Les cartes mycorhiziennes comme outil pour explorer les modèles de colonisation et les stratégies fongiques dans les racines de Festuca rubra et Zea mays

Summary

Le protocole décrit ici les méthodes d’évaluation des modèles et de la stratégie de colonisation mycorhizienne arbusculaire dans les racines de deux espèces: Zea mays et Festuca rubra. L’utilisation de la méthode MycoPatt permet le calcul de paramètres, la conversion de structures mycorhiziennes en données numériques et la cartographie de leur position réelle dans les racines.

Abstract

Les champignons mycorhiziens arbusculaires sont des symbiotes dans les racines des plantes. Leur rôle est de soutenir le développement de l’hôte et de maintenir l’équilibre nutritionnel dans les écosystèmes. Le processus de colonisation dépend de plusieurs facteurs tels que l’écologie du sol, la diversité génétique des champignons et de l’hôte, et les pratiques agronomiques. Leur action synchronisée conduit au développement d’un réseau hyphe complexe et conduit au développement secondaire de vésicules et d’arbuscules dans les cellules racinaires. Le but de cette recherche était d’analyser l’efficacité de la méthode des motifs mycorhiziens (MycoPatt) pour le positionnement des structures fongiques dans les racines de Festuca rubra et Zea mays. Un autre objectif était d’explorer la stratégie de colonisation fongique révélée par les cartes mycorhiziennes de chaque espèce. L’acquisition et l’assemblage de multiples images microscopiques permettent d’évaluer la colonisation mycorhizienne chez les plants de maïs et de fétuque rouge afin de fournir des informations sur la position réaliste des structures développées. Les schémas mycorhiziens observés mettent en évidence l’efficacité variable de chaque plante en termes de développement de connexions avec les champignons symbiotiques du sol, causées par les traitements appliqués et le stade de croissance. Les cartes détaillées mycorhiziennes obtenues par la méthode MycoPatt sont utiles pour la détection précoce de l’efficacité des plantes dans l’acquisition symbiotique du sol.

Introduction

Les mycorhizes arbusculaires (MA) sont une catégorie d’endophytes terricoles qui sont constamment un domaine d’intérêt pour les chercheurs. Leur présence dans les racines de la plupart des plantes et leur implication dans les cycles des nutriments en font des composantes essentielles de la stabilité de tout écosystème où des plantes herbacées sont présentes ^1,2. Grâce à leur mycélium extra-radiculaire, la FA agit comme une extension fongique pour les racines des plantes, en particulier dans les zones difficiles d’accès³. L’activité principale est dans les racines des plantes hôtes, où la FA développe de grands réseaux d’hyphes et des structures intracellulaires spécifiques appelées arbuscules. Le manque de spécificité de l’hôte permet au symbiote de coloniser plusieurs espèces en même temps. Cette capacité confère à la FA le rôle de l’allocation des ressources et de la régulation des nutriments dans l’écosystème; Le champignon fournit également un soutien à la survie des plantes et aide à la performance des plantes 4,5,6,7. La réaction des espèces AM aux racines hôtes est visible dans l’extension et l’emplacement du mycélium intra-radiculaire et la présence et la forme des arbuscules développés intracellulairement. Les arbuscules intracellulaires agissent comme un point d’échange entre les deux symbiotes et représentent des zones caractérisées par des processus de transfert rapides. Les structures produites par l’AM dépendent de l’espèce et, en plus des arbuscules, dans les racines, elles développent également des vésicules, des spores et des cellules auxiliaires.

L’évaluation des symbiotes AM dans les racines des plantes ^8,9 présente de nombreux défis. Le premier est leur développement constant pendant toute la période de végétation des hôtes, ce qui entraîne de multiples changements dans la structure arbusculaire hyphe. Les différents stades de croissance arbusculaire, jusqu’à leur effondrement, sont clairement présents dans les racines, mais les structures AM sénescentes sont parfois digérées, ce qui ne les rend que partiellement visibles¹⁰. Le deuxième défi est représenté par la méthode et le protocole de coloration, la grande diversité des systèmes racinaires, la dimension de leurs cellules et les différences d’épaisseur, qui rendent difficile la proposition d’une méthode unifiée. Le dernier défi est représenté par l’évaluation et la notation de la colonisation de la FA. Il existe de nombreuses méthodes qui notent la FA avec différents degrés d’objectivité, et la plupart d’entre elles sont encore limitées aux techniques de microscopie. Les plus simples sont basés sur la présence / absence de structures dans le cortex racinaire, tandis que les plus complexes sont basés sur la notation visuelle et l’utilisation de classes de colonisation, avec l’intégration de la fréquence et de l’intensité du phénomène de colonisation. De nombreuses données ont été produites au cours des dernières décennies sur le statut mycorhizien de plusieurs espèces, mais la plupart des méthodes sont limitées à la valeur observée de la colonisation sans indiquer la position réelle de chaque structure dans le cortex racinaire. En réponse à la nécessité de résultats plus précis sur la colonisation de la MA, une méthode basée sur l’analyse microscopique des motifs mycorhiziens (MycoPatt) dans les racines a été développée pour assembler, sous forme numérique, les cartes mycorhiziennes détaillées¹¹. En outre, la méthode permet le calcul objectif des paramètres de colonisation et la détermination de la position réelle de chaque structure dans la racine.

La position des structures fongiques AM peut être importante pour répondre aux deux questions suivantes. La première est liée à l’analyse de la colonisation à un moment précis du cycle de végétation d’une plante. Dans ce contexte, il est très utile d’observer l’abondance des arbusculaires / vésicules, de signaler comment elles sont situées dans la racine et de fournir une image et des paramètres de colonisation très clairs. La seconde est liée à la détection de la stratégie fongique et de son orientation et même à la prévision de son développement futur. Une application du MycoPatt peut être pour les plantes analysées quotidiennement, tous les 2-3 jours, chaque semaine ou pendant divers stades de croissance. Dans ce contexte, l’emplacement des vésicules/arbuscules est important pour mieux comprendre le mécanisme biologique de la colonisation par la MA. Ces paramètres et observations sont très utiles pour compléter les paramètres mathématiques.

Le but de cet article est de démontrer la capacité du système MycoPatt à explorer le potentiel et la stratégie de colonisation des champignons AM indigènes dans les racines de Zea mays (maïs) à différents stades de développement et dans les racines de Festuca rubra (fétuque rouge) dans différentes conditions de fécondation à long terme. Pour atteindre cet objectif, deux grandes bases de données issues de deux expériences ont été analysées. L’expérience sur le maïs a été établie à Cojocna (46°44′56 » lat. N et 23°50′0 » de long. E), dans la ferme didactique expérimentale de l’Université des sciences agricoles et de médecine vétérinaire de Cluj sur un phaeoziom avec un sol à texture limoneuse¹². L’expérience sur la fétuque rouge fait partie d’un site expérimental plus vaste établi en 2001 à Ghețari, dans les montagnes Apuseni (46°49'064 » lat. N et 22°81'418'' de long. E), sur un sol préluvosol (terra rossa) de type^13,14. Le maïs a été récolté dans cinq phénophases de croissance^{différentes 12} : B1 = 2-4 feuilles (comme point de contrôle pour le début de la colonisation mycorhizienne); B2 = 6 feuilles; B3 = 8-10 feuilles; B4 = formation d’épis; B5 = maturité physiologique. À partir du stade 2-4 feuilles (A0), un traitement organique a été appliqué, ce qui a entraîné un facteur de graduation à deux (A1 = témoin et A2 = traité). Les racines de fétuque rouge ont été recueillies à la floraison à partir d’une expérience avec cinq fertilisations à long terme^13,14: V1 = témoin^, non fertilisé; V2 = 10 t·^ha-1 fumier; V3 = 10 t·ha-1 fumier + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha-1, K₂O 25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 fumier + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1. Cinq plantes ont été collectées à chaque stade de développement de chaque variante de fertilisation. Les protocoles de coloration et leur performance en termes de temps de traitement des échantillons et de qualité de coloration ont été analysés. La relation entre le développement des hyphes AM et la présence de ses structures dans les racines a été analysée séparément pour chaque espèce et s’est poursuivie avec l’identification des racines les plus permissives pour la colonisation. Les modèles de colonisation spécifiques de chaque système racinaire ont été analysés en fonction des cartes de colonisation et de la valeur des paramètres AM.

Le maïs est une plante annuelle, ce qui implique une croissance continue des racines, et c’était la principale raison d’appliquer le MycoPatt dans les stades de croissance. La fétuque rouge est une plante vivace provenant d’une prairie traitée depuis longtemps avec différents engrais. Ses racines ont un développement plus court de 1 an, et l’anthèse est considérée comme le point de végétation lorsque la plante change son métabolisme de végétatif à génératif. Pour capturer ces plantes pendant ces périodes d’activité intense, les points temporels susmentionnés ont été choisis. L’échantillonnage pendant la période de végétation est difficile pour cette espèce lorsqu’elle est cultivée dans des prairies naturelles.

Protocol

1. Sélection du matériel biologique, échantillonnage des racines et entreposage

1. Recueillir toute la racine des plantes à l’aide d’une pelle (figure 1A) séparément pour chaque variante et la répliquer. Retirez doucement, à la main, les gros agrégats de terre des racines. Lavez tout le système racinaire et mesurez-le sur une échelle avec des cellules de 1 cm x 1 cm (Figure 1B). Coupez les racines séparément pour chaque plante et placez-les dans un sac en plastique.
2. Rassemblez toutes les racines propres de chaque plante dans un sac en plastique et collectez tous les échantillons d’une variante dans un sac plus grand. Inscrivez sur chaque sac le nom de la scène/variante et la date d’échantillonnage. Conservez les racines au réfrigérateur ou au congélateur à une température comprise entre −4 °C et −20 °C jusqu’à la transformation.

2. Traitement des racines, nettoyage et coloration pour la microscopie

REMARQUE : Utilisez des gants, un masque et une cagoule microbiologique/chimique pour cette étape du protocole.

1. Assurez-vous que le processus de décongélation des racines se fait lentement à température ambiante. Pour toutes les étapes du traitement, utilisez de petits pots (30-50 ml) pour réduire la quantité d’agents nécessaires.
2. Effectuez les quatre étapes suivantes de la procédure de nettoyage et de coloration lents¹⁵. Faites toutes les étapes à température ambiante. Cette méthode permet le traitement d’un grand nombre d’échantillons en même temps sans utiliser de bain-marie pour l’ébullition.
   1. Nettoyage des racines: Placez toutes les racines d’une plante dans un bocal. Préparez une solution de NaOH à 10% avec de l’eau du robinet et versez-la dans chaque pot jusqu’à ce qu’elle recouvre complètement les racines. Agiter vigoureusement les pots pendant 1 min ou 2 min pour produire une dispersion homogène de la solution de clairage dans les racines. Répétez cette procédure après 24 heures et laissez les racines dans la solution de nettoyage pendant au moins 48 heures.
      REMARQUE: Les racines propres ont un aspect jaune pâle (jusqu’à blanc) et la consistance est douce (elles peuvent être facilement écrasées en appuyant avec une pince à épiler).
   2. Rinçage des racines: Passez le contenu d’un pot à la fois à travers un tamis. Recyclez la solution de compensation. Rincer les racines plusieurs fois à l’eau du robinet jusqu’à ce que la solution de nettoyage soit complètement éliminée.
      REMARQUE: Si la solution de nettoyage n’est pas complètement éliminée, cela affectera la qualité de la procédure de coloration.
   3. Coloration des racines: Placez les racines rincées dans un bocal propre. Préparer une solution d’encre-vinaigre à 5 % : 5 % avec de l’eau du robinet (5 mL d’encre bleue + 5 mL d’acide acétique à 9 % + 90 mL d’eau du robinet). Versez la solution dans chaque pot jusqu’à ce qu’elle recouvre complètement les racines. Agiter vigoureusement les pots pendant 1 min ou 2 min pour produire une dispersion homogène de la solution de coloration dans les racines. Répétez cette procédure après 24 h et laissez les racines dans cette solution pendant 48 h.
      NOTE: Les racines tachées ont une couleur bleue intense.
   4. Décoloration partielle des racines: Rincer les racines tachées dans l’eau du robinet pendant 1-2 min. Secouez vigoureusement les pots pour enlever la solution de coloration supplémentaire. Répétez la procédure si la coloration est trop intense et ne permet pas une évaluation microscopique claire.
      REMARQUE : Les racines tachées peuvent être conservées dans l’eau du robinet jusqu’à 1 semaine à température ambiante sans altérer la qualité des taches (figure 2). Pendant de plus longues périodes, les racines peuvent être maintenues jusqu’à 2-3 mois dans une solution commerciale de vinaigre de pomme à 5% (acide acétique à 5%).

3. Traitement des racines pour la microscopie

1. Segmentation des racines : Placer les racines colorées de chaque échantillon sur une planche à découper à l’échelle (figure 3A). Couper les racines en segments de 1 cm (figure 3B). Choisissez 15 segments pour chaque variante.
2. Méthode de broyage doux pour la préparation des segments: Étaler les racines sur une lame. Utilisez une poche de laminage pour couvrir les racines et écrasez-les doucement à partir d’un bord (figure 3C,D). Utilisez un outil en plastique souple, par exemple une pince à épiler, un manche de scalpel, un stylo ou un crayon avec une gomme, pour afficher lentement les racines sur la lame. Retirez délicatement la pochette de laminage et recouvrez l’échantillon d’une lamelle de couverture (Figure 3E).
   REMARQUE: Les racines ont une forme tubulaire, il est donc nécessaire de les séparer dans un plan bidimensionnel. Cette action suppose la séparation des racines sur le point médian, conduisant à l’affichage des deux parties du diamètre interne. L’utilisation de sachets de laminage dans la procédure de broyage doux permet d’afficher les racines, qui ont une forme de cylindre, en deux morceaux - un à gauche et un à droite - vers leur point médian. De cette façon, la racine entière est analysée en profondeur, et le degré de colonisation est le paramètre qui montre la colonisation volumétrique (décrite dans le travail original sur MycoPatt¹¹). En gros, nous coupons un cylindre en deux, et après cela, nous le reconstruisons mathématiquement.
3. Ajouter de l’eau dans un coin de la lame à l’aide d’une pipette et laisser l’eau se répandre lentement sur la lame (Figure 3F). Retirez l’eau supplémentaire avec une serviette en papier.

4. Analyse microscopique des échantillons de racines

1. Utilisez un microscope équipé d’une caméra à bonne résolution.
2. Analysez les diapositives à partir d’une extrémité. Capturez chaque champ microscopique. Renommez chaque image capturée avec un code qui permettra le post-assemblage réel des parties racines. Pour les racines épaisses, utilisez le grossissement 10x ou 40x, et pour les racines minces, utilisez le grossissement 40x. Utilisez le même objectif et le même grossissement pour l’ensemble des racines d’une espèce.

5. Assemblage d’images post-microscopiques

1. Utilisez un logiciel de présentation pour concevoir une planche à dessin pour l’assemblage d’images. Définissez la largeur 2-3 cm plus large que la largeur de l’image. Ajoutez toutes les images capturées à partir d’un segment dans l’ordre de leur capture et reconstruisez toute la longueur du segment racine (Figure 4A).
   1. En bref, collectez un total de 15 images pour chaque segment de 1 cm et organisez-les verticalement, en commençant par 1 à 15, dans le logiciel de présentation pour reconstruire le segment.
2. Alignez les images au centre. Utilisez l’alignement vertical pour vous assurer que chaque image suit la précédente. Sur toutes les images, placez une grille de 10 cellules x 150 cellules pour couvrir tout le segment racine.
   1. De plus, sur chaque image individuelle, placez une grille de 10 x 10 et, dans chaque cellule de cette grille, insérez un nombre de un à six si une structure AM est visible ou laissez vide si aucune structure AM n’est présente. De cette façon, la précision du processus est maximale sans erreur dans l’emplacement des structures de FA observées.
3. Ajoutez un tableau pour une grille de 10 cellules de largeur et de 150 cellules de longueur (15 carrés de 10 cellules x 10 cellules). Remplacez les dimensions de la largeur du tableau par la largeur des images. Modifiez la longueur du tableau pour qu’il comprenne toutes les images (Figure 4B).

6. Notation de la colonisation mycorhizienne

1. Utilisez le numéro unique pour noter chaque type de structure comme décrit dans la méthode des motifs mycorhiziens¹¹: 1 pour les hyphes; 2 pour les arbuscules; 3 pour les vésicules; 4 pour les spores; 5 pour les cellules auxiliaires; et 6 pour les points d’entrée (figure 4C). Noter chaque structure mycorhizienne observée à partir de chaque cellule des grilles précédemment appliquées (Figure 4D).

7. Analyse des données brutes et extraction des résultats

1. Insérez tous les scores obtenus dans la feuille de calcul MycoPatt¹¹. Utilisez la fonction copier/coller pour transférer toutes les partitions de la présentation dans la première feuille nommée rawdata (Figure 5).
2. Analyse primaire des résultats : Utilisez la troisième feuille nommée paramètres dans le tableur MycoPatt pour visualiser les résultats sous forme de pourcentages (%) séparément sous trois formes (Figure 6A-C). Utiliser les colonnes A à K pour analyser l’image horizontale de la colonisation; colonnes M à W pour analyser l’image verticale de la colonisation; et les colonnes Y à AI pour analyser la colonisation transversale (moyenne) pour chacun des 15 carrés 10 x 10 (lignes 2-17) et la colonisation moyenne finale (lignes 19-20).
   NOTE: La colonisation moyenne transversale est utilisée pour le calcul des paramètres de colonisation réels, liés à l’analyse horizontale et verticale. De cette façon, aucune erreur ne peut être commise par rapport à si seule l’analyse horizontale ou verticale est utilisée (décrite en détail dans l’œuvre originale¹¹). En outre, cet ensemble de paramètres est calculé pour toute la surface du champ microscopique.
   1. Utilisez les définitions et formules, spécifiques à chaque paramètre, pour analyser les résultats¹¹. Utilisez les paramètres de colonisation suivants : fréquence de colonisation (%), intensité de la colonisation (%), arbuscules (%) et vésicules (%), spores (%) et cellules auxiliaires (%), points d’entrée (%), pourcentage de zones non mycorhiziennes (%), degré global de colonisation (%) et rapport des zones mycorhiziennes/non mycorhiziennes.
      REMARQUE: Si les arbuscules, les vésicules, les spores, les cellules auxiliaires et les points d’entrée sont manquants dans les échantillons analysés, la feuille de calcul MycoPatt les notera à zéro (0).
3. Production et extraction de cartes mycorhiziennes : Visualiser l’image obtenue à partir de la conversion du code des structures mycorhiziennes en couleurs dans la deuxième feuille des graphes nommés MycoPatt (Figure 7A). Exportez l’image résultante dans la feuille de graphiques en tant qu’image (Figure 7B). Utilisez le code couleur dans la légende pour l’analyse des motifs mycorhiziens.
4. Analyse cartographique mycorhizienne: Identifier les structures les plus importantes et leur assemblage sur les cartes mycorhiziennes. Décrire le schéma de colonisation mycorhizienne observé dans les racines analysées. Décrire la stratégie de colonisation mycorhizienne basée sur le développement structurel observé dans la racine, le modèle de ramification et le développement des arbuscules / vésicules.

Representative Results

L’utilisation correcte de la méthode de broyage doux des racines après les procédures de coloration fournit de bons détails sur les structures mycorhiziennes, à la fois pour Zea mays (Figure 8A-C) et Festuca rubra (Figure 9A-E), un bon contraste entre les structures mycorhiziennes et les cellules racinaires, et une confirmation de la stèle due à la couleur bleue. Si les procédures de défrichage et de coloration échouent, les échantillons de racines sont difficiles à écraser et ne montrent pas clairement les structures mycorhiziennes (figure 10A-E). Dans ce cas, répétez toute la procédure de dégagement-coloration.

L’utilisation de la méthode du motif mycorhizien et de l’outil MycoPatt a permis une exploration complète du mécanisme de colonisation. La méthode fournit une exploration approfondie et à petite échelle des modèles et des stratégies de colonisation pour chaque espèce (figure 11 et figure 12) avec une expression visuelle supplémentaire des paramètres de colonisation (tableau 1 et tableau 2). Les deux études menées sur Zea mays, décrites en détail par Pop-Moldovan et ^al.12, et Festuca rubra, détaillées par Corcoz et al. ^13,14, a fourni une grande base de données d’observations, de cartes mycorhiziennes et de paramètres de colonisation. Les deux bases de données ont noté la fréquence de colonisation (%), l’intensité de la colonisation (%), les arbuscules (%) et les vésicules (%), le pourcentage de zones non mycorhiziennes (%), le degré global de colonisation (%) et le rapport des zones mycorhiziennes / non mycorhiziennes comme paramètres de colonisation. Pour Zea mays, la base de données comprenait 5 850 entrées de ligne dans la base de données de tableurs, compilées dans 390 cartes de colonisation. L’expérience Zea mays a proposé le rapport des zones mycorhiziennes/non mycorhiziennes comme paramètre pour la description de l’alternance et de la perturbation entre les zones colonisées dans les racines. L’approche permet une analyse approfondie du mécanisme de colonisation et de son développement à la racine. Festuca rubra a fourni une base de données de 4 500 entrées de ligne dans la feuille de calcul, compilée dans 300 cartes. Un nouvel indice a été proposé, le rapport arbuscules/vésicules, qui a ensuite été utilisé comme indicateur de la stratégie de colonisation. L’évaluation globale de la stratégie de colonisation a proposé quatre scénarios différents de développement mycorhizien : 1) stratégie de propagation, 2) stratégie de transfert, 3) stratégie de stockage et 4) stratégie de résistance des plantes. Pour l’extraction des cartes mycorhiziennes les plus représentatives, les deux bases de données ont été explorées en fonction des valeurs moyennes transformées de la fréquence et de l’intensité de la colonisation, ce qui a donné lieu à l’extraction de trois cartes différentes pour chaque variante analysée (tableaux 1 et 2). Les trois cartes représentent la colonisation AM à partir des segments racines qui ont les valeurs les plus proches des suivantes: la moyenne (Av) de chaque variante, qui est calculée sur la base de toutes les données disponibles pour une variante; l’Av−, qui représente une valeur calculée par la différence entre la moyenne et la moyenne/2 (Av−Av/2) et montre un potentiel de colonisation normal plus faible; et l’Av+, qui représente une valeur calculée par la somme entre la moyenne et la moyenne/2 (Av+Av/2) et montre un potentiel de colonisation normal plus élevé. L’utilisation de cette formule d’extraction permet à l’utilisateur d’éviter les extrêmes (plus hauts ou plus bas) de la colonisation. La méthode permet d’extraire le plus de cas possibles de colonisation mycorhizienne.

Zea mays présentait un potentiel de colonisation très fluctuant, qui dépendait du stade de développement de la plante (tableau 1, figure 11). Les valeurs de fréquence de colonisation variaient grandement entre 3,67 % et 69,60 %, appuyées par des valeurs de 50 % pour l’intensité de la colonisation. La raison principale de ce phénomène est que le système racinaire se développe continuellement pendant toute la période de végétation. Arbuscules a présenté des valeurs maximales au stade de développement à 6 feuilles (B2), avec une diminution dans les stades de croissance suivants. Les vésicules sont apparues sporadiquement, avec des valeurs inférieures à 1%. L’exploration des motifs mycorhiziens a révélé que les hyphes se développaient dans différentes zones des racines, avec une extension limitée. De grandes discontinuités entre les zones colonisées ont été observées, avec un développement irrégulier d’hyphes autour du point central de colonisation. La stratégie de colonisation a montré de grandes variations dans l’intervalle de résistance de la plante aux stratégies de prolifération et de transfert. Le stade de 6 feuilles (B2), suivi du stade de formation de l’épi (B4), a montré une stratégie de transfert de colonisation, soutenue par les rapports de zone mycorhizée/non mycorhizée inférieure à 0,14. Le seul cas avec une stratégie de transfert élevée visible a été enregistré au stade B2 lorsque de grandes zones de racines présentaient des arbuscules. Leur positionnement global a montré une séparation claire entre la zone où les arbuscules ont été développés et la zone où les arbuscules étaient dans une phase émergente. Le schéma de colonisation moyen le plus homogène a été observé au stade de développement B5, avec des zones non colonisées constantes entre les zones colonisées. L’évaluation globale de ce phénomène visuel correspondait à la période finale de végétation, avec de petites valeurs d’arbuscules, qui indiquaient la régression de ces structures.

Festuca rubra est une espèce dominante dans les prairies de montagne avec un système racinaire vivace. En raison de cette adaptation, la plupart des processus de colonisation ont lieu à l’intérieur des racines, et le développement des réseaux hyphes est corrélé à une faible vitesse de développement des racines (Tableau 2, Figure 12). En raison de l’application d’engrais, les paramètres de colonisation présentaient de grandes différences entre les variantes. Les différences dans la fréquence de colonisation étaient de 65%, soutenues par une différence de 36% dans les intensités enregistrées. Chaque variante présentait un profil de colonisation différent, corrélé à l’application à long terme des traitements, et accompagné d’une variation comprise entre 0,09 et 0,96 dans le rapport sur les zones mycorhurisées / non mycorhizées et entre 0 et 9,43 dans le rapport sur les arbuscules / vésicules. La variante de contrôle (V1) a montré une stratégie moyenne axée sur le stockage, avec une zone limitée limitant le développement d’arbuscules pour la carte de colonisation Av+. L’image simplifiée de la colonisation (Av−) a montré le développement linéaire et latéral des hyphes, qui était complètement orienté vers une colonisation irrégulière pour les deux modèles supérieurs (Av− et Av+). L’application de traitements organiques (V2) a induit un développement hyphe double, linéaire et irrégulier dans les racines. La stratégie de colonisation identifiée pour le traitement organique a montré une orientation vers une stratégie d’entreposage, associée à la lente libération du fumier dans le sol et à sa persistance d’une saison à l’autre. Le modèle Av+ présentait le potentiel de colonisation le plus élevé, avec une présence intense de vésicules. Le rapport sur les zones mycorhizées/non mycorhizées présentait une colonisation homogène, avec de rares discontinuités entre les zones colonisées. Contrairement à cela, l’application d’engrais minéraux (V4) a induit la régression de la colonisation mycorhizienne. Les zones colonisées présentaient un schéma irrégulier, avec de grandes discontinuités non colonisées entre elles. La stratégie observée était généralement orientée vers une stratégie de résistance des plantes, avec de petites zones où une stratégie de stockage ou de transfert ponctuel était visible. L’analyse comparative entre les traitements organiques à faible teneur en minéraux (V3) et les traitements organiques riches en minéraux (V5) a montré une régression continue de la colonisation et des changements dans la stratégie de colonisation, ajustés entre les deux traitements opposés (V2 et V4). Toutes les zones colonisées se sont développées irrégulièrement autour d’un point central, avec une présence homogène de zones non colonisées. La stratégie de colonisation était orientée vers un transfert prolifératif, avec la présence de vésicules dans des zones limitées. Les plus grandes discontinuités non colonisées ont été identifiées dans la variante avec une plus grande quantité d’engrais minéral (V5).

Figure 1 : Procédures d’échantillonnage des racines. (A) Extraction d’échantillons avec de la terre pour protéger l’intégrité des racines. (B) Mesures du système racinaire après la première procédure de défrichage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Racines tachées maintenues dans un bocal avec de l’eau du robinet jusqu’au traitement. Les racines conservent leur couleur jusqu’à 1 semaine à température ambiante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Traitement des racines. (A) Conservez toutes les racines d’un échantillon dans de l’eau dans une boîte de Pétri. (B) Couper les racines en segments de 1 cm de longueur. (C-D) Appuyez doucement sur la poche de laminage pour écraser les racines et affichez-les lentement sur une lame. (E-F) Couvrez les segments racinaires avec une lamelle de couverture et ajoutez une goutte d’eau du robinet dans un coin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Traitement de l’image. (A) Ajoutez toutes les images capturées à partir d’un échantillon dans une présentation. Aligner toutes les images afin de reconstruire la vue microscopique de chaque racine. (B) Ajouter un tableau pour préparer la grille, d’une largeur de 10 cellules x 10 cellules pour chaque image. Définissez les frontières internes sur aucune. La frontière intérieure sera toujours visible, mais leur transparence n’interférera pas avec l’analyse mycorhizienne. (C-D) Utilisez la légende de MycoPatt pour noter chaque structure visible sur l’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Insertion des données dans MycoPatt. Copiez l’intégralité de la base de données avec les observations de la présentation dans MycoPatt. Collez-le sous forme de nombres. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Extraction des données brutes et analyse des données primaires. (A) Évaluation de la colonisation pour les 10 cellules horizontales d’une rangée. (B) Évaluation de la colonisation pour les 10 cellules d’une colonne (verticale) dans chacune des 10 cellules x 10 cellules carrées de MycoPatt. (C) Évaluation transversale de la colonisation et calcul des paramètres moyens de colonisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Extraction des cartes des motifs mycorhiziens. (A) Pour l’ensemble des données, une grande carte de 10 cellules x 150 cellules est disponible dans la feuille graphique de MycoPatt. (B) Extraire la carte de colonisation sous forme d’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Images microscopiques des structures AMF dans les racines traitées de Zea mays. (A) Développement intercellulaire et intracellulaire des arbuscules en réseau hyphe. (B) Réseau hyphe dense avec de nombreuses arbuscules se développant intracellulairement. (C) Série de vésicules de différentes dimensions. Abréviations : H = hyphes; A = arbuscules; V = vésicules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Images microscopiques des structures AMF dans les racines traitées de Festuca rubra. (A) Plusieurs réseaux hyphes avec des vésicules et des arbuscules se sont développés dans des zones séparées. (B) Détail d’un réseau hyphe enroulé. C) Détail d’un point d’entrée et de deux hyphes enroulés. (D) Détail d’une vésicule à l’extrémité d’un hyphe enroulé. (E) Détail d’une arbuscule intracellulaire, détail d’un hyphe enroulé et présence d’une vésicule à l’extrémité d’un hyphe. Abréviations : H = hyphes; A = arbuscules; V = vésicules; Ep = points d’entrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Images microscopiques peu claires des structures des CMA dans les racines de Festuca rubra (A-C) et de Zea mays (D-E) dans des racines dégagées et colorées incomplètes. (A) Racine tachée peu claire avec un faible nombre d’hyphes visibles et la couleur native des racines visible. (B) Hyphes de couleur bleue et bleu intense avec une distinction peu claire entre les cellules racinaires et les hyphes. (C) Réseau hyphe coloré clair dans la partie supérieure de l’image et hyphes colorés incomplets dans la partie inférieure de l’image. (D) Racines et hyphes colorés intenses, ce qui rend impossible l’identification des structures AM. (E) Détail d’une racine colorée intense avec des artefacts présents dans les cellules, ce qui rend impossible l’identification des structures AM. Abréviations : H = hyphes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11 : Profils de colonisation mycorhizienne (Av, Av− et Av+) dans les racines de Zea mays traitées. Abréviations : A0 = moment de l’application du traitement; A1 = variante témoin (sans traitement)/A2 = variante traitée; B1 = 2-4 feuilles (comme point de contrôle pour le début de la colonisation mycorhizienne); B2 = 6 feuilles; B3 = 8-10 feuilles; B4 = formation d’épis; B5 = maturité physiologique. Les combinaisons de variantes sont A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; et A1B5/A2-B5. La description complète des traitements peut être trouvée dans Pop-Moldovan et ^al.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 12 : Profils de colonisation mycorhizienne (Av, Av− et Av+) dans les racines de Festuca rubra traité à long terme. Abréviations : V1 = témoin, non fertilisé; V2 = 10 t·ha⁻¹ fumier; V3 = 10 t·ha−1 fumier + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha−1, K₂O 25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1,_P2O5 50 kg·ha−1, K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 fumier + N 100 kg·^ha-1,_P2O550 kg·ha−1, K ₂O 50 kg·ha⁻¹. La description complète des traitements peut être trouvée dans les travaux précédents^13,14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Valeurs des paramètres de colonisation mycorhizienne dans les racines de Zea mays selon le stade de développement. Légende: A0 = moment de l’application du traitement; A1 = variante témoin (sans traitement)/A2 = variante traitée; B1 = 2-4 feuilles (comme point de contrôle pour le début de la colonisation mycorhizienne); B2 = 6 feuilles; B3 = 8-10 feuilles; B4 = formation d’épis; B5 = maturité physiologique. Les combinaisons de variantes sont A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; et A1B5/A2-B5. La description complète des traitements peut être trouvée dans Pop-Moldovan et ^al.12. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Valeurs des paramètres de colonisation mycorhizienne dans les racines de Festuca rubra sur la base de la fécondation appliquée. Légende : V1 = témoin, non fertilisé; V2 = 10 t·ha⁻¹ fumier; V3 = 10 t·ha−1 fumier + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha−1, K₂O 25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1,_P2O5 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 fumier + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹. La description complète des traitements peut être trouvée dans les travaux précédents^13,14. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Étapes détaillées du protocole, de l’échantillonnage des racines sur le terrain à l’analyse des données brutes et à l’extraction de la carte mycorhizienne. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Les études sur la colonisation mycorhizienne sont vitales pour le développement de nouvelles stratégies dans le domaine agronomique. Le potentiel de multiples plantes cultivées à former une association symbiotique avec les mycorhizes arbusculaires en a fait une composante importante du développement durable de l’agroécosystème et du maintien de sa santé 16,17,18,19,20. Ainsi, il est nécessaire de mieux comprendre le mécanisme de colonisation et les stratégies fongiques, qui fournissent des données essentielles sur la façon dont une plante peut se connecter aux réseaux nutritionnels du sol, de son rendement et de son potentiel de survie. Par conséquent, dans le contexte de l’agriculture intelligente, il s’agit d’un incontournable de ce siècle, il est essentiel d’effectuer une évaluation approfondie de la colonisation et les études doivent fournir une image réaliste de la position fongique dans les racines.

La méthode des motifs mycorhiziens racinaires fournit une analyse aussi profonde des racines, mais elle présente à la fois des limites et des avantages¹¹. Les limites présentées sont le grand nombre d’échantillons qui doivent être notés lorsqu’une plante est analysée pour la première fois, la nécessité de manipuler l’image et l’allocation manuelle des structures mycorhiziennes dans les racines, mais tous ces éléments peuvent être surmontés par de multiples avantages à long terme. La grande base de données résultant de l’application de cette méthode et de l’intégration de la microscopie à l’outil MycoPatt offre stabilité, assurance statistique des résultats et pérennité en termes de comparaison des résultats. L’identification du motif mycorhizien pour les racines d’une plante spécifique facilitera les études ultérieures en termes de comparaison. En outre, il améliore l’identification de nouveaux modèles, ce qui peut fournir des informations sur l’évolution des mécanismes de colonisation et de la stratégie fongique. Le calcul des paramètres moyens de colonisation basé sur le développement horizontal et vertical permet l’acquisition de valeurs plus réalistes et complexes par rapport aux méthodes d’estimation visuelle, comme l’intersection en grille, l’estimation du segment racinaire et l’intersection agrandie ^9,11. Dans l’ensemble, la méthode du modèle mycorhizien permet d’évaluer l’avancée fongique et la ramification dans les racines et d’identifier de nouveaux points de colonisation externe et l’extension des hyphes le long des racines. Il permet le positionnement des arbuscules et des vésicules et leur attribue une position et une dimension réalistes dans le modèle global.

L’application correcte de la méthode MycoPatt repose sur la réussite de chaque étape du protocole (Tableau 3). Pour une plus grande efficacité, l’ensemble du flux de la méthode est conçu pour être mené par une ou plusieurs personnes avec différents niveaux d’entraînement. De cette façon, plusieurs résultats sont extraits de chaque étape et une analyse continue est possible. Pour la sélection du matériel biologique, l’échantillonnage des racines et l’étape de stockage, il est nécessaire qu’une personne hautement qualifiée identifie correctement l’espèce, quel que soit son stade de croissance. Une fois l’espèce identifiée, l’échantillonnage des racines peut être effectué par n’importe qui, avec une formation minimale pour l’élimination en douceur des particules du sol. La deuxième étape, le traitement des racines, le déminage et la coloration pour la microscopie, nécessite des personnes qualifiées; Le processus comporte plusieurs étapes de vérification, et chaque étape est nécessaire au succès de la procédure. Plusieurs échantillons peuvent être traités en même temps dans les deux premières étapes. Le traitement des racines pour la microscopie (étape 3) et l’analyse microscopique des échantillons de racines (étape 4) sont très importants en raison de la grande attention requise pour couper les segments en morceaux de 1 cm combinée à leur broyage doux pour la préparation des lames. La microscopie nécessite une attention particulière pour l’étalonnage de la lumière et le logiciel pour obtenir des images de haute qualité. Les deux étapes nécessitent des personnes hautement qualifiées ou moyennement formées sous la supervision d’un expert. L’assemblage d’images post-microscopique nécessite un personnel hautement qualifié pour le chevauchement et l’ordre corrects des images afin de reconstruire le segment. La notation de la colonisation mycorhizienne est une étape qui nécessite un spécialiste des champignons AM pour identifier leurs structures et leurs performances de colonisation, ainsi que pour attribuer des scores pour chaque structure sur des images quadrillées. La dernière étape, l’analyse des données brutes et l’extraction des résultats, nécessitent un analyste de données hautement qualifié qui compile les bases de données et gère les statistiques derrière le filtrage des données et l’extraction des cartes les plus pertinentes. Cette étape peut être combinée avec le travail du spécialiste mycorhizien pour une efficacité maximale du processus. Dans l’ensemble, l’ensemble du flux permet l’implication de plusieurs spécialistes dans une étude interdisciplinaire, ce qui conduit à des résultats de haute qualité.

Comme toute nouvelle méthode, la méthode du modèle mycorhizien doit évoluer et s’améliorer. Il y a quelques modifications qui, à l’avenir, rendront cette méthode plus facile à utiliser et fourniront des résultats multiples. Si elle est effectuée par la technique de nettoyage et de coloration lents, cette méthode permet la manipulation de plusieurs échantillons à la fois pour mettre en pause / redémarrer l’analyse après chaque étape de la procédure et obtenir plusieurs bases de données numériques. Une amélioration importante sera l’utilisation de scanners performants pour une acquisition d’image plus rapide et, après le développement d’outils appropriés et efficaces pour la reconnaissance de la structure mycorhizienne, l’automatisation de ce processus. Dans le contexte de l’évolution de la technique, l’acquisition rapide de modèles mycorhiziens soutiendra les études futures sur le terrain.

L’utilisation de logiciels automatiques pose plusieurs difficultés. 1) En raison des différentes positions des structures AM - hyphes et vésicules - à l’extérieur des cellules racinaires et des arbuscules à l’intérieur des cellules racinaires, il est difficile de calibrer et d’entraîner le logiciel à les reconnaître dans la même image. 2) Pour l’assemblage des images d’un segment, le logiciel n’alignera pas toujours les images pour recréer le segment, et il est possible qu’il les place au hasard, ce qui modifiera le processus. 3) Un autre problème est que le logiciel ne peut pas discriminer si certaines parties de deux images sont identiques ou si, dans les procédures de microscopie, certains champs se chevauchaient. Ainsi, le processus nécessite d’être effectué manuellement par des experts formés.

Dans l’ensemble, 60 cm de racine de chaque variante ont été analysés à partir de plusieurs plantes. Le manuscrit actuel est conçu pour présenter le concept d’utilisation du système et de l’outil MycoPatt, et les résultats présentent la fonctionnalité de cette méthode. Par rapport à cette méthode, la méthode d’intersection en grille a une subjectivité plus élevée en raison du placement aléatoire des racines tachées. Nous pensons qu’il sera nécessaire pour l’avenir d’établir pour chaque usine de FA le nombre de segments à utiliser. C’est une recherche qui doit être faite par tous les chercheurs dans le domaine des mycorhizes. L’un des articles qui comparait plusieurs méthodes⁹ présentait un taux de colonisation similaire de 50 à 200 segments racinaires/plante. Leurs conclusions indiquent qu’une méthode plus objective est nécessaire pour analyser chaque segment. Sur la base de nos recherches, MycoPatt réduit la subjectivité à 0. Chaque segment est scanné et analysé en profondeur. En outre, une base de données d’images pour tous les résultats de segments analysés peut être développée à l’aide de cette méthode. Cela peut également être utilisé pour réanalyser les données si nécessaire.

L’ensemble de la méthode fournit des résultats qui sont nécessaires pour de multiples domaines de recherche et commerciaux. Les sélectionneurs de plantes essaient constamment de créer des variétés et des hybrides plus résistants qui s’adaptent à des conditions de sol spécifiques. Dans ce contexte, les processus de sélection végétale bénéficieront en termes de connectivité des plantes aux réseaux mycorhiziens à partir du sol dès les étapes de sélection initiales. L’analyse du profil mycorhizien montrera les différences entre les hybrides en termes de récolte mycorhizienne du sol et d’acclimatation aux conditions du site. Les chercheurs dans le domaine de la sélection peuvent utiliser cette méthode pour détecter, même dès les premiers stades des processus de sélection, l’adéquation de nouvelles variétés / hybrides aux conditions mycorhiziennes du sol. De cette façon, il y aura des variétés/hybrides qui s’adaptent facilement à un grand nombre de conditions et de technologies, mais aussi des variétés/hybrides moins acceptés et une spécificité élevée pour des conditions étroites. Pour les écosystèmes de prairies, la méthode du modèle mycorhizien conviendra parfaitement à de multiples applications : une meilleure compréhension de la survie des plantes dans divers assemblages de végétation liés au support fongique ; l’analyse des schémas spécifiques de colonisation des espèces endémiques et menacées; le potentiel envahissant des espèces exogènes; et les fluctuations dominance-codominance dues à l’application de divers intrants²¹. Les modèles peuvent être utilisés par les producteurs d’inoculum qui doivent calculer les doses potentielles en fonction des propagules actives et des points d’entrée. En outre, des biofertilisants très spécifiques peuvent être développés qui contiendront un inoculum approprié pour les plantes qui partagent les mêmes géniteurs. Dans la recherche, les modèles mycorhiziens représentent une étude hautement comparative, à la fois d’un point de vue visuel et numérique. Il existe de multiples bases de données^22,23,24 qui présentent les espèces mycorhiziennes et les structures qu’elles peuvent développer dans les racines des plantes testeuses, mais aucune d’entre elles, à ce jour^, ne présente l’image complète de la colonisation. Toutes ces exigences et la nécessité d’études plus réalistes et applicatives appuient l’intégration de la méthode des modèles mycorhiziens dans les études d’interaction sol-microbe-plante.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb