Summary
Rask deteksjon og pålitelig kvantifisering av RNA-redigeringshendelser i genomisk skala er fortsatt utfordrende og er for tiden avhengig av direkte RNA-sekvenseringsmetoder. Protokollen beskrevet her bruker mikrotemperatur gradient gel elektroforese (μTGGE) som en enkel, rask og bærbar metode for å oppdage RNA-redigering.
Abstract
RNA-redigering er en prosess som fører til posttranscriptionale sekvensendringer i RNAer. Deteksjon og kvantifisering av RNA-redigering er hovedsakelig avhengig av Sanger-sekvensering og RNA-sekvenseringsteknikker. Imidlertid kan disse metodene være kostbare og tidkrevende. I denne protokollen brukes et bærbart mikrotemperatur gradient gel elektroforese (μTGGE) system som en ikke-sekvenserende tilnærming for rask påvisning av RNA-redigering. Prosessen er basert på prinsippet om elektroforese, som bruker høye temperaturer for å denaturere nukleinsyreprøver når de beveger seg over en polyakrylamidgel. På tvers av en rekke temperaturer danner et DNA-fragment en gradient av fullstendig dobbeltstrenget DNA til delvis separerte tråder og deretter helt separert enkeltstrenget DNA. RNA-redigerte steder med distinkte nukleotidbaser produserer forskjellige smelteprofiler i μTGGE-analyser. Vi brukte den μTGGE-baserte tilnærmingen til å karakterisere forskjellene mellom smelteprofilene til fire redigerte RNA-fragmenter og deres tilsvarende ikke-editerte (wild-type) fragmenter. Pattern Similarity Scores (PaSSs) ble beregnet ved å sammenligne båndmønstrene produsert av de redigerte og ikke-editerte RNAene og ble brukt til å vurdere metodens reproduserbarhet. Totalt sett muliggjør plattformen som er beskrevet her, deteksjon av selv enkeltbasemutasjoner i RNAer på en enkel, enkel og kostnadseffektiv måte. Det forventes at dette analyseverktøyet vil bidra til nye molekylærbiologiske funn.
Introduction
Enkle nukleotidvarianter (SNVer) i genomiske RNA-varianter, inkludert A-til-I-, C-til-U- og U-til-C-varianter, kan indikere RNA-redigeringshendelser. Imidlertid er påvisning av SNVer i RNA fortsatt en teknisk utfordrende oppgave. Konvensjonelt bestemmes forholdet mellom redigert til ikke-editert RNA ved direkte sekvensering, allelspesifikk sanntids polymerasekjedereaksjon (PCR), eller denaturering av høyytelses væskekromatografi (HPLC) nærmer seg 1,2,3,4,5,6. Disse tilnærmingene er imidlertid ikke spesielt tids- eller kostnadseffektive, og deres lave nøyaktigheter, forårsaket av høye støynivåer, utgjør teknologiske flaskehalser for RNA-basert SNV-deteksjon 7,8. Her beskriver vi en protokoll basert på temperaturgraderingsgelelektroforese (TGGE) for å identifisere enkeltkjernepolymorfier (SNPer) som en alternativ metode som eliminerer behovet for direkte RNA-sekvenseringsmetoder til RNA-redigeringsanalyser.
Elektroforese er en foretrukket metode for separasjon og analyse av biomolekyler i biovitenskapelige laboratorier. TGGE muliggjør separasjon av dobbeltstrengede DNA-fragmenter som er av samme størrelse, men som har forskjellige sekvenser. Teknikken er avhengig av sekvensrelaterte forskjeller i smeltetemperaturene til DNA-fragmenter og påfølgende endringer i deres mobiliteter i porøse geler med en lineær temperaturgradient 9,10. Smelting av DNA-fragmenter genererer spesifikke smelteprofiler. Når domenet med lavest smeltetemperatur når den tilsvarende temperaturen i en bestemt posisjon i gelen, oppstår overgangen fra en spiralstruktur til en delvis smeltet struktur, og migrasjon av molekylet vil praktisk talt stoppe. Derfor benytter TGGE både mobilitet (størrelsesinformasjon) og temperaturinduserte strukturelle overganger av DNA-fragmenter (sekvensavhengig informasjon), noe som gjør det til en kraftig tilnærming til karakterisering av DNA-fragmenter. Funksjonen peker i et TGGE-smeltemønster, som tilsvarer tre strukturelle overganger av DNA-molekylet, er trådens innledende dissosiasjonspunkt, trådens midtdissosiasjonspunkt og trådens ende-dissosiasjonspunkt (figur 1). Sekvensvariasjoner innen domener, selv enkeltbaseforskjeller, påvirker smeltetemperaturen, og derfor vil molekyler med forskjellige sekvenser vise diskrete smeltemønstre (denaturering) i TGGE-analyser. Derfor kan TGGE brukes til å analysere SNVer i genomisk RNA og kan være en uvurderlig høygjennomstrømningsmetode for å oppdage RNA-redigering. Denne høygjennomstrømningsgevinsten går tapt når tradisjonell gelelektroforesebasert TGGE brukes. Imidlertid kan en miniatyrisert versjon av TGGE, kalt microTGGE (μTGGE), brukes til å forkorte gelelektroforetisk tid og akselerere analysen med en 100 ganger økning i produktiviteten11. Enkelheten og kompaktheten til μTGGE-metoden har blitt forbedret ved innføring av PalmPAGE12, et felt-aktuelt, håndholdt og rimelig geleelektroforesesystem.
Her brukes en ny TGGE-basert protokoll til å undersøke tre typer RNA-redigeringssider (A-til-I, C-til-U og U-til-C) i fire gener, inkludert to fra Arabidopsis thaliana vev og to uttrykt i pattedyr HEK293 celler (figur 1A). Protokollen integrerer bruken av PalmPAGE (maskinvare), et bærbart system for rask deteksjon av RNA-redigering og uMelt (programvare)13. Med en gjennomsnittlig kjøretid på 15-30 min muliggjør denne protokollen rask, pålitelig og enkel identifisering av RNA-redigering uten behov for direkte RNA-sekvenseringsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optimalisering av målfragmentet
MERK: Fire redigerte gener ble brukt i utviklingen av denne protokollen, inkludert to kjernegener (AT2G16586 og AT5G02670) fra A. thaliana, og genene som koder blått fluorescerende protein (BFP) og forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) uttrykt i HEK293-celler.
- For å identifisere genfragmenter med forskjellige smelteprofiler, som representerer redigerte kontra ikke-editerte regioner, generere predikerte smeltekurver ved hjelp av det nettbaserte verktøyet uMelt HETS, en utvidelse av den opprinnelige uMelt-programvaren13.
MERK: Dette verktøyet forutsier formene til smeltekurver for heteroduplex- og homoduplexprodukter. - For hvert målgen, design tre par genfragmenter (300-324 bp i lengde). Hvert par består av et fragment med et redigert område og et tilsvarende wild-type fragment med et ikke-editert område, som ligger enten i 5-terminalenden, midtposisjonen eller 3-terminalenden.
- Velg det ikke-redigerte/redigerte paret som viste den maksimale forskjellen mellom smelteområdene på helicity-aksen for videre analyse. For μTGGE-analyse, syntetiser det valgte genfragmentet ved PCR-forsterkning, som beskrevet i avsnitt 2 nedenfor.
- Design de fremre og omvendte primerne ved hjelp av DNADynamo-programvaren (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) og bekreft ved hjelp av NCBI Primer-BLAST-verktøyet.
- Fortynn primerne i TE-buffer (10 mM Tris-HCl som inneholder 1 mM EDTA· Na2) og oppbevar dem i en konsentrasjon på 100 pmol/μL. Før bruk, fortynn hver primer satt til en konsentrasjon på 10 pmol/μL ved hjelp av destillert vann.
2. RNA-ekstraksjon og RT-PCR-forsterkning av målfragmentet
- RNA-ekstraksjon
- Trekk ut total RNA fra kilden til redigerte og ikke-redigerte gener ved hjelp av standardmetoder, for eksempel TRIzol ekstraksjon14 eller kommersielt tilgjengelige sett.
- Utfør syntesen av den tilsvarende cDNA ved hjelp av en standard RT-PCR-protokoll som beskrevet i trinn 2.2.
- Omvendt transkripsjon
- Tilsett 1 μL oligo(dT) primer, 1 μL 10 mM dNTP-blanding, 10 μL total RNA og 10 μL sterilt destillert vann til et nukleasefritt mikrosenterrifugerør.
- Varm blandingen ved 65 °C i 5 minutter og inkuber deretter på is i minst 1 min.
- Samle innholdet i røret ved sentrifugering ved maksimal hastighet (12.000 x g) for 2-3 s, og tilsett 4 μL 5x ReverTra Ace buffer, 1 μL 0.1 M DTT, og 1 μL M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) omvendt transkripsjonase (200 U / μL, Tabell over materialer).
- Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned. Hvis du bruker tilfeldige primere, inkuber røret ved 25 °C i 5 minutter.
- Inkuber røret ved 55 °C i 60 minutter og aktiver deretter reaksjonen ved oppvarming ved 70 °C i 15 minutter, i et digitalt tørt bad/blokkvarmer.
- Mål konsentrasjonen av cDNA ved hjelp av et spektrofotometer og oppbevar det ved -25 °C.
-
PCR-forsterkning og bekreftende sekvensering av produkter
- Legg følgende reagenser til et nukleasefritt mikrosenterrør: 4 μL 5x Taq Polymerase Buffer, 2 μL 2 mM dNTP-blanding, 2 μL 25 mM MgCl2, 1,6 μL av primersettet (forover og bakover; hver 10 mM), 2 μL cDNA-mal, 0,1 μL Taq-polymerase (2,5 U/μL) og 8,3 μL sterilt destillert vann (sluttvolum, 20 μL).
- Utfør PCR med følgende sykkelforhold: innledende denaturering ved 95 °C i 2 minutter; 35 sykluser med denaturering ved 95 °C i 2 minutter, gløding ved en passende temperatur (avhengig av det spesifikke primersettet som brukes) i 30 s, og forlengelse ved 72 °C i 2 minutter; og deretter en endelig forlengelse ved 72 °C i 7 minutter.
- For å rense PCR-produktene, tilsett 2 U exonuklease I og 0,5 U reker alkalisk fosfatase (ExoSAP). Inkuber røret i en termisk syklist ved 37 °C i 1 time, etterfulgt av 80 °C i 15 minutter, og hold deretter ved 4 °C til neste trinn.
- For bekreftende sekvensering, tilsett 11,5 μL sterilt destillert vann, 2,5 μL forover eller bakoverprimer og 1 μL PCR-produkter (med ExoSAP) til et nytt mikrocentrifugerør.
MERK: Bruk DNA-sekvenseringstjenester (f.eks. Eurofins Genomics) for sekvenseringsanalyse. - Hvis du vil validere spesifisiteten til PCR-produktene, utfører du sekvensering med både forover- og omvendte primere. Primerparene som brukes i den representative analysen er gitt i tabell 1.
- Fortynn de rensede PCR-produktene til en konsentrasjon på 200 ng /μL med deionisert vann. Bland deretter 6 μL av det rensede produktet med 3 μL 6x gellastefargestoff i et 250 μL rør og øk det totale volumet til 12 μL med sterilt vann. Oppbevar PCR-produktet (ved -25 °C) til det er klart til å fortsette med μTGGE som beskrevet nedenfor.
3. μTGGE analyse
MERK: μTGGE-analysen utføres ved hjelp av et miniatyrisert og økonomisk system. En oversikt over hele systemet, inkludert gelkassetter, gelkassettholder, horisontal gelelektroforeseplattform, strømforsyning og gelavbildningssystem, er vist i figur 2.
- Montering av gelkassettene
- Gelkassetten som brukes til μTGGE-analyse er vist i figur 2A. Designet består av tre 1 tommers gelplater: en bunngelplate, en toppgelplate og en kjørefelt-tidligere plate. Smør den øverste gelplaten mellom de to andre platene og monter i gelkassettholderen for gelpolymerisering.
- Polyakrylamid gel forberedelse
- Tilsett 7,2 g urea i et 50 ml rør og oppløs i 10 ml sterilt vann. Varm prøven i en mikrobølgeovn i 20-30 s og ta den deretter til romtemperatur (RT).
- Tilsett 3 ml 5x Tris/borat/EDTA (TBE)-buffer (materialtabell), 2,25 ml 40 % (w/v) akrylamid/bis (19:1), 75 μL 10x ammoniumpersulfat og 15 μL tetrametyletylendiamin til oppløsningen.
- Hell straks geloppløsningen langsomt inn i gelkassettholderen, og unngå dannelse av luftbobler.
- Generering av smelteprofiler ved hjelp av μTGGE-enheten
- Bruk den miniatyriserte, økonomiske versjonen av μTGGE-apparatet vist i figur 2 med en temperaturgradient (25-65 °C) vinkelrett på retningen av DNA-migrasjon.
- Bløtlegg de øvre og nedre elektroforesebufferputene (0,5 cm x 2,5 cm) i 2 ml 1x TBE-buffer.
- Plasser gelkassetten i den horisontale elektroforesekammerenheten og plasser de øvre og nedre bufferputene tilsvarende, som vist i figur 2.
- Deretter laster du 10 μL av PCR-produktet inn i den midterste (lengre) brønnen og 1 μL av PCR-produktet i hver sidebrønn.
- Etter en 1 min ventetid, koble til strømforsyningen og tilførsel 100 V i 12 min ved en lineær temperaturgradient fra 25-65 °C.
- Etter at løpet er fullført, ta ut kassetten og fjern det øvre glassdekselet.
- Hell 300 μL 10x SYBR Gold flekk på gelen. Visualiser smelteprofilene ved hjelp av den blå LED-lommelykten som er installert i den elektroforetiske enheten i palmestørrelse.
MERK: En myk fil av gelbildet bør lagres for beregning av mønsterlikhetspoeng (PaSS). - Gjenta hvert elektroforetisk eksperiment 3x for å bekrefte reproduserbarheten av dataene.
4. PaSS-beregninger
MERK: Beregningene utføres ved hjelp av μTGGE Analyzer programvare.
- Last ned og åpne programvaren.
- Åpne JPEG-filen som inneholder gelbildet. Vær oppmerksom på at programvaren bare godtar JPEG-formatfiler.
- Klikk på Frame-knappen og velg riktig område (ramme) av gelbildet.
- Klikk på Koordinatkorrigering-knappen og legg til to referansepunkter, som vist i figur 1B.
- Klikk på knappen Tillegg av funksjonspunkter og legg til eksempelpunkter som vist i figur 1B. Lagre deretter de behandlede gelbildedataene i μTGGE -format (*.tgg).
- Klikk på Eksempel-knappen og velg Alternativet Søk etter enkle poeng for å sammenligne to eller flere bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruk av μTGGE for å identifisere enkeltkjernebaseendringer i RNA-redigeringshendelser
Fire redigerte gener ble brukt til denne protokollen (tabell 1), inkludert BFP-genet produsert i HEK293-celler (med C-til-U RNA-redigering av deaminase enzymer av apolipoprotein B mRNA redigeringsenzymkompleks; APOBEC115), EGFP-genet som inneholder okerstoppkodon (TAA) produsert i HEK293-celler (med A-til-I RNA-redigering ved adenosindeaminase som virker på RNA 1; ADAR116), og AT2G16586 og AT5G02670 kjernegener i A. thaliana17,18 (med U-til-C RNA-redigering). Enkeltkjerneplid forskjeller mellom de redigerte og tilsvarende ikke-redigerte prøvene ble bekreftet ved DNA-sekvensering. Deretter ble det utført en μTGGE-analyse for å undersøke forskjellene mellom smeltekurvene i prøvene (figur 3).
For redigeringstypen C-to-U viste den ikke-redigerte prøven med den opprinnelige C-basen et lengre smeltemønster ved strandsluttsmeltingspunktet enn den redigerte prøven med den modifiserte U-basen (figur 3A). For redigeringstypen A-to-I(G) viste det redigerte eksemplet med den endrede I(G)-basen et lengre smeltemønster ved strandsluttsmeltingspunktet enn den ikke-redigerte prøven med den opprinnelige A-basen (figur 3B). For den "omvendte" U-til-C RNA-redigeringstypen ble to gener analysert. For AT2G16586-genet viste den redigerte prøven med den modifiserte C-basen et lengre smeltemønster mellom trådens innledende smelte- og strandesluttsmeltingspunkter enn den ikke-editerte prøven med den opprinnelige U-basen (figur 3C). Det ble imidlertid ikke observert et lignende mønster for det andre AT5G02670-genet (figur 3D). Likevel var det en klar forskjell mellom de ikke-redigerte og redigerte typene på slutten av smeltepunktet. Dette viser at det å observere smelteprofiler tydelig er et viktig skritt i å skille mellom ikke-redigerte og redigerte typer.
Kvantitativ analyse av μTGGE-smeltemønstre som representerer RNA-redigeringshendelser
Deretter beregnet vi PaSS-verdiene11 for å evaluere reproduserbarheten til de μTGGE-baserte smelteprofilene som representerer de fire RNA-redigeringshendelsene beskrevet ovenfor. PaSS-verdien gir et mål på hvor nært to smeltemønstre kan legges over, noe som genererer en høyere verdi (maksimum: 1) for svært like smeltemønstre. Dermed forventes PaSS-verdier for sammenligninger av ikke-redigerte og redigerte prøver å være mindre enn ett. Som vist i figur 1B ble funksjonspunktene i smeltemønstrene som korresponderte med strukturelle overganger fra dobbeltstrenget til enkeltstrenget DNA, brukt til å beregne PaSS-verdier. For å eliminere eksperimentelle variabler ble det utført dataassistert normalisering ved hjelp av to interne referansepunkter: referansepunkt #1, som representerer plasseringen av prøven i dobbeltstrenget form (kjørefelt lengst til venstre) og referansepunkt #2, som representerer plasseringen av prøven i enkeltstrenget form (kjørefelt lengst til høyre). Koordinatene til funksjonspunktene ble normalisert til de interne referansepunktene og ble deretter brukt til å beregne PaSS-verdiene. Hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger, og gjennomsnittsverdien ble bestemt. Som forventet var PaSS-verdiene for de fire redigerte prøvene lavere enn ett (figur 4). PaSS-verdiene for redigeringstypene C-to-you og A-to-I RNA var lavere enn verdiene for de to U-til-C RNA-redigeringstypene. Denne forskjellen er sannsynligvis relatert til de respektive plasseringene til redigeringsnettstedene. Spesielt var C-to-you og A-to-I redigerte nettsteder plassert relativt nær 5'-terminalendene (i posisjon 48 og 59 av ~ 300 bp fragmenter, henholdsvis), mens U-til-C redigerte nettsteder var plassert nær midten av fragmentene (i henholdsvis posisjon 152 og 169). Disse funnene tyder på at redigerte steder plassert i terminalposisjoner kan oppdages ved hjelp av μTGGE lettere enn de som ligger mot midten av fragmenter.
Optimalisering av TGGE-smeltemønstre for å identifisere RNA-redigeringshendelser
Som våre tidligere resultater antydet at PaSS-verdien kan variere avhengig av den spesifikke posisjonen til RNA-redigeringsstedet, undersøkte vi forskjellene mellom smeltemønstrene til et 300 bp fragment av BFP-genet (uttrykt i HEK293T-celler) der et C-til-U-redigert nettsted var plassert nær 5'-terminalenden, nær 3'-terminalenden, eller i midten av fragmentet (figur 5A). Før μTGGE-analysen ble smeltemønstrene til det ikke-redigerte fragmentet og tre redigerte fragmenter spådd ved hjelp av det nettbaserte verktøyet uMelt HETS. Denne analysen viste at C-til-U-modifikasjonen ville forventes å flytte smeltekurven til venstre langs temperaturaksen (figur 5B). PaSS-verdiene beregnet fra μTGGE-analyser av de ikke-redigerte og de tre redigerte fragmentene ble sortert som følger: 5'terminal end RNA edit < 3'-terminal end RNA edit < sentrum av 5'- og 3'-terminal ender RNA redigere (Figur 5C). Spesielt var disse PaSS-verdiene i samsvar med resultatene som ble spådd ved hjelp av uMelt. Disse funnene indikerer at nukleotidbaseforskjeller plassert ved den 5' eller 3'terminale enden resulterer i større variasjoner mellom PaSS-verdiene til redigerte og ikke-redigerte gener enn nukleotidbaseforskjeller som ligger mer sentralt. I tillegg tyder disse resultatene på at forkunnskaper om forskjellene mellom smelteprofilene til redigerte og ikke-redigerte gener kan brukes som en veiledning for å optimalisere genfragmenter for RNA-redigering.
Figur 1: Prosedyren som brukes til å identifisere RNA-redigering ved μTGGE. (A) Hvilke typer RNA-redigeringshendelser som undersøkes. (B) En skjematisk illustrasjon av de typiske smelteprofilene til redigerte og ikke-redigerte gener. I μTGGE migrerer en prøve gjennom en temperaturgraderingsgel, og produserer en karakteristisk krumning. Funksjonspunktene i smeltemønsteret tilordnes og behandles deretter for å beregne en PaSS-verdi (Pattern Similarity Score). PaSS-beregningen utføres som vist i ligningen, der vektoren P for hvert funksjonspunkt er i tilsvarende posisjon og funksjonen til temperatur og mobilitet (dvs. vektor P = P (T, m)). Hevet skrift (1) og (2) representerer henholdsvis de redigerte og ikke-redigerte genene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Illustrasjoner og fotografier av gelelektroforeseenheten i palmestørrelse. (A) Montering av de tre 1 i gelkassetter. (B) Illustrasjon av gelkassettholderen med temperaturgradientplaten. Bildet viser posisjonene til de øvre og nedre bufferputene, samt prøvens plassering etter første innlasting. (C) Oversikt over hele systemet, inkludert strømforsyning, horisontal gelelektroforeseplattform og gelavbildningssystem. Dette systemet gir en levedyktig løsning for raske, polyakrylamidgelelektroforesebaserte analyser på stedet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: TGGE-analyser av enkeltkjerneplagerendringer i RNA-redigeringshendelser. Smelteprofiler for tre forskjellige RNA-redigeringstyper ble undersøkt ved hjelp av fire gener. (A) C-til-U RNA-redigering i BFP uttrykt i HEK293T-celler. (B) A-til-I(G) RNA-redigering i EGFP uttrykt i HEK293T-celler. (C) U-til-C RNA-redigering i AT2G16586-genet fra A. thaliana. (D) U-til-C RNA-redigering i AT5G02670-genet fra A. thaliana. Plasseringene til de redigerte områdene er uthevet i gult (med rød skrift), og primerposisjonene er understreket. Forskjellene mellom smeltemønstrene i de redigerte og ikke-redigerte prøvene angis av røde sirkler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Gjennomsnittlige PaSS-verdier for de fire redigerte genene som undersøkes her. Feilfelt representerer standardavviket for tre replikeringer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Posisjonsspesifikk PaSS-analyse. (A) Redigeringsstedet for C-til-U-typen RNA i BFP-genet uttrykt i HEK293T-celler ble flyttet til den 5'terminale enden, 3'-terminalenden eller midten av genfragmentet. (B) Teoretisk prediksjon av smeltemønstrene til de ikke-redigerte og tre redigerte fragmentene vist i (A). Spådommene ble utført ved hjelp av uMelt. (C) De gjennomsnittlige PaSS-verdienetil de redigerte genene vist i (A). Feilfelt representerer standardavviket for tre replikeringer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| S.No | RNA-redigering | Kilde | Posisjon | Gen-ID | Fremre primer | Omvendt primer | Lengde på sekvens | ||
| 1 | C-til-U | HEK293T-celler | 48. plass | EGFP | AAGCTGACCC TGAAGTTCATC |
GCTGTTGTAGT TGTACTCCAGC |
324 | ||
| 2 | A-til-I | HEK293T-celler | 59. plass | EGFP | AGGGCGATGC CACCTACGGCA |
CCGTCCTCCT TTAAGTCGA |
300 | ||
| 3 | U-til-C | Arabidopsis | 152. plass | AT2G16586 | GGGCGATGTT ACGCTCGATGA |
GTGAAGAGTAA CATGGCGTT |
301 | ||
| 4 | U-til-C | Arabidopsis | 169. plass | AT5G02670 | CCAGTTGGCAG AATCCAGTCA |
CTAGCTTCCAC TGTTGAGATTC |
300 | ||
Tabell 1: Liste over gener som brukes i gjeldende protokoll
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA-redigering spiller en viktig rolle i biologi; Imidlertid presenterer nåværende metoder for å oppdage RNA-redigering, for eksempel kromatografi og sekvensering, flere utfordringer på grunn av deres høye kostnader, overdrevne tidskrav og kompleksitet. Protokollen som er beskrevet her, er en enkel, rask og kostnadseffektiv metode for å oppdage RNA-redigering som bruker et bærbart, mikrosized, TGGE-basert system. Dette systemet kan brukes til å skille mellom redigerte og ikke-redigerte gener før Sanger-sekvensering. Nærmere bestemt kan redigerte og ikke-redigerte gener med enkeltbase nukleotid modifikasjoner differensieres basert på endringer i TGGE-smelteprofilene. Siden det inneholder 1 i geler, krever systemet svært små mengder prøver og muliggjør rask påvisning av forskjeller mellom sekvenser. I tillegg er protokollen som er beskrevet her veldig enkel å følge for både eksperter og nykommere til feltet. Optimalisering av målgenfragmentet er avgjørende for klar differensiering mellom redigerte og ikke-redigerte regioner, og denne prosessen forenkles i gjeldende protokoll.
Denne protokollen er kompatibel med multipleksanalyser ved hjelp av fluorescerende merkede primere. For kvantitative analyser kan ukjente RNA-prøver (redigert eller ikke-editert) merkes med grønn fluorescens og komigrated med en rød fluorescensmerket referansestandard (redigert eller ikke-editert) under TGGE-analyse.
I tillegg til å demonstrere μTGGE-metodens evne til å oppdage enkeltkjerne RNA-redigeringshendelser, validerte vi også likheten mellom det eksperimentelle resultatet oppnådd ved hjelp av μTGGE og et teoretisk resultat oppnådd for det samme genfragmentet ved hjelp av uMELT. Videre fant vi at nukleotidbaseforskjeller plassert på 5' og 3'-terminalene av genfragmenter gir større forskjeller i μTGGE smelteprofiler (dvs. mindre PaSS-verdier) enn de som ligger mot midten av fragmentene. Selv om den er lovende, kan den nåværende protokollen være begrenset til analyse og deteksjon av bestemte typer nukleotidendringer under RNA-redigering. Ytterligere optimalisering og utvikling av denne protokollen for å analysere andre typer og / eller steder for RNA-redigering vil bli utført i vår kommende forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for Scientific Research fra Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 og 18K19288). Ruchika ble økonomisk støttet av den japanske regjeringen (MEXT-stipend). Vi takker Ms. Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) og Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) for hjelp med elektroforeserelaterte eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J.
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, Clifton, N.J. 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
