Mappe micorriziche come strumento per esplorare i modelli di colonizzazione e le strategie fungine nelle radici di Festuca rubra e Zea mays

Summary

Il protocollo qui descrive i metodi per la valutazione dei modelli di colonizzazione micorrizica arbuscolare e la strategia nelle radici per due specie: Zea mays e Festuca rubra. L'uso del metodo MycoPatt consente il calcolo dei parametri, la conversione delle strutture micorriziche in dati digitali e la mappatura della loro posizione reale nelle radici.

Abstract

I funghi micorrizici arbuscolari sono simbionti nelle radici delle piante. Il loro ruolo è quello di sostenere lo sviluppo dell'ospite e mantenere l'equilibrio nutrizionale negli ecosistemi. Il processo di colonizzazione dipende da diversi fattori come l'ecologia del suolo, la diversità genetica dei funghi e dell'ospite e le pratiche agronomiche. La loro azione sincronizzata porta allo sviluppo di una complessa rete ifica e porta allo sviluppo secondario di vescicole e arbuscoli nelle cellule radicali. Lo scopo di questa ricerca è stato quello di analizzare l'efficienza del metodo MycoPatt (pattern micorrizici) per il posizionamento di strutture fungine nelle radici di Festuca rubra e Zea mays. Un altro obiettivo era quello di esplorare la strategia di colonizzazione fungina come rivelato dalle mappe micorriziche di ciascuna specie. L'acquisizione e l'assemblaggio di più immagini microscopiche consentono la valutazione della colonizzazione micorrizica sia nelle piante di mais che in quelle di festuca rossa per fornire informazioni sulla posizione realistica delle strutture sviluppate. I pattern micorrizici osservati evidenziano l'efficienza variabile di ogni pianta in termini di sviluppo di connessioni con funghi simbiotici del suolo, causati da trattamenti applicati e fase di crescita. Le mappe dettagliate micorriziche ottenute attraverso il metodo MycoPatt sono utili per la diagnosi precoce dell'efficienza delle piante nell'acquisizione simbiotica dal suolo.

Introduction

I funghi micorrize arbuscolari (AM) sono una categoria di endofiti del suolo che sono costantemente un'area di interesse per i ricercatori. La loro presenza nelle radici della maggior parte delle piante e il loro coinvolgimento nei cicli dei nutrienti le rende componenti vitali per la stabilità di ogni ecosistema in cui sono presenti piante erbacee ^1,2. Attraverso il loro micelio extra-radicolare, AM agisce come un'estensione fungina per le radici delle piante, specialmente nelle aree difficili da raggiungere³. L'attività principale è nelle radici delle piante ospiti, dove AM sviluppa grandi reti ife e specifiche strutture intracellulari chiamate arbuscoli. La mancanza di specificità dell'ospite consente al simbionte di colonizzare più specie contemporaneamente. Questa capacità fornisce all'AM il ruolo dell'allocazione delle risorse e della regolazione dei nutrienti nell'ecosistema; Il fungo fornisce anche supporto nella sopravvivenza delle piante e aiuta nelle prestazioni della pianta 4,5,6,7. La reazione delle specie AM alle radici ospiti è visibile nell'estensione e nella posizione del micelio intra-radicolare e nella presenza e nella forma degli arbuscoli sviluppati intracellulari. Gli arbuscoli intracellulari fungono da punto di interscambio tra i due simbionti e rappresentano aree caratterizzate da processi di trasferimento rapidi. Le strutture che l'AM produce sono specie-dipendenti e, oltre agli arbuscoli, nelle radici, sviluppano anche vescicole, spore e cellule ausiliarie.

Ci sono molte sfide nella valutazione dei simbionti AM nelle radici delle piante ^8,9. Il primo è il loro costante sviluppo durante l'intero periodo vegetativo degli ospiti, che porta a molteplici cambiamenti nella struttura arbuscolare ifale. I diversi stadi di crescita arbuscolare, fino al loro collasso, sono chiaramente presenti nelle radici, ma le strutture senescenti AM sono talvolta digerite, il che le rende solo parzialmente visibili¹⁰. La seconda sfida è rappresentata dal metodo e dal protocollo di colorazione, dalla grande diversità dei sistemi radicali, dalla dimensione delle loro cellule e dalle differenze di spessore, che rendono difficile proporre un metodo unificato. L'ultima sfida è rappresentata dalla valutazione e dal punteggio della colonizzazione AM. Esistono numerosi metodi che valutano AM con diversi gradi di obiettività e la maggior parte di essi sono ancora limitati alle tecniche di microscopia. Quelli semplici si basano sulla presenza/assenza di strutture nella corteccia radicolare, mentre quelli più complessi si basano sul visual scoring e sull'uso di classi di colonizzazione, con l'integrazione della frequenza e dell'intensità del fenomeno di colonizzazione. Negli ultimi decenni sono stati prodotti molti dati sullo stato micorrizico di più specie, ma la maggior parte dei metodi sono limitati al valore osservato della colonizzazione senza indicare la posizione reale di ciascuna struttura nella corteccia radicale. Come risposta alla necessità di risultati più accurati sulla colonizzazione AM, è stato sviluppato un metodo basato sull'analisi microscopica dei pattern micorrizici (MycoPatt) nelle radici per assemblare, in forma digitale, le mappe micorriziche dettagliate¹¹. Inoltre, il metodo consente il calcolo oggettivo dei parametri di colonizzazione e la determinazione della posizione effettiva di ciascuna struttura nella radice.

La posizione delle strutture fungine AM può essere importante per rispondere alle seguenti due domande. Il primo è legato all'analisi della colonizzazione in un momento specifico dal ciclo vegetativo di una pianta. In questo contesto, è molto utile osservare l'abbondanza arbuscolare / vescicolare, segnalare come si trovano nella radice e fornire un'immagine e parametri di colonizzazione molto chiari. Il secondo è legato al rilevamento della strategia fungina e al suo orientamento e persino alla previsione del suo sviluppo futuro. Un'applicazione del MycoPatt può essere per le piante analizzate quotidianamente, ogni 2-3 giorni, settimanalmente o durante varie fasi di crescita. In questo contesto, la posizione delle vescicole/arbuscole è importante per comprendere meglio il meccanismo biologico della colonizzazione AM. Questi parametri e osservazioni sono molto utili per integrare i parametri matematici.

Lo scopo di questo articolo è dimostrare la capacità del sistema MycoPatt di esplorare il potenziale e la strategia di colonizzazione dei funghi AM nativi nelle radici di Zea mays (mais) durante le diverse fasi di sviluppo e nelle radici di Festuca rubra (festuca rossa) in diverse condizioni di fecondazione a lungo termine. Per raggiungere l'obiettivo, sono stati analizzati due grandi database di due esperimenti. L'esperimento del mais fu stabilito a Cojocna (46°44′56" lat. N e 23°50′0" di lunghezza. E), nella Fattoria Didattica Sperimentale dell'Università di Scienze Agrarie e Medicina Veterinaria Cluj su un feoziom con un terreno a tessitura argillosa¹². L'esperimento della festuca rossa fa parte di un più ampio sito sperimentale istituito nel 2001 a Ghețari, sui Monti Apuseni (46°49'064" lat. N e 22°81'418'' di lunghezza. E), su terreno preluvosol (terra rossa) tipo^13,14. Il mais è stato raccolto in cinque diverse fenofasi di crescita¹²: B1 = 2-4 foglie (come punto di controllo per l'inizio della colonizzazione micorrizica); B2 = 6 foglie; B3 = 8-10 foglie; B4 = formazione di pannocchie; B5 = maturità fisiologica. A partire dalla fase di 2-4 foglie (A0), è stato applicato un trattamento organico, che ha portato a un fattore di due graduazioni (A1 = controllo e A2 = trattato). Le radici della festuca rossa sono state raccolte alla fioritura da un esperimento con cinque concimazioni a lungo termine^13,14: V1 = controllo^, non fecondato; V2 = 10 t·^ha-1 letame; V3 = 10 t·ha-1 letame + N 50 kg·ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha-1, K₂O 25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 letame + N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1. Cinque piante sono state raccolte in ogni fase di sviluppo da ogni variante di fertilizzazione. Sono stati analizzati i protocolli di colorazione e le loro prestazioni in termini di tempo di elaborazione del campione e qualità della colorazione. La relazione tra lo sviluppo delle ife AM e la presenza delle sue strutture nelle radici è stata analizzata separatamente per ciascuna specie ed è proseguita con l'identificazione delle radici più permissive per la colonizzazione. I modelli di colonizzazione specifici di ciascun sistema di root sono stati analizzati in base alle mappe di colonizzazione e al valore dei parametri AM.

Il mais è una pianta annuale, che implica una crescita continua delle radici, e questa è stata la ragione principale per applicare il MycoPatt nelle fasi di crescita. La festuca rossa è una pianta perenne proveniente da una prateria trattata a lungo con diversi fertilizzanti. Le sue radici hanno uno sviluppo più breve di 1 anno e l'antesi è considerata come il punto di vegetazione quando la pianta cambia il suo metabolismo da vegetativo a generativo. Per catturare queste piante durante questi intensi periodi di attività, sono stati scelti i punti temporali sopra menzionati. Il campionamento durante il periodo vegetativo è difficile per questa specie se coltivata in praterie naturali.

Protocol

1. Selezione del materiale biologico, campionamento delle radici e conservazione

1. Raccogliere l'intera radice delle piante con una pala (Figura 1A) separatamente per ciascuna variante e replicare. Rimuovere delicatamente, a mano, i grandi aggregati di terreno dalle radici. Lavare l'intero apparato radicale e misurarlo su una bilancia con celle di 1 cm x 1 cm (Figura 1B). Tagliare le radici separatamente per ogni pianta e metterle in un sacchetto di plastica.
2. Raccogli tutte le radici pulite da ogni pianta in un sacchetto di plastica e raccogli tutti i campioni da una variante in un sacchetto più grande. Scrivi su ogni borsa il nome dello stage/variante e la data di campionamento. Conservare le radici in frigorifero o congelatore ad una temperatura compresa tra -4 °C e -20 °C fino alla lavorazione.

2. Elaborazione delle radici, pulizia e colorazione per microscopia

NOTA: Utilizzare guanti, una maschera e un cappuccio microbiologico / chimico per questa fase del protocollo.

1. Assicurarsi che il processo di scongelamento delle radici avvenga lentamente a temperatura ambiente. Per tutte le fasi della lavorazione, utilizzare piccoli barattoli (30-50 ml) per ridurre la quantità di agenti necessari.
2. Eseguire i seguenti quattro passaggi della procedura di pulizia lenta e colorazione¹⁵. Fai tutti i passaggi a temperatura ambiente. Questo metodo consente l'elaborazione di un gran numero di campioni contemporaneamente senza l'uso di un bagno d'acqua per l'ebollizione.
   1. Pulizia delle radici: metti tutte le radici di una pianta in un barattolo. Preparare una soluzione di NaOH al 10% con acqua di rubinetto e versarla in ogni barattolo fino a coprire completamente le radici. Agitare vigorosamente i barattoli per 1 minuto o 2 minuti per produrre una dispersione omogenea della soluzione di pulizia nelle radici. Ripetere questa procedura dopo 24 ore e lasciare le radici nella soluzione di compensazione per almeno 48 ore.
      NOTA: Le radici pulite hanno un aspetto giallo pallido (fino al bianco) e la consistenza è morbida (possono essere facilmente schiacciate premendo con una pinzetta).
   2. Risciacquo delle radici: passare il contenuto di un barattolo alla volta attraverso un setaccio. Riciclare la soluzione di compensazione. Risciacquare le radici più volte in acqua di rubinetto fino a completa rimozione della soluzione di pulizia.
      NOTA: se la soluzione di compensazione non viene completamente rimossa, influirà sulla qualità della procedura di colorazione.
   3. Colorazione delle radici: posizionare le radici sciacquate in un barattolo pulito. Preparare una soluzione di inchiostro-aceto al 5%:5% con acqua di rubinetto (5 ml di inchiostro blu + 5 ml di acido acetico al 9% + 90 ml di acqua di rubinetto). Versare la soluzione in ogni barattolo fino a coprire completamente le radici. Agitare vigorosamente i barattoli per 1 minuto o 2 minuti per produrre una dispersione omogenea della soluzione colorante nelle radici. Ripetere questa procedura dopo 24 ore e lasciare le radici in questa soluzione per 48 ore.
      NOTA: Le radici macchiate hanno un colore blu intenso.
   4. Decolorazione parziale della radice: sciacquare le radici macchiate in acqua di rubinetto per 1-2 minuti. Agitare vigorosamente i barattoli per rimuovere la soluzione macchiante in eccesso. Ripetere la procedura se la colorazione è troppo intensa e non consente una chiara valutazione microscopica.
      NOTA: Le radici colorate possono essere conservate in acqua di rubinetto fino a 1 settimana a temperatura ambiente senza alterare la qualità della colorazione (Figura 2). Per periodi più lunghi, le radici possono essere mantenute fino a 2-3 mesi in una soluzione commerciale di aceto di mele al 5% (acido acetico al 5%).

3. Elaborazione delle radici per microscopia

1. Segmentazione delle radici: posizionare le radici colorate di ciascun campione su un tagliere in scala (Figura 3A). Tagliare le radici in segmenti di 1 cm (Figura 3B). Scegli 15 segmenti per ogni variante.
2. Metodo di frantumazione delicato per la preparazione del segmento: stendere le radici su un vetrino. Utilizzare una busta di laminazione per coprire le radici e schiacciarle delicatamente partendo da un bordo (Figura 3C,D). Utilizzare uno strumento di plastica morbida, ad esempio una pinzetta, un manico di bisturi, una penna o una matita con una gomma, per visualizzare lentamente le radici sulla diapositiva. Rimuovere con cautela la busta di laminazione e coprire il campione con un vetrino di copertura (Figura 3E).
   NOTA: Le radici hanno una forma tubolare, quindi è necessario separarle in un piano bidimensionale. Questa azione presuppone la separazione delle radici sul punto centrale, portando alla visualizzazione delle due parti del diametro interno. L'uso di sacchetti di laminazione nella delicata procedura di frantumazione consente di visualizzare le radici, che hanno una forma cilindrica, in due pezzi - uno a sinistra e uno a destra - verso il loro punto centrale. In questo modo, l'intera radice viene analizzata in profondità e il grado di colonizzazione è il parametro che mostra la colonizzazione volumetrica (descritta nel lavoro originale su MycoPatt¹¹). Fondamentalmente, tagliamo un cilindro a metà e, successivamente, lo ricostruiamo matematicamente.
3. Aggiungere acqua a un angolo del vetrino con una pipetta e lasciare che l'acqua si diffonda lentamente sul vetrino (Figura 3F). Rimuovere l'acqua in eccesso con un tovagliolo di carta.

4. Analisi microscopica dei campioni di radice

1. Utilizzare un microscopio dotato di una fotocamera a buona risoluzione.
2. Analizza le diapositive partendo da un'estremità. Cattura ogni campo microscopico. Rinomina ogni immagine catturata con un codice che permetterà il vero post-assemblaggio delle parti radice. Per le radici spesse, utilizzare l'ingrandimento 10x o 40x e per le radici sottili, utilizzare l'ingrandimento 40x. Usa lo stesso obiettivo e lo stesso ingrandimento per l'intero set di radici di una specie.

5. Assemblaggio di immagini post-microscopia

1. Utilizzare il software di presentazione per progettare un tavolo da disegno per l'assemblaggio di immagini. Imposta la larghezza 2-3 cm più larga della larghezza dell'immagine. Aggiungere tutte le immagini acquisite da un segmento nell'ordine di acquisizione e ricostruire l'intera lunghezza del segmento radice (Figura 4A).
   1. In breve, raccogli un totale di 15 immagini per ogni segmento di 1 cm e organizzale verticalmente, a partire da 1 a 15, nel software di presentazione per ricostruire il segmento.
2. Allineare le immagini al centro. Usa l'allineamento verticale per assicurarti che ogni immagine segua quella precedente. Su tutte le immagini, posizionare una griglia di 10 celle x 150 celle per coprire l'intero segmento radice.
   1. Inoltre, su ogni singola immagine, posizionare una griglia 10 x 10 e, in ogni cella di questa griglia, inserire un numero da uno a sei se è visibile una struttura AM o lasciare vuota se non è presente alcuna struttura AM. In questo modo, l'accuratezza del processo è massima senza errori nella posizione delle strutture AM osservate.
3. Aggiungere una tabella per una griglia di 10 celle di larghezza e 150 celle di lunghezza (15 quadrati di 10 celle x 10 celle). Modificare le dimensioni della larghezza della tabella in larghezza delle immagini. Modificare la lunghezza della tabella in modo che comprenda tutte le immagini (Figura 4B).

6. Punteggio della colonizzazione micorrizica

1. Utilizzare il numero univoco per valutare ogni tipo di struttura come descritto nel metodo dei pattern micorrizici¹¹: 1 per le ife; 2 per gli arbuscoli; 3 per vescicole; 4 per le spore; 5 per le celle ausiliarie; e 6 per i punti di ingresso (Figura 4C). Assegna un punteggio a ciascuna struttura micorrizica osservata da ciascuna cellula delle griglie applicate in precedenza (Figura 4D).

7. Analisi dei dati grezzi ed estrazione dei risultati

1. Inserisci tutti i punteggi ottenuti nel foglio di calcolo MycoPatt¹¹. Utilizzare la funzione copia/incolla per trasferire tutti i punteggi dalla presentazione nel primo foglio denominato rawdata (Figura 5).
2. Analisi primaria dei risultati: utilizzare il terzo foglio denominato parametri nello strumento foglio di calcolo MycoPatt per visualizzare i risultati come percentuali (%) separatamente in tre forme (Figura 6A-C). Utilizzare le colonne da A a K per analizzare l'immagine orizzontale della colonizzazione; colonne da M a W per analizzare l'immagine verticale della colonizzazione; e le colonne da Y a AI per analizzare la colonizzazione trasversale (media) per ciascuno dei 15 quadrati 10 x 10 (linee 2-17) e la colonizzazione media finale (linee 19-20).
   NOTA: La colonizzazione media trasversale viene utilizzata per il calcolo dei parametri di colonizzazione reale, relativi all'analisi sia orizzontale che verticale. In questo modo, non è possibile commettere errori rispetto a se si utilizza solo l'analisi orizzontale o verticale (descritta in dettaglio nell'opera originale¹¹). Inoltre, questo insieme di parametri viene calcolato per l'intera superficie del campo microscopico.
   1. Utilizzare le definizioni e le formule, specifiche per ogni parametro, per analizzare i risultati¹¹. Utilizzare i seguenti parametri di colonizzazione: frequenza di colonizzazione (%), intensità di colonizzazione (%), arbuscoli (%) e vescicole (%), spore (%) e cellule ausiliarie (%), punti di ingresso (%), percentuale di aree non micorriziche (%), grado di colonizzazione globale (%) e il rapporto delle aree micorriziche/non micorriziche.
      NOTA: se arbuscoli, vescicole, spore, cellule ausiliarie e punti di ingresso mancano dai campioni analizzati, il foglio di calcolo MycoPatt li assegnerà come zero (0).
3. Produzione ed estrazione di mappe micorriziche: Visualizza l'immagine ottenuta dalla conversione del codice delle strutture micorriziche in colori nel secondo foglio dei grafici denominati MycoPatt (Figura 7A). Esportare l'immagine risultante nel foglio grafico come immagine (Figura 7B). Utilizzare il codice colore nella legenda per l'analisi dei modelli micorrizici.
4. Analisi della mappa micorrizica: identificare le strutture più importanti e il loro assemblaggio su mappe micorriziche. Descrivere il modello di colonizzazione micorrizica osservato nelle radici analizzate. Descrivere la strategia di colonizzazione micorrizica basata sullo sviluppo strutturale osservato nella radice, il modello di ramificazione e lo sviluppo di arbuscolo / vescicola.

Representative Results

L'uso corretto del metodo di schiacciamento delicato delle radici dopo le procedure di colorazione fornisce buoni dettagli delle strutture micorriziche, sia per Zea mays (Figura 8A-C) che per Festuca rubra (Figura 9A-E), un buon contrasto tra strutture micorriziche e cellule radicali e una conferma della stele dovuta al colore blu. Se le procedure di pulizia e colorazione non hanno successo, i campioni di radice sono difficili da schiacciare e non mostrano chiaramente le strutture micorriziche (Figura 10A-E). In questo caso, ripetere l'intera procedura di pulizia-colorazione.

L'uso del metodo del pattern micorrizico e dello strumento MycoPatt ha permesso un'esplorazione completa del meccanismo di colonizzazione. Il metodo fornisce un'esplorazione approfondita e su piccola scala dei modelli e delle strategie di colonizzazione per ciascuna specie (Figura 11 e Figura 12) con un'ulteriore espressione visiva dei parametri di colonizzazione (Tabella 1 e Tabella 2). I due studi condotti su Zea mays, ampiamente descritti da Pop-Moldovan et ^al.12, e Festuca rubra, dettagliati da Corcoz et al. ^13,14, ha fornito un ampio database di osservazioni, mappe micorriziche e parametri di colonizzazione. Entrambi i database hanno valutato la frequenza di colonizzazione (%), l'intensità della colonizzazione (%), gli arbuscoli (%) e le vescicole (%), la percentuale di aree non micorriziche (%), il grado di colonizzazione complessiva (%) e il rapporto delle aree micorriziche / non micorriziche come parametri di colonizzazione. Per Zea mays, il database consisteva di 5.850 voci di riga nel database di fogli di calcolo, compilato in 390 mappe di colonizzazione. L'esperimento di Zea mays ha proposto il rapporto delle aree micorriziche/non micorriziche come parametro per la descrizione dell'alternanza e della rottura tra aree colonizzate nelle radici. L'approccio permette l'analisi approfondita del meccanismo di colonizzazione e del suo sviluppo lungo le radici. Festuca rubra ha fornito un database di 4.500 voci di linea nel foglio di calcolo, compilato in 300 mappe. È stato proposto un nuovo indice, il rapporto arbuscules/vescicole, che è stato ulteriormente utilizzato come indicatore della strategia di colonizzazione. La valutazione complessiva della strategia di colonizzazione ha proposto quattro diversi scenari di sviluppo micorrizico: 1) strategia di propagazione, 2) strategia di trasferimento, 3) strategia di stoccaggio e 4) strategia di resistenza delle piante. Per l'estrazione delle mappe micorriziche più rappresentative, sono stati esplorati entrambi i database basati su valori medi trasformati di frequenza e intensità di colonizzazione, risultando nell'estrazione di tre diverse mappe per ogni variante analizzata (Tabella 1 e Tabella 2). Le tre mappe rappresentano la colonizzazione AM dai segmenti radice che hanno i valori più vicini ai seguenti: la media (Av) di ciascuna variante, che viene calcolata in base a tutti i dati disponibili per una variante; l'Av−, che rappresenta un valore calcolato dalla differenza tra media e media/2 (Av−Av/2) e mostra un potenziale di colonizzazione normale inferiore; e l'Av+, che rappresenta un valore calcolato dalla somma tra media e media/2 (Av+Av/2) e mostra un potenziale di colonizzazione normale più elevato. L'uso di questa formula di estrazione consente all'utente di evitare gli estremi (più alti o più bassi) della colonizzazione. Il metodo consente l'estrazione del maggior numero possibile di casi di colonizzazione micorrizica.

Zea mays presentava un potenziale di colonizzazione altamente fluttuante, che dipendeva dalla fase di sviluppo della pianta (Tabella 1, Figura 11). I valori di frequenza della colonizzazione variavano notevolmente tra il 3,67% e il 69,60%, supportati da valori al 50% per l'intensità della colonizzazione. La ragione principale di questo fenomeno è che il sistema radicale si sviluppa continuamente durante l'intero periodo di vegetazione. Gli arbuscoli hanno presentato valori massimi nella fase di sviluppo delle 6 foglie (B2), con una diminuzione nelle fasi di crescita successive. Le vescicole sono apparse sporadicamente, con valori inferiori all'1%. L'esplorazione dei pattern micorrizici ha rivelato che le ife si sviluppavano in diverse aree delle radici, con estensione limitata. Sono state osservate grandi discontinuità tra le aree colonizzate, con uno sviluppo irregolare di ife attorno al punto centrale della colonizzazione. La strategia di colonizzazione ha mostrato grandi variazioni nell'intervallo della resistenza delle piante alle strategie proliferative e di trasferimento. Lo stadio di 6 foglie (B2), seguito dallo stadio di formazione della pannocchia (B4), ha mostrato una strategia di trasferimento di colonizzazione, sostenuta dai rapporti di area micorritizzati / non micorrizzati inferiori a 0,14. L'unico caso con una strategia di trasferimento elevata visibile è stato registrato nella fase B2 quando ampie aree di radici presentavano arbuscoli. La loro posizione generale mostrava una netta separazione tra l'area in cui gli arbuscoli erano sviluppati e l'area in cui gli arbuscoli erano in una fase emergente. Il modello di colonizzazione media più omogeneo è stato osservato nella fase di sviluppo B5, con aree non colonizzate costanti tra quelle colonizzate. La valutazione complessiva di questo fenomeno visivo corrispondeva al periodo vegetativo finale, con piccoli valori di arbuscoli, che indicavano la regressione di queste strutture.

Festuca rubra è una specie dominante nelle praterie montane con un apparato radicale perenne. A causa di questo adattamento, la maggior parte dei processi di colonizzazione avvengono all'interno delle radici e lo sviluppo delle reti ifali è correlato con una bassa velocità di sviluppo delle radici (Tabella 2, Figura 12). A causa dell'applicazione di fertilizzanti, i parametri di colonizzazione presentavano elevate differenze tra le varianti. Le differenze nella frequenza di colonizzazione erano del 65%, sostenute da una differenza del 36% nelle intensità registrate. Ogni variante ha mostrato un diverso modello di colonizzazione, correlato con l'applicazione a lungo termine dei trattamenti e accompagnato da una variazione tra 0,09-0,96 nel rapporto sulle aree micorrizizzate / non micorrizate e 0-9,43 nel rapporto arbuscoli / vescicole. La variante di controllo (V1) ha mostrato una strategia media orientata allo storage, con un'area limitata che limita lo sviluppo di arbuscoli per la mappa di colonizzazione Av+. L'immagine semplificata della colonizzazione (Av−) mostrava uno sviluppo lineare e laterale delle ife, che era completamente orientato alla colonizzazione irregolare per i due modelli superiori (Av− e Av+). L'applicazione di trattamenti organici (V2) ha indotto uno sviluppo ifico duale, lineare e irregolare nelle radici. La strategia di colonizzazione identificata per il trattamento organico ha mostrato un orientamento verso una strategia di stoccaggio, associata al lento rilascio di letame nel suolo e alla sua persistenza da una stagione all'altra. Il modello Av+ presentava il più alto potenziale di colonizzazione, con un'intensa presenza di vescicole. Il rapporto sulle aree micorrizzate/non micorrizizzate presentava colonizzazioni omogenee, con rare discontinuità tra le aree colonizzate. Al contrario, l'applicazione di fertilizzanti minerali (V4) ha indotto la regressione della colonizzazione micorrizica. Le aree colonizzate presentavano un modello irregolare, con grandi discontinuità non colonizzate tra di loro. La strategia osservata era generalmente orientata verso una strategia di resistenza delle piante, con piccole aree in cui era visibile una strategia di stoccaggio o trasferimento puntuale. L'analisi comparativa tra trattamenti organici a basso contenuto di minerali (V3) e ad alto contenuto di minerali (V5) ha mostrato una continua regressione della colonizzazione e cambiamenti nella strategia di colonizzazione, inseriti tra i due trattamenti opposti (V2 e V4). Tutte le aree colonizzate si svilupparono irregolarmente attorno ad un punto centrale, con una presenza omogenea di aree non colonizzate. La strategia di colonizzazione era orientata verso una strategia proliferativo-transfer, con la presenza di vescicole in aree limitate. Le maggiori discontinuità non colonizzate sono state identificate nella variante con una maggiore quantità di fertilizzante minerale (V5).

Figura 1: Procedure di campionamento delle radici. (A) Estrazione di campioni con terreno per proteggere l'integrità delle radici. (B) Misurazioni del sistema radicale dopo la prima procedura di pulizia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Radici macchiate mantenute in un barattolo con acqua di rubinetto fino alla lavorazione. Le radici mantengono il loro colore fino a 1 settimana a temperatura ambiente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Elaborazione delle radici. (A) Conservare tutte le radici di un campione in acqua in una capsula di Petri. (B) Tagliare le radici in segmenti di 1 cm di lunghezza. (C-D) Premere delicatamente sulla busta di laminazione per schiacciare le radici e visualizzarle lentamente su una diapositiva. (E-F) Coprire i segmenti della radice con un coprislip e aggiungere una goccia di acqua di rubinetto in un angolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Elaborazione delle immagini. (A) Aggiungere tutte le immagini acquisite da un campione in una presentazione. Allineare tutte le immagini in modo da ricostruire la vista microscopica di ogni radice. (B) Aggiungi una tabella per preparare la griglia, con una larghezza di 10 celle x 10 celle di lunghezza per ogni immagine. Impostare i confini interni su nessuno. Il confine interno sarà ancora visibile, ma la loro trasparenza non interferirà con l'analisi micorrizica. (C-D) Usa la legenda di MycoPatt per assegnare un punteggio a ogni struttura visibile sull'immagine. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Inserimento dei dati in MycoPatt. Copiare l'intero database con le osservazioni dalla presentazione in MycoPatt. Incollalo come numeri. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Estrazione dei dati grezzi e analisi dei dati primari. (A) Valutazione della colonizzazione per tutte le 10 celle orizzontali di una riga. (B) Valutazione della colonizzazione per tutte le 10 cellule di una colonna (verticale) in ciascuna delle 10 celle x 10 quadrati di celle di MycoPatt. (C) Valutazione della colonizzazione trasversale e calcolo dei parametri medi di colonizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Estrazione delle mappe dei pattern micorrizici . (A) Per l'intero set di dati, una grande mappa di 10 celle x 150 celle è disponibile nel foglio grafico di MycoPatt. (B) Estrarre la mappa di colonizzazione come immagine. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 8: Immagini microscopiche delle strutture AMF nelle radici processate di Zea mays. (A) Sviluppo intercellulare e intracellulare della rete hyphal degli arbuscoli. (B) Densa rete ifale, con numerosi arbuscoli che si sviluppano intracellulari. (C) Serie di vescicole di diverse dimensioni. Abbreviazioni: H = ife; A = arbuscoli; V = vescicole. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 9: Immagini microscopiche di strutture AMF in radici lavorate di Festuca rubra. (A) Reti ifali multiple con vescicole e arbuscoli sviluppati in aree separate. (B) Dettaglio di una rete ifica a spirale. (C) Dettaglio di un punto di ingresso e di due ife arrotolate. (D) Particolare di una vescicola all'estremità di un'ifa arrotolata. (E) Dettaglio di un arbuscolo intracellulare, dettaglio di un'ifa arrotolata e presenza di una vescicola alla fine di un'ifa. Abbreviazioni: H = ife; A = arbuscoli; V = vescicole; Ep = punti di ingresso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 10: Immagini microscopiche poco chiare delle strutture AMF nelle radici di Festuca rubra (A-C) e Zea mays (D-E) in radici incomplete cancellate e colorate. (A) Radice macchiata poco chiara con un basso numero di ife visibili e il colore nativo delle radici visibile. (B) Ife di colore blu intenso e blu intenso con distinzione poco chiara tra le cellule della radice e le ife. (C) Rete di ife colorate chiare nella parte superiore dell'immagine e ife colorate incomplete nella parte inferiore dell'immagine. (D) Radice e ife colorate intense, che rendono impossibile l'identificazione delle strutture AM. (E) Dettaglio di una radice colorata intensamente con artefatti presenti nelle cellule, che rende impossibile l'identificazione delle strutture AM. Abbreviazioni: H = ife. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 11: Modelli di colonizzazione micorrizica (Av, Av− e Av+) nelle radici di Zea mays trattata. Abbreviazioni: A0 = momento dell'applicazione del trattamento; A1 = variante di controllo (nessun trattamento)/A2 = variante trattata; B1 = 2-4 foglie (come punto di controllo per l'inizio della colonizzazione micorrizica); B2 = 6 foglie; B3 = 8-10 foglie; B4 = formazione di pannocchie; B5 = maturità fisiologica. Le combinazioni di varianti sono A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; e A1B5/A2-B5. La descrizione completa dei trattamenti può essere trovata in Pop-Moldovan et ^al.12. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 12: Modelli di colonizzazione micorrizica (Av, Av− e Av+) nelle radici di Festuca rubra trattata a lungo termine. Abbreviazioni: V1 = controllo, non fecondato; V2 = 10 t·ha⁻¹ letame; V3 = 10 t·ha−1 letame + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha−1, K₂O25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O₅ 50 kg·ha⁻1, K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 letame + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1, K₂O50 kg·ha⁻¹. La descrizione completa dei trattamenti può essere trovata nel lavoro precedente^13,14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Valori dei parametri di colonizzazione micorrizica nelle radici di Zea mays in base allo stadio di sviluppo. Legenda: A0 = momento dell'applicazione del trattamento; A1 = variante di controllo (nessun trattamento)/A2 = variante trattata; B1 = 2-4 foglie (come punto di controllo per l'inizio della colonizzazione micorrizica); B2 = 6 foglie; B3 = 8-10 foglie; B4 = formazione di pannocchie; B5 = maturità fisiologica. Le combinazioni di varianti sono A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; e A1B5/A2-B5. La descrizione completa dei trattamenti può essere trovata in Pop-Moldovan et ^al.12. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Valori dei parametri di colonizzazione micorrizica nelle radici di Festuca rubra basati sulla fecondazione applicata. Legenda: V1 = controllo, non fecondato; V2 = 10 t·ha⁻¹ letame; V3 = 10 t·ha−1 letame + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha−1, K₂O25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 letame + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹. La descrizione completa dei trattamenti può essere trovata nel lavoro precedente^13,14. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Fasi dettagliate del protocollo dal campionamento sul campo delle radici all'analisi dei dati grezzi e all'estrazione della mappa micorrizica. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Gli studi sulla colonizzazione micorrizica sono vitali per lo sviluppo di nuove strategie in campo agronomico. Il potenziale di più piante coltivate di formare un'associazione simbiotica con le micorrize arbuscolari le ha rese una componente importante dello sviluppo sostenibile dell'agroecosistema e del mantenimento della sua salute 16,17,18,19,20. Pertanto, è necessaria una migliore comprensione del meccanismo di colonizzazione e delle strategie fungine, che forniscono dati essenziali su come una pianta può connettersi con le reti nutrizionali dal suolo, la sua resa e il suo potenziale di sopravvivenza. Pertanto, nel contesto dell'agricoltura intelligente, questo è un must di questo secolo, è fondamentale eseguire una valutazione approfondita della colonizzazione e gli studi devono fornire un'immagine realistica della posizione fungina nelle radici.

Il metodo dei pattern micorrizici delle radici fornisce una scansione così profonda delle radici, ma presenta sia limitazioni che vantaggi¹¹. I limiti presentati sono il gran numero di campioni che devono essere valutati quando una pianta viene analizzata per la prima volta, la necessità di manipolazione delle immagini e l'assegnazione manuale delle strutture micorriziche nelle radici, ma tutti questi possono essere superati da molteplici benefici a lungo termine. L'ampio database risultante dall'applicazione di questo metodo e dall'integrazione della microscopia con lo strumento MycoPatt fornisce stabilità, garanzia statistica dei risultati e perennità in termini di confronto dei risultati. L'identificazione del pattern micorrizico per le radici di una pianta specifica faciliterà studi successivi in termini di confronto. Inoltre, migliora l'identificazione di nuovi modelli, che possono fornire informazioni sull'evoluzione dei meccanismi di colonizzazione e sulla strategia fungina. Il calcolo dei parametri medi di colonizzazione basato sullo sviluppo orizzontale e verticale consente l'acquisizione di valori più realistici e complessi rispetto ai metodi di stima visiva, come l'intersezione della griglia, la stima del segmento radice e l'intersezione ingrandita ^9,11. Nel complesso, il metodo del pattern micorrizico consente la valutazione dell'avanzamento e della ramificazione fungina nelle radici e l'identificazione di nuovi punti di colonizzazione esterna e l'estensione delle ife lungo le radici. Permette il posizionamento di arbuscoli e vescicole e assegna loro una posizione e una dimensione realistiche nel modello globale.

La corretta applicazione del metodo MycoPatt si basa sul completamento con successo di ogni fase del protocollo (Tabella 3). Per una maggiore efficienza, l'intero flusso del metodo è progettato per essere condotto da una o più persone con diversi livelli di allenamento. In questo modo, vengono estratti più risultati da ogni fase ed è possibile un'analisi continua. Per la selezione del materiale biologico, il campionamento delle radici e la fase di conservazione, è necessario che una persona altamente addestrata identifichi correttamente la specie, indipendentemente dal suo stadio di crescita. Una volta identificata la specie, il campionamento delle radici può essere effettuato da qualsiasi persona, con una formazione minima per una delicata rimozione delle particelle del suolo. La seconda fase, l'elaborazione delle radici, la pulizia e la colorazione per la microscopia, richiede persone addestrate; Il processo prevede più passaggi di verifica e ogni passaggio è necessario per il successo della procedura. Più campioni possono essere elaborati contemporaneamente nelle prime due fasi. L'elaborazione delle radici per microscopia (fase 3) e l'analisi microscopica dei campioni di radice (fase 4) sono molto importanti a causa dell'elevata attenzione richiesta per tagliare i segmenti in pezzi di 1 cm combinata con la loro delicata frantumazione per la preparazione dei vetrini. La microscopia richiede attenzione per la calibrazione della luce e il software per ottenere immagini di alta qualità. Entrambe le fasi richiedono persone altamente qualificate o mediamente addestrate sotto la supervisione di un esperto. L'assemblaggio di immagini post-microscopia richiede personale altamente qualificato per la corretta sovrapposizione e ordine delle immagini per ricostruire il segmento. Il punteggio della colonizzazione micorrizica è un passaggio che richiede uno specialista in funghi AM per identificare le loro strutture e le prestazioni di colonizzazione, nonché per assegnare punteggi per ciascuna struttura su immagini a griglia. L'ultima fase, l'analisi dei dati grezzi e l'estrazione dei risultati richiedono un analista di dati altamente qualificato che compila i database e gestisce le statistiche dietro il filtraggio dei dati e l'estrazione delle mappe più rilevanti. Questo passaggio può essere combinato con il lavoro dello specialista micorrizico per la massima efficienza del processo. Nel complesso, l'intero flusso consente il coinvolgimento di più specialisti all'interno di uno studio interdisciplinare, che porta a risultati di alta qualità.

Come ogni nuovo metodo, il metodo del pattern micorrizico deve evolversi e migliorare. Ci sono alcune modifiche che, in futuro, renderanno questo metodo più facile da usare e forniranno risultati multipli. Se viene eseguito con la tecnica di pulizia lenta e colorazione, questo metodo consente la manipolazione di più campioni alla volta per mettere in pausa/riavviare l'analisi dopo ogni fase della procedura e ottenere più database digitali. Un importante miglioramento sarà l'uso di scanner performanti per un'acquisizione più rapida delle immagini e, dopo lo sviluppo di strumenti adeguati ed efficienti per il riconoscimento delle strutture micorriziche, l'automazione di questo processo. Nel contesto dell'evoluzione della tecnica, la rapida acquisizione di pattern micorrizici sosterrà studi futuri sul campo.

Ci sono diverse difficoltà nell'uso del software automatico. 1) A causa delle diverse posizioni delle strutture AM - ife e vescicole - al di fuori delle cellule radicolari e degli arbuscoli all'interno delle cellule radicolari, è difficile calibrare e addestrare il software a riconoscerle nella stessa immagine. 2) Per l'assemblaggio delle immagini da un segmento, il software non allineerà sempre le immagini per ricreare il segmento, ed è possibile che possa posizionarle in modo casuale, il che altererà il processo. 3) Un altro problema è che il software non può discriminare se alcune parti di due immagini sono identiche o se, nelle procedure di microscopia, alcuni campi sono stati sovrapposti. Pertanto, il processo richiede di essere eseguito manualmente da esperti addestrati.

Nel complesso, 60 cm di radice di ciascuna variante sono stati analizzati da più piante. Il manoscritto attuale è progettato per presentare il concetto di utilizzo del sistema e dello strumento MycoPatt e i risultati presentano la funzionalità di questo metodo. Rispetto a questo metodo, il metodo dell'intersezione della griglia ha una maggiore soggettività a causa del posizionamento casuale delle radici colorate. Riteniamo che sarà necessario per il futuro stabilire per ogni impianto AM il numero di segmenti da utilizzare. Questa è una ricerca che deve essere fatta da tutti i ricercatori nel campo delle micorrize. Uno degli articoli che ha confrontato più metodi⁹ ha presentato un tasso di colonizzazione simile da 50 a 200 segmenti di radici / pianta. Le loro conclusioni hanno affermato che è necessario un metodo più obiettivo per analizzare ciascun segmento. Sulla base della nostra ricerca, MycoPatt riduce la soggettività a 0. Ogni segmento viene scansionato e analizzato in profondità. Inoltre, è possibile sviluppare un database di immagini per tutti i risultati dei segmenti analizzati utilizzando questo metodo. Questo può anche essere utilizzato per rianalizzare i dati, se necessario.

L'intero metodo fornisce risultati necessari per molteplici campi di ricerca e commerciali. I selezionatori di piante cercano costantemente di creare varietà e ibridi più resistenti che si adattano alle specifiche condizioni del suolo. In questo contesto, i processi di selezione vegetale beneficeranno in termini di connettività delle piante alle reti micorriziche dal suolo fin dalle fasi iniziali di selezione. L'analisi del pattern micorrizico mostrerà le differenze tra gli ibridi in termini di raccolta micorrizica dal suolo e acclimatazione alle condizioni del sito. I ricercatori nel campo dell'allevamento possono utilizzare questo metodo per rilevare, fin dalle prime fasi dei processi di selezione, l'idoneità di nuove varietà/ibridi per le condizioni micorriziche del suolo. In questo modo, ci saranno varietà/ibridi che si adattano facilmente a un gran numero di condizioni e tecnologie, ma anche varietà/ibridi con minore accettazione e alta specificità per condizioni ristrette. Per gli ecosistemi delle praterie, il metodo del pattern micorrizico si adatterà perfettamente a molteplici applicazioni: una migliore comprensione della sopravvivenza delle piante in diversi assemblaggi di vegetazione legati al supporto fungino; l'analisi di specifici modelli di colonizzazione in specie endemiche e in via di estinzione; il potenziale invasivo delle specie esogene; e le fluttuazioni di dominanza-codominanza dovute all'applicazione di vari input²¹. I modelli possono essere ulteriormente utilizzati dai produttori di inoculo che devono calcolare le dosi potenziali in base ai propaguli attivi e ai punti di ingresso. Inoltre, possono essere sviluppati biofertilizzanti altamente specifici che conterranno inoculo adatto per piante che condividono gli stessi genitori. Nella ricerca, i pattern micorrizici rappresentano uno studio altamente comparativo, sia dal punto di vista visivo che numerico. Esistono più database^22,23,24 che presentano le specie micorriziche e le strutture che possono sviluppare nelle radici delle piante tester, ma nessuno di essi, ad oggi^, presenta l'immagine completa della colonizzazione. Tutti questi requisiti e la necessità di studi più realistici e applicativi supportano l'integrazione del metodo dei pattern micorrizici negli studi di interazione suolo-microbi-pianta.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb