Mykorrhizakarten als Werkzeug zur Erforschung von Besiedlungsmustern und Pilzstrategien in den Wurzeln von Festuca rubra und Zea mays

Summary

Das Protokoll beschreibt hier die Methoden zur Beurteilung der arbuskulären Mykorrhiza-Besiedlungsmuster und -Strategien in Wurzeln für zwei Arten: Zea mays und Festuca rubra. Der Einsatz der MycoPatt-Methode ermöglicht die Berechnung von Parametern, die Umwandlung von Mykorrhizastrukturen in digitale Daten und die Kartierung ihrer realen Position in Wurzeln.

Abstract

Arbuskuläre Mykorrhizapilze sind Symbionten in den Wurzeln von Pflanzen. Ihre Aufgabe ist es, die Wirtsentwicklung aufrechtzuerhalten und das Ernährungsgleichgewicht in den Ökosystemen aufrechtzuerhalten. Der Besiedlungsprozess hängt von mehreren Faktoren wie der Bodenökologie, der genetischen Vielfalt der Pilze und des Wirts sowie agronomischen Praktiken ab. Ihre synchronisierte Wirkung führt zur Entwicklung eines komplexen Hyphennetzwerks und zur sekundären Entwicklung von Vesikeln und Arbuskeln in den Wurzelzellen. Ziel dieser Forschung war es, die Effizienz der Mykorrhizamuster-Methode (MycoPatt) zur Positionierung von Pilzstrukturen in den Wurzeln von Festuca rubra und Zea mays zu analysieren. Ein weiteres Ziel war es, die Pilzbesiedlungsstrategie zu erforschen, wie sie durch Mykorrhizakarten jeder Art sichtbar wird. Die Aufnahme und Assemblage mehrerer mikroskopischer Bilder ermöglicht die Beurteilung der Mykorrhizabesiedlung sowohl in Mais- als auch in Rotschwingelpflanzen, um Informationen über die realistische Position der entwickelten Strukturen zu liefern. Die beobachteten Mykorrhizamuster unterstreichen die unterschiedliche Effizienz jeder Pflanze in Bezug auf die Entwicklung von Verbindungen mit symbiotischen Bodenpilzen, die durch angewandte Behandlungen und Wachstumsstadien verursacht werden. Mykorrhiza-Detailkarten, die mit der MycoPatt-Methode gewonnen werden, sind nützlich für die Früherkennung der Pflanzeneffizienz bei der symbiotischen Aufnahme aus dem Boden.

Introduction

Arbuskuläre Mykorrhiza (AM) Pilze sind eine Kategorie von bodenbürtigen Endophyten, die für Forscher ständig von Interesse sind. Ihre Anwesenheit in den Wurzeln der meisten Pflanzen und ihre Beteiligung an Nährstoffkreisläufen machen sie zu lebenswichtigen Komponenten für die Stabilität jedes Ökosystems, in dem krautige Pflanzen vorhanden sind ^1,2. Durch ihr extraradikuläres Myzel wirken AM als Pilzverlängerung für Pflanzenwurzeln, insbesondere in schwer zugänglichen Bereichen³. Die Hauptaktivität liegt in den Wurzeln der Wirtspflanze, wo AM große Hyphennetzwerke und spezifische intrazelluläre Strukturen, die Arbuskeln genannt werden, entwickelt. Die fehlende Wirtsspezifität ermöglicht es dem Symbionten, mehrere Arten gleichzeitig zu besiedeln. Diese Fähigkeit verleiht AM die Rolle der Ressourcenallokation und Nährstoffregulierung im Ökosystem; Der Pilz unterstützt auch das Überleben der Pflanzen und hilft bei der Pflanzenleistung 4,5,6,7. Die Reaktion von AM-Spezies auf Wirtswurzeln ist in der Ausdehnung und Lage des intraradikulären Myzels und dem Vorhandensein und der Form der intrazellulär entwickelten Arbuskeln sichtbar. Die intrazellulären Arbuskeln fungieren als Austauschpunkt zwischen den beiden Symbionten und stellen Bereiche dar, die durch schnelle Transferprozesse gekennzeichnet sind. Die Strukturen, die die AM produzieren, sind artabhängig und entwickeln neben Arbuskeln in den Wurzeln auch Vesikel, Sporen und Hilfszellen.

Es gibt viele Herausforderungen bei der Beurteilung von AM-Symbionten in Pflanzenwurzeln ^8,9. Die erste ist ihre ständige Entwicklung während der gesamten Vegetationsperiode der Wirte, was zu mehreren Veränderungen in der hyphalen arbuskulären Struktur führt. Die verschiedenen Stadien des arbuskulären Wachstums bis zu ihrem Kollaps sind in den Wurzeln deutlich vorhanden, aber die seneszenten AM-Strukturen werden manchmal verdaut, was sie nur teilweise sichtbar macht¹⁰. Die zweite Herausforderung besteht in der Färbemethode und dem Protokoll, der großen Vielfalt der Wurzelsysteme, der Größe ihrer Zellen und den Unterschieden in der Dicke, die es schwierig machen, eine einheitliche Methode vorzuschlagen. Die letzte Herausforderung stellt die Bewertung und Bewertung der AM-Kolonisation dar. Es gibt zahlreiche Methoden, die AM mit unterschiedlicher Objektivität bewerten, und die meisten von ihnen sind immer noch auf Mikroskopietechniken beschränkt. Die einfachen basieren auf dem Vorhandensein / Fehlen von Strukturen im Wurzelkortex, während die komplexeren auf visuellem Scoring und der Verwendung von Kolonisationsklassen basieren, mit der Integration der Häufigkeit und Intensität des Kolonisationsphänomens. In den letzten Jahrzehnten wurden viele Daten über den Mykorrhizastatus mehrerer Arten produziert, aber die meisten Methoden beschränken sich auf den beobachteten Wert der Besiedlung, ohne auf die tatsächliche Position jeder Struktur im Wurzelkortex hinzuweisen. Als Reaktion auf die Notwendigkeit genauerer Ergebnisse zur AM-Besiedlung wurde eine Methode entwickelt, die auf mikroskopischer Analyse von Mykorrhizamustern (MycoPatt) in Wurzeln basiert, um die detaillierten Mykorrhizakarten in digitaler Form zusammenzustellen¹¹. Die Methode ermöglicht auch die objektive Berechnung von Besiedlungsparametern und die Bestimmung der tatsächlichen Position jeder Struktur in der Wurzel.

Die Position der AM-Pilzstrukturen kann bei der Beantwortung der folgenden zwei Fragen wichtig sein. Die erste bezieht sich auf die Analyse der Besiedlung in einem bestimmten Moment aus dem Vegetationszyklus einer Pflanze. In diesem Zusammenhang ist es sehr nützlich, die Arbuskular-/Vesikelhäufigkeit zu beobachten, zu berichten, wie sie sich in der Wurzel befinden, und ein sehr klares Kolonisationsbild und Parameter zu liefern. Die zweite bezieht sich auf die Erkennung der Pilzstrategie und ihre Ausrichtung und sogar die Prognose ihrer zukünftigen Entwicklung. Eine Anwendung des MycoPatt kann für Pflanzen täglich, alle 2-3 Tage, wöchentlich oder während verschiedener Wachstumsstadien analysiert werden. In diesem Zusammenhang ist die Lage der Vesikel/Arbuskel wichtig, um den biologischen Mechanismus der AM-Besiedlung besser zu verstehen. Diese Parameter und Beobachtungen sind sehr nützlich, um die mathematischen Parameter zu ergänzen.

Das Ziel dieses Artikels ist es, die Fähigkeit des MycoPatt-Systems zu demonstrieren, das native AM-Pilzbesiedlungspotenzial und die Strategie in Zea mays (Mais) Wurzeln während verschiedener Entwicklungsstadien und in Festuca rubra (Rotschwingel) Wurzeln unter verschiedenen Langzeitbefruchtungsbedingungen zu erforschen. Um das Ziel zu erreichen, wurden zwei große Datenbanken aus zwei Experimenten analysiert. Das Maisexperiment wurde in Cojocna (46°44′56" lat. N und 23°50′0" lang) eingerichtet. E), in der experimentellen didaktischen Farm der Universität für Agrarwissenschaften und Veterinärmedizin Cluj auf einem Phäozom mit einer lehmigen Textur^{Erde 12}. Das Rotschwingelexperiment ist Teil eines größeren Versuchsgeländes, das 2001 in Ghețari, Apuseni-Gebirge (46°49'064" lat. N und 22°81'418'' lang) eingerichtet wurde. E), auf einem Präluvosol (terra rossa) Bodentyp^13,14. Mais wurde in fünf verschiedenen Wachstumsphänophasen^{gesammelt 12}: B1 = 2-4 Blätter (als Kontrollpunkt für den Beginn der Mykorrhizabesiedlung); B2 = 6 Blätter; B3 = 8-10 Blätter; B4 = Kolbenbildung; B5 = physiologische Reife. Ausgehend vom 2-4-Blatt-Stadium (A0) wurde eine organische Behandlung angewendet, die zu einem Zwei-Graduierungsfaktor führte (A1 = Kontrolle und A2 = behandelt). Wurzeln des Rotschwingels wurden bei der Blüte aus einem Versuch mit fünf Langzeitdüngungen gesammelt^13,14: V1 = Kontrolle^, nicht befruchtet; V2 = 10 t·^ha-1 Gülle; V3 = 10 t·ha-1 Gülle + N 50 kg·ha-1, P2O5 25kg·ha-1,_K2O25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P2O5 50 kg·ha-1,_K2O50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 Gülle + N 100 kg·ha-1, P2O5 50kg·ha-1,_K2O50 kg·^ha-1. Aus jeder Düngungsvariante wurden in jeder Entwicklungsstufe fünf Pflanzen gesammelt. Die Färbeprotokolle und ihre Leistung in Bezug auf Probenverarbeitungszeit und Färbequalität wurden analysiert. Der Zusammenhang zwischen der Entwicklung von AM-Hyphen und dem Vorhandensein ihrer Strukturen in den Wurzeln wurde für jede Art separat analysiert und mit der Identifizierung der freizügigsten Wurzeln für die Besiedlung fortgesetzt. Die spezifischen Besiedlungsmuster jedes Wurzelsystems wurden basierend auf Kolonisationskarten und dem Wert der AM-Parameter analysiert.

Mais ist eine einjährige Pflanze, was ein kontinuierliches Wachstum der Wurzeln impliziert, und das war der Hauptgrund, den MycoPatt in den Wachstumsstadien anzuwenden. Rotschwingel ist eine mehrjährige Pflanze aus einem Grasland, das lange Zeit mit verschiedenen Düngemitteln behandelt wurde. Seine Wurzeln haben eine kürzere Entwicklung von 1 Jahr, und die Anthese gilt als Vegetationspunkt, wenn die Pflanze ihren Stoffwechsel von vegetativ zu generativ ändert. Um diese Pflanzen während dieser intensiven Aktivitätsperioden zu fangen, wurden die oben genannten Zeitpunkte gewählt. Die Probenahme während der Vegetationsperiode ist für diese Art schwierig, wenn sie in natürlichem Grasland angebaut wird.

Protocol

1. Auswahl des biologischen Materials, Wurzelprobenahme und Lagerung

1. Sammeln Sie die gesamte Pflanzenwurzel mit einer Schaufel (Abbildung 1A) separat für jede Variante und replizieren Sie. Entfernen Sie vorsichtig von Hand die großen Bodenaggregate von den Wurzeln. Waschen Sie das gesamte Wurzelsystem und messen Sie es auf einer Skala mit 1 cm x 1 cm großen Zellen (Abbildung 1B). Schneiden Sie die Wurzeln für jede Pflanze separat und legen Sie sie in eine Plastiktüte.
2. Sammeln Sie alle sauberen Wurzeln jeder Pflanze in einer Plastiktüte und sammeln Sie alle Proben einer Variante in einem größeren Beutel. Schreiben Sie auf jeden Beutel den Namen der Bühne/Variante und das Stichprobendatum. Lagern Sie die Wurzeln bis zur Verarbeitung in einem Kühlschrank oder Gefrierschrank bei einer Temperatur zwischen −4 °C und −20 °C.

2. Wurzelverarbeitung, -reinigung und -färbung für die Mikroskopie

HINWEIS: Verwenden Sie Handschuhe, eine Maske und eine mikrobiologische/chemische Haube für diesen Schritt des Protokolls.

1. Stellen Sie sicher, dass der Auftauvorgang der Wurzel langsam bei Raumtemperatur erfolgt. Verwenden Sie für alle Verarbeitungsschritte kleine Gläser (30-50 ml), um die Menge der notwendigen Mittel zu reduzieren.
2. Führen Sie die folgenden vier Schritte des langsamen Reinigungs- und Färbevorgangs¹⁵ durch. Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur aus. Dieses Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben ohne Verwendung eines Wasserbades zum Kochen.
   1. Wurzelreinigung: Legen Sie alle Wurzeln einer Pflanze in ein Glas. Bereiten Sie eine 10% ige NaOH-Lösung mit Leitungswasser vor und gießen Sie sie in jedes Glas, bis sie die Wurzeln vollständig bedeckt. Schütteln Sie die Gläser kräftig für 1 min oder 2 min, um eine homogene Dispersion der klärenden Lösung in den Wurzeln zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach 24 h und lassen Sie die Wurzeln mindestens 48 h in der Clearinglösung.
      HINWEIS: Saubere Wurzeln haben ein hellgelbes (bis weißes) Aussehen und die Konsistenz ist weich (sie können leicht durch Pressen mit einer Pinzette zerkleinert werden).
   2. Wurzelspülen: Geben Sie den Inhalt eines Glases nach dem anderen durch ein Sieb. Recyceln Sie die Clearing-Lösung. Spülen Sie die Wurzeln mehrmals in Leitungswasser ab, bis die Reinigungslösung vollständig entfernt ist.
      HINWEIS: Wenn die Reinigungslösung nicht vollständig entfernt wird, wirkt sich dies auf die Qualität des Färbevorgangs aus.
   3. Wurzelfärbung: Legen Sie die gespülten Wurzeln in ein sauberes Glas. Bereiten Sie eine 5%:5%ige Tintenessiglösung mit Leitungswasser vor (5 ml blaue Tinte + 5 ml 9% Essigsäure + 90 ml Leitungswasser). Gießen Sie die Lösung in jedes Glas, bis sie die Wurzeln vollständig bedeckt. Schütteln Sie die Gläser kräftig für 1 min oder 2 min, um eine homogene Dispersion der Färbelösung in den Wurzeln zu erzeugen. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach 24 h und lassen Sie die Wurzeln für 48 h in dieser Lösung.
      HINWEIS: Gefärbte Wurzeln haben eine intensive blaue Farbe.
   4. Wurzelteilentfärbung: Spülen Sie die fleckigen Wurzeln 1-2 min in Leitungswasser ab. Schütteln Sie die Gläser kräftig, um die zusätzliche Färbelösung zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang, wenn die Färbung zu intensiv ist und keine eindeutige mikroskopische Beurteilung zulässt.
      HINWEIS: Gefärbte Wurzeln können bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur in Leitungswasser aufbewahrt werden, ohne die Färbequalität zu verändern (Abbildung 2). Über längere Zeiträume können die Wurzeln bis zu 2-3 Monate in einer 5% kommerziellen Apfelessiglösung (5% Essigsäure) gehalten werden.

3. Wurzelverarbeitung für die Mikroskopie

1. Wurzelsegmentierung: Legen Sie die gefärbten Wurzeln jeder Probe auf ein skaliertes Schneidebrett (Abbildung 3A). Schneiden Sie die Wurzeln in 1 cm große Segmente (Abbildung 3B). Wählen Sie 15 Segmente für jede Variante.
2. Schonende Zerkleinerungsmethode zur Segmentvorbereitung: Die Wurzeln auf einem Objektträger verteilen. Verwenden Sie einen Laminierbeutel zum Abdecken der Wurzeln und zerkleinern Sie sie vorsichtig ausgehend von einer Kante (Abbildung 3C,D). Verwenden Sie ein weiches Kunststoffwerkzeug, z. B. Pinzette, Skalpellgriff, Stift oder einen Bleistift mit Radiergummi, um die Wurzeln auf dem Objektträger langsam anzuzeigen. Entfernen Sie vorsichtig den Laminierbeutel, und decken Sie die Probe mit einem Deckglas ab (Abbildung 3E).
   HINWEIS: Wurzeln haben eine röhrenförmige Form, daher ist es notwendig, sie in einer zweidimensionalen Ebene zu trennen. Diese Aktion setzt die Trennung der Wurzeln am Mittelpunkt voraus, was zur Anzeige der beiden Teile des Innendurchmessers führt. Die Verwendung von Laminierbeuteln im schonenden Brechverfahren ermöglicht die Darstellung der Wurzeln, die eine Zylinderform haben, in zwei Teilen - eines links und eines rechts - in Richtung ihres Mittelpunkts. Auf diese Weise wird die gesamte Wurzel eingehend analysiert, und der Kolonisationsgrad ist der Parameter, der die volumetrische Besiedlung zeigt (beschrieben in der ursprünglichen Arbeit zu MycoPatt¹¹). Im Grunde schneiden wir einen Zylinder in zwei Hälften, und danach bauen wir ihn mathematisch wieder auf.
3. Geben Sie mit einer Pipette Wasser in eine Ecke des Objektträgers, und lassen Sie das Wasser langsam auf dem Objektträger verteilen (Abbildung 3F). Entfernen Sie das zusätzliche Wasser mit einem Papiertuch.

4. Mikroskopische Analyse der Wurzelproben

1. Verwenden Sie ein Mikroskop, das mit einer Kamera mit guter Auflösung ausgestattet ist.
2. Analysieren Sie die Objektträger ausgehend von einer Extremität. Erfassen Sie jedes mikroskopische Feld. Benennen Sie jedes aufgenommene Bild mit einem Code um, der die tatsächliche Nachmontage von Stammteilen ermöglicht. Verwenden Sie für dicke Wurzeln die 10-fache oder 40-fache Vergrößerung und für dünne Wurzeln die 40-fache Vergrößerung. Verwenden Sie das gleiche Objektiv und die gleiche Vergrößerung für den gesamten Satz von Wurzeln einer Art.

5. Postmikroskopische Bildzusammenstellung

1. Verwenden Sie eine Präsentationssoftware, um ein Zeichenbrett für die Bildzusammenstellung zu entwerfen. Stellen Sie die Breite 2-3 cm weiter als die Bildbreite ein. Addieren Sie alle aufgenommenen Bilder aus einem Segment in der Reihenfolge ihrer Aufnahme, und rekonstruieren Sie die gesamte Länge des Stammsegments (Abbildung 4A).
   1. Kurz gesagt, sammeln Sie insgesamt 15 Bilder für jedes 1 cm Segment und organisieren Sie sie vertikal, beginnend mit 1 bis 15, in der Präsentationssoftware, um das Segment zu rekonstruieren.
2. Richten Sie die Bilder in der Mitte aus. Verwenden Sie die vertikale Ausrichtung, um sicherzustellen, dass jedes Bild dem vorherigen folgt. Platzieren Sie auf allen Bildern ein Raster aus 10 Zellen x 150 Zellen, um das gesamte Wurzelsegment abzudecken.
   1. Platzieren Sie außerdem auf jedem einzelnen Bild ein 10 x 10-Raster, und fügen Sie in jede Zelle dieses Rasters eine Zahl von eins bis sechs ein, wenn eine AM-Struktur sichtbar ist, oder lassen Sie sie leer, wenn keine AM-Struktur vorhanden ist. Auf diese Weise ist die Genauigkeit des Prozesses maximal, ohne dass Fehler in der Position der AM-Strukturen beobachtet werden.
3. Fügen Sie eine Tabelle für ein Raster mit einer Breite von 10 Zellen und einer Länge von 150 Zellen hinzu (15 Quadrate mit 10 Zellen x 10 Zellen). Ändern Sie die Abmessungen der Tabellenbreite in die Breite der Bilder. Ändern Sie die Länge der Tabelle so, dass sie alle Bilder umfasst (Abbildung 4B).

6. Bewertung der Mykorrhizabesiedlung

1. Verwenden Sie die eindeutige Zahl, um jede Art von Struktur zu bewerten, wie in der Mykorrhizamustermethode¹¹: 1 für Hyphen beschrieben; 2 für Arbuskeln; 3 für Vesikel; 4 für Sporen; 5 für Hilfszellen; und 6 für Einstiegspunkte (Abbildung 4C). Bewerten Sie jede beobachtete Mykorrhizastruktur aus jeder Zelle der zuvor angewendeten Gitter (Abbildung 4D).

7. Rohdatenanalyse und Ergebnisextraktion

1. Fügen Sie alle erhaltenen Ergebnisse in die MycoPatt-Tabelle¹¹ ein. Verwenden Sie die Funktion zum Kopieren/Einfügen, um alle Ergebnisse aus der Präsentation in das erste Blatt mit dem Namen rawdata zu übertragen (Abbildung 5).
2. Primäre Analyse der Ergebnisse: Verwenden Sie das dritte Blatt mit dem Namen Parameter im MycoPatt-Tabellenkalkulationstool, um die Ergebnisse als Prozentsätze (%) separat in drei Formen zu visualisieren (Abbildung 6A-C). Verwenden Sie die Spalten A bis K, um das horizontale Bild der Kolonisation zu analysieren. Spalten M bis W, um das vertikale Bild der Kolonisation zu analysieren; und Spalten Y bis AI, um die transversale (durchschnittliche) Kolonisation für jedes der 15 10 x 10 Quadrate (Zeilen 2-17) und die endgültige durchschnittliche Kolonisierung (Zeilen 19-20) zu analysieren.
   HINWEIS: Die transversale durchschnittliche Besiedlung wird für die Berechnung der tatsächlichen Kolonisationsparameter verwendet, die sich sowohl auf die horizontale als auch auf die vertikale Analyse beziehen. Auf diese Weise können keine Fehler gemacht werden, verglichen mit der Verwendung nur der horizontalen oder vertikalen Analyse (ausführlich beschrieben in der Originalarbeit¹¹). Auch dieser Parametersatz wird für die gesamte Oberfläche des mikroskopischen Feldes berechnet.
   1. Verwenden Sie die Definitionen und Formeln, die für jeden Parameter spezifisch sind, um die Ergebnisse zu analysieren¹¹. Verwenden Sie die folgenden Besiedlungsparameter: Häufigkeit der Besiedlung (%), Intensität der Besiedlung (%), Arbuskeln (%) und Vesikel (%), Sporen (%) und Hilfszellen (%), Eintrittspunkte (%), Prozentsatz der Nicht-Mykorrhizabereiche (%), Gesamtbesiedlungsgrad (%) und der Bericht über Mykorrhiza-/Nicht-Mykorrhiza-Bereiche.
      HINWEIS: Wenn Arbuskeln, Vesikel, Sporen, Hilfszellen und Eintrittspunkte in analysierten Proben fehlen, werden sie von der MycoPatt-Tabelle mit Null (0) bewertet.
3. Erstellung und Extraktion von Mykorrhizakarten: Visualisieren Sie das Bild, das aus der Umwandlung des Mykorrhizastrukturcodes in Farben im zweiten Blatt der MycoPatt-Diagramme gewonnen wird (Abbildung 7A). Exportieren Sie das resultierende Bild im Diagrammblatt als Bild (Abbildung 7B). Verwenden Sie den Farbcode in der Legende für die Analyse von Mykorrhizamustern.
4. Mykorrhiza-Kartenanalyse: Identifizieren Sie die wichtigsten Strukturen und deren Assemblage auf Mykorrhizakarten. Beschreiben Sie das Mykorrhiza-Besiedlungsmuster, das in den analysierten Wurzeln beobachtet wurde. Beschreiben Sie die Mykorrhiza-Kolonisationsstrategie basierend auf der beobachteten strukturellen Entwicklung in der Wurzel, dem Verzweigungsmuster und der Arbuskel-/Vesikelentwicklung.

Representative Results

Die korrekte Anwendung der schonenden Zerkleinerungsmethode der Wurzeln nach den Färbevorgängen liefert gute Details der Mykorrhizastrukturen, sowohl für Zea mays (Abbildung 8A-C) als auch für Festuca rubra (Abbildung 9A-E), einen guten Kontrast zwischen Mykorrhizastrukturen und Wurzelzellen und eine Bestätigung der Stele aufgrund der blauen Farbe. Wenn die Reinigungs- und Färbeverfahren nicht erfolgreich sind, sind Wurzelproben schwer zu zerkleinern und zeigen keine eindeutigen Mykorrhizastrukturen (Abbildung 10A-E). Wiederholen Sie in diesem Fall den gesamten Reinigungs-Färbe-Vorgang.

Die Verwendung der Mykorrhiza-Mustermethode und des MycoPatt-Tools ermöglichte eine vollständige Erforschung des Kolonisationsmechanismus. Die Methode bietet eine tiefe, kleinräumige Untersuchung von Besiedlungsmustern und -strategien für jede Art (Abbildung 11 und Abbildung 12) mit einem zusätzlichen visuellen Ausdruck der Kolonisationsparameter (Tabelle 1 und Tabelle 2). Die beiden Studien an Zea mays, ausführlich beschrieben von Pop-Moldovan et ^al.12, und Festuca rubra, detailliert von Corcoz et al. ^13,14, lieferte eine große Datenbank mit Beobachtungen, Mykorrhizakarten und Kolonisationsparametern. Beide Datenbanken bewerteten die Häufigkeit der Besiedlung (%), die Intensität der Besiedlung (%), Arbuskeln (%) und Vesikel (%), den Prozentsatz der Nicht-Mykorrhiza-Bereiche (%), den Gesamtbesiedlungsgrad (%) und den Bericht über Mykorrhiza-/Nicht-Mykorrhiza-Gebiete als Kolonisationsparameter. Für Zea mays bestand die Datenbank aus 5.850 Linieneinträgen in der Tabellenkalkulationsdatenbank, zusammengestellt in 390 Kolonisationskarten. Das Zea mays-Experiment schlug den Bericht über Mykorrhiza-/Nicht-Mykorrhiza-Gebiete als Parameter für die Beschreibung des Wechsels und der Störung zwischen besiedelten Bereichen in den Wurzeln vor. Der Ansatz erlaubt eine eingehende Analyse des Kolonisationsmechanismus und seiner Entwicklung entlang der Wurzeln. Festuca rubra stellte eine Datenbank mit 4.500 Zeileneinträgen in der Tabelle zur Verfügung, die in 300 Karten zusammengestellt wurden. Ein neuer Index wurde vorgeschlagen, der Arbuskel/Vesikel-Bericht, der weiter als Indikator für die Kolonisationsstrategie verwendet wurde. Die Gesamtbewertung der Kolonisationsstrategie schlug vier verschiedene Szenarien der Mykorrhizaentwicklung vor: 1) Vermehrungsstrategie, 2) Transferstrategie, 3) Speicherstrategie und 4) Pflanzenresistenzstrategie. Für die Extraktion der repräsentativsten Mykorrhizakarten wurden beide Datenbanken auf der Grundlage transformierter Durchschnittswerte der Häufigkeit und Intensität der Besiedlung untersucht, was zur Extraktion von drei verschiedenen Karten für jede analysierte Variante führte (Tabelle 1 und Tabelle 2). Die drei Karten stellen die AM-Besiedlung aus den Stammsegmenten dar, die den folgenden Werten am nächsten kommen: der Durchschnitt (Av) jeder Variante, der auf der Grundlage aller für eine Variante verfügbaren Daten berechnet wird; das Av−, das einen Wert darstellt, der aus der Differenz zwischen Durchschnitt und Durchschnitt/2 (Av−Av/2) berechnet wird und ein geringeres normales Kolonisationspotential aufweist; und die Av+, die einen Wert darstellt, der aus der Summe zwischen Durchschnitt und Durchschnitt/2 (Av+Av/2) berechnet wird und ein höheres normales Kolonisationspotential aufweist. Die Verwendung dieser Extraktionsformel ermöglicht es dem Benutzer, die Extreme (höchste oder niedrigste) der Besiedlung zu vermeiden. Die Methode ermöglicht die Extraktion der meisten möglichen Fälle von Mykorrhizabesiedlung.

Zea mays wiesen ein stark schwankendes Besiedlungspotenzial auf, das vom Entwicklungsstadium der Pflanze abhing (Tabelle 1, Abbildung 11). Die Werte der Kolonisationshäufigkeit variierten stark zwischen 3,67% und 69,60%, unterstützt durch Werte von 50% für die Intensität der Kolonisation. Der Hauptgrund für dieses Phänomen ist, dass sich das Wurzelsystem während der gesamten Vegetationsperiode kontinuierlich entwickelt. Arbuskeln wiesen Maximalwerte in der Entwicklungsphase von 6 Blättern (B2) auf, mit einer Abnahme in den folgenden Wachstumsstadien. Vesikel traten sporadisch auf, mit Werten unter 1%. Die Untersuchung von Mykorrhizamustern ergab, dass Hyphen in verschiedenen Bereichen der Wurzeln mit begrenzter Ausdehnung entwickelt wurden. Große Diskontinuitäten zwischen kolonisierten Gebieten wurden beobachtet, mit einer unregelmäßigen Entwicklung von Hyphen um den zentralen Punkt der Kolonisation. Die Besiedlungsstrategie zeigte große Unterschiede im Intervall der Pflanzenresistenz zu den Proliferations- und Transferstrategien. Das Stadium von 6 Blättern (B2), gefolgt vom Stadium der Kolbenbildung (B4), zeigte eine Transferstrategie der Kolonisation, die durch die mykorrhifizierten / nicht-mykorrhizierten Flächenberichte von weniger als 0,14 unterstützt wurde. Der einzige Fall mit einer sichtbaren hohen Transferstrategie wurde in der B2-Phase aufgezeichnet, als große Wurzelflächen Arbuskeln aufwiesen. Ihre Gesamtpositionierung zeigte eine klare Trennung zwischen dem Bereich, in dem Arbuskeln entwickelt wurden, und dem Bereich, in dem sich Arbuskeln in einem emergenten Stadium befanden. Das homogenste durchschnittliche Besiedlungsmuster wurde in der B5-Entwicklungsphase beobachtet, mit konstanten nicht kolonisierten Gebieten zwischen den kolonisierten. Die Gesamtbewertung dieses visuellen Phänomens entsprach der endgültigen Vegetationsperiode, mit geringen Werten von Arbuskeln, die auf die Regression dieser Strukturen hindeuteten.

Festuca rubra ist eine dominante Art in Bergwiesen mit einem mehrjährigen Wurzelsystem. Aufgrund dieser Anpassung finden die meisten Besiedlungsprozesse innerhalb der Wurzeln statt, und die Entwicklung von Hyphennetzwerken korreliert mit einer geringen Entwicklungsgeschwindigkeit der Wurzeln (Tabelle 2, Abbildung 12). Aufgrund des Einsatzes von Düngemitteln wiesen die Besiedlungsparameter hohe Unterschiede zwischen den Varianten auf. Die Unterschiede in der Kolonisationshäufigkeit betrugen 65%, unterstützt von einem Unterschied von 36% in den aufgezeichneten Intensitäten. Jede Variante zeigte ein anderes Kolonisationsmuster, korrelierte mit der langfristigen Anwendung von Behandlungen und begleitete eine Variation zwischen 0,09-0,96 im Bericht über mykorrhisierte/nicht mykorrhizierte Bereiche und 0-9,43 im Bericht über Arbuskeln/Vesikel. Die Kontrollvariante (V1) zeigte eine durchschnittliche speicherorientierte Strategie, wobei eine begrenzte Fläche die Entwicklung von Arbuskeln für die Av+-Kolonisationskarte einschränkte. Das vereinfachte Bild der Besiedlung (Av−) zeigte sowohl eine lineare als auch laterale Entwicklung der Hyphen, die für die beiden oberen Modelle (Av− und Av+) vollständig auf eine unregelmäßige Besiedlung ausgerichtet war. Die Anwendung organischer Behandlungen (V2) induzierte duale, lineare und unregelmäßige Hyphenentwicklung in den Wurzeln. Die für die organische Behandlung identifizierte Kolonisierungsstrategie zeigte eine Orientierung auf eine Lagerstrategie, die mit der langsamen Freisetzung von Gülle im Boden und seiner Persistenz von einer Saison zur nächsten verbunden ist. Das Av+-Modell wies das höchste Kolonisationspotenzial mit einer intensiven Präsenz von Vesikeln auf. Der Bericht über mykorrhisierte/nicht mykorrhizierte Gebiete zeigte eine homogene Besiedlung mit seltenen Diskontinuitäten zwischen kolonisierten Gebieten. Im Gegensatz dazu induzierte die Anwendung von Mineraldüngern (V4) die Rückbildung der Mykorrhizabesiedlung. Die kolonisierten Gebiete wiesen ein unregelmäßiges Muster auf, mit großen unkolonisierten Diskontinuitäten zwischen ihnen. Die beobachtete Strategie war im Allgemeinen auf eine Pflanzenresistenz ausgerichtet, mit kleinen Bereichen, in denen entweder eine punktuelle Lager- oder Transferstrategie sichtbar war. Die vergleichende Analyse zwischen mineralischen organischen (V3) und mineralreichen organischen (V5) Behandlungen zeigte eine kontinuierliche Regression der Kolonisation und Verschiebungen in der Kolonisationsstrategie, angepasst zwischen den beiden entgegengesetzten Behandlungen (V2 und V4). Alle kolonisierten Gebiete entwickelten sich unregelmäßig um einen zentralen Punkt, mit einer homogenen Präsenz von nicht kolonisierten Gebieten. Die Kolonisationsstrategie war auf eine proliferative Transferstrategie ausgerichtet, mit dem Vorhandensein von Vesikeln in begrenzten Bereichen. Die größten nicht besiedelten Diskontinuitäten wurden in der Variante mit einem höheren Mineraldüngeranteil (V5) identifiziert.

Abbildung 1: Verfahren zur Probenahme von Wurzeln . (A) Entnahme von Proben mit Erde zum Schutz der Unversehrtheit der Wurzeln. (B) Messungen des Wurzelsystems nach dem ersten Clearing-Verfahren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Gefärbte Wurzeln werden bis zur Verarbeitung in einem Glas mit Leitungswasser aufbewahrt. Wurzeln behalten ihre Farbe bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Wurzelverarbeitung . (A) Bewahren Sie alle Wurzeln einer Probe in Wasser in einer Petrischale auf. (B) Die Wurzeln in Segmente von 1 cm Länge schneiden. (C-D) Drücken Sie vorsichtig auf den Laminierbeutel, um die Wurzeln zu zerkleinern, und legen Sie sie langsam auf einem Objektträger an. (E-F) Bedecken Sie die Wurzelsegmente mit einem Deckglas und fügen Sie an einer Ecke einen Tropfen Leitungswasser hinzu. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Bildverarbeitung. (A) Fügen Sie alle Bilder hinzu, die von einer Probe in einer Präsentation aufgenommen wurden. Richten Sie alle Bilder aus, um die mikroskopische Ansicht jeder Wurzel zu rekonstruieren. (B) Fügen Sie zur Vorbereitung des Rasters eine Tabelle mit einer Breite von 10 Zellen x 10 Zellen Länge für jedes Bild hinzu. Legen Sie die internen Grenzen auf "Keine" fest. Die Binnengrenze wird weiterhin sichtbar sein, aber ihre Transparenz wird die Mykorrhizaanalyse nicht beeinträchtigen. (C-D) Verwenden Sie die Legende von MycoPatt, um jede auf dem Bild sichtbare Struktur zu bewerten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Einfügen von Daten in MycoPatt. Kopieren Sie die gesamte Datenbank mit Beobachtungen aus der Präsentation nach MycoPatt. Fügen Sie es als Zahlen ein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Rohdatenextraktion und Primärdatenanalyse. (A) Kolonisationsbewertung für alle 10 horizontalen Zellen aus einer Reihe. (B) Kolonisationsbewertung für alle 10 Zellen aus einer Spalte (vertikal) in jedem der 10 Zellen x 10 Zellquadrate von MycoPatt. (C) Bewertung der transversalen Besiedlung und Berechnung der durchschnittlichen Besiedlungsparameter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Extraktion von Mykorrhizamusterkarten . (A) Für den gesamten Datensatz ist eine große Karte mit 10 Zellen x 150 Zellen im Diagrammblatt von MycoPatt verfügbar. (B) Extrahieren Sie die Kolonisationskarte als Bild. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Mikroskopische Aufnahmen von AMF-Strukturen in verarbeiteten Wurzeln von Zea mays. (A) Interzelluläre und intrazelluläre Entwicklung von Arbuskeln im Hyphennetzwerk. (B) Dichtes Hyphennetzwerk mit zahlreichen Arbuskeln, die sich intrazellulär entwickeln. (C) Reihe von Vesikeln unterschiedlicher Abmessungen. Abkürzungen: H = Hyphen; A = Arbuskeln; V = Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 9: Mikroskopische Aufnahmen von AMF-Strukturen in verarbeiteten Wurzeln von Festuca rubra. (A) Mehrere Hyphennetzwerke mit Vesikeln und Arbuskeln entwickelten sich in getrennten Bereichen. (B) Detail eines aufgewickelten Hyphennetzwerks. (C) Detail eines Eintrittspunktes und zweier gewundener Hyphen. (D) Detail eines Vesikels am Ende einer aufgewickelten Hyphe. (E) Detail einer intrazellulären Arbuskel, Detail einer gewundenen Hyphe und das Vorhandensein eines Vesikels am Ende einer Hyphe. Abkürzungen: H = Hyphen; A = Arbuskeln; V = Vesikel; Ep = Einstiegspunkte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 10: Unklare mikroskopische Bilder von AMF-Strukturen in Wurzeln von Festuca rubra (A-C) und Zea mays (D-E) in unvollständigen gereinigten und gefärbten Wurzeln. (A) Unklar gefärbte Wurzel mit einer geringen Anzahl sichtbarer Hyphen und der einheimischen Farbe der Wurzeln. (B) Hyphen aus blauem und intensiv blauem Farbverlauf mit unklarer Unterscheidung zwischen den Wurzelzellen und Hyphen. (C) Klares gefärbtes Hyphennetzwerk im oberen Teil des Bildes und unvollständig gefärbte Hyphen im unteren Teil des Bildes. (D) Intensiv gefärbte Wurzel und Hyphen, die die Identifizierung von AM-Strukturen unmöglich machen. (E) Detail einer intensiv gefärbten Wurzel mit Artefakten in den Zellen, die die Identifizierung von AM-Strukturen unmöglich machen. Abkürzungen: H = Hyphen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 11: Mykorrhiza-Besiedlungsmuster (Av, Av− und Av+) in Wurzeln behandelter Zea mays. Abkürzungen: A0 = Zeitpunkt der Anwendung der Behandlung; A1 = Kontrollvariante (keine Behandlung)/A2 = behandelte Variante; B1 = 2-4 Blätter (als Kontrollpunkt für den Beginn der Mykorrhizabesiedlung); B2 = 6 Blätter; B3 = 8-10 Blätter; B4 = Kolbenbildung; B5 = physiologische Reife. Variantenkombinationen sind A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; und A1B5/A2-B5. Die vollständige Beschreibung der Behandlungen finden Sie in Pop-Moldovan et ^al.12. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 12: Mykorrhiza-Besiedlungsmuster (Av, Av− und Av+) in Wurzeln von langzeitbehandelten Festuca rubra. Abkürzungen: V1 = Kontrolle, nicht gedüngt; V2 = 10 t·ha⁻¹ Mist; V3 = 10 t·ha−1 Gülle + N 50 kg·^ha-1,_P2O525 kg·ha−1,_K2O25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P2O5 50 kg·ha−1,_K2O50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 Gülle + N 100 kg·^ha-1,_P2O5 50 kg·ha−1, K₂O 50 kg·ha⁻¹. Die vollständige Beschreibung der Behandlungen finden Sie in früheren Arbeiten^13,14. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Werte der Mykorrhiza-Besiedlungsparameter in Wurzeln von Zea mays basierend auf dem Entwicklungsstadium. Legende: A0 = Zeitpunkt der Anwendung der Behandlung; A1 = Kontrollvariante (keine Behandlung)/A2 = behandelte Variante; B1 = 2-4 Blätter (als Kontrollpunkt für den Beginn der Mykorrhizabesiedlung); B2 = 6 Blätter; B3 = 8-10 Blätter; B4 = Kolbenbildung; B5 = physiologische Reife. Variantenkombinationen sind A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; und A1B5/A2-B5. Die vollständige Beschreibung der Behandlungen finden Sie in Pop-Moldovan et ^al.12. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Werte der Mykorrhizakolonisationsparameter in Wurzeln von Festuca rubra basierend auf angewandter Düngung. Legende: V1 = Kontrolle, nicht gedüngt; V2 = 10 t·ha⁻¹ Mist; V3 = 10 t·ha−1 Gülle + N 50 kg·^ha-1,_P2O525 kg·ha−1,_K2O25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P2O₅ 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 Gülle + N 100 kg·^ha-1, P2O₅ 50kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹. Die vollständige Beschreibung der Behandlungen finden Sie in früheren Arbeiten^13,14. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Detaillierte Protokollschritte von der Feldprobenahme der Wurzeln bis zur Rohdatenanalyse und Mykorrhizakartenextraktion. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Studien zur Mykorrhizabesiedlung sind entscheidend für die Entwicklung neuer Strategien im agronomischen Bereich. Das Potenzial mehrerer Kulturpflanzen, eine symbiotische Assoziation mit arbuskulären Mykorrhizen zu bilden, machte sie zu einem wichtigen Bestandteil der nachhaltigen Entwicklung des Agrarökosystems und der Erhaltung seiner Gesundheit 16,17,18,19,20. Daher besteht ein Bedarf an einem besseren Verständnis des Besiedlungsmechanismus und der Pilzstrategien, die wichtige Daten darüber liefern, wie sich eine Pflanze mit Ernährungsnetzwerken aus dem Boden, ihrem Ertrag und ihrem Überlebenspotenzial verbinden kann. Daher ist dies im Kontext der intelligenten Landwirtschaft ein Muss dieses Jahrhunderts, es ist wichtig, eine eingehende Bewertung der Kolonisierung durchzuführen, und Studien müssen ein realistisches Bild der Pilzposition in den Wurzeln liefern.

Die Methode der Wurzelmykorrhizamuster bietet einen so tiefen Scan der Wurzeln, bringt jedoch sowohl Einschränkungen als auch Vorteile mit sich¹¹. Die dargestellten Einschränkungen sind die große Anzahl von Proben, die bei der ersten Analyse einer Pflanze bewertet werden müssen, die Notwendigkeit der Bildmanipulation und die manuelle Zuordnung von Mykorrhizastrukturen in Wurzeln, aber all dies kann durch mehrere langfristige Vorteile überwunden werden. Die große Datenbasis, die sich aus der Anwendung dieser Methode und der Integration der Mikroskopie mit dem MycoPatt-Tool ergibt, bietet Stabilität, statistische Sicherheit der Ergebnisse und Beständigkeit im Vergleich der Ergebnisse. Die Identifizierung von Mykorrhizamustern für die Wurzeln einer bestimmten Pflanze wird nachfolgende Vergleichsstudien erleichtern. Außerdem verbessert es die Identifizierung neuer Muster, die Informationen über die Entwicklung von Kolonisationsmechanismen und Pilzstrategien liefern können. Die Berechnung der durchschnittlichen Kolonisationsparameter basierend auf horizontaler und vertikaler Entwicklung ermöglicht die Erfassung realistischerer und komplexerer Werte im Vergleich zu den visuellen Schätzmethoden wie Gitterschnittpunkt, Wurzelsegmentschätzung und vergrößertem Schnittpunkt ^9,11. Insgesamt erlaubt die Mykorrhizamustermethode die Beurteilung des Pilzvormarsches und der Verzweigung in den Wurzeln sowie die Identifizierung neuer Punkte der äußeren Besiedlung und die Ausdehnung von Hyphen entlang der Wurzeln. Es ermöglicht die Positionierung von Arbuskeln und Vesikeln und weist ihnen eine realistische Position und Dimension im globalen Muster zu.

Die korrekte Anwendung der MycoPatt-Methode hängt vom erfolgreichen Abschluss jedes Schritts des Protokolls ab (Tabelle 3). Für eine höhere Effizienz ist der gesamte Ablauf der Methode so konzipiert, dass er von einer oder mehreren Personen mit unterschiedlichen Ausbildungsstufen durchgeführt wird. Auf diese Weise werden aus jedem Schritt mehrere Ergebnisse extrahiert und eine kontinuierliche Analyse ist möglich. Für die Auswahl des biologischen Materials, die Wurzelprobenahme und den Lagerschritt ist es notwendig, dass eine gut ausgebildete Person die Art unabhängig von ihrem Wachstumsstadium korrekt identifiziert. Sobald die Art identifiziert ist, kann die Wurzelprobenahme von jeder Person durchgeführt werden, mit minimalem Training für die schonende Entfernung von Bodenpartikeln. Der zweite Schritt, die Wurzelverarbeitung, -reinigung und -färbung für die Mikroskopie, erfordert geschulte Personen. Der Prozess besteht aus mehreren Verifizierungsschritten, und jeder Schritt ist für den Erfolg des Verfahrens erforderlich. In den ersten beiden Schritten können mehrere Proben gleichzeitig verarbeitet werden. Die Wurzelbearbeitung für die Mikroskopie (Schritt 3) und die mikroskopische Analyse von Wurzelproben (Schritt 4) sind aufgrund der hohen Aufmerksamkeit, die für das Schneiden der Segmente in 1 cm große Stücke erforderlich ist, in Kombination mit ihrer schonenden Zerkleinerung für die Objektträgerpräparation sehr wichtig. Die Mikroskopie benötigt Aufmerksamkeit für die Kalibrierung des Lichts und die Software, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten. Beide Schritte erfordern gut ausgebildete oder mittelgeschulte Personen unter Aufsicht eines Experten. Die postmikroskopische Bildzusammenstellung erfordert hochqualifiziertes Personal für die korrekte Überlappung und Reihenfolge der Bilder, um das Segment zu rekonstruieren. Die Bewertung der Mykorrhizakolonisation ist ein Schritt, bei dem ein Spezialist für AM-Pilze ihre Strukturen und Kolonisationsleistung identifizieren und für jede Struktur Scores auf Rasterbildern zuweisen muss. Der letzte Schritt, die Rohdatenanalyse und die Ergebnisextraktion, erfordern einen hochqualifizierten Datenanalysten, der die Datenbanken zusammenstellt und die Statistiken hinter der Datenfilterung und der Extraktion der relevantesten Karten verwaltet. Dieser Schritt kann mit der Arbeit des Mykorrhizaspezialisten kombiniert werden, um eine maximale Effizienz des Prozesses zu erzielen. Insgesamt ermöglicht der gesamte Ablauf die Einbindung mehrerer Spezialisten in eine interdisziplinäre Studie, was zu qualitativ hochwertigen Ergebnissen führt.

Wie jede neue Methode muss sich auch die Mykorrhizamustermethode weiterentwickeln und verbessern. Es gibt einige Änderungen, die diese Methode in Zukunft einfacher zu verwenden machen und mehrere Ergebnisse liefern werden. Wenn dies durch die langsame Reinigungs- und Färbetechnik geschieht, ermöglicht diese Methode die Manipulation mehrerer Proben gleichzeitig, um die Analyse nach jedem Schritt des Verfahrens zu pausieren / neu zu starten und mehrere digitale Datenbanken zu erhalten. Eine wichtige Verbesserung wird der Einsatz leistungsfähiger Scanner zur schnelleren Bildaufnahme und nach der Entwicklung geeigneter und effizienter Werkzeuge zur Mykorrhizastrukturerkennung die Automatisierung dieses Prozesses sein. Im Kontext der Technikentwicklung wird die schnelle Erfassung von Mykorrhizamustern zukünftige Studien auf diesem Gebiet unterstützen.

Es gibt mehrere Schwierigkeiten bei der Verwendung automatischer Software. 1) Aufgrund der unterschiedlichen Positionen von AM-Strukturen - Hyphen und Vesikeln - außerhalb der Wurzelzellen und Arbuskeln innerhalb der Wurzelzellen ist es schwierig, Software zu kalibrieren und zu trainieren, um sie im selben Bild zu erkennen. 2) Für die Zusammenstellung der Bilder aus einem Segment richtet die Software die Bilder nicht immer aus, um das Segment neu zu erstellen, und es ist möglich, dass sie zufällig platziert werden, was den Prozess verändert. 3) Ein weiteres Problem ist, dass Software nicht unterscheiden kann, ob einige Teile zweier Bilder identisch sind oder ob sich bei den Mikroskopieverfahren einige Felder überlappen. Daher muss der Prozess manuell von geschulten Experten durchgeführt werden.

Insgesamt wurden 60 cm Wurzel von jeder Variante aus mehreren Pflanzen analysiert. Das aktuelle Manuskript soll das Konzept der Verwendung des MycoPatt-Systems und -Tools vorstellen, und die Ergebnisse präsentieren die Funktionalität dieser Methode. Im Vergleich zu dieser Methode hat die Gitterschnittmethode aufgrund der zufälligen Platzierung der gefärbten Wurzeln eine höhere Subjektivität. Wir glauben, dass es in Zukunft notwendig sein wird, für jede AM-Anlage die Anzahl der zu verwendenden Segmente festzulegen. Dies ist Forschung, die von allen Forschern auf dem Gebiet der Mykorrhizen durchgeführt werden muss. Einer der Artikel, die mehrere Methoden⁹ verglichen, zeigte eine ähnliche Besiedlungsrate von 50 bis 200 Wurzelsegmenten / Pflanze. Ihre Schlussfolgerungen besagten, dass eine objektivere Methode erforderlich ist, um jedes Segment zu analysieren. Basierend auf unserer Forschung reduziert MycoPatt die Subjektivität auf 0. Jedes Segment wird gescannt und eingehend analysiert. Auch eine Bilddatenbank für alle analysierten Segmentergebnisse kann mit dieser Methode entwickelt werden. Dies kann bei Bedarf auch für die erneute Analyse der Daten verwendet werden.

Die gesamte Methode liefert Ergebnisse, die für mehrere Forschungs- und kommerzielle Bereiche notwendig sind. Pflanzenzüchter versuchen ständig, widerstandsfähigere Sorten und Hybriden zu schaffen, die sich an bestimmte Bodenbedingungen anpassen. In diesem Zusammenhang werden Pflanzenzüchtungsprozesse in Bezug auf die Pflanzenanbindung an Mykorrhizanetzwerke aus dem Boden von den ersten Selektionsstadien profitieren. Die Mykorrhizamusteranalyse zeigt die Unterschiede zwischen Hybriden in Bezug auf die Mykorrhizaernte aus dem Boden und die Akklimatisierung an die Standortbedingungen. Forscher im Züchtungsbereich können mit dieser Methode bereits in frühen Stadien der Selektionsprozesse die Eignung neuer Sorten/Hybriden für Bodenmykorrhizabedingungen nachweisen. Auf diese Weise wird es Sorten/Hybriden geben, die sich leicht an eine Vielzahl von Bedingungen und Technologien anpassen, aber auch Sorten/Hybriden mit geringerer Akzeptanz und hoher Spezifität für enge Bedingungen. Für Grünlandökosysteme eignet sich die Mykorrhizamustermethode perfekt für mehrere Anwendungen: ein besseres Verständnis des Pflanzenüberlebens in verschiedenen Vegetationsgemeinschaften im Zusammenhang mit Pilzunterstützung; die Analyse spezifischer Besiedlungsmuster bei endemischen und gefährdeten Arten; das invasive Potenzial exogener Arten; und die Dominanz-Kodominanz-Fluktuationen aufgrund der Anwendung verschiedener Inputs²¹. Die Muster können von Inokulumherstellern weiter verwendet werden, die die potenziellen Dosen basierend auf aktiven Ausbreitungen und Eintrittspunkten berechnen müssen. Es können auch hochspezifische Biodünger entwickelt werden, die geeignetes Inokulum für Pflanzen mit den gleichen Genitoren enthalten. In der Forschung stellen Mykorrhizamuster eine sehr vergleichende Studie dar, sowohl aus visueller als auch aus numerischer Sicht. Es gibt mehrere Datenbanken^22,23,24, die Mykorrhizaarten und die Strukturen, die sie in den Wurzeln von Testpflanzen entwickeln können, präsentieren^, aber keine von ihnen präsentiert bis heute das vollständige Kolonisationsbild. All diese Anforderungen und die Notwendigkeit realistischerer und anwendungsorientierterer Studien unterstützen die Integration der Mykorrhiza-Mustermethode in Boden-Mikroben-Pflanzen-Interaktionsstudien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb