Mycorrhiza-kaarten als hulpmiddel om kolonisatiepatronen en schimmelstrategieën in de wortels van Festuca rubra en Zea mays te verkennen

Summary

Het protocol beschrijft hier de methoden voor de beoordeling van de arbusculaire mycorrhiza kolonisatiepatronen en strategie in wortels voor twee soorten: Zea mays en Festuca rubra. Het gebruik van de MycoPatt-methode maakt de berekening van parameters, de conversie van mycorrhizastructuren in digitale gegevens en het in kaart brengen van hun werkelijke positie in wortels mogelijk.

Abstract

Arbusculaire mycorrhizaschimmels zijn symbionten in de wortels van planten. Hun rol is om de ontwikkeling van de gastheer te ondersteunen en het voedingsevenwicht in de ecosystemen te behouden. Het kolonisatieproces is afhankelijk van verschillende factoren zoals bodemecologie, de genetische diversiteit van de schimmels en gastheer en agronomische praktijken. Hun gesynchroniseerde werking leidt tot de ontwikkeling van een complex hyphal netwerk en leidt tot de secundaire ontwikkeling van blaasjes en arbuscules in de wortelcellen. Het doel van dit onderzoek was om de efficiëntie van de mycorrhizapatronen (MycoPatt) methode te analyseren voor de positionering van schimmelstructuren in de wortels van Festuca rubra en Zea mays. Een ander doel was om de schimmelkolonisatiestrategie te verkennen, zoals onthuld door mycorrhiza-kaarten van elke soort. De verwerving en assemblage van meerdere microscopische beelden maken mycorrhiza kolonisatiebeoordeling in zowel maïs- als roodzwenkgrasplanten mogelijk om informatie te geven over de realistische positie van de ontwikkelde structuren. De waargenomen mycorrhizapatronen benadrukken de variabele efficiëntie van elke plant in termen van het ontwikkelen van verbindingen met bodemsymbiotische schimmels, veroorzaakt door toegepaste behandelingen en groeifase. Mycorrhiza gedetailleerde kaarten verkregen via de MycoPatt-methode zijn nuttig voor de vroege detectie van plantefficiëntie in symbiotische acquisitie uit de bodem.

Introduction

Arbusculaire mycorrhiza (AM) schimmels zijn een categorie van bodemgedragen endofyten die voortdurend een interessegebied zijn voor onderzoekers. Hun aanwezigheid in de wortels van de meeste planten en hun betrokkenheid bij voedingscycli maakt ze vitale componenten in de stabiliteit van elk ecosysteem waar kruidachtige planten aanwezig zijn ^1,2. Door hun extra radiculair mycelium fungeert AM als een schimmelverlenging voor plantenwortels, vooral in moeilijk bereikbare gebieden³. De hoofdactiviteit is in de wortels van waardplanten, waar AM grote schimmeldradennetwerken en specifieke intracellulaire structuren ontwikkelt die arbuscules worden genoemd. Het gebrek aan gastheerspecificiteit stelt de symbiont in staat om meerdere soorten tegelijkertijd te koloniseren. Dit vermogen biedt AM de rol van toewijzing van hulpbronnen en regulering van voedingsstoffen in het ecosysteem; de schimmel biedt ook ondersteuning bij het overleven van planten en helpt bij de prestaties van de plant 4,5,6,7. De reactie van AM-soorten op gastheerwortels is zichtbaar in de extensie en locatie van het intra-radiculaire mycelium en de aanwezigheid en vorm van de arbuscules die intracellulair zijn ontwikkeld. De intracellulaire arbuscules fungeren als een uitwisselingspunt tussen de twee symbionten en vertegenwoordigen gebieden die worden gekenmerkt door snelle overdrachtsprocessen. De structuren die de AM produceren zijn soortafhankelijk en ontwikkelen naast arbuscules in de wortels ook blaasjes, sporen en hulpcellen.

Er zijn veel uitdagingen bij de beoordeling van AM-symbionten in plantenwortels ^8,9. De eerste is hun constante ontwikkeling gedurende de hele vegetatieperiode van gastheren, wat leidt tot meerdere veranderingen in de hyphal arbusculaire structuur. De verschillende stadia van arbusculaire groei, tot hun ineenstorting, zijn duidelijk aanwezig in wortels, maar de senescente AM-structuren worden soms verteerd, waardoor ze slechts gedeeltelijk zichtbaar zijn¹⁰. De tweede uitdaging wordt vertegenwoordigd door de kleuringsmethode en het protocol, de grote diversiteit van wortelsystemen, de dimensie van hun cellen en de verschillen in dikte, waardoor het moeilijk is om een uniforme methode voor te stellen. De laatste uitdaging wordt vertegenwoordigd door de beoordeling en scoring van AM-kolonisatie. Er zijn talloze methoden die AM scoren met verschillende gradaties van objectiviteit, en de meeste zijn nog steeds beperkt tot microscopietechnieken. De eenvoudige zijn gebaseerd op de aanwezigheid / afwezigheid van structuren in de wortelschors, terwijl de meer complexe zijn gebaseerd op visuele scoring en het gebruik van kolonisatieklassen, met de integratie van de frequentie en intensiteit van het kolonisatiefenomeen. Er zijn de afgelopen decennia veel gegevens geproduceerd over de mycorrhiza-status van meerdere soorten, maar de meeste methoden zijn beperkt tot de waargenomen waarde van kolonisatie zonder te wijzen op de werkelijke positie van elke structuur in de wortelschors. Als antwoord op de noodzaak van nauwkeurigere resultaten over AM-kolonisatie, werd een methode ontwikkeld op basis van microscopische analyse van mycorrhizapatronen (MycoPatt) in wortels om in digitale vorm de gedetailleerde mycorrhiza-kaarten samen te stellen¹¹. Ook maakt de methode de objectieve berekening van kolonisatieparameters en de bepaling van de werkelijke positie van elke structuur in de wortel mogelijk.

De positie van de AM-schimmelstructuren kan belangrijk zijn bij het beantwoorden van de volgende twee vragen. De eerste heeft betrekking op de analyse van de kolonisatie op één specifiek moment uit de vegetatiecyclus van een plant. In deze context is het zeer nuttig om de arbusculaire / blaasjesrijkdom te observeren, te rapporteren hoe ze zich in de wortel bevinden en een zeer duidelijk kolonisatiebeeld en parameters te geven. De tweede heeft betrekking op de detectie van schimmelstrategie en de oriëntatie ervan en zelfs de voorspelling van de toekomstige ontwikkeling ervan. Een toepassing van de MycoPatt kan zijn voor planten die dagelijks, elke 2-3 dagen, wekelijks of tijdens verschillende groeistadia worden geanalyseerd. In deze context is de locatie van de blaasjes / arbuscules belangrijk om het biologische mechanisme van AM-kolonisatie beter te begrijpen. Deze parameters en waarnemingen zijn zeer nuttig om de wiskundige parameters aan te vullen.

Het doel van dit artikel is om het vermogen van het MycoPatt-systeem aan te tonen om het inheemse AM-schimmelkolonisatiepotentieel en -strategie in Zea mays (maïs) wortels tijdens verschillende ontwikkelingsstadia en in Festuca rubra (rood zwenkgras) wortels onder verschillende langdurige bevruchtingsomstandigheden te verkennen. Om het doel te bereiken, werden twee grote databases van twee experimenten geanalyseerd. Het maïsexperiment werd opgezet in Cojocna (46°44′56" lat. N en 23°50′0" lang. E), in de Experimentele Didactische Boerderij van de Universiteit voor Landbouwwetenschappen en Diergeneeskunde Cluj op een phaeoziom met een leemachtige textuur bodem¹². Het roodzwenkgrasexperiment maakt deel uit van een grotere experimentele site die in 2001 is opgericht in Ghețari, Apuseni Mountains (46°49'064" lat. N. N en 22°81'418'' lang. E), op een preluvosol (terra rossa) bodemsoort^13,14. Maïs werd verzameld in vijf verschillende groeifenofas¹²: B1 = 2-4 bladeren (als controlepunt voor het begin van mycorrhiza-kolonisatie); B2 = 6 bladeren; B3 = 8-10 bladeren; B4 = cob-vorming; B5 = fysiologische volwassenheid. Vanaf het 2-4 bladeren stadium (A0) werd een organische behandeling toegepast, wat resulteerde in een tweegradefactor (A1 = controle en A2 = behandeld). Wortels van rood zwenkgras werden verzameld bij de bloei van een experiment met vijf langdurige bevruchtingen^13,14: V1 = controle, niet-bevrucht; V2 = 10 t·^ha-1 mest; V3 = 10 t·^ha-1 mest + N 50 kg·^ha-1, P₂O₅ 25 kg·^ha-1, K₂O 25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·^ha-1, P₂O₅ 50 kg·^ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·^ha-1 mest + N 100 kg·^ha-1, P₂O₅ 50 kg·^ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1. In elke ontwikkelingsfase werden uit elke bemestingsvariant vijf planten verzameld. De kleuringsprotocollen en hun prestaties in termen van monsterverwerkingstijd en kwaliteit van de kleuring werden geanalyseerd. De relatie tussen de ontwikkeling van AM-schimmeldraden en de aanwezigheid van zijn structuren in wortels werd voor elke soort afzonderlijk geanalyseerd en voortgezet met de identificatie van de meest tolerante wortels voor kolonisatie. De specifieke kolonisatiepatronen van elk wortelstelsel werden geanalyseerd op basis van kolonisatiekaarten en de waarde van AM-parameters.

Maïs is een eenjarige plant, wat een continue groei van de wortels impliceert, en dat was de belangrijkste reden om de MycoPatt in de groeifasen toe te passen. Rood zwenkgras is een overblijvende plant uit een grasland dat lange tijd is behandeld met verschillende meststoffen. De wortels hebben een kortere ontwikkeling van 1 jaar en de anthese wordt beschouwd als het vegetatiepunt wanneer de plant zijn metabolisme verandert van vegetatief naar generatief. Om deze planten tijdens deze intense activiteitsperiodes te vangen, werden de bovengenoemde tijdstippen gekozen. Bemonstering tijdens de vegetatieperiode is moeilijk voor deze soort wanneer deze in natuurlijke graslanden wordt gekweekt.

Protocol

1. Selectie van biologisch materiaal, wortelbemonstering en opslag

1. Verzamel de volledige wortel van planten met een schop (figuur 1A) afzonderlijk voor elke variant en repliceer. Verwijder voorzichtig, met de hand, de grote grondaggregaten van de wortels. Was het hele wortelstelsel en meet het op een schaal met cellen van 1 cm x 1 cm (figuur 1B). Snijd de wortels voor elke plant afzonderlijk en plaats ze in een plastic zak.
2. Verzamel alle schone wortels van elke plant in een plastic zak en verzamel alle monsters van één variant in één grotere zak. Schrijf op elke zak de naam van het stadium/de variant en de bemonsteringsdatum. Bewaar de wortels in een koelkast of vriezer bij een temperatuur tussen −4 °C en −20 °C totdat ze verwerkt zijn.

2. Wortelverwerking, clearing en kleuring voor microscopie

OPMERKING: Gebruik handschoenen, een masker en een microbiologische /chemische capuchon voor deze stap van het protocol.

1. Zorg ervoor dat het ontdooien van de wortel langzaam gebeurt bij kamertemperatuur. Gebruik voor alle verwerkingsstappen kleine potten (30-50 ml) om de hoeveelheid benodigde middelen te verminderen.
2. Voer de volgende vier stappen uit van de langzame opruim- en kleuringsprocedure¹⁵. Doe alle stappen op kamertemperatuur. Deze methode maakt de verwerking van een groot aantal monsters tegelijkertijd mogelijk zonder het gebruik van een waterbad om te koken.
   1. Wortel opruimen: Plaats alle wortels van één plant in een pot. Bereid een 10% NaOH-oplossing met kraanwater en giet het in elke pot totdat deze de wortels volledig bedekt. Schud de potten krachtig gedurende 1 min of 2 minuten om een homogene dispersie van de opruimoplossing in de wortels te produceren. Herhaal deze procedure na 24 uur en laat de wortels ten minste 48 uur in de opruimoplossing zitten.
      OPMERKING: Schone wortels hebben een lichtgeel (tot wit) aspect en de consistentie is zacht (ze kunnen gemakkelijk worden verpletterd door met een pincet te drukken).
   2. Wortelspoeling: Haal de inhoud van één pot per keer door een zeef. Recycle de opruimoplossing. Spoel de wortels meerdere keren in leidingwater totdat de opruimoplossing volledig is verwijderd.
      OPMERKING: Als de opruimoplossing niet volledig wordt verwijderd, heeft dit invloed op de kwaliteit van de kleuringsprocedure.
   3. Wortelvlekken: Plaats de gespoelde wortels in een schone pot. Bereid een 5%:5% inktazijnoplossing met kraanwater (5 ml blauwe inkt + 5 ml 9% azijnzuur + 90 ml kraanwater). Giet de oplossing in elke pot totdat deze de wortels volledig bedekt. Schud de potten krachtig gedurende 1 minuut of 2 minuten om een homogene dispersie van de kleuringsoplossing in de wortels te produceren. Herhaal deze procedure na 24 uur en laat de wortels in deze oplossing gedurende 48 uur.
      OPMERKING: Gekleurde wortels hebben een intens blauwe kleur.
   4. Wortel gedeeltelijk vasthoudend: Spoel de gekleurde wortels in kraanwater gedurende 1-2 min. Schud de potten krachtig om de extra vlekkenoplossing te verwijderen. Herhaal de procedure als de kleuring te intens is en geen duidelijke microscopische evaluatie mogelijk maakt.
      OPMERKING: Gekleurde wortels kunnen tot 1 week bij kamertemperatuur in leidingwater worden bewaard zonder de kleuringskwaliteit te veranderen (figuur 2). Voor langere periodes kunnen wortels tot 2-3 maanden worden gehandhaafd in een 5% commerciële appelazijnoplossing (5% azijnzuur).

3. Wortelverwerking voor microscopie

1. Wortelsegmentatie: Plaats de gekleurde wortels van elk monster op een geschaalde snijplank (figuur 3A). Snijd de wortels in segmenten van 1 cm (figuur 3B). Kies 15 segmenten voor elke variant.
2. Zachte breekmethode voor segmentvoorbereiding: Verdeel de wortels op een glijbaan. Gebruik een lamineerzakje om de wortels te bedekken en plet ze voorzichtig vanaf een rand (figuur 3C,D). Gebruik een zacht plastic gereedschap, bijvoorbeeld een pincet, scalpelhandvat, pen of een potlood met een gum, om de wortels langzaam op de dia weer te geven. Verwijder het lamineerzakje voorzichtig en bedek het monster met een coverslip (figuur 3E).
   OPMERKING: Wortels hebben een buisvorm, dus het is noodzakelijk om ze in een tweedimensionaal vlak te scheiden. Deze actie veronderstelt de scheiding van wortels op het middelste punt, wat leidt tot de weergave van de twee delen van de interne diameter. Het gebruik van lamineerzakjes in de zachte breekprocedure maakt het mogelijk om de wortels, die een cilindervorm hebben, in twee stukken weer te geven - een aan de linkerkant en een aan de rechterkant - naar hun middenpunt. Op deze manier wordt de hele wortel diepgaand geanalyseerd en is de kolonisatiegraad de parameter die de volumetrische kolonisatie laat zien (beschreven in het oorspronkelijke werk op MycoPatt¹¹). Kortom, we snijden een cilinder doormidden en daarna bouwen we hem wiskundig opnieuw op.
3. Voeg met een pipet water toe aan een hoek van de glijbaan en laat het water langzaam op de glijbaan verspreiden (figuur 3F). Verwijder het extra water met een papieren handdoek.

4. Microscopische analyse van de wortelmonsters

1. Gebruik een microscoop uitgerust met een camera met een goede resolutie.
2. Analyseer de dia's vanaf een extremiteit. Leg elk microscopisch veld vast. Hernoem elke afbeelding die is vastgelegd met een code die de echte post-assemblage van root-onderdelen mogelijk maakt. Gebruik voor dikke wortels de vergroting van 10x of 40x en voor dunne wortels de 40x vergroting. Gebruik hetzelfde doel en dezelfde vergroting voor de hele set wortels van een soort.

5. Post-microscopie beeldassemblage

1. Gebruik presentatiesoftware om een tekentafel te ontwerpen voor het samenstellen van afbeeldingen. Stel de breedte in op 2-3 cm breder dan de afbeeldingsbreedte. Voeg alle vastgelegde afbeeldingen uit één segment toe in de volgorde van hun opname en reconstrueer de volledige lengte van het hoofdsegment (figuur 4A).
   1. Kortom, verzamel in totaal 15 foto's voor elk segment van 1 cm en organiseer ze verticaal, beginnend met 1 tot 15, in de presentatiesoftware om het segment te reconstrueren.
2. Lijn de afbeeldingen in het midden uit. Gebruik de verticale uitlijning om ervoor te zorgen dat elke afbeelding de vorige volgt. Plaats op alle afbeeldingen een raster van 10 cellen x 150 cellen om het hele wortelsegment te bedekken.
   1. Plaats bovendien op elke afzonderlijke afbeelding een raster van 10 x 10 en voeg in elke cel van dit raster een getal in van één tot zes als een AM-structuur zichtbaar is of laat leeg als er geen AM-structuur aanwezig is. Op deze manier is de nauwkeurigheid van het proces maximaal en worden er geen fouten in de locatie van de AM-structuren waargenomen.
3. Voeg een tabel toe voor een raster van 10 cellen in breedte en 150 cellen in lengte (15 vierkanten van 10 cellen x 10 cellen). Wijzig de afmetingen van de tabelbreedte in de breedte van de afbeeldingen. Wijzig de lengte van de tabel zodat deze uit alle afbeeldingen bestaat (figuur 4B).

6. Scoren van mycorrhiza-kolonisatie

1. Gebruik het unieke getal om elk type structuur te scoren zoals beschreven in de mycorrhizapatronen methode¹¹: 1 voor schimmeldraden; 2 voor arbuscules; 3 voor blaasjes; 4 voor sporen; 5 voor hulpcellen; en 6 voor toegangspunten (figuur 4C). Scoor elke waargenomen mycorrhizastructuur van elke cel van de eerder toegepaste rasters (figuur 4D).

7. Ruwe data analyse en resultaat extractie

1. Voeg alle verkregen scores in de MycoPatt-spreadsheet^{in 11}. Gebruik de kopieer-/plakfunctie om alle scores van de presentatie over te zetten naar het eerste blad met de naam rawdata (figuur 5).
2. Primaire analyse van resultaten: Gebruik het derde blad met de naam parameters in de MycoPatt-spreadsheettool om de resultaten te visualiseren als percentages (%) afzonderlijk in drie vormen (figuur 6A-C). Gebruik de kolommen A tot en met K om het horizontale beeld van kolonisatie te analyseren; kolommen M tot W om het verticale beeld van kolonisatie te analyseren; en kolommen Y tot AI om de transversale (gemiddelde) kolonisatie te analyseren voor elk van de 15 10 x 10 vierkanten (lijnen 2-17) en de uiteindelijke gemiddelde kolonisatie (regels 19-20).
   OPMERKING: De transversale gemiddelde kolonisatie wordt gebruikt voor de berekening van de reële kolonisatieparameters, gerelateerd aan zowel horizontale als verticale analyse. Op deze manier kunnen er geen fouten worden gemaakt in vergelijking met wanneer alleen de horizontale of verticale analyse wordt gebruikt (in detail beschreven in het oorspronkelijke werk¹¹). Ook wordt deze set parameters berekend voor het gehele oppervlak van het microscopische veld.
   1. Gebruik de definities en formules, specifiek voor elke parameter, om de resultaten te analyseren¹¹. Gebruik de volgende kolonisatieparameters: frequentie van kolonisatie (%), intensiteit van kolonisatie (%), arbuscules (%) en blaasjes (%), sporen (%) en hulpcellen (%), toegangspunten (%), het percentage niet-mycorrhizagebieden (%), de totale kolonisatiegraad (%), en het rapport van mycorrhiza / niet-mycorrhizale gebieden.
      OPMERKING: Als arbuscules, blaasjes, sporen, hulpcellen en toegangspunten ontbreken in geanalyseerde monsters, zal de MycoPatt-spreadsheet ze als nul (0) scoren.
3. Productie en extractie van mycorrhiza-kaarten: Visualiseer het beeld dat wordt verkregen door de conversie van mycorrhizastructuurcode in kleuren in het tweede blad van de MycoPatt-benoemde grafieken (figuur 7A). Exporteer de resulterende afbeelding in het grafiekblad als een afbeelding (figuur 7B). Gebruik de kleurcode in de legenda voor de analyse van mycorrhizapatronen.
4. Mycorrhiza kaartanalyse: Identificeer de belangrijkste structuren en hun assemblage op mycorrhizakaarten. Beschrijf het mycorrhiza-kolonisatiepatroon dat wordt waargenomen in de geanalyseerde wortels. Beschrijf de mycorrhiza-kolonisatiestrategie op basis van waargenomen structurele ontwikkeling in de wortel, het vertakkingspatroon en de ontwikkeling van arbuscule / blaasjes.

Representative Results

Het juiste gebruik van de zachte verpletteringsmethode van de wortels na de kleuringsprocedures biedt goede details van mycorrhizastructuren, zowel voor Zea mays (figuur 8A-C) als Festuca rubra (figuur 9A-E), een goed contrast tussen mycorrhizastructuren en wortelcellen, en een bevestiging van de stele vanwege de blauwe kleur. Als de opruim- en kleuringsprocedures niet slagen, zijn wortelmonsters moeilijk te verpletteren en vertonen ze niet duidelijk mycorrhizastructuren (figuur 10A-E). Herhaal in dit geval de hele clearing-staining-procedure.

Het gebruik van de mycorrhiza-patroonmethode en de MycoPatt-tool maakte een volledige verkenning van het kolonisatiemechanisme mogelijk. De methode biedt een diepgaande, kleinschalige verkenning van kolonisatiepatronen en -strategieën voor elke soort (figuur 11 en figuur 12) met een extra visuele expressie van kolonisatieparameters (tabel 1 en tabel 2). De twee studies uitgevoerd op Zea mays, uitgebreid beschreven door Pop-Moldovan et ^al.12, en Festuca rubra, gedetailleerd door Corcoz et al. ^13,14, leverde een grote database van waarnemingen, mycorrhiza-kaarten en kolonisatieparameters. Beide databases scoorden de frequentie van kolonisatie (%), intensiteit van kolonisatie (%), arbuscules (%) en blaasjes (%), het percentage niet-mycorrhizagebieden (%), de totale kolonisatiegraad (%), en het rapport van mycorrhiza / niet-mycorrhizale gebieden als kolonisatieparameters. Voor Zea mays bestond de database uit 5.850 regelvermeldingen in de spreadsheetdatabase, samengesteld in 390 kolonisatiekaarten. Het Zea mays-experiment stelde het rapport van mycorrhiza/niet-mycorrhiza-gebieden voor als parameter voor de beschrijving van afwisseling en verstoring tussen gekoloniseerde gebieden in de wortels. De aanpak maakt de diepgaande analyse van het kolonisatiemechanisme en de ontwikkeling ervan langs de wortels mogelijk. Festuca rubra leverde een database van 4.500 regelitems in de spreadsheet, samengesteld in 300 kaarten. Er werd een nieuwe index voorgesteld, het arbuscules/vesicles-rapport, dat verder werd gebruikt als een indicator van de kolonisatiestrategie. De algemene beoordeling van de kolonisatiestrategie stelde vier verschillende scenario's van mycorrhizale ontwikkeling voor: 1) propagatieve strategie, 2) overdrachtsstrategie, 3) opslagstrategie en 4) plantresistentiestrategie. Voor de extractie van de meest representatieve mycorrhiza-kaarten werden beide databases onderzocht op basis van getransformeerde gemiddelde waarden van frequentie en intensiteit van kolonisatie, wat resulteerde in de extractie van drie verschillende kaarten voor elke geanalyseerde variant (tabel 1 en tabel 2). De drie kaarten vertegenwoordigen de AM-kolonisatie van de hoofdsegmenten die de dichtstbijzijnde waarden hebben voor de volgende: het gemiddelde (Av) van elke variant, dat wordt berekend op basis van alle beschikbare gegevens voor een variant; de Av−, die een waarde vertegenwoordigt die wordt berekend door het verschil tussen gemiddeld en gemiddeld/2 (Av−Av/2) en een lager normaal kolonisatiepotentieel vertoont; en de Av+, die een waarde vertegenwoordigt die wordt berekend door de som tussen gemiddelde en gemiddelde/2 (Av+Av/2) en een hoger normaal kolonisatiepotentieel laat zien. Het gebruik van deze extractieformule stelt de gebruiker in staat om de extremen (hoogste of laagste) van de kolonisatie te vermijden. De methode maakt de extractie van de meest mogelijke gevallen van mycorrhiza-kolonisatie mogelijk.

Zea mays vertoonde een sterk fluctuerend kolonisatiepotentieel, dat afhankelijk was van de ontwikkelingsfase van de plant (tabel 1, figuur 11). De waarden van de kolonisatiefrequentie varieerden sterk tussen 3,67% -69,60%, ondersteund door waarden op 50% voor de intensiteit van de kolonisatie. De belangrijkste reden voor dit fenomeen is dat het wortelstelsel zich gedurende de gehele vegetatieperiode continu ontwikkelt. Arbuscules presenteerden maximale waarden in de ontwikkelingsfase van 6 bladeren (B2), met een afname in de volgende groeistadia. Blaasjes verschenen sporadisch, met waarden lager dan 1%. De verkenning van mycorrhizapatronen onthulde dat schimmeldraden werden ontwikkeld in verschillende delen van de wortels, met beperkte extensie. Grote discontinuïteiten tussen gekoloniseerde gebieden werden waargenomen, met een onregelmatige ontwikkeling van schimmeldraden rond het centrale punt van kolonisatie. De kolonisatiestrategie vertoonde grote variaties in het interval van de plantresistentie tegen de proliferatieve en overdrachtsstrategieën. Het stadium van 6 bladeren (B2), gevolgd door het stadium van cob-vorming (B4), vertoonde een overdrachtsstrategie van kolonisatie, ondersteund door de mycorrhized / niet-mycorrhized gebiedsrapporten die lager waren dan 0,14. Het enige geval met een zichtbare hoge transferstrategie werd geregistreerd in de B2-fase toen grote gebieden van wortels arbuscules presenteerden. Hun algemene positionering toonde een duidelijke scheiding tussen het gebied waar arbuscules werden ontwikkeld en het gebied waar arbuscules zich in een opkomend stadium bevonden. Het meest homogene gemiddelde kolonisatiepatroon werd waargenomen in de ontwikkelingsfase van B5, met constante niet-gekoloniseerde gebieden tussen de gekoloniseerde gebieden. De algemene beoordeling van dit visuele fenomeen kwam overeen met de laatste vegetatieperiode, met kleine waarden van arbuscules, die de regressie van deze structuren aangaven.

Festuca rubra is een dominante soort in berggraslanden met een meerjarig wortelstelsel. Door deze aanpassing vinden de meeste kolonisatieprocessen plaats in de wortels en is de ontwikkeling van hyphale netwerken gecorreleerd met een lage ontwikkelingssnelheid van de wortels (tabel 2, figuur 12). Door de toepassing van meststoffen vertoonden de kolonisatieparameters grote verschillen tussen varianten. De verschillen in de kolonisatiefrequentie waren 65%, ondersteund door een verschil van 36% in de geregistreerde intensiteiten. Elke variant vertoonde een ander kolonisatiepatroon, gecorreleerd met de langdurige toepassing van behandelingen, en vergezeld van avariatie tussen 0,09-0,96 in het rapport over gemenecorrhiseerde / niet-gemycorrhiseerde gebieden en 0-9,43 in het arbuscules / blaasjesrapport. De controlevariant (V1) vertoonde een gemiddelde opslaggerichte strategie, met een beperkt gebied dat de ontwikkeling van arbuscules voor de Av+ kolonisatiekaart beperkte. Het vereenvoudigde beeld van de kolonisatie (Av−) toonde zowel lineaire als laterale ontwikkeling van de schimmeldraden, die volledig gericht was op onregelmatige kolonisatie voor de twee bovenste modellen (Av− en Av +). De toepassing van organische behandelingen (V2) veroorzaakte dubbele, lineaire en onregelmatige hyphale ontwikkeling in de wortels. De kolonisatiestrategie die voor de organische behandeling werd geïdentificeerd, toonde een oriëntatie op een opslagstrategie, geassocieerd met de langzame afgifte van mest in de bodem en de persistentie ervan van het ene seizoen op het andere. Het Av+-model bood het hoogste kolonisatiepotentieel, met een intense aanwezigheid van blaasjes. Het rapport over mycorrhized / niet-mycorrhized gebieden presenteerde homogene kolonisatie, met zeldzame discontinuïteiten tussen gekoloniseerde gebieden. In tegenstelling hiermee veroorzaakte de toepassing van minerale meststoffen (V4) de regressie van mycorrhiza-kolonisatie. De gekoloniseerde gebieden vertoonden een onregelmatig patroon, met grote niet-gekoloniseerde discontinuïteiten ertussen. De waargenomen strategie was over het algemeen gericht op een plantresistentiestrategie, met kleine gebieden waar een punctuele opslag- of overdrachtsstrategie zichtbaar was. De vergelijkende analyse tussen laag-minerale organische (V3) en hoog-minerale organische (V5) behandelingen toonde een continue regressie van kolonisatie en verschuivingen in kolonisatiestrategie, passend tussen de twee tegenovergestelde behandelingen (V2 en V4). Alle gekoloniseerde gebieden ontwikkelden zich onregelmatig rond een centraal punt, met een homogene aanwezigheid van niet-gekoloniseerde gebieden. De kolonisatiestrategie was gericht op een proliferatieve overdrachtsstrategie, met de aanwezigheid van blaasjes in beperkte gebieden. De grootste niet-gekoloniseerde discontinuïteiten werden geïdentificeerd in de variant met een hogere hoeveelheid minerale meststof (V5).

Figuur 1: Wortelbemonsteringsprocedures. (A) Extractie van monsters met grond om de integriteit van de wortels te beschermen. (B) Metingen van het wortelstelsel na de eerste opruimingsprocedure. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Gekleurde wortels in een pot met kraanwater tot de verwerking. Wortels behouden hun kleur tot 1 week bij kamertemperatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Wortelverwerking. (A) Bewaar alle wortels van één monster in water in een petrischaaltje. (B) Snijd de wortels in segmenten van 1 cm lengte. (C-D) Druk voorzichtig op het lamineerzakje om de wortels te verpletteren en laat ze langzaam op een dia zien. (E-F) Bedek de wortelsegmenten met een coverslip en voeg op een hoek een druppel kraanwater toe. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Beeldverwerking. (A) Voeg alle afbeeldingen toe die uit één voorbeeld in een presentatie zijn vastgelegd. Lijn alle afbeeldingen uit om het microscopische beeld van elke wortel te reconstrueren. (B) Voeg een tabel toe om het raster voor te bereiden, met een breedte van 10 cellen x 10 cellen lengte voor elke afbeelding. Stel de binnengrenzen in op geen. De binnengrens zal nog steeds zichtbaar zijn, maar hun transparantie zal de mycorrhiza-analyse niet in de weg staan. (C-D) Gebruik de legenda van MycoPatt om elke structuur te scoren die zichtbaar is op de afbeelding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Invoeging van gegevens in MycoPatt. Kopieer de volledige database met observaties uit de presentatie naar MycoPatt. Plak het als getallen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Ruwe data extractie en primaire data analyse. (A) Kolonisatiebeoordeling voor alle 10 horizontale cellen uit één rij. (B) Kolonisatiebeoordeling voor alle 10 cellen uit één kolom (verticaal) in elk van de 10 cellen x 10 cellen vierkanten van MycoPatt. (C) Transversale kolonisatiebeoordeling en de berekening van gemiddelde kolonisatieparameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Extractie van mycorrhizapatronen kaarten. (A) Voor de gehele dataset is een grote kaart van 10 cellen x 150 cellen beschikbaar in het grafiekenblad van MycoPatt. (B) Extraheer de kolonisatiekaart als afbeelding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Microscopische beelden van AMF-structuren in bewerkte wortels van Zea mays. (A) Hyphal netwerk intercellulaire en intracellulaire ontwikkeling van arbuscules. (B) Dicht hyphal netwerk met talrijke arbuscules die zich intracellulair ontwikkelen. (C) Reeks blaasjes van verschillende afmetingen. Afkortingen: H = hyphae; A = arbuscules; V = blaasjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Microscopische beelden van AMF-structuren in bewerkte wortels van Festuca rubra. (A) Meerdere hyphale netwerken met blaasjes en arbuscules ontwikkelden zich in afzonderlijke gebieden. (B) Detail van een opgerold hyphal netwerk. C) Detail van een toegangspunt en twee opgerolde schimmeldraden. (D) Detail van een blaasje aan het einde van een opgerolde schimmeldraden. (E) Detail van een intracellulaire arbuscule, detail van een opgerolde hypha en de aanwezigheid van een blaasje aan het einde van een hypha. Afkortingen: H = hyphae; A = arbuscules; V = blaasjes; Ep = toegangspunten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Onduidelijke microscopische beelden van AMF-structuren in wortels van Festuca rubra (A-C) en Zea mays (D-E) in onvolledige geklaarde en gekleurde wortels. (A) Onduidelijke gekleurde wortel met een laag aantal schimmeldraden zichtbaar en de oorspronkelijke kleur van wortels zichtbaar. (B) Schimmeldraden van blauw en intens blauw kleurverloop met onduidelijk onderscheid tussen de wortelcellen en schimmeldraden. (C) Duidelijk gekleurd hyphal netwerk in het bovenste deel van het beeld en onvolledige gekleurde schimmeldraden in het onderste deel van het beeld. (D) Intens gekleurde wortel en schimmeldraden, wat de identificatie van AM-structuren onmogelijk maakt. (E) Detail van een intens gekleurde wortel met artefacten aanwezig in de cellen, wat de identificatie van AM-structuren onmogelijk maakt. Afkortingen: H = hyphae. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: Mycorrhiza kolonisatiepatronen (Av, Av−en Av+) in wortels van behandelde Zea mays. Afkortingen: A0 = moment van behandelingstoepassing; A1 = controlevariant (geen behandeling)/A2 = behandelde variant; B1 = 2-4 bladeren (als controlepunt voor het begin van mycorrhiza-kolonisatie); B2 = 6 bladeren; B3 = 8-10 bladeren; B4 = cob-vorming; B5 = fysiologische volwassenheid. Variantcombinaties zijn A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; en A1B5/A2-B5. De volledige beschrijving van behandelingen is te vinden in Pop-Moldovan et ^al.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 12: Mycorrhiza-kolonisatiepatronen (Av, Av− en Av+) in wortels van langdurig behandelde Festuca rubra. Afkortingen: V1 = controle, niet-bemest; V2 = 10 t·ha⁻¹ mest; V3 = 10 t·ha⁻¹ mest + N 50 kg·^ha-1, P₂O₅ 25 kg·ha⁻¹, K₂O 25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha⁻¹, P₂O₅ 50 kg·ha⁻¹, K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha⁻¹ mest + N 100 kg·^ha-1, P₂O₅ 50 kg·ha⁻¹, K₂O 50 kg·ha⁻¹. De volledige beschrijving van behandelingen is te vinden in eerder werk^13,14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Waarden van mycorrhiza-kolonisatieparameters in wortels van Zea mays op basis van de ontwikkelingsfase. Legenda: A0 = moment van toepassing van de behandeling; A1 = controlevariant (geen behandeling)/A2 = behandelde variant; B1 = 2-4 bladeren (als controlepunt voor het begin van mycorrhiza-kolonisatie); B2 = 6 bladeren; B3 = 8-10 bladeren; B4 = cob-vorming; B5 = fysiologische volwassenheid. Variantcombinaties zijn A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; en A1B5/A2-B5. De volledige beschrijving van behandelingen is te vinden in Pop-Moldovan et ^al.12. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Waarden van mycorrhiza-kolonisatieparameters in wortels van Festuca rubra op basis van toegepaste bevruchting. Legenda: V1 = controle, niet-bemest; V2 = 10 t·ha⁻¹ mest; V3 = 10 t·ha⁻¹ mest + N 50 kg·^ha-1, P₂O₅ 25 kg·ha⁻¹, K₂O 25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha⁻¹, P₂O₅ 50 kg·ha⁻¹ K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha⁻¹ mest + N 100 kg·^ha-1, P₂O₅ 50 kg·ha⁻¹ K₂O 50 kg·ha⁻¹. De volledige beschrijving van behandelingen is te vinden in eerder werk^13,14. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Gedetailleerde protocolstappen van veldbemonstering van wortels tot ruwe data-analyse en mycorrhiza-kaartextractie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Studies over mycorrhiza kolonisatie zijn van vitaal belang voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën op agronomisch gebied. Het potentieel van meerdere gecultiveerde planten om een symbiotische associatie te vormen met arbusculaire mycorrhiza's maakte ze een belangrijk onderdeel van de duurzame ontwikkeling van het agro-ecosysteem en het behoud van zijn gezondheid 16,17,18,19,20. Er is dus behoefte aan een beter begrip van het kolonisatiemechanisme en schimmelstrategieën, die essentiële gegevens opleveren over hoe een plant verbinding kan maken met voedingsnetwerken uit de bodem, de opbrengst en het overlevingspotentieel. Daarom is dit in de context van slimme landbouw een must-have van deze eeuw, het is van vitaal belang om een diepgaande beoordeling van kolonisatie uit te voeren en studies moeten een realistisch beeld geven van de schimmelpositie in de wortels.

De wortel mycorrhizapatronen methode biedt zo'n diepe scan van de wortels, maar het komt met zowel beperkingen als voordelen¹¹. De gepresenteerde beperkingen zijn het grote aantal monsters dat moet worden gescoord wanneer een plant voor de eerste keer wordt geanalyseerd, de noodzaak voor beeldmanipulatie en de handmatige toewijzing van mycorrhizastructuren in wortels, maar al deze kunnen worden overwonnen door meerdere voordelen op lange termijn. De grote database die voortvloeit uit de toepassing van deze methode en de integratie van microscopie met de MycoPatt-tool biedt stabiliteit, statistische zekerheid van resultaten en meerjarigheid in termen van resultatenvergelijking. Mycorrhiza-patroonidentificatie voor de wortels van een specifieke plant zal latere studies in termen van vergelijking vergemakkelijken. Ook verbetert het de identificatie van nieuwe patronen, die informatie kunnen geven over de evolutie van kolonisatiemechanismen en schimmelstrategie. De berekening van gemiddelde kolonisatieparameters op basis van horizontale en verticale ontwikkeling maakt het mogelijk om meer realistische en complexe waarden te verkrijgen in vergelijking met de visuele schattingsmethoden, zoals rasterkruising, schatting van het hoofdsegment en vergroot snijpunt ^9,11. Over het algemeen maakt de mycorrhiza-patroonmethode de beoordeling mogelijk van schimmelvooruitgang en vertakking in wortels en de identificatie van nieuwe punten van externe kolonisatie en de uitbreiding van schimmeldraden langs de wortels. Het maakt de positionering van arbuscules en blaasjes mogelijk en wijst ze een realistische positie en dimensie toe in het globale patroon.

De juiste toepassing van de MycoPatt-methode is afhankelijk van de succesvolle voltooiing van elke stap van het protocol (tabel 3). Voor een hogere efficiëntie is de volledige stroom van de methode ontworpen om te worden uitgevoerd door een of meerdere personen met verschillende trainingsniveaus. Op deze manier worden uit elke stap meerdere resultaten gehaald en is continue analyse mogelijk. Voor de selectie van biologisch materiaal, wortelbemonstering en de opslagstap is het noodzakelijk dat een hoogopgeleide persoon de soort correct identificeert, ongeacht het groeistadium. Zodra de soort is geïdentificeerd, kan de wortelbemonstering door elke persoon worden uitgevoerd, met minimale training voor het verwijderen van zachte bodemdeeltjes. De tweede stap, wortelverwerking, clearing en kleuring voor microscopie, vereist getrainde personen; het proces heeft meerdere verificatiestappen en elke stap is noodzakelijk voor het succes van de procedure. In de eerste twee stappen kunnen meerdere monsters tegelijk worden verwerkt. Wortelverwerking voor microscopie (stap 3) en de microscopische analyse van wortelmonsters (stap 4) zijn erg belangrijk vanwege de hoge aandacht die nodig is voor het snijden van de segmenten in stukken van 1 cm in combinatie met hun zachte verbrijzeling voor diabereiding. Microscopie heeft aandacht nodig voor de kalibratie van licht en de software om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen. Beide stappen vereisen hoogopgeleide personen of middelmatig opgeleide personen onder toezicht van een expert. Post-microscopie beeldassemblage vereist hoog opgeleid personeel voor de juiste overlap en volgorde van afbeeldingen om het segment te reconstrueren. Het scoren van mycorrhiza-kolonisatie is een stap die een specialist in AM-schimmels vereist om hun structuren en kolonisatieprestaties te identificeren, evenals om scores voor elke structuur op gerasterde afbeeldingen toe te wijzen. De laatste stap, ruwe data-analyse en resultaatextractie vereisen een hoogopgeleide data-analist die de databases samenstelt en de statistieken achter datafiltering en de extractie van de meest relevante kaarten beheert. Deze stap kan worden gecombineerd met het werk van de mycorrhizaspecialist voor maximale efficiëntie van het proces. Over het algemeen maakt de hele stroom de betrokkenheid van meerdere specialisten binnen een interdisciplinaire studie mogelijk, wat leidt tot resultaten van hoge kwaliteit.

Zoals elke nieuwe methode moet de mycorrhiza-patroonmethode evolueren en verbeteren. Er zijn enkele wijzigingen die deze methode in de toekomst gebruiksvriendelijker maken en meerdere resultaten opleveren. Als dit wordt gedaan door de langzame clearing- en kleuringstechniek, maakt deze methode de manipulatie van meerdere monsters tegelijk mogelijk om de analyse na elke stap van de procedure te pauzeren / opnieuw te starten en meerdere digitale databases te verkrijgen. Een belangrijke verbetering is het gebruik van performante scanners voor snellere beeldacquisitie en, na de ontwikkeling van geschikte en efficiënte tools voor mycorrhizastructuurherkenning, de automatisering van dit proces. In de context van de evolutie van de techniek zal een snelle verwerving van mycorrhizapatronen toekomstige studies in het veld ondersteunen.

Er zijn verschillende problemen bij het gebruik van automatische software. 1) Vanwege de verschillende posities van AM-structuren - schimmeldraden en blaasjes - buiten de wortelcellen en arbuscules in de wortelcellen, is het moeilijk om software te kalibreren en te trainen om ze in hetzelfde beeld te herkennen. 2) Voor de assemblage van de foto's uit één segment zal de software de foto's niet altijd uitlijnen om het segment opnieuw te maken, en het is mogelijk dat het ze willekeurig plaatst, waardoor het proces verandert. 3) Een ander probleem is dat software niet kan onderscheiden of sommige delen van twee foto's identiek zijn of dat in de microscopieprocedures sommige velden elkaar overlappen. Het proces moet dus handmatig worden uitgevoerd door getrainde experts.

In totaal werd 60 cm wortel van elke variant geanalyseerd van meerdere planten. Het huidige manuscript is ontworpen om het concept van het gebruik van het MycoPatt-systeem en -tool te presenteren, en de resultaten presenteren de functionaliteit van deze methode. In vergelijking met deze methode heeft de rasterkruisingsmethode een hogere subjectiviteit vanwege de willekeurige plaatsing van gekleurde wortels. Wij zijn van mening dat het voor de toekomst noodzakelijk zal zijn om voor elke AM-fabriek het aantal te gebruiken segmenten vast te stellen. Dit is onderzoek dat door alle onderzoekers op het gebied van mycorrhiza's moet worden gedaan. Een van de artikelen die meerdere methoden⁹ vergeleek, presenteerde een vergelijkbare kolonisatiesnelheid van 50 tot 200 wortelsegmenten / plant. Hun conclusies stelden dat een meer objectieve methode nodig is om elk segment te analyseren. Op basis van ons onderzoek reduceert MycoPatt de subjectiviteit tot 0. Elk segment wordt gescand en diepgaand geanalyseerd. Ook kan met behulp van deze methode een beelddatabase voor alle geanalyseerde segmentresultaten worden ontwikkeld. Dit kan ook worden gebruikt voor het opnieuw analyseren van de gegevens indien nodig.

De hele methode levert resultaten op die nodig zijn voor meerdere onderzoeks- en commerciële gebieden. Plantenveredelaars proberen voortdurend resistentere variëteiten en hybriden te creëren die zich aanpassen aan specifieke bodemomstandigheden. In deze context zullen plantenveredelingsprocessen profiteren in termen van plantenconnectiviteit met mycorrhizanetwerken uit de bodem vanaf de eerste selectiefasen. Mycorrhiza-patroonanalyse zal de verschillen tussen hybriden laten zien in termen van mycorrhiza-oogst uit de bodem en acclimatisatie aan locatieomstandigheden. Onderzoekers in het veredelingsveld kunnen deze methode gebruiken om, zelfs vanaf de vroege stadia van de selectieprocessen, de geschiktheid van nieuwe rassen / hybriden voor mycorrhiza-omstandigheden in de bodem te detecteren. Op deze manier zullen er variëteiten/hybriden zijn die zich gemakkelijk aanpassen aan een groot aantal omstandigheden en technologieën, maar ook variëteiten/hybriden met een lagere acceptatie en hoge specificiteit voor smalle omstandigheden. Voor graslandecosystemen past de mycorrhizapatroonmethode perfect voor meerdere toepassingen: een beter begrip van de overleving van planten in diverse vegetatieassemblages gerelateerd aan schimmelondersteuning; de analyse van specifieke kolonisatiepatronen bij endemische en bedreigde soorten; het invasieve potentieel van exogene soorten; en de dominantie-codominantie fluctuaties als gevolg van de toepassing van verschillende inputs²¹. De patronen kunnen verder worden gebruikt door enthouders die de potentiële doses moeten berekenen op basis van actieve propagules en toegangspunten. Ook kunnen zeer specifieke biofertilizers worden ontwikkeld die geschikt entmateriaal bevatten voor planten die dezelfde genitors delen. In onderzoek vertegenwoordigen mycorrhizapatronen een zeer vergelijkende studie, zowel vanuit visueel als numeriek oogpunt. Er zijn meerdere databases 22,23,24 die mycorrhiza soorten presenteren en de structuren die ze kunnen ontwikkelen in de wortels van testerplanten, maar geen van hen presenteert tot op heden het volledige kolonisatiebeeld. Al deze vereisten en de behoefte aan meer realistische en toepassingsgerichte studies ondersteunen de integratie van de mycorrhizapatronenmethode in bodem-microbe-plantinteractiestudies.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb