Summary
여기의 프로토콜은 Zea mays 와 Festuca rubra의 두 종에 대한 뿌리의 arbuscular mycorrhizal 식민지화 패턴과 전략을 평가하는 방법을 설명합니다. MycoPatt 방법을 사용하면 매개 변수 계산, 균근 구조를 디지털 데이터로 변환하고 뿌리에서 실제 위치를 매핑 할 수 있습니다.
Abstract
Arbuscular 균근 곰팡이는 식물의 뿌리에있는 공생체입니다. 그들의 역할은 숙주 발달을 유지하고 생태계의 영양 균형을 유지하는 것입니다. 식민지화 과정은 토양 생태학, 곰팡이와 숙주의 유전 적 다양성, 농업 관행과 같은 여러 요인에 따라 달라집니다. 그들의 동기화 된 작용은 복잡한 균사 네트워크의 발달로 이어지고 뿌리 세포에서 소포와 arbuscules의 2 차 발달로 이어진다. 이 연구의 목적은 Festuca rubra 및 Zea mays의 뿌리에서 곰팡이 구조의 위치를위한 균근 패턴 (MycoPatt) 방법의 효율성을 분석하는 것이 었습니다. 또 다른 목표는 각 종의 균근 지도에 의해 밝혀진 곰팡이 식민지화 전략을 탐구하는 것이었습니다. 여러 현미경 이미지의 획득 및 조립을 통해 옥수수 및 적색 페스 큐 식물 모두에서 균근 집락 평가를 통해 개발 된 구조의 실제 위치에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. 관찰 된 균근 패턴은 적용된 처리 및 성장 단계로 인한 토양 공생 균류와의 연결 개발 측면에서 각 식물의 다양한 효율성을 강조합니다. MycoPatt 방법을 통해 얻은 Mycorrhizal 상세지도는 토양에서 공생 획득에서 식물 효율성을 조기에 감지하는 데 유용합니다.
Introduction
Arbuscular mycorrhiza (AM) 곰팡이는 연구자들에게 지속적으로 관심있는 토양 매개 내생 식물의 범주입니다. 대부분의 식물의 뿌리에 존재하고 영양 순환에 관여하기 때문에 초본 식물이 존재하는 모든 생태계의 안정성에 중요한 구성 요소가 됩니다 1,2. 그들의 여분의 방사상 균사체를 통해 AM은 특히 도달하기 어려운 지역에서 식물 뿌리에 대한 곰팡이 확장 역할을합니다3. 주요 활동은 숙주 식물 뿌리에 있으며, AM은 큰 균사 네트워크와 arbuscules라고하는 특정 세포 내 구조를 개발합니다. 숙주 특이성이 없기 때문에 공생체가 동시에 여러 종을 식민지화 할 수 있습니다. 이 능력은 AM에게 생태계에서 자원 할당 및 영양 조절의 역할을 제공합니다. 곰팡이는 또한 식물 생존을 지원하고 식물 성능 4,5,6,7을 돕습니다. 숙주 뿌리에 대한 AM 종의 반응은 방사상 내 균사체의 확장 및 위치 및 세포 내에서 발달 된 arbuscules의 존재와 모양에서 볼 수 있습니다. 세포 내 arbuscules는 두 공생 사이의 교환 지점 역할을하며 빠른 전달 과정을 특징으로하는 영역을 나타냅니다. AM이 생산하는 구조는 종 의존적이며 뿌리에서 arbuscules 외에도 소포, 포자 및 보조 세포를 개발합니다.
식물 뿌리 8,9에서 AM 공생체를 평가하는 데는 많은 어려움이 있습니다. 첫 번째는 숙주의 전체 식생 기간 동안 지속적으로 발달하여 균사 arbuscular 구조에 여러 가지 변화를 가져옵니다. 붕괴까지의 arbuscular 성장의 여러 단계는 뿌리에 분명히 존재하지만, 노화 AM 구조는 때때로 소화되어 부분적으로 만 볼 수 있습니다10. 두 번째 과제는 염색 방법 및 프로토콜, 뿌리 시스템의 다양성, 세포의 크기 및 두께의 차이로 대표되며, 이로 인해 통일 된 방법을 제안하기가 어렵습니다. 마지막 도전은 AM 식민지화의 평가 및 점수로 표현됩니다. 다양한 객관성으로 AM에 점수를 매기는 방법은 여러 가지가 있으며 대부분은 여전히 현미경 기술로 제한됩니다. 단순한 것들은 뿌리 피질의 구조 유무를 기반으로하는 반면, 더 복잡한 것들은 식민지 현상의 빈도와 강도의 통합과 함께 시각적 점수 매기기와 식민지화 클래스의 사용을 기반으로합니다. 지난 수십 년 동안 여러 종의 균근 상태에 대한 많은 데이터가 생성되었지만 대부분의 방법은 뿌리 피질의 각 구조의 실제 위치를 가리 키지 않고 관찰 된 식민지화 값으로 제한됩니다. AM 집락화에 대한 보다 정확한 결과의 필요성에 대한 응답으로, 뿌리의 균근 패턴(MycoPatt)의 현미경 분석에 기초한 방법이 개발되어 상세한 균근 지도(11)를 디지털 형태로 조립했습니다. 또한이 방법을 사용하면 식민지화 매개 변수를 객관적으로 계산하고 루트에서 각 구조의 실제 위치를 결정할 수 있습니다.
AM 곰팡이 구조의 위치는 다음 두 가지 질문에 답하는 데 중요 할 수 있습니다. 첫 번째는 식물의 식생주기에서 특정 순간의 식민지화 분석과 관련이 있습니다. 이러한 맥락에서 수목/소포 풍부도를 관찰하고, 뿌리에 어떻게 위치하는지 보고하고, 매우 명확한 식민지화 이미지와 매개변수를 제공하는 것이 매우 유용합니다. 두 번째는 곰팡이 전략의 탐지와 그 방향, 심지어 미래 발전의 예측과 관련이 있습니다. MycoPatt의 한 가지 응용 분야는 매일, 2-3일마다, 매주 또는 다양한 성장 단계에서 분석된 식물을 위한 것입니다. 이러한 맥락에서 소포 / arbuscules의 위치는 AM 식민지화의 생물학적 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 이러한 매개 변수와 관찰은 수학적 매개 변수를 보완하는 데 매우 유용합니다.
이 기사의 목적은 MycoPatt 시스템이 다양한 발달 단계에서 Zea mays (옥수수) 뿌리와 다양한 장기 수정 조건에서 Festuca rubra (붉은 페스 큐) 뿌리에서 토착 AM 곰팡이 식민지화 잠재력과 전략을 탐구 할 수있는 능력을 입증하는 것입니다. 목표를 달성하기 위해 두 번의 실험에서 두 개의 큰 데이터베이스를 분석했습니다. 옥수수 실험은 Cojocna (북위 46 ° 44′ 56 "및 길이 23 ° 50′0")에서 확립되었습니다. E), 농업 과학 및 수의학 대학의 실험 교훈 농장에서 Cluj는 양토 질감의 토양을 가진 phaeoziom에12. 적색 페스큐 실험은 2001년 아푸세니 산맥의 게샤리(북위 46°49'064" 및 길이 22°81'418'')에 설립된 더 큰 실험 사이트의 일부입니다. E), 프렐루보솔(테라로사) 토양 유형13,14. 옥수수는 5 개의 다른 성장 표현상12에서 수집되었다 : B1 = 2-4 잎 (균근 식민지화 시작을위한 조절점으로서); B2 = 6 잎; B3 = 8-10 잎; B4 = 개암 나무 열매 형성; B5 = 생리적 성숙도. 2-4 잎 단계 (A0)에서 시작하여 유기 처리가 적용되어 2 개의 눈금 계수 (A1 = 대조군 및 A2 = 처리)가 발생했습니다. 붉은 fescue의 뿌리는 5 개의 장기 수정13,14 실험에서 개화시 수집되었습니다 : V1 = 대조군, 비 수정; V2 = 10 t·ha-1 분뇨; V3 = 10 t·ha-1 분뇨 + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P2O5 50 kg·ha-1,K2O50 kg·ha-1; V5 = 10 t·ha-1 분뇨 + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1. 각 개발 단계에서 모든 수정 변종에서 5 개의 식물을 수집했습니다. 염색 프로토콜과 샘플 처리 시간 및 염색 품질 측면에서 그 성능을 분석했습니다. AM 균사 발달과 뿌리에서의 구조 존재 사이의 관계는 각 종에 대해 개별적으로 분석되었으며 식민지화에 가장 관대 한 뿌리를 식별하는 것으로 계속되었습니다. 각 루트 시스템의 특정 식민지화 패턴은 식민지화 맵과 AM 매개 변수의 값을 기반으로 분석되었습니다.
옥수수는 뿌리의 지속적인 성장을 의미하는 일년생 식물이며, 이것이 성장 단계에서 MycoPatt를 적용하는 주된 이유였습니다. Red fescue는 다른 비료로 오랫동안 처리 된 초원의 다년생 식물입니다. 그것의 뿌리는 1 년의 더 짧은 발달을 가지고 있고, anthesis는 식물이 신진 대사를 식물에서 생식으로 바꿀 때 식생 지점으로 간주됩니다. 이 강렬한 활동 기간 동안 이러한 식물을 잡기 위해 위에서 언급 한 시점이 선택되었습니다. 식생 기간 동안의 샘플링은 자연 초원에서 재배 될 때이 종에 대해 어렵습니다.
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Protocol
1. 생물학적 물질 선택, 뿌리 샘플링 및 저장
- 각 변종에 대해 별도로 삽 (그림 1A)으로 식물의 전체 뿌리를 수집하고 복제하십시오. 뿌리에서 큰 토양 응집체를 손으로 부드럽게 제거하십시오. 전체 뿌리 시스템을 씻고 1cm x 1cm 셀로 눈금으로 측정하십시오 (그림 1B). 각 식물에 대해 뿌리를 따로 자르고 비닐 봉지에 넣으십시오.
- 비닐 봉지에 각 식물의 깨끗한 뿌리를 모두 모으고 하나의 큰 봉지에 한 변종의 모든 샘플을 수집하십시오. 각 가방에 스테이지/변형 이름과 샘플링 날짜를 적습니다. 가공할 때까지 뿌리를 -4°C에서 -20°C 사이의 온도에서 냉장고 또는 냉동고에 보관하십시오.
2. 현미경을 위한 뿌리 처리, 제거 및 염색
알림: 프로토콜의 이 단계에서는 장갑, 마스크 및 미생물학적/화학적 후드를 사용하십시오.
- 루트 해동 과정이 실온에서 천천히 수행되는지 확인하십시오. 모든 가공 단계에서 작은 항아리 (30-50 mL)를 사용하여 필요한 약제의 양을 줄이십시오.
- 서른 클리어링 및 염색 절차15의 다음 4단계를 수행한다. 실온에서 모든 단계를 수행하십시오. 이 방법을 사용하면 끓기 위해 수조를 사용하지 않고도 동시에 많은 수의 샘플을 처리 할 수 있습니다.
- 뿌리 정리 : 한 식물의 모든 뿌리를 항아리에 넣습니다. 수돗물로 10 % NaOH 용액을 준비하고 뿌리를 완전히 덮을 때까지 각 병에 부어 넣으십시오. 항아리를 1 분 또는 2 분 동안 격렬하게 흔들어 뿌리에 균일 한 맑은 용액이 분산되도록합니다. 24 시간 후에이 절차를 반복하고 적어도 48 시간 동안 클리어링 용액에 뿌리를 두십시오.
알림: 깨끗한 뿌리는 옅은 노란색 (흰색까지) 측면을 가지며 일관성이 부드럽습니다 (핀셋으로 눌러 쉽게 분쇄 할 수 있음). - 뿌리 헹굼 : 한 번에 한 병의 내용물을 체에 통과시킵니다. 클리어링 용액을 재활용하십시오. 클리어링 용액이 완전히 제거 될 때까지 수돗물로 뿌리를 여러 번 헹굽니다.
알림: 투명화 용액이 완전히 제거되지 않으면 염색 절차의 품질에 영향을 미칩니다. - 뿌리 염색 : 헹군 뿌리를 깨끗한 병에 넣으십시오. 수돗물(파란색 잉크 5mL + 9% 아세트산 5mL + 수돗물 90mL)로 5%:5% 잉크 식초 용액을 준비합니다. 뿌리를 완전히 덮을 때까지 각 병에 용액을 붓습니다. 항아리를 1 분 또는 2 분 동안 격렬하게 흔들어 뿌리에 균일 한 염색 용액 분산을 생성합니다. 24 시간 후에이 절차를 반복하고이 용액에 뿌리를 48 시간 동안 그대로 두십시오.
참고: 얼룩진 뿌리는 강렬한 파란색을 띠고 있습니다. - 뿌리 부분 얼룩 제거: 얼룩진 뿌리를 수돗물에 1-2분 동안 헹굽니다. 항아리를 세게 흔들어 여분의 얼룩 용액을 제거하십시오. 염색이 너무 강렬하고 명확한 현미경 평가를 허용하지 않는 경우 절차를 반복하십시오.
참고: 염색된 뿌리는 염색 품질을 변경하지 않고 실온에서 최대 1주일 동안 수돗물에 보관할 수 있습니다(그림 2). 더 오랜 기간 동안 뿌리는 5 % 상업용 사과 식초 용액 (5 % 아세트산)에서 최대 2-3 개월 동안 유지 될 수 있습니다.
- 뿌리 정리 : 한 식물의 모든 뿌리를 항아리에 넣습니다. 수돗물로 10 % NaOH 용액을 준비하고 뿌리를 완전히 덮을 때까지 각 병에 부어 넣으십시오. 항아리를 1 분 또는 2 분 동안 격렬하게 흔들어 뿌리에 균일 한 맑은 용액이 분산되도록합니다. 24 시간 후에이 절차를 반복하고 적어도 48 시간 동안 클리어링 용액에 뿌리를 두십시오.
3. 현미경 검사를위한 루트 처리
- 뿌리 분할: 각 샘플의 염색된 뿌리를 스케일링된 도마에 놓습니다(그림 3A). 뿌리를 1cm 세그먼트로 자릅니다 (그림 3B). 각 변형에 대해 15개의 세그먼트를 선택합니다.
- 세그먼트 준비를위한 부드러운 분쇄 방법 : 슬라이드에 뿌리를 펼칩니다. 라미네이팅 파우치를 사용하여 뿌리를 덮고 가장자리에서 시작하여 부드럽게 분쇄합니다(그림 3C, D). 핀셋, 메스 손잡이, 펜 또는 지우개가 달린 연필과 같은 부드러운 플라스틱 도구를 사용하여 슬라이드에 뿌리를 천천히 표시합니다. 라미네이팅 파우치를 조심스럽게 제거하고 커버슬립으로 샘플을 덮습니다(그림 3E).
참고 : 뿌리는 관형이므로 2 차원 평면에서 분리해야합니다. 이 동작은 중간 지점에서 뿌리가 분리되어 내경의 두 부분이 표시된다고 가정합니다. 부드러운 분쇄 절차에서 라미네이팅 파우치를 사용하면 실린더 형태의 뿌리를 왼쪽과 오른쪽에 하나씩 중간 지점을 향해 두 조각으로 표시 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 전체 루트를 심층적으로 분석하고 집락 정도는 체적 식민지화를 보여주는 매개 변수입니다 (MycoPatt11의 원래 작업에 설명 됨). 기본적으로 실린더를 반으로 자른 후 수학적으로 다시 만듭니다. - 피펫으로 슬라이드 모서리에 물을 넣고 물이 슬라이드에 천천히 퍼지도록 합니다(그림 3F). 종이 타월로 여분의 물을 제거하십시오.
4. 뿌리 샘플의 현미경 분석
- 좋은 해상도의 카메라가 장착 된 현미경을 사용하십시오.
- 말단에서 시작하여 슬라이드를 분석합니다. 각 미세한 필드를 캡처합니다. 캡처된 각 이미지의 이름을 루트 파트의 실제 사후 조립을 허용하는 코드로 바꿉니다. 두꺼운 뿌리의 경우 10x 또는 40x 배율을 사용하고 얇은 뿌리의 경우 40x 배율을 사용합니다. 종의 전체 뿌리 집합에 대해 동일한 대물렌즈와 배율을 사용합니다.
5. 현미경 후 이미지 조립
- 프레젠테이션 소프트웨어를 사용하여 이미지 조립을 위한 드로잉 보드를 디자인합니다. 너비를 이미지 너비보다 2-3cm 넓게 설정하십시오. 캡처 순서대로 한 세그먼트에서 캡처된 모든 이미지를 추가하고 루트 세그먼트의 전체 길이를 재구성합니다(그림 4A).
- 간단히 말해서, 각 1cm 세그먼트에 대해 총 15개의 사진을 수집하고 프레젠테이션 소프트웨어에서 1에서 15까지 수직으로 구성하여 세그먼트를 재구성합니다.
- 이미지를 가운데에 맞춥니다. 수직 정렬을 사용하여 각 이미지가 이전 이미지를 따르도록 합니다. 모든 그림에서 전체 루트 세그먼트를 덮도록 10 셀 x 150 셀의 격자를 배치하십시오.
- 또한 각 개별 그림에 10 x 10 격자를 배치하고 이 격자의 모든 셀에 AM 구조가 표시되는 경우 1에서 6까지의 숫자를 삽입하고 AM 구조가 없는 경우 비워 둡니다. 이러한 방식으로 공정의 정확도는 관찰되는 AM 구조의 위치에 오류가 없이 최대입니다.
- 너비가 10셀이고 길이가 150셀인 그리드에 대한 표를 추가합니다(10셀로 구성된 15제곱 x 10셀). 테이블 너비 치수를 이미지 너비로 변경합니다. 모든 이미지를 포함하도록 테이블의 길이를 변경합니다(그림 4B).
6. 균근 집락의 점수 매기기
- 균근 패턴 방법11에 설명 된대로 각 유형의 구조를 점수화하기 위해 고유 번호를 사용하십시오 : 균사에 대한 1; 2 arbuscules; 소포의 경우 3; 포자의 경우 4; 보조 셀의 경우 5; 진입점의 경우 6입니다(그림 4C). 이전에 적용된 그리드의 각 세포에서 관찰된 각 균근 구조에 점수를 매깁니다(그림 4D).
7. 원시 데이터 분석 및 결과 추출
- 획득한 모든 점수를 MycoPatt 스프레드시트(11)에 삽입한다. 복사/붙여넣기 기능을 사용하여 프레젠테이션의 모든 점수를 rawdata 라는 첫 번째 시트로 전송합니다(그림 5).
- 결과의 기본 분석: MycoPatt 스프레드시트 도구에서 매개 변수라는 세 번째 시트를 사용하여 결과를 세 가지 형식으로 개별적으로 백분율(%)로 시각화합니다(그림 6A-C). A에서 K 열을 사용하여 식민지화의 수평 이미지를 분석합니다. 컬럼 M 내지 W 를 이용하여 식민지화의 수직 이미지를 분석하는 단계; 그리고 열 Y에서 AI로 15 개의 10 x 10 사각형 (2-17 행) 각각에 대한 횡단 (평균) 식민지화와 최종 평균 식민지화 (19-20 행)를 분석합니다.
참고: 횡단 평균 식민지화는 수평 및 수직 분석과 관련된 실제 식민지화 매개변수의 계산에 사용됩니다. 이러한 방식으로, 수평 또는 수직 분석만이 사용되는 경우와 비교하여 오류가 발생할 수 없다(원본 작업(11)에서 상세히 설명됨). 또한이 매개 변수 세트는 현미경 필드의 전체 표면에 대해 계산됩니다.- 각 매개 변수에 특정한 정의와 공식을 사용하여 결과를 분석하십시오11. 식민지화 빈도 (%), 식민지화 강도 (%), arbuscules (%) 및 소포 (%), 포자 (%) 및 보조 세포 (%), 진입 점 (%), 비 균근 영역의 백분율 (%), 전체 식민지화 정도 (%) 및 균근 / 비 균근 영역의보고.
참고: 분석된 샘플에서 arbuscules, 소포, 포자, 보조 세포 및 진입점이 누락된 경우 MycoPatt 스프레드시트는 이를 영(0)으로 채점합니다.
- 각 매개 변수에 특정한 정의와 공식을 사용하여 결과를 분석하십시오11. 식민지화 빈도 (%), 식민지화 강도 (%), arbuscules (%) 및 소포 (%), 포자 (%) 및 보조 세포 (%), 진입 점 (%), 비 균근 영역의 백분율 (%), 전체 식민지화 정도 (%) 및 균근 / 비 균근 영역의보고.
- 균근 지도의 생성 및 추출: MycoPatt 명명된 그래프의 두 번째 시트에서 균근 구조 코드를 색상으로 변환하여 얻은 이미지를 시각화 합니다 (그림 7A). 그래프 시트의 결과 이미지를 이미지로 내보냅니다(그림 7B). 균근 패턴 분석을 위해 범례의 색상 코드를 사용하십시오.
- 균근 지도 분석: 균근 지도에서 가장 중요한 구조와 그 집합을 식별합니다. 분석된 뿌리에서 관찰된 균근 집락화 패턴을 설명하십시오. 뿌리에서 관찰된 구조적 발달, 분기 패턴 및 수목/소포 발달을 기반으로 한 균근 집락화 전략을 설명합니다.
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Representative Results
염색 절차 후 뿌리의 부드러운 분쇄 방법을 올바르게 사용하면 Zea mays (그림 8A-C)와 Festuca rubra (그림 9A-E) 모두에 대해 균근 구조에 대한 좋은 세부 사항, 균근 구조와 뿌리 세포 사이의 좋은 대비, 파란색으로 인한 비석 확인. 세척 및 염색 절차가 성공하지 못하면 뿌리 샘플을 분쇄하기 어렵고 균근 구조가 명확하게 표시되지 않습니다(그림 10A-E). 이 경우 전체 클리어링 염색 절차를 반복하십시오.
균근 패턴 방법과 MycoPatt 도구를 사용하여 식민지화 메커니즘을 완전히 탐구 할 수있었습니다. 이 방법은 식민지화 매개 변수 (표 1 및 표 2)의 추가 시각적 표현과 함께 각 종 (그림 11 및 그림 12)에 대한 식민지화 패턴 및 전략에 대한 심층적 인 소규모 탐구를 제공합니다. Zea mays에 대해 수행 된 두 가지 연구는 Pop-Moldovan et al.12에 의해 광범위하게 설명되었으며 Corcoz et al. 13,14, 관측, 균근 지도 및 식민지화 매개변수의 대규모 데이터베이스를 제공했습니다. 두 데이터베이스 모두 집락화 빈도(%), 집락 강도(%), 수목(%) 및 소포(%), 비균근 영역의 백분율(%), 전체 집락 정도(%) 및 균근/비균근 영역의 보고를 집락화 매개변수로 채점했습니다. Zea mays의 경우 데이터베이스는 390개의 식민지 지도로 컴파일된 스프레드시트 데이터베이스의 5,850줄 항목으로 구성되었습니다. Zea mays 실험은 뿌리의 식민지 영역 간의 교대 및 중단을 설명하기위한 매개 변수로 균근 / 비 균근 영역의 보고서를 제안했습니다. 이 접근법은 식민지화 메커니즘과 뿌리를 따라 발전에 대한 심층 분석을 허용합니다. Festuca rubra는 300개의 지도로 컴파일된 스프레드시트에 4,500개의 라인 항목 데이터베이스를 제공했습니다. 하나의 새로운 색인인 arbuscules/vesicles 보고서가 제안되었으며, 이는 식민지화 전략의 지표로 추가로 사용되었습니다. 식민지화 전략에 대한 전반적인 평가는 균근 발달의 네 가지 시나리오, 즉 1) 번식 전략, 2) 이전 전략, 3) 저장 전략, 4) 식물 저항 전략을 제안했습니다. 가장 대표적인 균근 지도의 추출을 위해, 두 데이터베이스는 식민지화의 빈도 및 강도의 변환된 평균값을 기반으로 탐색되었으며, 그 결과 분석된 각 변이체에 대해 세 가지 다른 지도가 추출되었습니다(표 1 및 표 2). 세 개의 맵은 다음에 가장 가까운 값을 갖는 루트 세그먼트의 AM 식민지화를 나타냅니다: 각 변형의 평균(Av)은 변형에 사용할 수 있는 모든 데이터를 기반으로 계산됩니다. Av-는 평균과 평균 / 2 (Av−Av / 2)의 차이로 계산 된 값을 나타내며 더 낮은 정규 식민지화 잠재력을 보여줍니다. 평균과 평균/2(Av+Av/2) 사이의 합으로 계산된 값을 나타내며 더 높은 정규 식민지화 가능성을 나타내는 Av+. 이 추출 공식을 사용하면 사용자가 식민지화의 극단 (최고 또는 최저)을 피할 수 있습니다. 이 방법은 균근 식민지화의 가장 가능한 경우를 추출 할 수 있습니다.
Zea mays는 식물의 발달 단계에 따라 변동이 심한 식민지화 잠재력을 나타 냈습니다 (표 1, 그림 11). 식민지화 빈도의 값은 3.67%-69.60% 사이에서 크게 다양했으며, 식민지화 강도에 대한 50%의 값으로 뒷받침됩니다. 이 현상의 주된 이유는 뿌리 시스템이 전체 식생 기간 동안 지속적으로 발전하기 때문입니다. Arbuscules는 6 잎 (B2) 발달 단계에서 최대 값을 나타 냈으며 다음 성장 단계에서 감소했습니다. 소포는 산발적으로 나타 났으며 값은 1 % 미만이었습니다. 균근 패턴의 탐구는 균사가 뿌리의 다른 영역에서 제한된 확장으로 개발되었음을 보여주었습니다. 식민지화 된 지역 사이의 큰 불연속성이 관찰되었으며, 식민지화의 중심점 주변에서 균사가 불규칙하게 발달했습니다. 식민지화 전략은 증식 및 전달 전략에 대한 식물 저항성의 간격에 큰 변화를 보였다. 6 잎 (B2)의 단계와 개암 나무 열매 형성 단계 (B4)는 균근 화 / 비 균근 지역 보고서가 0.14보다 낮기 때문에 지속되는 식민지화의 이동 전략을 나타 냈습니다. 눈에 띄는 높은 전송 전략을 가진 유일한 사례는 B2 단계에서 넓은 뿌리 영역이 arbuscules를 나타 냈을 때 기록되었습니다. 그들의 전반적인 위치는 arbuscules가 개발 된 영역과 arbuscules가 출현 단계에있는 영역 사이의 명확한 분리를 보여주었습니다. 가장 균질한 평균 식민지화 패턴은 B5 발달 단계에서 관찰되었으며, 식민지화된 영역 사이에 일정한 비식민지 영역이 있었습니다. 이 시각적 현상에 대한 전반적인 평가는 최종 식생 기간에 해당하며, arbuscules의 작은 값은 이러한 구조의 퇴행을 나타냅니다.
Festuca rubra 는 다년생 뿌리 계통을 가진 산악 초원에서 지배적 인 종입니다. 이러한 적응으로 인해 대부분의 식민지화 과정은 뿌리 내부에서 이루어지며 균사 네트워크의 발달은 뿌리의 낮은 발달 속도와 관련이 있습니다 (표 2, 그림 12). 비료의 적용으로 인해 식민지화 매개 변수는 변종간에 큰 차이를 나타 냈습니다. 식민지화 빈도의 차이는 65 %였으며, 기록 된 강도의 36 % 차이로 지속되었습니다. 각 변종은 치료의 장기 적용과 상관 관계가 있는 다른 집락화 패턴을 보였으며 균근/비균근 지역 보고서에서 0.09-0.96, 수포/소포 보고서에서 0-9.43 사이의 변이를 동반했습니다. 제어 변형(V1)은 Av+ 식민지화 지도에 대한 arbuscules의 개발을 제한하는 제한된 영역으로 평균적인 저장 지향 전략을 보여주었습니다. 식민지화의 단순화 된 이미지 (Av-)는 균사의 선형 및 측면 발달을 보여 주었으며, 이는 두 개의 상위 모델 (Av- 및 Av +)에 대한 불규칙한 식민지화를 완전히 지향했습니다. 유기적 처리(V2)의 적용은 뿌리에서 이중, 선형 및 불규칙한 균사 발달을 유도했습니다. 유기 처리를 위해 확인 된 식민지화 전략은 토양에서 분뇨의 느린 방출과 한 계절에서 다음 계절로의 지속성과 관련된 저장 전략에 대한 방향을 보여주었습니다. Av+ 모델은 소포의 강렬한 존재와 함께 가장 높은 집락화 잠재력을 나타냈습니다. 균근 / 비 균근 지역 보고서는 식민지화 된 지역 간의 드문 불연속성과 함께 균질 한 식민지화를 제시했습니다. 이와 반대로, 광물질 비료 (V4)의 적용은 균근 식민지화의 퇴행을 유도했다. 식민지화 된 지역은 불규칙한 패턴을 나타 냈으며, 그들 사이에 식민지화되지 않은 큰 불연속성이 있습니다. 관찰 된 전략은 일반적으로 식물 저항성 전략을 지향했으며, 시간을 엄수하는 저장 또는 이송 전략이 보이는 작은 영역이 있습니다. 저 광물 유기 (V3)와 고 광물 유기 (V5) 처리 간의 비교 분석은 두 가지 반대 처리 (V2 및 V4) 사이에 맞는 식민지화의 지속적인 회귀와 식민지화 전략의 변화를 보여주었습니다. 식민지화 된 모든 지역은 식민지화되지 않은 지역의 균질 한 존재와 함께 중심점을 중심으로 불규칙하게 발전했습니다. 식민지화 전략은 제한된 지역에 소포가 존재하는 증식 전이 전략을 지향했습니다. 가장 큰 비 식민지화 된 불연속성은 더 많은 양의 광물질 비료 (V5)가있는 변종에서 확인되었습니다.
그림 1: 루트 샘플링 절차 . (A) 뿌리의 무결성을 보호하기 위해 토양으로 샘플을 추출합니다. (B) 첫 번째 청산 절차 후 루트 시스템의 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 염색된 뿌리는 가공될 때까지 수돗물로 항아리에 보관됩니다. 뿌리는 실온에서 최대 1 주일 동안 색을 유지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 루트 처리 . (A) 한 샘플의 모든 뿌리를 페트리 접시의 물에 보관하십시오. (B) 뿌리를 1cm 길이로 자릅니다. (씨디) 라미네이팅 파우치를 부드럽게 눌러 뿌리를 부수고 천천히 슬라이드에 표시합니다. (E-F) 뿌리 부분을 커버 슬립으로 덮고 한쪽 모서리에 수돗물 한 방울을 추가하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 이미지 처리. (A) 프레젠테이션의 한 샘플에서 캡처한 모든 이미지를 추가합니다. 각 루트의 현미경보기를 재구성하기 위해 모든 이미지를 정렬하십시오. (B) 각 이미지에 대해 너비 10 셀 x 셀 길이 10 셀의 그리드를 준비 할 테이블을 추가합니다. 내부 테두리를 없음으로 설정합니다. 내부 경계는 여전히 볼 수 있지만 투명성은 균근 분석을 방해하지 않습니다. (씨디) MycoPatt의 범례를 사용하여 이미지에 표시되는 각 구조의 점수를 매깁니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: MycoPatt에 데이터 삽입. 프레젠테이션의 관찰 내용이 포함된 전체 데이터베이스를 MycoPatt에 복사합니다. 숫자로 붙여 넣습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 원시 데이터 추출 및 기본 데이터 분석. (A) 한 행에서 10 개의 수평 세포 모두에 대한 집락 평가. (B) MycoPatt로부터의 10개 세포 x 10개 세포 사각형 각각에서 하나의 열(수직)으로부터 10개 세포 모두에 대한 집락화 평가. (C) 횡단 식민지화 평가 및 평균 식민지화 매개변수의 계산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 균근 패턴 맵의 추출 . (A) 전체 데이터 세트에 대해 MycoPatt의 그래프 시트에서 10개 셀 x 150개 셀의 큰 맵을 사용할 수 있습니다. (B) 식민지 지도를 이미지로 추출합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: Zea mays의 가공된 뿌리에서 AMF 구조의 현미경 이미지 . (A) 균사 네트워크 arbuscules의 세포 간 및 세포 내 발달. (B) 세포 내에서 발달하는 수많은 arbuscules가있는 조밀 한 균사 네트워크. (C) 다른 차원의 일련의 소포. 약어 : H = 균사; A = 아르부스큘레; V = 소포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: Festuca rubra의 가공된 뿌리에 있는 AMF 구조의 현미경 이미지 . (A) 소포와 arbuscules가있는 여러 균사 네트워크가 별도의 영역에서 개발되었습니다. (B) 코일 균사 네트워크의 세부 사항. (C) 진입 점과 두 개의 코일 균사의 세부 사항. (D) 코일 균사 끝에 있는 소포의 세부 사항. (E) 세포 내 arbuscule의 세부 사항, 코일 균사의 세부 사항 및 균사 끝에 소포의 존재. 약어 : H = 균사; A = 아르부스큘레; V = 소포; Ep = 진입점. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 불완전하게 제거되고 염색된 뿌리에서 Festuca rubra (A-C) 및 Zea mays (D-E)의 뿌리에 있는 AMF 구조의 불명확한 현미경 이미지. (A) 균사 수가 적고 뿌리의 본래 색이 보이는 불분명 한 얼룩진 뿌리. (B) 뿌리 세포와 균사 사이의 구별이 불분명 한 파란색과 강렬한 파란색의 균사. (C) 이미지 상단의 명확한 염색 된 균사 네트워크와 이미지 하단의 불완전한 염색 균사. (D) 강렬한 얼룩진 뿌리와 균사로 인해 AM 구조의 식별이 불가능합니다. (E) AM 구조의 식별을 불가능하게 만드는 세포에 존재하는 인공물이있는 강렬한 염색 된 뿌리의 세부 사항. 약어 : H = 균사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 처리된 Zea mays의 뿌리에서 균근 집락화 패턴(Av, Av- 및 Av+). 약어 : A0 = 치료 적용의 순간; A1 = 대조군 변이체 (치료 없음) / A2 = 치료 된 변이체; B1 = 2-4 잎 (균근 식민지 시작을위한 조절점); B2 = 6 잎; B3 = 8-10 잎; B4 = 개암 나무 열매 형성; B5 = 생리적 성숙도. 변형 조합은 A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3 / A2-B3; A1-B4 / A2-B4; 및 A1B5/A2-B5. 치료에 대한 전체 설명은 Pop-Moldovan et al.12에서 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12: 장기간 처리된 Festuca rubra의 뿌리에서 균근 집락화 패턴(Av, Av- 및 Av+). 약어 : V1 = 대조군, 비 수정; V2 = 10 t·ha-1 분뇨; V3 = 10 t·ha-1 분뇨 + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1,P2O5 50 kg·ha-1,K2O50 kg·ha-1; V5 = 10 t·ha-1 분뇨 + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1. 치료에 대한 전체 설명은 이전 작업13,14에서 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 발달 단계에 따른 Zea mays 뿌리의 균근 집락화 매개변수 값. 범례: A0 = 치료 적용의 순간; A1 = 대조군 변이체 (치료 없음) / A2 = 치료 된 변이체; B1 = 2-4 잎 (균근 식민지 시작을위한 조절점); B2 = 6 잎; B3 = 8-10 잎; B4 = 개암 나무 열매 형성; B5 = 생리적 성숙도. 변형 조합은 A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3 / A2-B3; A1-B4 / A2-B4; 및 A1B5/A2-B5. 치료에 대한 전체 설명은 Pop-Moldovan et al.12에서 찾을 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2 : 적용된 수정을 기반으로 한 Festuca rubra 뿌리의 균근 식민지화 매개 변수 값. 범례 : V1 = 대조군, 수정되지 않음; V2 = 10 t·ha-1 분뇨; V3 = 10 t·ha-1 분뇨 + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1; V4 = N 100 kg·ha−1,P2O5 50 kg·ha−1K2O50 kg·ha−1; V5 = 10 t·ha-1 분뇨 + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50kg·ha-1 K2O 50 kg·ha-1. 치료에 대한 전체 설명은 이전 작업13,14에서 찾을 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 루트의 현장 샘플링에서 원시 데이터 분석 및 균근 맵 추출에 이르는 자세한 프로토콜 단계. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
균근 식민지화에 대한 연구는 농업 분야의 새로운 전략 개발에 필수적입니다. 여러 재배 식물이 arbuscular mycorrhizas와 공생 관계를 형성 할 수있는 잠재력은 농업 생태계의 지속 가능한 발전과 건강 유지의 중요한 구성 요소가되었습니다 16,17,18,19,20. 따라서 식물이 토양의 영양 네트워크, 수확량 및 생존 잠재력과 어떻게 연결될 수 있는지에 대한 필수 데이터를 제공하는 식민지화 메커니즘 및 곰팡이 전략에 대한 더 나은 이해가 필요합니다. 따라서 스마트 농업 맥락에서 이것은 금세기의 필수품이며 식민지화에 대한 심층적 인 평가를 수행하는 것이 중요하며 연구는 뿌리에서 곰팡이 위치에 대한 현실적인 이미지를 제공해야합니다.
뿌리 균근 패턴 방법은 뿌리의 깊은 스캔을 제공하지만 한계와 장점이 있습니다11. 제시된 한계는 식물을 처음 분석할 때 점수를 매겨야 하는 많은 수의 샘플, 이미지 조작의 필요성, 뿌리에 균근 구조의 수동 할당이지만 이 모든 것은 여러 장기적인 이점으로 극복할 수 있습니다. 이 방법의 적용과 MycoPatt 도구와 현미경의 통합으로 인한 대규모 데이터베이스는 안정성, 결과의 통계적 보증 및 결과 비교 측면에서 영속성을 제공합니다. 하나의 특정 식물의 뿌리에 대한 균근 패턴 식별은 비교 측면에서 후속 연구를 용이하게 할 것입니다. 또한 식민지화 메커니즘 및 곰팡이 전략의 진화에 대한 정보를 제공 할 수있는 새로운 패턴의 식별을 향상시킵니다. 수평 및 수직 개발을 기반으로 한 평균 식민지화 매개 변수의 계산은 그리드 교차, 루트 세그먼트 추정 및 확대 된 교차점 9,11과 같은 시각적 추정 방법에 비해 더 현실적이고 복잡한 값을 얻을 수 있습니다. 전반적으로, 균근 패턴 방법은 뿌리에서 곰팡이 전진 및 분지를 평가하고 외부 식민지화의 새로운 지점을 식별하고 뿌리를 따라 균사를 확장 할 수 있습니다. 그것은 arbuscules와 소포의 위치를 허용하고 글로벌 패턴에서 현실적인 위치와 차원을 할당합니다.
MycoPatt 방법의 올바른 적용은 프로토콜의 각 단계를 성공적으로 완료하는 데 달려 있습니다(표 3). 더 높은 효율성을 위해, 방법의 전체 흐름은 서로 다른 훈련 수준을 가진 한 명 또는 여러 사람에 의해 수행되도록 설계되었습니다. 이러한 방식으로 각 단계에서 여러 결과를 추출하여 지속적인 분석이 가능합니다. 생물학적 물질의 선택, 뿌리 샘플링 및 저장 단계를 위해서는 고도로 훈련 된 사람이 성장 단계에 관계없이 종을 정확하게 식별해야합니다. 종이 확인되면 부드러운 토양 입자 제거를위한 최소한의 훈련으로 모든 사람이 뿌리 샘플링을 수행 할 수 있습니다. 두 번째 단계인 현미경 검사를 위한 뿌리 처리, 제거 및 염색에는 숙련된 사람이 필요합니다. 프로세스에는 여러 확인 단계가 있으며 각 단계는 절차의 성공을 위해 필요합니다. 처음 두 단계에서 여러 샘플을 동시에 처리할 수 있습니다. 현미경 검사를 위한 루트 처리(3단계)와 루트 샘플의 현미경 분석(4단계)은 세그먼트를 1cm 조각으로 절단하는 데 필요한 높은 주의와 슬라이드 준비를 위한 부드러운 분쇄로 인해 매우 중요합니다. 현미경은 빛의 보정과 고품질 이미지를 얻기 위한 소프트웨어에 주의가 필요합니다. 두 단계 모두 전문가의 감독하에 고도로 훈련 된 사람 또는 중간 수준의 훈련을받은 사람이 필요합니다. 현미경 검사 후 이미지 조합에는 세그먼트를 재구성하기 위해 이미지의 올바른 겹침 및 순서를 위해 고도로 훈련된 직원이 필요합니다. 균근 집락화의 채점은 AM 균류의 전문가가 구조와 집락 성능을 식별하고 격자 이미지의 각 구조에 대한 점수를 할당해야 하는 단계입니다. 마지막 단계인 원시 데이터 분석 및 결과 추출에는 데이터베이스를 컴파일하고 데이터 필터링 및 가장 관련성이 높은 맵의 추출 뒤에 있는 통계를 관리하는 고도로 훈련된 데이터 분석가가 필요합니다. 이 단계는 공정의 효율성을 극대화하기 위해 균근 전문가의 작업과 결합 될 수 있습니다. 전반적으로 전체 흐름은 학제 간 연구에 여러 전문가의 참여를 허용하여 고품질 결과로 이어집니다.
다른 새로운 방법과 마찬가지로 균근 패턴 방법은 진화하고 개선해야합니다. 향후 이 방법을 더 쉽게 사용하고 여러 결과를 제공할 몇 가지 수정 사항이 있습니다. 느린 클리어링 및 염색 기술로 수행되는 경우 이 방법을 사용하면 한 번에 여러 샘플을 조작하여 절차의 각 단계 후에 분석을 일시 중지/다시 시작하고 여러 디지털 데이터베이스를 얻을 수 있습니다. 중요한 개선 사항은 더 빠른 이미지 획득을 위해 고성능 스캐너를 사용하고 균근 구조 인식에 적합하고 효율적인 도구를 개발한 후 이 프로세스를 자동화하는 것입니다. 기술 진화의 맥락에서 균근 패턴의 빠른 획득은 해당 분야의 향후 연구를 유지할 것입니다.
자동 소프트웨어 사용에는 몇 가지 어려움이 있습니다. 1) AM 구조 (균사와 소포)의 위치가 뿌리 세포 외부와 뿌리 세포 내부의 arbuscules가 다르기 때문에 동일한 그림에서 인식하도록 소프트웨어를 보정하고 훈련하기가 어렵습니다. 2) 한 세그먼트의 사진 조합의 경우 소프트웨어가 항상 세그먼트를 다시 만들기 위해 사진을 정렬하는 것은 아니며 무작위로 배치하여 프로세스를 변경할 수 있습니다. 3) 또 다른 문제는 소프트웨어가 두 사진의 일부가 동일하거나 현미경 절차에서 일부 필드가 겹치는 경우 구별 할 수 없다는 것입니다. 따라서이 프로세스는 숙련 된 전문가가 수동으로 수행해야합니다.
전체적으로, 각 변종으로부터의 60cm의 뿌리가 여러 식물로부터 분석되었다. 현재 원고는 MycoPatt 시스템 및 도구 사용의 개념을 제시하도록 설계되었으며 결과는 이 방법의 기능을 제시합니다. 이 방법에 비해 그리드 교차 방법은 염색 된 뿌리의 무작위 배치로 인해 주관성이 더 높습니다. 우리는 미래가 각 AM 플랜트에 대해 사용할 세그먼트 수를 설정하는 것이 필요할 것이라고 믿습니다. 이것은 균근 분야의 모든 연구자들이 수행해야 할 연구입니다. 여러 방법9 을 비교 한 기사 중 하나는 50에서 최대 200 개의 뿌리 세그먼트 / 식물의 유사한 식민지화 비율을 나타 냈습니다. 그들의 결론은 각 세그먼트를 분석하기 위해보다 객관적인 방법이 필요하다고 말했습니다. 우리의 연구에 따르면 MycoPatt는 주관성을 0으로 줄입니다. 각 세그먼트를 심층적으로 스캔하고 분석합니다. 또한 이 방법을 사용하여 분석된 모든 세그먼트 결과에 대한 이미지 데이터베이스를 개발할 수 있습니다. 필요한 경우 데이터를 다시 분석하는 데에도 사용할 수 있습니다.
전체 방법은 여러 연구 및 상업 분야에 필요한 결과를 제공합니다. 식물 육종가들은 특정 토양 조건에 적응하는보다 내성이 강한 품종과 잡종을 만들기 위해 끊임없이 노력합니다. 이러한 맥락에서 식물 육종 과정은 초기 선택 단계부터 토양에서 균근 네트워크에 대한 식물 연결성 측면에서 도움이 될 것입니다. 균근 패턴 분석은 토양에서 균근 수확과 현장 조건에 대한 순응 측면에서 잡종 간의 차이를 보여줍니다. 번식 분야의 연구원은이 방법을 사용하여 선택 과정의 초기 단계에서도 토양 균근 조건에 대한 새로운 품종 / 잡종의 적합성을 감지 할 수 있습니다. 이런 식으로 많은 조건과 기술에 쉽게 적응할 수있는 품종 / 잡종이있을 뿐만 아니라 좁은 조건에 대한 수용도가 낮고 특이성이 높은 품종 / 잡종도 있습니다. 초원 생태계의 경우, 균근 패턴 방법은 여러 응용 분야에 완벽하게 적합합니다 : 곰팡이 지원과 관련된 다양한 식생 집합체에서 식물 생존에 대한 더 나은 이해; 고유종 및 멸종 위기 종의 특정 식민지화 패턴 분석; 외인성 종의 침입 가능성; 그리고 다양한 입력의 적용으로 인한 지배-공지배성 변동21. 패턴은 활성 전파 및 진입점을 기반으로 잠재적 용량을 계산해야 하는 접종 생산자가 추가로 사용할 수 있습니다. 또한, 동일한 genitors를 공유하는 식물에 적합한 접종 물을 포함하는 매우 특정한 생물 비료가 개발 될 수있다. 연구에서 균근 패턴은 시각적 및 수치적 관점에서 매우 비교적인 연구를 나타냅니다. 균근 종과 테스터 식물의 뿌리에서 발달할 수 있는 구조를 제시하는 여러 데이터베이스(22,23,24)가 있지만 현재까지 완전한 식민지화 이미지를 제시하는 데이터베이스는 없습니다. 이러한 모든 요구 사항과 보다 현실적이고 적용 가능한 연구의 필요성은 토양-미생물-식물 상호 작용 연구에서 균근 패턴 방법의 통합을 지원합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 논문은 빅토리아 팝 몰도바 (Victoria Pop-Moldovan)가 수행 한 "농업 학적 투입물에 의해 구동되는 옥수수 균근 패턴"과 라리사 코르 코즈 (Larisa Corcoz)가 수행 한 "산 초원 우성 종의 균근 상태 및 식민지화 개발"이라는 주제 분야의 두 가지 박사 연구 결과를 얻은 데이터를 사용합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple vinegar 5% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | O?ET DE MERE | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere |
| Blue Ink | Pelikan | 4001 | https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan |
| Cover slips | Menzel-Glaser | D 263 M | https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser |
| Forceps, PMP | Vitalab | 9.171 411 | http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33 |
| Glass jar 47 mL | Indigo Cards | BORCAN 47 ML HEXAGONAL | https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal |
| Laminating Pouches | Peach | PP525-08 | Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328 |
| Microflow Class II ABS Cabinet | Bioquell UK Ltd | Microflow Class II ABS Cabinet | http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf |
| Microscope slides | Deltalab | D100001 | https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE |
| Microsoft Office 365 | Microsoft | Office 365 | Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation |
| NaOH | Oltchim | 01-2119457892-27-0065 | http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf |
| Nitrile gloves | SemperGuard | 816780637 | https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE |
| Optika camera | OPTIKA | CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0 | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/ |
| Optika Microscope | OPTIKA | B383pL | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/ |
| Protective mask FFP3 | Hermes Gift | HERMES000100 | EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section |
| Scalpel | Cutfix | 9409814 | https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809 |
| White wine vinegar 9% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | O?ET DE VIN ALB | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb |
References
- Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nature Reviews Microbiology. 18 (11), 607-621 (2020).
- Jeffries, P., Barea, J. M. 4 Arbuscular Mycorrhiza: A Key Component of Sustainable Plant-Soil Ecosystems. The Mycota. IX Fungal Associations. Hock, B. , SpringerVerlag. Berlin, Germany. 51-75 (2012).
- Parniske, M. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses. Nature Reviews Microbiology. 6 (10), 763-775 (2008).
- Gianinazzi, S., et al. Agroecology: The key role of arbuscular mycorrhizas in ecosystem services. Mycorrhiza. 20 (8), 519-530 (2010).
- Lee, E. -H., Eo, J. -K., Ka, K. -H., Eom, A. -H. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi and their roles in ecosystems. Mycobiology. 41 (3), 121-125 (2013).
- Zhang, Y., Zeng, M., Xiong, B., Yang, X. Ecological significance of arbuscular mycorrhiza biotechnology in modern agricultural system. Ying Yong Sheng Tai Xue Bao = The Journal of Applied Ecology. 14 (4), 613-617 (2003).
- Shah, A. A., et al. Effect of endophytic Bacillus megaterium colonization on structure strengthening, microbial community, chemical composition and stabilization properties of Hybrid Pennisetum. Journal of the Science of Food and Agriculture. 100 (3), 1164-1173 (2020).
- Souza, T. Handbook of Arbuscular Mycorrhizal Fungi. , Springer. New York City, NY. (2015).
- Sun, X. -G., Tang, M. Comparison of four routinely used methods for assessing root colonization by arbuscular mycorrhizal fungi. Botany. 90 (11), 1073-1083 (2012).
- Smith, S., Read, D. Colonization of Roots and Anatomy of Arbuscular Mycorrhiza. Mycorrhizal Symbiosis. Smith, S. E., Read, D. J. , Academic Press. London, UK. 42-90 (2008).
- Stoian, V., et al. Sensitive approach and future perspectives in microscopic patterns of mycorrhizal roots. Scientific Reports. 9 (1), 10233 (2019).
- Pop-Moldovan, V., et al. Divergence in corn mycorrhizal colonization patterns due to organic treatment. Plants. 10 (12), 2760 (2021).
- Corcoz, L., et al. Mycorrhizal patterns in the roots of dominant Festuca rubra in a high-natural-value grassland. Plants. 11 (1), 112 (2021).
- Corcoz, L., et al. Deciphering the colonization strategies in roots of long-term fertilized Festuca rubra. Agronomy. 12 (3), 650 (2022).
- Stoian, V., Florian, V. Mycorrhiza - Benefits, influence, diagnostic method. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca. Agriculture. 66 (1), 2009 (2009).
- Prates Júnior, P., et al. Agroecological coffee management increases arbuscular mycorrhizal fungi diversity. PLoS One. 14 (1), 0209093 (2019).
- Rillig, M. C., et al. Why farmers should manage the arbuscular mycorrhizal symbiosis. New Phytologist. 222 (3), 1171-1175 (2019).
- Rillig, M. C., et al. Towards an integrated mycorrhizal technology: Harnessing mycorrhiza for sustainable intensification in agriculture. Frontiers in Plant Science. 7, 1625 (2016).
- Bhale, U. N., Bansode, S. A., Singh, S. Multifactorial Role of Arbuscular Mycorrhizae in Agroecosystem. Fungi and their Role in Sustainable Development: Current Perspectives. Gehlot, P., Singh, J. , Springer. New York City, NY. 205-220 (2018).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
- Vaida, I., Păcurar, F., Rotar, I., Tomoș, L., Stoian, V. Changes in diversity due to long-term management in a high natural value grassland. Plants. 10 (4), 739 (2021).
- Taxonomy of Arbuscular Fungi. , Available from: http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota/Taxonomy.html (2022).
- The International Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi. , Available from: https://invam.wvu.edu/collection (2022).
- The International Bank for the Glomeromycota. , Available from: https://www.i-beg.eu/ (2022).
