 خلية 7,8. بالنسبة للبروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRMS) ، تشمل المزايا الإضافية للنموذج حجما كبيرا نسبيا (~ 1 مم في القطر) ، والذي ينتج محتوى بروتينيا وفيرا للتحليل (~ 130 ميكروغرام في أجنة مرحلة الانقسام المبكرة ، ~ 10 ميكروغرام من محتوى البروتين في خلايا مفردة من الجنين المكون من 16 خلية)9,10.
في الوقت الحاضر ، HRMS هي التكنولوجيا الرائدة المفضلة للكشف عن البروتينات. تتيح هذه التقنية الكشف المباشر والحساس والمحدد والقياس الكمي للبروتينات المتعددة ، وعادة ما تكون مئات إلى آلاف البروتينات المختلفة11. تتضمن البروتينات من أسفل إلى أعلى بواسطة HRMS سلسلة من الخطوات المترابطة. بعد الاستخراج من عينة الخلية / الأنسجة ، يتم هضم البروتينات بإنزيم محلل للبروتين ، مثل التربسين (البروتينات من أسفل إلى أعلى). يتم فصل الببتيدات الناتجة بناء على خصائصها الفيزيائية والكيميائية المختلفة ، بما في ذلك الكارهة للماء (كروماتوغرافيا السائل ذات الطور العكسي ، LC) ، الشحنة الصافية (كروماتوغرافيا التبادل الأيوني) ، الحجم (كروماتوغرافيا استبعاد الحجم) ، أو الحركة الكهربائية (الرحلان الكهربائي الشعري ، CE). ثم يتم شحن الببتيدات (المتأينة) ، عادة باستخدام التأين بالرش الكهربائي (ESI) ، ويتم الكشف عن أيونات الببتيد وتسلسلها عبر تجزئة الطور الغازي بواسطة نظام إدارة الموارد البشرية الترادفي. يتم تعيين بيانات الببتيد الناتجة إلى بروتين الكائن الحي قيد الدراسة. مع ارتباط شدة إشارة أيون الببتيد الخاصة بالبروتين (البروتيني) بالتركيز ، يمكن إجراء القياس الكمي للبروتين بدون ملصق أو قائم على الملصق (تكميم تعدد الإرسال). تنتج بروتينات HRMS موردا غنيا من المعلومات حول الحالة الجزيئية للنظام قيد الدراسة ، مما يسمح بتوليد الفرضيات ومتابعة الدراسات الوظيفية.
الشكل 1: البروتينات القابلة للتطوير المكاني الزماني التي تمكن بروتينات HRMS الموجهة بنسب الخلية في الجنين النامي (الضفدع). (أ) تصور العينة (1) باستخدام مجهر مجسم (2) لحقن خلية محددة (أقحم) ، باستخدام ماصة دقيقة مصنعة (3) تحت السيطرة من خلال مرحلة الترجمة (4). ب: أخذ عينات تحت خلوية من الخلية D 11 اليسرى المحددة في جنين مكون من16 خلية. ج: تشريح خلية D 11 كاملة من جنين مكون من16 خلية. (د) تتبع الفلورسنت (الأخضر) لنسل D111 الأيسر والأيمن من جنين مكون من 32 خلية لتوجيه تشريح الأديم الظاهر العصبي (NE) في المعدة (المرحلة 10) وعزل النسيج المنحدر من الشرغوف باستخدام FACS. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر للأجنة ، 1.25 مم للقارورة. تم تكييف الأرقام بإذن من المراجع15،19،21،59. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتيح البروتوكول المقدم هنا القياس الكمي القائم على نظام إدارة الموارد البشرية لأعداد كبيرة من البروتينات في الخلايا / الأنسجة المحددة في أجنة X. laevis النامية. يعتمد النهج على التحديد الدقيق للخلايا ، وخرائط مصير الخلية القابلة للتكرار ، والمنهجيات المعمول بها لتتبع سلالات الخلايا في هذا النموذج البيولوجي6،7،8. كما هو موضح في الشكل 1، ندرس البروتينات من الخلايا المفردة عن طريق استخدام تشريح الخلية الكاملة أو أخذ العينات المجهرية الشعرية لشفط المحتوى الخلوي. تسمح لنا مراقبة نسب الخلية بدراسة التطور الزماني المكاني للبروتين حيث تشكل الخلايا الأنسجة أثناء المعدة. يتم تمييز ذرية الخلية بالفلورسنت عن طريق حقن فلوروفور مترافق مع ديكستران خامل أو mRNA للبروتين الفلوري (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر ، أو GFP). يتم عزل النسل المسمى في النقاط الزمنية التطورية المطلوبة. أثناء المعدة ، يمكن عزل الحيوانات المستنسخة الخلوية المتجمعة بإحكام عن طريق التشريح. بعد المعدة ، يمكن توزيع استنساخ الخلايا داخل الجنين بسبب حركات الهجرة ويمكن عزلها عن الأنسجة المنفصلة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS). يتم قياس البروتينات في هذه الخلايا والأنسجة عن طريق البروتينات من أسفل إلى أعلى باستخدام HPLC أو CE للفصل و ESI جنبا إلى جنب HRMS لتحديد الهوية. بروتينات HRMS الموجهة بنسب الخلايا قابلة للتطوير لأحجام وسلالات مختلفة داخل الجنين وهي محددة وحساسة وكميتة. من خلال أمثلة مختارة موضحة هنا ، نوضح أيضا أن هذا البروتوكول قابل للتطوير وقابل للتكيف على نطاق واسع مع أنواع مختلفة من الخلايا وسلالات الخلايا.
الشكل 2: سير عمل التحليل الحيوي. سهل التشريح الدقيق والشفط الشعري ، أو FACS أخذ عينات من محتوى البروتين الخلوي والنسيلي. استنفاد بروتينات صفار البيض الوفيرة وفصلها عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري (CE) أو كروماتوغرافيا السائل ذات التدفق النانوي (LC) حساسية التعريف المعززة (ID) باستخدام التأين الكهربائي (ESI) قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRMS). كشف القياس الكمي عن عدم التنظيم ، وتوفير معلومات جديدة للدراسات القائمة على الفرضيات بالتزامن مع المعلومات المتاحة من علم الوجود الجيني (GO). تم تكييف الأرقام بإذن من المرجع15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التي تضمن الصيانة الإنسانية والتعامل مع الضفادع البالغة Xenopus laevis من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة ماريلاند ، كوليدج بارك (أرقام الموافقة R-DEC-17-57 و R-FEB-21-07).
1. إعداد الحلول
- لعلم الأجنة
- قم بإعداد 1x و 0.5x و 0.2x محلول شتاينبرغ (SS) ، ثم قم بتعقيمها (120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) للعقم باتباع البروتوكولات القياسية12.
- قم بإعداد 3٪ (w / v) Ficoll في 1x SS معقم باتباع البروتوكولات القياسية12.
- لإزالة الهلام ، قم بإعداد محلول السيستين الطازج بنسبة 2٪ (وزن / حجم) واضبط درجة الحموضة إلى 8 عن طريق إضافة محلول هيدروكسيد الصوديوم 10 أمتار بالتنقيط.
تنبيه: التعرض للسيستين يمكن أن يسبب تلف الجلد والجهاز التنفسي. هيدروكسيد الصوديوم هو مادة أكالة يمكن أن تسبب أضرارا جسيمة للجلد والعينين عند التعرض المباشر. استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) عند التعامل مع هذه المواد الكيميائية ، مثل القفازات ومعطف المختبر. - بالنسبة لمقتفي النسب ، قم بإعداد 0.5٪ (v / v) من ديكستران الفلورسنت في ماء منزوع الأيونات معقم. بدلا من ذلك ، قم بإعداد محلول 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر من mRNA للبروتينات الفلورية في الماء منزوع الأيونات المعقم (على سبيل المثال ، GFP).
- لفصل الخلايا ، قم بإعداد نيوبورت 2.0 عازلة تحتوي على 0.1 M إسيثيونات الصوديوم ، 20 mM بيروفوسفات الصوديوم ، و 10 mM CAPS ، ثم ارفع الرقم الهيدروجيني إلى 10.513.
تنبيه: التعرض لبيروفوسفات الصوديوم يمكن أن يسبب تهيج الجلد والعين. استخدم معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع هذه المواد الكيميائية.
- للبروتينات من أسفل إلى أعلى
- قم بإعداد المخزن المؤقت لتحلل الخلية ليشمل: 250 مللي مول سكروز ، 1٪ نونيديت P-40 بديل (وزن / حجم) ، 20 مللي متر Tris-HCl ، 5 mM EDTA ، 10 μM سيتوكلاسين D ، و 10 ميكرومتر كومبريتاستاتين 4A. قم بإعداد مخزون من 10٪ (وزن / حجم) كبريتات دوديسيل الصوديوم14,15.
ملاحظة: تم اختيار Tris-HCl لتقليل تلوث HEPES أثناء تدفق النانو LC (nanoLC) - HRMS.
تنبيه: التعرض لبديل Nonidet P-40 يمكن أن يسبب تهيج الجلد. السيتوكلاسين D ماسخ إذا تم استهلاكه والكومبريتاستاتين شديد السمية عند التعرض المباشر. استخدم معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع هذه المواد الكيميائية. - لفصل الببتيدات بواسطة CE ، قم بإعداد المذيبات التالية (v / v): مذيب عينة ، 75٪ أسيتونيتريل (ACN) يحتوي على 0.05٪ حمض الخليك (AcOH) في الماء ؛ محلول غمد ، 10٪ ACN يحتوي على 0.05٪ AcOH في الماء ؛ المنحل بالكهرباء الخلفية (BGE) ، 25٪ ACN تحتوي على 1 M حمض الفورميك (FA) في الماء.
تنبيه: AcOH و FA سامة عند استنشاقها أو استهلاكها ويمكن أن تسبب تلفا خطيرا للجلد والعين عند التعرض المباشر. استخدم معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع هذه المواد الكيميائية. - لفصل الببتيدات عن طريق nanoLC عكس الطور ، تحضير (v / v): المرحلة المتنقلة A (مائي) ، الماء الذي يحتوي على 0.1٪ FA ؛ المرحلة المتنقلة B (العضوية) ، 0.1 ٪ FA في ACN.
ملاحظة: يجب تحضير جميع المخاليط باستخدام مذيبات من الدرجة LC-MS لتقليل التداخلات الكيميائية أثناء اكتشاف نظام إدارة الموارد البشرية.
- قم بإعداد المخزن المؤقت لتحلل الخلية ليشمل: 250 مللي مول سكروز ، 1٪ نونيديت P-40 بديل (وزن / حجم) ، 20 مللي متر Tris-HCl ، 5 mM EDTA ، 10 μM سيتوكلاسين D ، و 10 ميكرومتر كومبريتاستاتين 4A. قم بإعداد مخزون من 10٪ (وزن / حجم) كبريتات دوديسيل الصوديوم14,15.
2. إعداد الأدوات للحقن المجهري والتشريح
- لتحريك الأجنة وتوجيهها برفق ، قم بعمل حلقات شعر عن طريق تثبيت شعر نظيف في ماصة باستور كما هو موضح في مكان آخر16.
- للحقن المجهري ، قم بتصنيع الإبر عن طريق سحب الشعيرات الدموية البورسليكات (1 مم / 500 ميكرومتر قطر خارجي / داخلي) باستخدام مجتذب ماصة كما هو موضح في مكان آخر16.
ملاحظة: هنا ، تم استخدام مجتذب ماصة P-1000 مع الإعدادات التالية لتصنيع الإبر: الحرارة ، 495 ؛ سحب ، 30 ، السرعة ، 60 ؛ الوقت ، 150 ؛ الضغط ، 200. - مع الملاحظة تحت المجهر المجسم ، قم بقطع طرف الشعيرات الدموية باستخدام زوج من الملقط الحاد لتصنيع الشعيرات الدموية بشكل أساسي في إبرة (دقيقة) (على سبيل المثال ، Dumont # 5) 16.
تنبيه: الشعيرات الدموية المسحوبة حادة جدا ويجب التعامل معها بحذر.
ملاحظة: يجب أن يكون طرف الإبرة حادا بدرجة كافية (القطر الخارجي 10-15 ميكرومتر) ليكون قادرا على اختراق الخلية بأقل قدر من الضرر لغشاء الخلية حتى لا يتسرب المحتوى داخل الخلايا ويمكن للخلية أن تلتئم وتستمر في البقاء قابلة للحياة. - لعقد الأجنة أثناء الحقن المجهري ، قم بإعداد الآبار في طبق مملوء بالطين. في طبق بتري 15 مم ، بصمة ~ 1 مم قطر × ~ 0.5 مم عميق في طين البلاستيسين غير السام كما هو موضح في مكان آخر16.
- للتشريح الدقيق ، قم بإعداد الأطباق المغلفة بالأغاروز. اصنع 2٪ أغاروز في 1x SS وقم بتعقيمه لتعقيم المحلول (120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة). املأ أطباق بتري 60 مم في منتصف الطريق ، واترك الأطباق تتصلب. اصنع آبارا بقطر ~ 1 مم × ~ 0.5 مم باستخدام أداة ماصة باستور الكروية كما هو موضح سابقا16.
3. عزل سلالة الخلية
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية لعزل الخلايا المفردة المحددة و / أو سلالات الخلايا المنحدرة منها. عادة ، يتم استزراع الجنين إلى مرحلة 16 أو 32 خلية ، حيث يتم تعيين مصائر الأنسجة لكل خلية بشكل متكرر6،7،17. يتم تحديد الخلايا الجنينية بناء على التشكل والموقع وبالإشارة إلى خرائط مصيرها. لتحليل الخلية الواحدة ، يتم عزل الخلايا المحددة عن طريق التشريح اليدوي ، أو يتم جمع محتوياتها داخل الخلايا في ماصة شعرية وترسب في 5 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 0.5 mM. يتم تخزين العينة الناتجة عند -80 درجة مئوية حتى التحليل (الشكل 1)18،19،20،21. لتحليل نسب الخلية ، يتم حقن الخلايا المحددة بمقتفي النسب ، ويتم عزل الحيوانات المستنسخة اللاحقة في المراحل الرئيسية من التطور (على سبيل المثال ، أثناء المعدة لدراسة تحريض الأنسجة ، بعد العصبية لدراسة التزام الأنسجة). في ما يلي ، تم تحديد الخطوات لتسمية سلالة الخلايا المحددة بالفلورسنت للعزل عن طريق التشريح أو FACS.
- زراعة الأجنة
- الحصول على الأجنة عن طريق التزاوج الطبيعي أو الإخصاب في المختبر (IVF) باتباع البروتوكولات المعمول بها12.
ملاحظة: التزاوج الطبيعي أبسط من الناحية اللوجستية ، ويجنب ذكور الضفادع البالغة ، وينتج أجنة في مراحل نمو مختلفة ، بينما يوفر التلقيح الاصطناعي أجنة متزامنة تنمويا للتجارب التي تتطلب تدريجا دقيقا. - ديجيل الأجنة. قم بإزالة طبقة الهلام المحيطة بالأجنة عن طريق العلاج بمحلول إزالة الهلام كما هو موضح في مكان آخر12،16.
ملاحظة: تتطلب الحقن المجهرية والتشريح الوصول إلى الخلايا والأنسجة ، مما يستلزم إزالة الهلام في أجنة X. laevis. - حدد أجنة 2-cell مع تصبغ نمطي 16,22.
ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لضمان الدقة والتكرار في تحديد الخلية ونسبها. - زراعة الأجنة إلى مرحلة النمو المطلوبة. نقل الأجنة dejellied إلى طبق بتري يحتوي على 1x SS واحتضانها بين 14-25 درجة مئوية للتحكم في سرعة التطور.
ملاحظة: الاعتماد على درجة حرارة التطور قابل للتكرار ومخطط ل X. laevis ، متاح على Xenbase23 (www.xenbase.org). يسمح استزراع دفعات من الأجنة في درجات حرارة مختلفة بمراحل نمو مذهلة. يساعد القيام بذلك في توزيع عدد الأجنة المتاحة في وقت معين للتجربة. - مراقبة نمط انشقاق الأجنة واختيار الأجنة ذات التصبغ النمطي وأنماط الانقسام للحقن المجهري16.
ملاحظة: عند اختيار أجنة مكونة من 16 و 32 خلية ، تأكد من أن انقسامات الخلايا متناظرة لتتبع النسب القابل للتكرار.
- الحصول على الأجنة عن طريق التزاوج الطبيعي أو الإخصاب في المختبر (IVF) باتباع البروتوكولات المعمول بها12.
- تسمية الخلية (الخلايا) ذات الاهتمام
- قم بإعداد إبرة الحقن التي تحتوي على محلول تتبع النسب. قم بتركيب إبرة الحقن المجهري في حامل ماصة دقيقة يتم التحكم فيها بواسطة مناولة دقيقة متعددة المحاور.
- قم بتوصيل حامل الماصة الدقيقة بحاقن دقيق. املأ الإبرة بمقتفي النسب عن طريق تطبيق الضغط السلبي كما هو موضح في مكان آخر16. يوضح الشكل 1 أ الإعداد.
- معايرة الإبرة. اضبط حجم طرف الإبرة ووقت الحقن لتقديم ~ 1 nL من محلول تتبع النسب ، المقاس بالزيت (المعدني) باتباع بروتوكول متاح في مكان آخر16.
ملاحظة: تميل الشعيرات الدموية ذات الطرف الأوسع إلى إتلاف غشاء الخلية ، مما يتسبب في تسرب المحتويات تحت الخلوية وتتبع النسب المحقون ، في حين أن الشعيرات الدموية ذات الأطراف الأصغر عرضة للانسداد. تعتبر الشعيرات الدموية ذات القطر الخارجي لطرف ~ 10 ميكرومتر مثالية ، وتتطلب نبضة ضغط 40 رطل لكل بوصة مربعة تزيد عن ~ 300 مللي ثانية لتقديم ~ 1 nL. - اغمر طبق الطين بالحقن الدقيق بمحلول Ficoll 3٪ وانقل ~ 10 أجنة إلى طبق الطين باستخدام ماصة النقل. استخدم حلقة شعر لتوجيه كل جنين إلى بئر ووضعه برفق بحيث تكون الخلية المستهدفة موضع الاهتمام في الزاوية اليمنى للإبرة الدقيقة.
- تحديد الخلية السلائف للسلالة محل الاهتمام باتباع خرائط مصير الأنسجة X. laevis. على سبيل المثال ، يوضح الشكل 1 وضع العلامات على استنساخ الأديم الظاهر العصبي بناء على حقن خلايا السلائف في أجنة مكونة من 32 خلية (خلايا D111 اليمنى واليسرى).
ملاحظة: تتوفر خرائط مصير مفصلة للأجنة المكونة من 16-6 و 32 خلية 7,8 في منصة تفاعلية عبر Xenbase23. من المهم ضمان التصبغ والانقسامات النمطية على الأجنة عند استخدامها لتجارب تتبع السلالة. - حقن الخلية (الخلايا) ذات الأهمية ب ~ 1 nL من ديكستران الفلورسنت أو ~ 200 بيكوغرام من mRNA كما هو موضح سابقا16.
ملاحظة: استخدم اتحادات ديكستران التي تتراوح بين 10,000 و40,000 ميجاوات. يمكن أن تمر اتحادات ديكستران الأصغر عبر تقاطعات الفجوة ، في حين أن اتحادات ديكستران الأكبر قد لا تنتشر بالتساوي في الخلية المحقونة. خطة لحقن الخلايا في ~ 10 أجنة للحصول على أنسجة كافية للتحليلات البروتينية. - تأكيد نجاح وضع العلامات الخلوية تحت المجهر المجسم. تأكد من حقن الخلية المقصودة فقط. تجاهل الأجنة التي تحتوي على خلايا مصابة أو مصنفة بشكل غير صحيح وفقا للسياسات المؤسسية.
ملاحظة: نظرا لأن X. laevis غازي في العديد من البيئات غير الطبيعية ، فقد يتم تجميد الأجنة لضمان الفتك قبل التخلص من الأجنة.
- عزل ذرية الخلية المسماة
- نقل الأجنة المحقونة إلى 0.5x SS في طبق بتري واستزراعها بين 14-25 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى مرحلة النمو المطلوبة.
ملاحظة: استشر البروتوكولات المعمول بها لتحديد مرحلة الأجنة المبلغ عنها على Xenbase. - نقل 3-5 أجنة إلى طبق أجار مع محلول 0.2x SS للتشريح المجهري.
ملاحظة: يساعد تقليل تركيز الملح في محلول SS من 0.5x إلى 0.2x على فصل الخلايا أثناء التشريح. - استخدم ملقطين حادين لإزالة غشاء فيتيلين المحيط بالجنين برفق.
ملاحظة: لتجنيب استنساخ الفائدة من التلف ، قشر الغشاء من الجانب الآخر من النسخة ذات العلامات الفلورية. - اعزل النسخة المسماة عن طريق التشريح اليدوي (الخطوات 3.3.5-3.3.6) أو FACS (الخطوات 3.3.7-3.3.8) على النحو التالي.
- استخدم ملقط لتشريح الاستنساخ المسمى من الجنين.
ملاحظة: يمكن استخدام أدوات أخرى مثل مقص الجراحة المجهرية أو إبر التنغستن أو سكاكين شعر الحاجب لتشريح النسخة المسماة ، كما هو مفصل في مكان آخر16. - اجمع الأنسجة المشرحة باستخدام ماصة 0.5-10 ميكرولتر وقم بإيداعها في قارورة طرد مركزي دقيقة. باستخدام ماصة النقل ، قم بشفط الوسائط المحيطة بالأنسجة المجمعة للحد من الأملاح في العينة ، والتي تتداخل مع تحليل HRMS في خطوات لاحقة.
ملاحظة: استخدم القوارير التي تقلل من امتصاص البروتين على الأسطح البلاستيكية لتقليل فقد البروتين على أسطح القارورة أثناء الخطوات اللاحقة من سير العمل. - للعزل بواسطة FACS ، قم بنقل ~ 5-8 أجنة منحرفة إلى كل بئر من صفيحة 12 بئرا تحتوي على ~ 5 مل من المخزن المؤقت Newport 2.0. فصل الأجنة عن طريق تغذية اللوحة عند 80 دورة في الدقيقة لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارةالغرفة 13.
ملاحظة: تحتوي الأجنة / اليرقات الأقدم من المرحلة 22 على بروتينات مصفوفة خارج الخلية وفيرة ، مما يجعل التفكك إلى خلايا منفصلة أمرا صعبا. يمكن تكييف الأساليب الأنزيمية الإضافية لفصل الأنسجة عن الأجنة الأكبر سنا كما هو موضح في مكان آخر24. - تنقية الخلايا الموسومة بالفلورسنت من التعليق باستخدام FACS كما هو موضح في مكان آخر24.
- خلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي وتجاهل طاف.
ملاحظة: استخدم سرعة طرد مركزي منخفضة (400 × جم) ودرجة حرارة (4 درجات مئوية) لمنع تحلل الخلايا. في حالة استخدام ألبومين مصل الأبقار (BSA) ل FACS ، اغسل حبيبات الخلية لتقليل تداخل BSA أثناء اكتشاف HRMS. أعد تعليق الخلايا برفق في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى إلى الخلايا المغسولة بالحبيبات. قم بإزالة سائل PBS الطافي. - قم بتجميد الخلايا المعزولة بسرعة عن طريق وضع قارورة العينة على الثلج الجاف أو النيتروجين السائل.
ملاحظة: احتفظ بالعينات (الأنسجة أو الخلايا) باردة (على سبيل المثال ، على الجليد) أثناء خطوات المعالجة. قم بتجميد الخلايا بأقل قدر ممكن من الوسائط حول العينة لتسهيل المعالجة النهائية. - قم بتخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى تحليل نظام إدارة الموارد البشرية.
- نقل الأجنة المحقونة إلى 0.5x SS في طبق بتري واستزراعها بين 14-25 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى مرحلة النمو المطلوبة.
4. تحليل البروتينات عن طريق قياس الطيف الكتلي
يعتمد التوصيف البروتيني للأنسجة أو الخلايا المعزولة على سلسلة من الخطوات المعمول بها في نظام إدارة الموارد البشرية. يوضح الشكل 2 خطوات سير عمل التحليل الحيوي. يتوافق بروتوكول جمع العينات المستخدم هنا مع سير عمل البروتينات من أسفل إلىأعلى 11 أو من أسفل إلىأسفل 25 أو من أعلى إلى أسفل26 . في ما يلي ، يتم وصف الإستراتيجية من أسفل إلى أعلى المستخدمة في هذه الدراسة ، والتي أثبتت أنها حساسة وكمية وقابلة للتكيف مع أنواع مختلفة من مطياف الكتلة. بعد استخراج البروتينات وهضمها إنزيميا ، يتم فصل الببتيدات الناتجة ، يليها تحليل HRMS.
- معالجة الأنسجة / الخلايا المفردة
- لتحليل الخلية الواحدة بواسطة CE ، قم بتسخين العينة إلى 60 °C لمدة ~ 15 دقيقة لتشويه البروتينات ، ثم موازنة العينة مع درجة حرارة الغرفة (RT ، ~ 5 دقائق) 18,21.
ملاحظة: على عكس العمل مع الأنسجة، يتم تخطي خطوات الاختزال والألكلة للحد من فقد البروتين أثناء تحضير العينة من الخلايا المفردة. يمكن اعتماد تحضير العينة بمساعدة المرشح (FASP) 27،28 ، واستراتيجيات الوعاء الفردي الأخرى29 ، ونهج الموائع الدقيقة30 لتقليل فقد البروتين أثناء تحضير العينة. - للتحليل بواسطة nanoLC ، تحلل ما يصل إلى 5 أنسجة تشريح في 50 ميكرولتر من محلول التحلل (~ 100 ميكروغرام من البروتين الكلي). قم بتسهيل العملية عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل عدة مرات.
- احتضان المحللة عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتجميع بقايا الخلايا والصفائح الدموية المحية عن طريق الطرد المركزي عند 4500 × جم عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى قارورة طرد مركزي دقيقة نظيفة وأضف 10٪ SDS للحصول على تركيز نهائي قدره 1٪ SDS في المحللة (v / v).
- بالنسبة للأنسجة، اتبع الخطوات 4.1.5-4.1.7.
- أضف 0.5 M dithiothreitol إلى المحللة للحصول على تركيز نهائي ~ 25 mM (على سبيل المثال ، 2.5 μL من 0.5 M dithiothretol إلى 50 μL من المحللة) واحتضان المحللة لمدة 30 دقيقة عند 60 °C لتقليل روابط ثاني كبريتيد كيميائيا في البروتينات.
- أضف 0.5 M iodoacetamide للحصول على تركيز نهائي ~ 75 mM في المحللة واحتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام (الشكل 2).
- أضف 0.5 M ثنائي ثيوثريتول ، نفس الحجم الأولي (على سبيل المثال ، 2.5 ميكرولتر من 0.5 M dithiothretol إلى 50 μL من المحللة) لإخماد المواد المتفاعلة المتبقية من تفاعل الألكلة.
تنبيه: يمكن أن يسبب يودواسيتاميد وديثيوثريتول تلفا خطيرا للجلد والعين عند التعرض المباشر. استخدم معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع هذه المواد الكيميائية. - تنقية البروتينات عن طريق هطول الأمطار. يؤدي هطول الأمطار القائم على الكلوروفورم والميثانول أداء جيدا31. هذا البروتوكول قابل للتكيف أيضا مع أنواع أخرى من نهج هطول الأمطار32.
ملاحظة: لتحليل الخلية الواحدة ، حيث يكون فقدان البروتين مصدر قلق ، تخطي خطوة هطول الأمطار ل CE-HRMS. - جفف راسب البروتين في مكثف فراغ (4-37 درجة مئوية) ، ثم أعد تعليق البروتين المستخرج في 50 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 50 مللي مول. قم بتقدير تركيز البروتين باستخدام مقايسة قياس لوني للبروتين الكلي لتحديد كمية الإنزيم المطلوبة للهضم (على سبيل المثال ، مقايسة بروتين حمض البيسينتشونيك).
- هضم البروتينات إلى الببتيدات. أضف التربسين (1 ميكروغرام / ميكرولتر من المخزون) للحصول على نسبة بروتياز: بروتين تبلغ 1:50 واحتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 ساعات لعينات الخلية الواحدة وحتى 14 ساعة لعينات الأنسجة. استشر التوصيات الخاصة بالبائع لمعرفة التفاعل.
ملاحظة: قد يؤدي الهضم مع التربسين لمدة تزيد عن 14 ساعة أو تركيزات أعلى إلى حدوث انشقاقات غير محددة لتسلسل البروتين ، وبالتالي تحدي تحديد البروتين33. - حدد تركيز الببتيد الكلي باستخدام الفحص اللوني.
- اختياري: من أجل تعدد الإرسال الكمي ، ضع علامة على الببتيدات من كل عينة بعلامة كتلة متساوية الضغط مختلفة باتباع التعليمات الخاصة بالبائع. امزج الببتيدات المشفرة بنسب متساوية لكل عينة ببتيد.
ملاحظة: تأكد من وضع العلامات والخلط بدقة لتجنب التحيزات الكمية. بالنسبة للعينات محدودة الكمية أو العينات أحادية الخلية ، يمكن تضمين قناة حاملة قائمة على TMT تتكون من أنسجة / خلايا مجمعة لتقليل خسائر العينة أثناء خطوات الفصل اللاحقة ولتعزيز حساسية البروتينات الأقل وفرة34. - اختياري: إزالة الببتيدات الملحة لإزالة الأملاح والملوثات (على سبيل المثال ، كواشف علامة الكتلة متساوية الضغط غير المتفاعلة) على عمود / طرف الدوران العكسي C18 لحماية نظام LC-MS.
- اختياري: تجزئة (على سبيل المثال ، تجزئة الطور العكسي ذات الأس الهيدروجيني المتوسط أو العالي) خليط الببتيد للكشف الأعمق عن البروتين عبر منصات يدوية أو أوتوماتيكية. استخدم المرحلة الثابتة C18 التي تحتوي على أطراف لتجزئة كميات منخفضة (1-10 ميكروغرام) من هضم الببتيد.
- جفف خليط الببتيد على حرارة 60 درجة مئوية في مكثف فراغ.
- قم بتخزين خليط الببتيد في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى القياس.
- لتحليل الخلية الواحدة بواسطة CE ، قم بتسخين العينة إلى 60 °C لمدة ~ 15 دقيقة لتشويه البروتينات ، ثم موازنة العينة مع درجة حرارة الغرفة (RT ، ~ 5 دقائق) 18,21.
- افصل الببتيدات
ملاحظة: بعد استخراج البروتينات وهضمها إنزيميا ، يتم فصل الببتيدات الناتجة بواسطة nanoLC أو CE وتتأين بواسطة ESI للتسلسل بواسطة HRMS جنبا إلى جنب. يعتبر فصل nanoLC ذو الطور العكسي مثاليا للببتيدات التي تتراكم ~ 150 نانوغرام إلى ~ 1 ميكروغرام لكل تحليل. يوفر CE حساسية تكميلية للببتيدات التي تتراوح من الفيمتوجرام إلى <100 ng. Various custom-built and commercial CE-ESI interfaces allow for ready coupling of CE to HRMS with robust performance35 وتستخدم بشكل متزايد لتحليل الخلية الواحدة18,36,37.- للفصل باستخدام CE ، اتبع الخطوات 4.2.2-4.2.7.
ملاحظة: في ما يلي ، يتم وصف استخدام منصة CE المصممة خصيصا لقياس الببتيدات. تم توفير بروتوكولات لبناء واستخدام أداة CE هذه في وقت سابق38 ، جنبا إلى جنب مع تجربة مرئية حول استخدام الجزيئات الصغيرة20. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء هذه القياسات على نظام CE تجاري ، مثل AB SCIEX CESI أو Agilent 7100 أو ما يعادلها. - إعادة تكوين هضم البروتين في 1-2 ميكرولتر من مذيب العينة ، دوامة لخلط العينة ، وطردها مركزيا عند 10000 × جم لمدة دقيقتين لحطام خلايا الحبيبات.
ملاحظة: تقلل إزالة حطام الخلية من احتمالية انسداد الشعيرات الدموية CE ، وبالتالي إطالة عمر نظام الفصل وزيادة إنتاجية القياس. - قم بتهيئة أداة CE-ESI عن طريق شطف الشعيرات الدموية CE باستخدام BGE.
- التحقق من صحة الأداء الآلي باستخدام معيار معروف (على سبيل المثال ، هضم السيتوكروم C أو BSA ، ببتيدات الأنجيوتنسين).
ملاحظة: يوصى بتقييم الأداة من حيث دقة الكتلة وحساسية الكشف والتكاثر والنطاق الديناميكي الخطي للقياس الكمي قبل قياس العينات الثمينة. يتم سرد ملاحظات إضافية حول التحقق من صحة أداء CE-ESI-MS واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في مكان آخر18،20،38. - حقن ~ 1-10 nL من العينة في الشعيرات الدموية الفصل CE.
ملاحظة: تستخدم هذه الدراسة شعرية السيليكا المنصهرة بطول ~ 1 متر (قطر داخلي / خارجي 40/110 ميكرومتر) مع إعداد تدفق غمد يتم ضخه كهربائيا. تتطلب أدوات CE التجارية عادة تقديم 5-10 ميكرولتر من العينة في قارورة ميكروفية للحقن. منصة CE المصممة خصيصا18,38 متوافقة مع ~ 250 nL إلى 1 μL من العينة المودعة في قارورة تحميل العينات. - انقل نهاية مدخل الشعيرات الدموية لفصل CE إلى BGE.
- ابدأ الفصل الكهربائي عن طريق زيادة جهد الفصل CE تدريجيا من الأرض (على سبيل المثال ، تدريجيا أكثر من 1 دقيقة). تضمن إمكانات 20-28 كيلو فولت مع تيار أقل من ~ 10 μA أداء فعالا مستقرا وقابلا للتكرار للتحليل.
- للفصل باستخدام nanoLC ، اتبع الخطوات 4.2.9-4.2.12.
- أعد تعليق عينة الببتيد في المرحلة المتنقلة A. يعتمد تركيز العينة وحجمها للحقن على نظام LC والعمود المتاحين. في هذه الدراسة ، يتم حقن ~ 250 نانوغرام -1 ميكروغرام من هضم البروتين في 1-20 ميكرولتر من حجم العينة على عمود C18 معبأ (قطر داخلي 75 ميكرومتر ، حجم جسيم 2 ميكرومتر مع مسام 100 Å ، عمود فصل بطول 25 سم).
- انقل العينة إلى قارورة LC.
ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في القارورة ، مما قد يؤدي إلى تلف العمود التحليلي. يمكن استخدام القوارير ذات الإدخالات للأنسجة منخفضة الحجم أو عينات الخلية الواحدة. - تحميل ~ 200 نانوغرام إلى 2 ميكروغرام من عينة الببتيد على العمود التحليلي C18.
ملاحظة: اختياريا ، يمكن تحميل الببتيدات على عمود مصيدة لتحلية المياه قبل الفصل التحليلي. على سبيل المثال ، عمود مصيدة C18 بقطر داخلي 0.1 مم ، حجم جسيم 5 ميكرومتر ، حجم مسام 100 Å ، طول 20 مم. الببتيدات المملحة مع 100٪ عازلة A بمعدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق قبل أن يبدأ تدرج الفصل. - افصل الببتيدات باستخدام شطف التدرج. عند معدل تدفق 300 nL / min ، يكون التدرج 120 دقيقة المستخدم في هذه الدراسة كما يلي: 0-5 دقيقة 2٪ B ، 5-85 دقيقة 2-35٪ B ، 86-90 دقيقة 70٪ B ، 91-120 دقيقة 2٪ B.
- للفصل باستخدام CE ، اتبع الخطوات 4.2.2-4.2.7.
- تأين الببتيدات بواسطة ESI
ملاحظة: عادة ما تقترن الشعيرات الدموية CE أو nanoLC بمصدر ESI للتأين. تم تطوير واجهات CE-ESI ذات التدفق الدقيق (الطرف الحاد) والتدفق النانوي (الطرف المدبب39 وتصميم غمد الضخالكهروحركي 36 ) للكشف عن الحساسية الفائقة.- قم بتزويد الببتيدات المنفصلة في مصدر أيون بالرش الكهربائي للتأين باستخدام واجهة ESI تجارية أو مصممة خصيصا. لتحليل CE-ESI-MS أحادي الخلية في أجنة Xenopus ، استخدم واجهة منخفضة التدفق يتم ضخها كهربائيا حيث يتم وضع مخرج الشعيرات الدموية CE في باعث البورسليكات المسحوب.
- تحقق من تدفق السائل عبر باعث الرذاذ الكهربائي باستخدام كاميرا وافحص الإعداد بصريا بحثا عن التسريبات المحتملة.
- اضبط جهد الرش الكهربائي على ~ 2.5 كيلو فولت لبدء مصدر ESI (مقابل الأرض الأرضية).
- ضمان رذاذ نانوي مستقر لتحليل نظام إدارة الموارد البشرية من خلال مراقبة إجمالي تيار الأيون. اضبط جهد الرش الكهربائي ومسافة الباعث إلى مدخل HRMS لتحقيق رذاذ مستقر (<15٪ انحراف معياري نسبي في الكثافة الكلية).
- كشف الببتيدات
ملاحظة: يتبع الكشف عن الببتيدات اعتبارات مفيدة مختلفة للببتيدات الموسومة وغير الموسومة بالكتلة متساوية الضغط ويعتمد على نوع مطياف الكتلة المتاح. تستخدم هذه الدراسة مطياف الكتلة المداري الثلاثي وفقا للخطوات التالية.- الحصول على أحداث MS1 مع الإعدادات: محلل ، orbitrap ؛ الدقة الطيفية ، 120000 عرض كامل بنصف الحد الأقصى (FWHM) ؛ الحد الأقصى لوقت الحقن (IT) ، 50 مللي ثانية ؛ التحكم التلقائي في الكسب (AGC) ، 4 × 105 تهم ؛ المجهرية ، 1.
- لتسلسل الببتيدات ، أيونات السلائف الشظية للكشف في محلل مصيدة الأيونات باستخدام الإعدادات: وضع التجزئة ، تفكك تصادم الطاقة الأعلى (HCD) ؛ غاز الاصطدام والنيتروجين. طاقة الاصطدام ، 32٪ طاقة تصادم طبيعية (NCE) ؛ الحد الأقصى لتكنولوجيا المعلومات ، 70 مللي ثانية ؛ AGC ، 1 × 104 تهم ؛ المجهرية ، 1.
- اختياري: تحديد كمية الببتيدات الموسومة TMT باستخدام نظام إدارة الموارد البشرية الترادفية / متعددة المراحل (MS2 / MS3). بالنسبة ل MS3 الذي يستخدم اختيار السلائف المتزامنة ، تكون الإعدادات الآلية النموذجية كما يلي. يتم فصل عمليات المسح أحادية المرحلة (MS1) التي تستطلع الأيونات الأكثر وفرة عن طريق الاستحواذ المعتمد على البيانات باستخدام المعلمات: وضع تجزئة MS2 ، التفكك الناجم عن الاصطدام (CID) ؛ غاز الاصطدام والهيليوم. طاقة الاصطدام ، 35٪ NCE ؛ محلل لأيونات الشظايا ، مصيدة الأيونات الإعدادات التالية: الحد الأقصى لتكنولوجيا المعلومات ، 50 مللي ثانية ؛ AGC ، 5 × 104 تهم ؛ المجهرية ، 1. حدد 10 أيونات شظايا MS2 وقم بتجزئتها باستخدام HCD في النيتروجين (65٪ NCE). كشف أيونات شظايا MS3 باستخدام الإعدادات التالية: دقة Orbitrap 15000 FWHM ، الحد الأقصى لتكنولوجيا المعلومات ، 120 مللي ثانية ؛ AGC ، 1 × 105 تهم ؛ المجهرية ، 1.
ملاحظة: يمكن استخدام طرق ومعلمات مختلفة لاكتساب MS للعينات الموسومة باتباع توصيات البائع كما هو موضح في مكان آخر11،40.
- تحليل البيانات
ملاحظة: يتم تحديد البروتينات وقياسها باستخدام حزم المعلوماتية الحيوية المتقدمة. يتم حساب دقة الهويات باستخدام قاعدة بيانات شرك ، معبرا عنها بمعدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) على مستوى الببتيدات والبروتينات.- معالجة البيانات باستخدام حزم البرامج التجارية أو مفتوحة المصدر (تمت مراجعتها في المرجع41). قم بمطابقة البيانات الأولية مع قاعدة بيانات تم إعدادها عن طريق ربط بروتين Xenopus 9.2 بقاعدة بيانات PHROG المشتقة من mRNA42.
ملاحظة: معلمات البحث هي: إنزيم الهضم ، التربسين. الانقسامات الفائتة ، حتى 2 ؛ تعديل متغير ، أكسدة الميثيونين. تعديل ثابت ، كارباميدوميثيل السيستين. التسامح الشامل السلائف ، 10 جزء في المليون ؛ شظايا التسامح الشامل ، 0.6 دا ؛ الحد الأدنى لطول الببتيد ، 5 ؛ تحديد الإخلاص ، <1 ٪ FDR للببتيدات والبروتينات. بدون الألكلة إلى الببتيدات ، يتم استبعاد كرباميدوميثيل كتعديل ثابت أثناء البحث في قاعدة البيانات (على سبيل المثال ، لتحليل الخلية الواحدة). - حدد كمية وفرة البروتين عبر43 الخالية من الملصقات أو الاستراتيجيات القائمة على الملصقات44,45.
- اختياري: تعليق البروتينات لأنطولوجيا الجينات. يمكن استخدام PantherDB46 أو Reactome47 أو Xenbase23 .
- اختياري: تحديد وفرة البروتين والاختلافات في وفرة البروتين عبر أنواع الخلايا / الأنسجة باستخدام حزم البرامج / أدوات الويب ، مثل خط الأنابيب عبر البروتينات48 و Perseus49 و Orange50.
ملاحظة: تمت مراجعة اعتبارات إضافية حول التصميم التجريبي وخيارات البرامج في مكان آخر41،51. - اختياري: قم بتقييم النتائج بشكل أكبر باستخدام قواعد المعرفة ، مثل STRING52 و BioPlex Display 53 للتفاعلات المعروفة بين البروتين والبروتين و PhosphoSiteplus54 للفسفرة. لتحليل الزخارف والمجالات الممثلة في البروتين ، استخدم أدوات الويب مثل أبحاث العمارة المعيارية البسيطة (SMART) 55.
- معالجة البيانات باستخدام حزم البرامج التجارية أو مفتوحة المصدر (تمت مراجعتها في المرجع41). قم بمطابقة البيانات الأولية مع قاعدة بيانات تم إعدادها عن طريق ربط بروتين Xenopus 9.2 بقاعدة بيانات PHROG المشتقة من mRNA42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مكن هذا البروتوكول من دراسة البروتينات في الخلايا المفردة وأنسابها أثناء قيامها بإنشاء الأنسجة في أجنة X. laevis. يوضح الشكل 1 أحد هذه التطبيقات لنهج دراسة البروتينات في الخلايا المصيرية للأنسجة العصبية والأديم الظاهر العصبي المستحث حديثا في الجنين. كما هو موضح في الشكل 1 أ ، دمج سير عمل التحليل الحيوي الأدوات التقليدية للخلية والبيولوجيا التنموية لتحديد الخلايا وحقنها / شفطها وجمع العينات. يوضح الشكل 1B أخذ عينات مسبار دقيق من خلية الحيوان الظهري الأيسر (D 11) في الجنين المكون من16 خلية في الجسم الحي باستخدام حاقن دقيق. بعد التجربة ، تطورت الأجنة بنجاح إلى الضفادع الصغيرة ذات التشريح الطبيعي56. كانت الخلايا الجنينية الكبيرة (~ 100-250 ميكرومتر في القطر) مواتية للتشريح المجهري اليدوي أيضا. يوضح تشريح خلية خط الوسط الظهري الحيواني الأيمن (D11) من الجنين المكون من 16 خلية في الشكل 1C. كما سمح الإعداد بتتبع مسار نسيلي عن طريق حقن مادة تتبع الفلورسنت في السلائف المحددة. كما هو موضح في الشكل 1D ، سمح النهج بعزل الحيوانات المستنسخة الناشئة عن خلايا D111 اليمنى واليسرى عن طريق تشريح الأنسجة أو عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS). استراتيجيات جمع العينات الموصوفة هنا قابلة للتطوير بما فيه الكفاية في المكان والزمان لدراسة التطور الجنيني بتفاصيل جديدة.
دمج سير العمل التحليلي الحيوي تقنيات نظام إدارة الموارد البشرية لتحسين الحساسية والقياس الكمي (الشكل 2). تم قياس البروتينات التي تم جمعها من خلال نهج بروتيني من أسفل إلى أعلى. ساعدت التجزئة الاختيارية للعينات بناء على الكيمياء المتعامدة (على سبيل المثال ، درجة الحموضة العالية ثم LC ذات الطور العكسي منخفض الأس الهيدروجيني) في الكشف عن الحساسية. لفصل الببتيدات ، تم اختيار CE لكميات ضئيلة من العينات (<< ~ 100 نانوغرام)) و nanoLC لكميات محدودة من المواد (>> 150 نانوغرام). تم تسلسل الببتيدات باستخدام ESI-HRMS. تم قياس البروتينات المكتشفة باستخدام استراتيجيات خالية من الملصقات وقائمة على الملصقات. تبسيط معالجة العينات لتحليل الخلية الواحدة ، مثل القضاء على الخطوات النموذجية للاختزال والألكلة متبوعة بتحليل CE ، سهل تحديد ~ 400-800 بروتين مختلف. من بين البروتينات المبلغ عنها كان هناك العديد من الأدوار الوظيفية الهامة ، مثل chaperonin التي تحتوي على الوحدة الفرعية TCP1 3 (Cct3) ، والقناة الأيونية المعتمدة على الجهد (Vdac2) ، والكرياتين كيناز الدماغ (Ckb). ساعدتنا نماذج البيانات الإحصائيةمتعددة المتغيرات 10,57 والآخرين 9,58 في العثور على اختلافات غير معروفة سابقا في التركيب البروتيني لخلايا وأنسجة مختارة باستخدام الأساليب الملخصة في هذا البروتوكول. والجدير بالذكر أن قياسات نظام إدارة الموارد البشرية هذه لم تتطلب أي تحقيقات عاملة أو معرفة حول تكوين العينات في وقت مبكر ، مما يدعم الاكتشافات.
في سلسلة من الدراسات ، تم تحديد الحالة البروتينية للخلايا المحددة في الأجنة النامية من X. laevis (الشكل 3)21. يوضح الشكل 3 أ اكتشاف الاختلافات في الترجمة الجينية بين الخلايا D11 التي تم تشريحها من أجنة مختلفة10. سمح لنا أخذ العينات المجهرية CE-ESI-HRMS بتحديد وقياس ما يصل إلى ~ 700 بروتين من خلايا مفردة21. تم إيداع بيانات HRMS-MS / MS الأولية التمثيلية حول تحديد ~ 400 بروتين تراكمي من القياسات المكررة التقنية على خلية D11 في الجنين إلى PRIDE. كان هذا النهج قابلا للتطوير لخلايا وأجنة أصغر من كائنات نموذجية أخرى ، مثل الزرد21. سمحت لنا قابلية التوسع إلى أحجام الخلايا الأصغر باستكشاف إعادة التنظيم الزماني المكاني لذرية D11 من جنين حي أثناء تطوره في الوقت المناسب. يوضح الشكل 3 ب استخدام هذا البروتوكول لإجراء البروتينات الكمية تحت الخلوية للخلايا المحددة في الأجنة المكونة من 16 و 32 و 64 و 128 خلية. تم فصل البروتينات إلى أربع مجموعات أظهرت ملامح وفرة مميزة على التطور النسيلي21.
الشكل 3: قابلية توسع البروتوكول من الحيز دون الخلوي إلى الأنسجة النسيلية في جنين X. laevis . أ: قياس الاختلافات البروتينية بين خلايا D11 الكاملة المحددة، والكشف عن عدم تجانس الخلايا الخلوية. أسماء الجينات المعروضة لبروتينات مختارة. ب: إعادة تنظيم البروتين الخلوي في نسخة خلية D11 النامية. يعني C الضبابي التحليل العنقودي (GProx) لديناميكيات البروتين ، وتجميع البروتينات بناء على أنماط تعبير مماثلة. تظهر الأرقام الرمادية عدد البروتينات المختلفة التي تم قياسها كميا في كل مجموعة. تم تكييف الأرقام بإذن من المراجع21,57. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
سمح لنا هذا البروتوكول بإجراء البروتينات المكانية والزمانية في استنساخ الخلايا المحددة والنامية (الشكل 4). يوضح الشكل 4 أ تطبيق نهج تصنيف وعزل مستنسخات الخلايا التي تشكل نسيجين لهما أدوار مهمة في تطور الأنسجة العصبية وتشكيل نمط الجنين. تم تتبع غالبية منظم Spemann (SO) عن طريق تسمية خلايا D 112 و D212 اليمنى واليسرى عن طريق حقن ديكستران الفلوري. في موازاة ذلك ، تم تصنيف الخلايا الظهرية الحيوانية المجاورة (D111) لتمييز غالبية الأديم الظاهر العصبي (NE). تم تشريح الأنسجة ، وتم تحليل محتواها من البروتين باتباع هذا البروتوكول. أعاد nanoLC-ESI-HRMS ما يصل إلى 2000 بروتين مختلف من الأنسجة ، بما في ذلك الإشارات ، مثل مسارات Wnt و Fgf و Tgfβ. تم إيداع بيانات HRMS-MS / MS الأولية التمثيلية حول تحديد ~ 1800 بروتين تراكمي من القياسات المكررة التقنية على مجموعة من أنسجة SO المشرحة إلى PRIDE. تم الكشف عن مسار Wnt ligand Wnt10a و Wntless (Wls) ، وهو بروتين غشائي مخصص لإفراز روابط Wnt ، فقط في بروتين NE. تم العثور على مسار Wnt مكبوت في SO وقد يفسر نقص البروتينات المتفاعلة مع Wnt المكتشفة في SO. تظهر هذه النتائج قابلية تطبيق هذا البروتوكول لدراسة الاختلافات الخاصة بالنسب داخل الجنين.
الشكل 4: مثال على تحليل البيانات من البروتينات النسيجية المكانية في أجنة X. laevis . أ: الوسم التفاضلي لمنظم سبيمان (SO) وأنسجة الأديم الظاهر العصبي (NE) عن طريق حقن البروتين الفلوري mRNA في السلف D 112 و D212 في الجنين المكون من32 خلية ، على الترتيب. (ب) أعلى 5 عمليات بيولوجية ممثلة تمثيلا زائدا في بروتين SO (أحمر) و NE (أخضر) تظهر اختلافات يمكن اكتشافها. يظهر تحليل التمثيل الزائد للمسار العمليات البيولوجية باستخدام تصحيح Bonferroni. (ج) تحليل إثراء مجال البروتين (SMART) ، الذي يكشف عن إثراء البروتينات المحتوية على شكل الحمض النووي والحمض النووي الريبي في SO. (د) تحليل STRING الذي يتنبأ بالتفاعلات الكنسية بين البروتين والبروتين بناء على بروتين SO المكتشف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تعمل البيانات البروتينية المتنوعة كمعلومات قيمة لتقييم الوظيفة. يمكن تقييم البيانات البروتينية باستخدام قواعد المعرفة الكنسية. كما هو موضح في الشكل 4 ب ، أظهر تحليل المسار للبروتينات غير المنظمة ترجمة ممثلة تمثيلا زائدا واستقلاب الطاقة في كل من مجموعات بيانات SO و NE في دراساتنا الحديثة. تم إثراء بروتين NE بالبروتينات المرتبطة بالنقل النووي لشحنة البروتين في الخلية ، مما يشير على الأرجح إلى أحداث المصب التالية للإشارات في NE المنشأة حديثا (الشكل 4C). وجد تحليل التخصيب في الشكل 4D تنظيما في بدء الترجمة ، وربط الحمض النووي الريبي ، والربط في مركب البروتيازوم ، مما يشير إلى دور دوران البروتين الديناميكي في تطوير SO. بروتينات HRMS الموجهة بنسب الخلايا قابلة للتطوير في المكان والزمان وحساسة بما فيه الكفاية للمساعدة في فهم التنظيم الجزيئي للخلايا بشكل أفضل أثناء التطور الطبيعي والضعيف.
الملف التكميلي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتيح هذا البروتوكول توصيف تعبير البروتين في سلالات الخلايا المحددة في أجنة أنواع Xenopus. انطلاقا من نظام إدارة الموارد البشرية ، تجمع المنهجية بين الخصوصية الرائعة في التحديد الجزيئي ، والقدرة على الكشف عن البروتينات المتعددة بدون تحقيقات جزيئية (عادة مئات إلى آلاف البروتينات المختلفة) ، والقدرة على القياس الكمي. تعمل القدرة على التكيف مع الأدوات الكلاسيكية وسير العمل في الخلية والبيولوجيا التنموية (العصبية) على توسيع بروتينات HRMS إلى تطبيقات مثيرة ، بما في ذلك التوصيف الشامل لتمايز الخلايا الجذعية في جنين الفقاريات X. laevis.
تصف الخطوات البروتينات الموجهة بنسب الخلايا في جنين X. laevis. على سبيل المثال ، نوضح تحليل الخلايا المفردة المشؤومة عصبيا وأنسالها ونوفر مجموعات بيانات CE- و nanoLC HRMS المقابلة من خلال مستودع بيانات عام (انظر PRIDE). هذا النهج قابل للتكيف بسهولة مع الدراسات حول التنظيم الزماني المكاني للبروتينات في أنواع متعددة من الخلايا (والأنساب). يمكن أيضا توسيع البروتيوميات الموجهة زمانيا مكانيا في الجنين النامي لتشمل الدراسات النسخية والأيضية لتعزيز فهم بيولوجيا الأنظمة الجزيئية لتمايز الخلايا وتطور الأعضاء الرئيسية ، مثل الجهاز العصبي.
يضيف هذا البروتوكول أبعادا جديدة للتحليل الحيوي. تسهل مزارع الخلايا ، مثل الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) 1,2 ، قياس ديناميكيات البروتين الزمني أثناء تمايز الخلايا. النهج المفصل في هذه الدراسة الأقران في تحريض مصير الخلية في الجنين الحي 3 الأبعاد ، حيث تتعاون تدرجات المورفوجين المعقدة ، ومسارات الإشارات المتوازية ، وعمليات التمديد المتقاربة لتحقيق تحريض الأنسجة والتشكل. يمكن أن توفر دراسة ديناميكيات البروتين في سياق الجنين معلومات حول الآليات المتوازية التي توجه تمايز الخلايا ، وهو اتجاه مثير لتعميق فهم التمايز والتطور.
يستعير النهج الموصوف هنا الفوائد التجريبية لأنواع Xenopus لتحقيق هذه الغاية ، X. laevis على وجه الخصوص. يتم تعيين كل خلية من الجنين X. laevis المكون من 16 و 32 خلية في وقت مبكر إلى مصائر الأنسجة القابلة للتكاثر في الكائن الحي البالغ ، وهو في الأساس إسقاط مكاني للخلايا في أجنة مرحلة الانقسام. تعتمد قابلية استنساخ البروتينات الموجهة بالخلايا على الكتابة الدقيقة للخلايا. نحن نساعد في النجاح من خلال اعتماد الأجنة للتصبغ النمطي والانقسام قبل الشروع في التجارب التي تصف تشريح الخلايا وتتبع النسب16،20. من المهم أن نلاحظ أن خلايا أجنة مرحلة الانقسام غالبا ما تساهم في تكوين أنواع مختلفة من الأنسجة بدرجات مختلفة. تتوفر تفاصيل مساهمة مستواهم في كل نوع من الأنسجة على Xenbase23. ولذلك ينبغي اختيار المرحلة الجنينية وخلايا السلائف المراد تتبع سلالتها استنادا إلى المسألة البيولوجية المطروحة. عند زراعة الأجنة على مدى فترات زمنية أطول (على سبيل المثال ، >1 د) ، يجب توخي الحذر لإزالة الأجنة التالفة / الميتة ، والتي بدورها قد تقلل من صلاحية الأجنة الأخرى في السكان.
من أجل بروتينات HRMS الناجحة ، يجب إيلاء اهتمام دقيق للأسس التحليلية لجمع الخلايا / الأنسجة ، واستخراج البروتين ، وقياس نظام إدارة الموارد البشرية. نظرا لأن أجنة Xenopus يتم استزراعها في وسائط تحتوي على تركيزات عالية من الأملاح غير المتطايرة المعروفة بتقليل حساسية HRMS ، فمن المستحسن تقليل الوسائط المستنشقة عند جمع الخلايا والأنسجة للدراسات البروتينية. من الممارسات الجيدة استكشاف التحلية لتعزيز تحديد البروتينات وقياسها. قبل قياس نظام إدارة الموارد البشرية ، يجب تقييم الأداء التحليلي لأجهزة CE- و LC-ESI-HRMS ، بما في ذلك الفصل والتأين والتكرار والنطاق الديناميكي الخطي للقياس الكمي. مع المقاييس التحليلية الجيدة ، يساعد هذا البروتوكول على تقليل استخدام الحيوانات في البحوث البيولوجية ، ويساعد على الحساسية للحصول على مجموعات أكثر قوة من البيانات الكيميائية الحيوية ، ويعزز قوة تحليل البيانات الإحصائية لتفسير النتائج. بشكل افتراضي ، نقوم بتحليل كل نسخة بيولوجية في 3 نسخ مكررة تقنية على الأقل باستخدام CE أو LC-HRMS ، والتي تستخدم لتقييم قابلية التكاثر التقني وتعميق تغطية البروتين القابل للاكتشاف. يساعد تحليل الطاقة على تقدير القوة الإحصائية وتصميم حجم النسخ المتماثل البيولوجي. ينصح باستخدام مجموعات مختلفة من الضفادع الأم لمراعاة التباين البيولوجي الذي يحدث بشكل طبيعي بين الأجنة.
معلومات تكميلية
تم إيداع بيانات البروتينات HRMS-MS / MS وملفات المعالجة ذات الصلة إلى اتحاد ProteomeExchange عبر مستودع شركاء PRIDE60 مع معرف مجموعة البيانات PXD030059.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
نحن ممتنون ل Jie Li (جامعة ماريلاند ، كوليدج بارك) للمناقشات القيمة حول التفكك الجنيني و FACS. نشكر Vi M. Quach و Camille Lombard-Banek للمساعدة في إعداد العينات وجمع البيانات في الدراسات السابقة التي تجسد التطبيقات البروتينية التي تم تسليط الضوء عليها في هذا البروتوكول. تم دعم أجزاء من هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم تحت رقم الجائزة IOS-1832968 CAREER (إلى PN) ، والمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R35GM124755 (إلى PN) ، وبرنامج شراكة المعهد الوطني للسرطان بجامعة ماريلاند (إلى PN) ، وجوائز أبحاث مؤسسة COSMOS Club (إلى ABB و L.R.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Scientific | A643-500 | |
| Analytical Column | Thermo Scientific | 164941 | |
| Analytical microbalance | Mettler-Toledo | XSE105DU | |
| Automatic peptide fractionation platform | Agilent | 1260 Infinity II | |
| Borosilicate Capillaries | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| C18 spin columns (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 89870 | |
| Camera ro monitor electrospray | Edmund Optics Inc. | EO-2018C | |
| Combretastatin A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| Commercial CESI system | AB SCIEX | CESI | |
| (Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) | VWR | 97061-492 | |
| Cytochalasin D | Millipore Sigma | C8273 | |
| Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | ThermoFisher Scientific | D22910 | |
| Diothiothreitol | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| Epifluorescence light source | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBing microcentrifuge tubes: protein | Fisher Scientific | 13-698-793 | |
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| Fused silica capillary | Molex | 1088150596 | |
| Heat Block | Benchmark | BSH300 | |
| High pressure liquid Chromatography System | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | |
| High-resolution Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | |
| HPLC caps | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| HPLC Vials | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122275000 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Microcapillary puller | Suttor Instruments | P-2000 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Micropippette puller | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| MS data analysis software, commercial | ProteomeDiscoverer | ||
| MS data analysis software, opensource | MaxQuant | ||
| non-idet 40 substitute | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 87782 | |
| Pierce bicinchoninic acid protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pierce quantitative colorimetric peptide assay | ThermoFisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Trypsin Protease (MS Grade) | Fisher Scientific | PI90058 | |
| Protein LoBind vials | Eppendorf | 0030108434 , 0030108442 |
|
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Refrigerated Incubator | Thermo Scientific | PR505755R/3721 | |
| sodium isethionate | Millipore Sigma | 220078 | |
| sodium pyrophosphate | Sigma Aldrich | 221368-100G | |
| Stainless steel BGE vial | Custom-Built | ||
| Stainless steel sample vials | Custom-Built | ||
| Stereomicroscope (objective 10x) | Nikon | SMZ 1270, SZX18 | |
| Sucrose | VWR | 97063-790 | |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Syringes (gas-tight): 500–1000 µL | Hamilton | 1750TTL | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Trap Column | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl (1 M solution) | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C | Labconco | 7310022 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-Built |
References
- Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
- Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their secretome during in vitro differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 612560 (2021).
- Christian, J. L. Morphogen gradients in development: From form to function. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 1 (1), 3-15 (2012).
- Gurdon, J. B., Elsdale, T. R., M, F. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature. 182, 64-65 (1958).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends in Genetics. 27 (12), 507-515 (2011).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Sun, L. L., et al. Single cell proteomics using frog (Xenopus laevis) blastomeres isolated from early stage embryos, which form a geometric progression in protein content. Analytical Chemistry. 88 (13), 6653-6657 (2016).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry for discovery proteomics: quantifying translational cell heterogeneity in the 16-cell frog (Xenopus) embryo. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (7), 2454-2458 (2016).
- Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2000).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Gupta, M., Sonnett, M., Ryazanova, L., Presler, M., Wuhr, M. Quantitative proteomics of xenopus embryos I, sample preparation. Xenopus. Methods in Molecular Biology. Vleminckx, K. 1865, Humana Press Inc. NY. 175-194 (2018).
- Baxi, A. B., Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Proteomic characterization of the neural ectoderm fated cell clones in the Xenopus laevis embryo by high-resolution mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 2064-2073 (2018).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 135, 331-347 (2000).
- Sater, A. K., Moody, S. A. Using Xenopus to understand human diseases and developmental disorders. Genesis. 55 (1-2), 1-14 (2017).
- Lombard-Banek, C., Choi, S. B., Nemes, P. Enzyme Activity in Single Cells. Methods in Enzymology. Allbritton, N. L., Kovarik, M. L. 628, 263-292 (2019).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. High-sensitivity mass spectrometry for probing gene translation in single embryonic cells in the early frog (Xenopus) embryo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 11 (2016).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (Xenopus laevis) embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56956 (2017).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Manzin, M. C., Nemes, P. Microsampling capillary electrophoresis mass spectrometry enables single-cell proteomics in complex tissues: developing cell clones in live Xenopus laevis and zebrafish embryos. Analytical Chemistry. 91 (7), 4797-4805 (2019).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Developmental Biology. 120 (1), 299-304 (1987).
- Karimi, K., et al. Xenbase: a genomic, epigenomic and transcriptomic model organism database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 861-868 (2018).
- Kakebeen, A. D., Chitsazan, A. D., Wills, A. E. Tissue disaggregation and isolation of specific cell types from transgenic Xenopus appendages for transcriptional analysis by FACS. Developmental Dynamics. 250 (9), 1381-1392 (2021).
- Garcia, B. A. What does the future hold for top down mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 193-202 (2010).
- Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in top-down proteomics and the analysis of proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. (Palo Alto Calif). 9 (1), 499-519 (2016).
- Zhang, Z. B., Dubiak, K. M., Huber, P. W., Dovichi, N. J. Miniaturized filter-aided sample preparation (MICRO-FASP) method for high throughput, ultrasensitive proteomics sample preparation reveals proteome asymmetry in Xenopus laevis Embryos. Analytical Chemistry. 92 (7), 5554-5560 (2020).
- Wisniewski, J. R. Microbial Proteomics: Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology. Becher, D. 1841, Humana Press Inc. NY. 3-10 (2018).
- Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9, 882 (2018).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute-solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
- Jiang, L., He, L., Fountoulakis, M. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. Journal of Chromatography A. 1023 (2), 317-320 (2004).
- Hildonen, S., Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Why less is more when generating tryptic peptides in bottom-up proteomics. Proteomics. 14 (17-18), 2031-2041 (2014).
- Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19, 161 (2018).
- Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry at trial by metabo-ring: effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
- Sun, L. L., Zhu, G. J., Zhang, Z. B., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-generation electrokinetically pumped sheath-flow nanospray interface with improved stability and sensitivity for automated capillary zone electrophoresis-mass spectrometry analysis of complex proteome digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
- DeLaney, K., Sauer, C. S., Vu, N. Q., Li, L. J. Recent advances and new perspectives in capillary electrophoresis-mass spectrometry for single cell "omics". Molecules. 24 (1), 21 (2019).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Protocols. 8 (4), 783-799 (2013).
- Choi, S. B., Zamarbide, M., Manzini, M. C., Nemes, P. Tapered-tip capillary electrophoresis nano-electrospray ionization mass spectrometry for ultrasensitive proteomics: the mouse cortex. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (4), 597-607 (2017).
- Pino, L. K., Rose, J., O'Broin, A., Shah, S., Schilling, B. Emerging mass spectrometry-based proteomics methodologies for novel biomedical applications. Biochemical Society Transactions. 48 (5), 1953-1966 (2020).
- Chen, C., Hou, J., Tanner, J. J., Cheng, J. L. Bioinformatics methods for mass spectrometry-based proteomics data analysis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 25 (2020).
- Peshkin, L., et al. On the relationship of protein and mRNA dynamics in vertebrate embryonic development. Developmental Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Mi, H. Y., et al. PANTHER version 16: a revised family classification, tree-based classification tool, enhancer regions and extensive api. Nucleic Acids Research. 49, 394-403 (2021).
- Schmidt, E., et al. On the Move Federated Workshops. , Springer, Verlag. Berlin. 710-719 (2006).
- Deutsch, E. W., et al. Trans-Proteomic pipeline, a standardized data processing pipeline for large-scale reproducible proteomics informatics. Proteomics Clinical Applications. 9 (7-8), 745-754 (2015).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Demsar, J., et al. Orange: Data mining toolbox in Python. Journal of Machine Learning Research. 14, 2349-2353 (2013).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. Journal of Proteome Research. 8 (5), 2144-2156 (2009).
- Jensen, L. J., et al. STRING 8 - a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, 412-416 (2009).
- Schweppe, D. K., Huttlin, E. L., Harper, J. W., Gygi, S. P. BioPlex display: an interactive suite for large-scale AP-MS protein-protein interaction data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 722-726 (2018).
- Hornbeck, P. V., et al. PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations. Nucleic Acids Research. 43, 512-520 (2015).
- Letunic, I., Khedkar, S., Bork, P. SMART: recent updates, new developments and status in 2020. Nucleic Acids Research. 49, 458-460 (2021).
- Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie-International Edition. 60 (23), 12852-12858 (2021).
- Lombard-Banek, C., Reddy, S., Moody, S. A., Nemes, P. Label-free quantification of proteins in single embryonic cells with neural fate in the cleavage-stage frog (Xenopus laevis) embryo using capillary electrophoresis electrospray ionization high-resolution mass spectrometry (CE-ESI-HRMS). Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2756-2768 (2016).
- Saha-Shah, A., et al. Single cell proteomics by data-independent acquisition to study embryonic asymmetry in Xenopus laevis. Analytical Chemistry. 91 (14), 8891-8899 (2019).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Analytical Chemistry. 89 (13), 7069-7076 (2017).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
