Mycorrhizal kort som et værktøj til at udforske koloniseringsmønstre og svampestrategier i rødderne af Festuca rubra og Zea mays

Summary

Protokollen her beskriver metoderne til vurdering af de arbuskulære mycorrhizal koloniseringsmønstre og strategi i rødder for to arter: Zea mays og Festuca rubra. Brugen af MycoPatt-metoden tillader beregning af parametre, omdannelse af mykorrhizastrukturer til digitale data og kortlægning af deres reelle position i rødder.

Abstract

Arbuskulære mycorrhizal svampe er symbionter i planternes rødder. Deres rolle er at opretholde værtsudvikling og opretholde den ernæringsmæssige ligevægt i økosystemerne. Koloniseringsprocessen er afhængig af flere faktorer som jordøkologi, svampens og værtens genetiske mangfoldighed og agronomisk praksis. Deres synkroniserede virkning fører til udviklingen af et komplekst hyphalnetværk og fører til sekundær udvikling af vesikler og arbuscules i rodcellerne. Formålet med denne forskning var at analysere effektiviteten af mycorrhizal mønstre (MycoPatt) metode til positionering af svampestrukturer i rødderne af Festuca rubra og Zea mays. Et andet mål var at udforske svampekoloniseringsstrategien som afsløret af mycorrhizalkort over hver art. Erhvervelsen og samlingen af flere mikroskopiske billeder tillader mycorrhizal koloniseringsvurdering i både majs- og rødsvingelplanter for at give information om den realistiske position af de udviklede strukturer. De observerede mykorrhizale mønstre fremhæver den variable effektivitet af hver plante med hensyn til at udvikle forbindelser med jordsymbiotiske svampe forårsaget af anvendte behandlinger og vækststadium. Mycorrhizal detaljerede kort opnået gennem MycoPatt-metoden er nyttige til tidlig påvisning af planteeffektivitet i symbiotisk erhvervelse fra jorden.

Introduction

Arbuskulære mycorrhiza (AM) svampe er en kategori af jordbårne endofytter, der konstant er et område af interesse for forskere. Deres tilstedeværelse i de fleste planters rødder og deres involvering i næringsstofcyklusser gør dem til vitale komponenter i stabiliteten af ethvert økosystem, hvor urteagtige planter er til stede ^1,2. Gennem deres ekstra-radikulære mycelium fungerer AM som en svampeforlængelse for planterødder, især i svært tilgængelige områder³. Hovedaktiviteten er i værtsplanterødder, hvor AM udvikler store hyfernetværk og specifikke intracellulære strukturer kaldet arbuscules. Manglen på værtsspecificitet gør det muligt for symbionten at kolonisere flere arter på samme tid. Denne evne giver AM rollen som ressourceallokering og næringsstofregulering i økosystemet; svampen giver også støtte til planteoverlevelse og hjælper med plantens ydeevne 4,5,6,7. AM-arters reaktion på værtsrødder er synlig i forlængelsen og placeringen af det intraradikulære mycelium og tilstedeværelsen og formen af arbuscules udviklet intracellulært. De intracellulære arbuscules fungerer som et udvekslingspunkt mellem de to symbionter og repræsenterer områder præget af hurtige overførselsprocesser. De strukturer, som AM producerer, er artsafhængige, og ud over arbuscules i rødderne udvikler de også vesikler, sporer og hjælpeceller.

Der er mange udfordringer i vurderingen af AM-symbionter i planterødder ^8,9. Den første er deres konstante udvikling i hele vegetationsperioden for værter, hvilket fører til flere ændringer i hyphal arbuskulær struktur. De forskellige stadier af arbuskulær vækst, op til deres sammenbrud, er tydeligt til stede i rødder, men de senescent AM-strukturer fordøjes undertiden, hvilket gør dem kun delvist synlige¹⁰. Den anden udfordring er repræsenteret af farvningsmetoden og protokollen, den store mangfoldighed af rodsystemer, dimensionen af deres celler og forskellene i tykkelse, hvilket gør det svært at foreslå en samlet metode. Den sidste udfordring er repræsenteret ved vurdering og scoring af AM-kolonisering. Der er mange metoder, der scorer AM med forskellige grader af objektivitet, og de fleste af dem er stadig begrænset til mikroskopiteknikker. De enkle er baseret på tilstedeværelsen / fraværet af strukturer i rodbarken, mens de mere komplekse er baseret på visuel scoring og brugen af koloniseringsklasser med integration af hyppigheden og intensiteten af koloniseringsfænomenet. Der er produceret mange data i de sidste årtier om mycorrhizal status for flere arter, men de fleste af metoderne er begrænset til den observerede værdi af kolonisering uden at pege på den reelle position af hver struktur i rodbarken. Som et svar på nødvendigheden af mere nøjagtige resultater om AM-kolonisering blev der udviklet en metode baseret på mikroskopisk analyse af mycorrhizale mønstre (MycoPatt) i rødder til at samle de detaljerede mycorrhizalkort i digital form¹¹. Metoden tillader også den objektive beregning af koloniseringsparametre og bestemmelsen af den faktiske position af hver struktur i roden.

Placeringen af AM-svampestrukturerne kan være vigtig for at besvare følgende to spørgsmål. Den første er relateret til analysen af koloniseringen i et bestemt øjeblik fra vegetationscyklussen af en plante. I denne sammenhæng er det meget nyttigt at observere den arbuskulære / vesikel overflod, rapportere, hvordan de er placeret i roden, og give et meget klart koloniseringsbillede og parametre. Den anden er relateret til påvisning af svampestrategi og dens orientering og endda prognosen for dens fremtidige udvikling. En anvendelse af MycoPatt kan være til planter, der analyseres dagligt, hver 2-3 dage, ugentligt eller under forskellige vækststadier. I denne sammenhæng er placeringen af vesikler / arbuscules vigtig for bedre at forstå den biologiske mekanisme for AM-kolonisering. Disse parametre og observationer er meget nyttige til at supplere de matematiske parametre.

Formålet med denne artikel er at demonstrere MycoPatt-systemets evne til at udforske det oprindelige AM-svampekoloniseringspotentiale og strategi i Zea mays (majs) rødder i forskellige udviklingsstadier og i Festuca rubra (rød svingel) rødder under forskellige langsigtede befrugtningsbetingelser. For at opfylde målet blev to store databaser fra to eksperimenter analyseret. Majseksperimentet blev etableret ved Cojocna (46°44′56" lat. N og 23°50′0" lang. E), i den eksperimentelle didaktiske gård ved University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj på et phaeoziom med en leragtig teksturjord¹². Rødsvingeleksperimentet er en del af et større forsøgssted, der blev etableret i 2001 i Ghețari, Apuseni-bjergene (46°49'064" lat. N og 22°81'418'' lang. E), på en preluvosol (terra rossa) jordtype^13,14. Majs blev samlet i fem forskellige vækstfænofaser¹²: B1 = 2-4 blade (som kontrolpunkt for starten af mycorrhizal kolonisering); B2 = 6 blade; B3 = 8-10 blade; B4 = kolbdannelse; B5 = fysiologisk modenhed. Fra 2-4 blade trin (A0) blev der anvendt en organisk behandling, hvilket resulterede i en to-gradueringsfaktor (A1 = kontrol og A2 = behandlet). Rødder af rødsvingel blev indsamlet ved blomstring fra et forsøg med fem langtidsbefrugtninger^13,14: V1 = kontrol^, ikke-befrugtet; V2 = 10 t·^ha-1 gødning; V3 = 10 t·ha-1 husdyrgødning + N 50 kg·ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha-1, K₂O 25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 husdyrgødning + N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1. Fem planter blev indsamlet i hvert udviklingsstadium fra hver befrugtningsvariant. Farvningsprotokollerne og deres ydeevne med hensyn til prøvebehandlingstid og farvningskvalitet blev analyseret. Forholdet mellem AM-hyferudvikling og tilstedeværelsen af dets strukturer i rødder blev analyseret separat for hver art og fortsatte med identifikationen af de mest tilladelige rødder til kolonisering. De specifikke koloniseringsmønstre for hvert rodsystem blev analyseret baseret på koloniseringskort og værdien af AM-parametre.

Majs er en årlig plante, hvilket indebærer kontinuerlig vækst af rødderne, og det var hovedårsagen til at anvende MycoPatt i vækststadierne. Rødsvingel er en flerårig plante fra et græsareal behandlet i lang tid med forskellige gødninger. Dens rødder har en kortere udvikling på 1 år, og anthesis betragtes som vegetationspunktet, når planten ændrer sit stofskifte fra vegetativ til generativ. For at fange disse planter i disse intense aktivitetsperioder blev ovennævnte tidspunkter valgt. Prøveudtagning i vegetationsperioden er vanskelig for denne art, når den dyrkes i naturlige græsarealer.

Protocol

1. Udvælgelse af biologisk materiale, rodprøvetagning og opbevaring

1. Saml hele roden af planter med en skovl (figur 1A) separat for hver variant og repliker. Fjern forsigtigt de store jordaggregater fra rødderne med hånden. Vask hele rodsystemet og mål det på en skala med 1 cm x 1 cm celler (figur 1B). Skær rødderne separat for hver plante, og læg dem i en plastikpose.
2. Saml alle de rene rødder fra hver plante i en plastikpose, og saml alle prøver fra en variant i en større pose. Skriv på hver pose scenen / variantnavnet og prøveudtagningsdatoen. Opbevar rødderne i køleskab eller fryser ved en temperatur mellem -4 °C og -20 °C indtil forarbejdning.

2. Rodbehandling, rydning og farvning til mikroskopi

BEMÆRK: Brug handsker, en maske og en mikrobiologisk / kemisk hætte til dette trin i protokollen.

1. Sørg for, at rodoptøningsprocessen udføres langsomt ved stuetemperatur. Til alle trin i behandlingen skal du bruge små krukker (30-50 ml) for at reducere mængden af nødvendige midler.
2. Udfør følgende fire trin i den langsomme rydnings- og farvningsprocedure¹⁵. Gør alle trin ved stuetemperatur. Denne metode tillader behandling af et stort antal prøver på samme tid uden brug af et vandbad til kogning.
   1. Rodrensning: Placer alle rødder fra en plante i en krukke. Forbered en 10% NaOH-opløsning med ledningsvand og hæld den i hver krukke, indtil den helt dækker rødderne. Ryst glassene kraftigt i 1 minut eller 2 minutter for at producere en homogen spredning af rydningsopløsning i rødderne. Gentag denne procedure efter 24 timer, og lad rødderne stå i rydningsopløsningen i mindst 48 timer.
      BEMÆRK: Rene rødder har et lysegult (op til hvidt) aspekt, og konsistensen er blød (de kan let knuses ved at trykke med en pincet).
   2. Rodskylning: Før indholdet af en krukke ad gangen gennem en sigte. Genbrug rydningsløsningen. Skyl rødderne flere gange i ledningsvand, indtil rydningsopløsningen er helt fjernet.
      BEMÆRK: Hvis rydningsopløsningen ikke fjernes helt, vil det påvirke kvaliteten af farvningsproceduren.
   3. Rodfarvning: Læg de skyllede rødder i en ren krukke. Forbered en 5%:5% blækeddikeopløsning med ledningsvand (5 ml blåt blæk + 5 ml 9% eddikesyre + 90 ml ledningsvand). Hæld opløsningen i hver krukke, indtil den helt dækker rødderne. Ryst krukkerne kraftigt i 1 minut eller 2 minutter for at producere en homogen spredning af farvningsopløsning i rødderne. Gentag denne procedure efter 24 timer og lad rødderne i denne opløsning stå i 48 timer.
      BEMÆRK: Farvede rødder har en intens blå farve.
   4. Roddelvis affarvning: Skyl de farvede rødder i ledningsvand i 1-2 min. Ryst glassene kraftigt for at fjerne den ekstra farvningsopløsning. Gentag proceduren, hvis farvningen er for intens og ikke tillader en klar mikroskopisk evaluering.
      BEMÆRK: Farvede rødder kan opbevares i ledningsvand i op til 1 uge ved stuetemperatur uden at ændre farvningskvaliteten (figur 2). I længere perioder kan rødder opretholdes i op til 2-3 måneder i en 5% kommerciel æbleeddikeopløsning (5% eddikesyre).

3. Rodbehandling til mikroskopi

1. Rodsegmentering: Anbring de farvede rødder fra hver prøve på et skaleret skærebræt (figur 3A). Skær rødderne i 1 cm segmenter (figur 3B). Vælg 15 segmenter for hver variant.
2. Skånsom knusningsmetode til segmentforberedelse: Spred rødderne på et dias. Brug en lamineringspose til at dække rødderne og knus dem forsigtigt startende fra en kant (figur 3C, D). Brug et blødt plastværktøj, f.eks. pincet, skalpelhåndtag, pen eller en blyant med et viskelæder, til langsomt at vise rødderne på diaset. Fjern forsigtigt lamineringsposen, og dæk prøven med en dæksel (figur 3E).
   BEMÆRK: Rødder har en rørformet form, så det er nødvendigt at adskille dem i et todimensionelt plan. Denne handling forudsætter adskillelse af rødder på midtpunktet, hvilket fører til visning af de to dele af den indre diameter. Brugen af lamineringsposer i den blide knusningsprocedure tillader visning af rødderne, som har en cylinderform, i to stykker - en til venstre og en til højre - mod deres midtpunkt. På denne måde analyseres hele roden dybtgående, og koloniseringsgraden er den parameter, der viser den volumetriske kolonisering (beskrevet i det oprindelige arbejde på MycoPatt¹¹). Dybest set skærer vi en cylinder i halvdelen, og derefter genopbygger vi den matematisk.
3. Tilsæt vand til et hjørne af rutsjebanen med en pipette, og lad vandet langsomt sprede sig på rutsjebanen (figur 3F). Fjern det ekstra vand med et papirhåndklæde.

4. Mikroskopisk analyse af rodprøverne

1. Brug et mikroskop udstyret med et kamera med god opløsning.
2. Analyser diasene startende fra en ekstremitet. Fang hvert mikroskopisk felt. Omdøb hvert billede, der er taget med en kode, der tillader den rigtige eftermontering af roddele. For tykke rødder skal du bruge 10x eller 40x forstørrelse, og for tynde rødder skal du bruge 40x forstørrelse. Brug det samme mål og forstørrelse for hele sættet af rødder fra en art.

5. Samling af billeder efter mikroskopi

1. Brug præsentationssoftware til at designe et tegnebræt til billedsamling. Indstil bredden 2-3 cm bredere end billedbredden. Tilføj alle optagne billeder fra et segment i rækkefølgen af deres optagelse, og rekonstruer hele længden af rodsegmentet (figur 4A).
   1. Kort sagt skal du indsamle i alt 15 billeder for hvert 1 cm segment og organisere dem lodret, startende med 1 til 15, i præsentationssoftwaren for at rekonstruere segmentet.
2. Juster billederne i midten. Brug den lodrette justering til at sikre, at hvert billede følger det forrige. På alle billeder skal du placere et gitter med 10 celler x 150 celler for at dække hele rodsegmentet.
   1. Derudover skal du placere et 10 x 10-gitter på hvert enkelt billede og indsætte et tal fra et til seks i hver celle i dette gitter, hvis en AM-struktur er synlig, eller lade være tom, hvis der ikke er nogen AM-struktur. På denne måde er nøjagtigheden af processen maksimal uden fejl i placeringen af AM-strukturerne, der observeres.
3. Tilføj en tabel for et gitter med 10 celler i bredden og 150 celler i længden (15 kvadrater med 10 celler x 10 celler). Skift tabellens breddedimensioner til billedernes bredde. Ændre tabellens længde til at omfatte alle billederne (figur 4B).

6. Scoring af mycorrhizal kolonisering

1. Brug det unikke tal til at score hver type struktur som beskrevet i mycorrhizal mønstre metode¹¹: 1 for hyfer; 2 for arbuscules; 3 for vesikler; 4 for sporer; 5 for hjælpeceller; og 6 for indgangspunkter (figur 4C). Scor hver observeret mycorrhizal struktur fra hver celle i de tidligere anvendte gitre (figur 4D).

7. Rådataanalyse og resultatudtræk

1. Indsæt alle de opnåede scorer i MycoPatt-regnearket¹¹. Brug copy/paste-funktionen til at overføre alle scores fra præsentationen til det første ark, der hedder rawdata (figur 5).
2. Primær analyse af resultater: Brug det tredje ark med navngivne parametre i MycoPatt-regnearksværktøjet til at visualisere resultaterne som procenter (%) separat i tre former (figur 6A-C). Brug kolonne A til K til at analysere det vandrette billede af kolonisering; kolonner M til W for at analysere det lodrette billede af kolonisering; og kolonner Y til AI for at analysere den tværgående (gennemsnitlige) kolonisering for hver af de 15 10 x 10 kvadrater (linjer 2-17) og den endelige gennemsnitlige kolonisering (linje 19-20).
   BEMÆRK: Den tværgående gennemsnitlige kolonisering bruges til beregning af de reelle koloniseringsparametre, relateret til både vandret og lodret analyse. På denne måde kan der ikke begås fejl i forhold til, hvis kun den vandrette eller lodrette analyse anvendes (beskrevet detaljeret i det originale værk¹¹). Også dette sæt parametre beregnes for hele overfladen af det mikroskopiske felt.
   1. Brug definitionerne og formlerne, der er specifikke for hver parameter, til at analysere resultaterne¹¹. Brug følgende koloniseringsparametre: koloniseringshyppighed (%), koloniseringsintensitet (%), arbuscules (%) og vesikler (%), sporer (%) og hjælpeceller (%), indgangspunkter (%), procentdelen af ikke-mycorrhizale områder (%), samlet koloniseringsgrad (%) og rapporten om mycorrhizal / ikke-mycorrhizal områder.
      BEMÆRK: Hvis arbuscules, vesikler, sporer, hjælpeceller og indgangspunkter mangler i analyserede prøver, scorer MycoPatt-regnearket dem som nul (0).
3. Produktion og ekstraktion af mycorrhizal kort: Visualiser billedet opnået ved omdannelsen af mycorrhizal strukturer kode til farver i det andet ark i MycoPatt navngivne grafer (figur 7A). Eksporter det resulterende billede i grafarket som et billede (figur 7B). Brug farvekoden i forklaringen til analyse af mycorrhizal mønstre.
4. Mycorrhizal kortanalyse: Identificer de vigtigste strukturer og deres samling på mycorrhizal kort. Beskriv det mycorrhizal koloniseringsmønster, der observeres i de analyserede rødder. Beskriv mycorrhizal koloniseringsstrategien baseret på observeret strukturel udvikling i roden, forgreningsmønsteret og arbuscule / vesikeludvikling.

Representative Results

Den korrekte brug af røddernes blide knusningsmetode efter farvningsprocedurerne giver gode detaljer om mycorrhizale strukturer, både for Zea mays (figur 8A-C) og Festuca rubra (figur 9A-E), god kontrast mellem mycorrhizal strukturer og rodceller og en bekræftelse af stelen på grund af den blå farve. Hvis rydnings- og farvningsprocedurerne ikke lykkes, er rodprøver svære at knuse og viser ikke tydeligt mykorrhizastrukturer (figur 10A-E). I dette tilfælde gentages hele rydningsfarvningsproceduren.

Anvendelsen af mycorrhizal mønstermetoden og MycoPatt-værktøjet tillod en fuldstændig udforskning af koloniseringsmekanismen. Metoden giver en dyb, lille udforskning af koloniseringsmønstre og strategier for hver art (figur 11 og figur 12) med et yderligere visuelt udtryk for koloniseringsparametre (tabel 1 og tabel 2). De to undersøgelser udført på Zea mays, beskrevet udførligt af Pop-Moldovan et ^al.12, og Festuca rubra, detaljeret af Corcoz et al. ^13,14, leverede en stor database med observationer, mykorrhizakort og koloniseringsparametre. Begge databaser scorede hyppigheden af kolonisering (%), koloniseringsintensitet (%), arbuscules (%) og vesikler (%), procentdelen af ikke-mycorrhizale områder (%), samlet koloniseringsgrad (%) og rapporten om mycorrhizal / ikke-mycorrhizal områder som koloniseringsparametre. For Zea mays bestod databasen af 5.850 linjeposter i regnearksdatabasen, samlet i 390 koloniseringskort. Zea mays-eksperimentet foreslog rapporten om mycorrhizal / ikke-mycorrhizal områder som en parameter til beskrivelsen af veksling og forstyrrelse mellem koloniserede områder i rødderne. Fremgangsmåden tillader en grundig analyse af koloniseringsmekanismen og dens udvikling langs rødderne. Festuca rubra leverede en database med 4.500 linjeposter i regnearket, samlet i 300 kort. Et nyt indeks blev foreslået, arbuscules / vesikler-rapporten, som yderligere blev brugt som en indikator for koloniseringsstrategi. Den samlede vurdering af koloniseringsstrategien foreslog fire forskellige scenarier for mycorrhizal udvikling: 1) propagativ strategi, 2) overførselsstrategi, 3) opbevaringsstrategi og 4) plantebestandighedsstrategi. Til udvinding af de mest repræsentative mycorrhizalkort blev begge databaser udforsket baseret på transformerede gennemsnitsværdier for koloniseringens frekvens og intensitet, hvilket resulterede i udtrækning af tre forskellige kort for hver analyseret variant (tabel 1 og tabel 2). De tre kort repræsenterer AM-koloniseringen fra de rodsegmenter, der har de nærmeste værdier til følgende: gennemsnittet (Av) for hver variant, som beregnes ud fra alle tilgængelige data for en variant; Av−, som repræsenterer en værdi beregnet ved forskellen mellem gennemsnit og gennemsnit/2 (Av−Av/2) og viser et lavere normalt koloniseringspotentiale; og Av+, som repræsenterer en værdi beregnet af summen mellem gennemsnit og gennemsnit/2 (Av+Av/2) og viser et højere normalt koloniseringspotentiale. Brugen af denne ekstraktionsformel tillader brugeren at undgå ekstremerne (højeste eller laveste) af koloniseringen. Metoden tillader udvinding af de mest mulige tilfælde af mycorrhizal kolonisering.

Zea mays præsenterede meget svingende koloniseringspotentiale, som afhang af plantens udviklingsstadium (tabel 1, figur 11). Værdierne for koloniseringsfrekvensen varierede meget mellem 3,67% -69,60%, understøttet af værdier ved 50% for koloniseringens intensitet. Hovedårsagen til dette fænomen er, at rodsystemet løbende udvikler sig i hele vegetationsperioden. Arbuscules præsenterede maksimale værdier i udviklingsfasen 6 blade (B2) med et fald i de følgende vækstfaser. Vesikler optrådte sporadisk, med værdier lavere end 1%. Udforskningen af mycorrhizal mønstre afslørede, at hyfer blev udviklet i forskellige områder af rødderne med begrænset udvidelse. Store diskontinuiteter mellem koloniserede områder blev observeret med en uregelmæssig udvikling af hyfer omkring det centrale koloniseringspunkt. Koloniseringsstrategien viste store variationer i intervallet af plantemodstanden mod de proliferative og overførselsstrategier. Scenen med 6 blade (B2), efterfulgt af stadiet af kolbedannelse (B4), udviste en overførselsstrategi for kolonisering, opretholdt af de mycorrhiserede / ikke-mycorrhiserede områderapporter, der var lavere end 0,14. Det eneste tilfælde med en synlig høj overførselsstrategi blev registreret i B2-fasen, da store områder af rødder præsenterede arbuscules. Deres overordnede placering viste en klar adskillelse mellem det område, hvor arbuscules blev udviklet, og det område, hvor arbuscules var i en fremvoksende fase. Det mest homogene gennemsnitlige koloniseringsmønster blev observeret i B5-udviklingsstadiet med konstante ikke-koloniserede områder mellem de koloniserede. Den samlede vurdering af dette visuelle fænomen svarede til den endelige vegetationsperiode med små værdier af arbuscules, hvilket indikerede regressionen af disse strukturer.

Festuca rubra er en dominerende art i bjerggræsarealer med et flerårigt rodsystem. På grund af denne tilpasning finder de fleste koloniseringsprocesser sted inde i rødderne, og udviklingen af hyphalnetværk er korreleret med en lav udviklingshastighed af rødderne (tabel 2, figur 12). På grund af anvendelsen af gødning præsenterede koloniseringsparametrene store forskelle mellem varianter. Forskellene i koloniseringsfrekvensen var 65%, opretholdt af en forskel på 36% i de registrerede intensiteter. Hver variant viste et andet koloniseringsmønster, korreleret med den langsigtede anvendelse af behandlinger og ledsaget af variation mellem 0,09-0,96 i rapporten om mycorrhiserede / ikke-mykorrerede områder og 0-9,43 i arbuscules / vesikles-rapporten. Kontrolvarianten (V1) viste en gennemsnitlig lagringsorienteret strategi med et begrænset område, der begrænsede udviklingen af arbuscules til Av + koloniseringskortet. Det forenklede billede af koloniseringen (Av−) viste lineær såvel som lateral udvikling af hyferen, som var fuldstændig orienteret mod uregelmæssig kolonisering for de to øvre modeller (Av− og Av+). Anvendelsen af organiske behandlinger (V2) inducerede dobbelt, lineær og uregelmæssig hyphaludvikling i rødderne. Koloniseringsstrategien, der blev identificeret for den organiske behandling, viste en orientering mod en opbevaringsstrategi, der var forbundet med langsom frigivelse af gødning i jord og dens vedholdenhed fra den ene sæson til den næste. Av + -modellen præsenterede det højeste koloniseringspotentiale med en intens tilstedeværelse af vesikler. Rapporten om mycorrhiserede / ikke-mykorrhiserede områder præsenterede homogen kolonisering med sjældne diskontinuiteter mellem koloniserede områder. I modsætning hertil inducerede anvendelsen af mineralgødning (V4) regressionen af mycorrhizal kolonisering. De koloniserede områder præsenterede et uregelmæssigt mønster med store ukoloniserede diskontinuiteter mellem dem. Den observerede strategi var generelt orienteret mod en plantebestandighed med små områder, hvor enten en punktlig opbevarings- eller overførselsstrategi var synlig. Den sammenlignende analyse mellem lavmineralske organiske (V3) og højmineralske organiske (V5) behandlinger viste en kontinuerlig regression af kolonisering og skift i koloniseringsstrategi, tilpasset mellem de to modsatte behandlinger (V2 og V4). Alle de koloniserede områder udviklede sig uregelmæssigt omkring et centralt punkt med en homogen tilstedeværelse af ikke-koloniserede områder. Koloniseringsstrategien var orienteret mod en proliferativ overførsel med tilstedeværelsen af vesikler i begrænsede områder. De største ikke-koloniserede diskontinuiteter blev identificeret i varianten med en højere mængde mineralgødning (V5).

Figur 1: Rodprøvetagningsprocedurer . (A) Ekstraktion af prøver med jord for at beskytte røddernes integritet. (B) Målinger af rodsystemet efter den første rydningsprocedure. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Farvede rødder opretholdt i en krukke med ledningsvand indtil forarbejdning. Rødder opretholder deres farve i op til 1 uge ved stuetemperatur. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Rodbehandling . (A) Opbevar alle rødderne fra en prøve i vand i en petriskål. (B) Skær rødderne i segmenter på 1 cm længde. (C-D) Tryk forsigtigt på lamineringsposen for at knuse rødderne og langsomt vise dem på et dias. (E-F) Dæk rodsegmenterne med en dækslip og tilsæt en dråbe ledningsvand i det ene hjørne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Billedbehandling. (A) Tilføj alle de billeder, der er taget fra et eksempel i en præsentation. Juster alle billederne for at rekonstruere den mikroskopiske visning af hver rod. (B) Tilføj en tabel for at forberede gitteret med en bredde på 10 celler x 10 celler længde for hvert billede. Indstil de indre grænser til ingen. Den indre grænse vil stadig være synlig, men deres gennemsigtighed vil ikke forstyrre mykorrhizaanalysen. (C-D) Brug legenden om MycoPatt til at score hver struktur, der er synlig på billedet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Indsættelse af data i MycoPatt. Kopier hele databasen med observationer fra præsentationen til MycoPatt. Indsæt det som tal. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Rådataudtræk og primær dataanalyse. (A) Koloniseringsvurdering for alle 10 vandrette celler fra en række. (B) Koloniseringsvurdering for alle 10 celler fra en kolonne (lodret) i hver af de 10 celler x 10 cellekvadrater fra MycoPatt. (C) Tværgående koloniseringsvurdering og beregning af gennemsnitlige koloniseringsparametre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Ekstraktion af mykorrhizale mønstre kort. (A) For hele datasættet er et stort kort over 10 celler x 150 celler tilgængeligt i grafarket i MycoPatt. (B) Udtræk koloniseringskortet som et billede. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8: Mikroskopiske billeder af AMF-strukturer i forarbejdede rødder af Zea-mays. (A) Hyphal netværk intercellulær og intracellulær udvikling af arbuscules. (B) Tæt hyphal netværk med talrige arbuscules, der udvikler sig intracellulært. (C) Serie af vesikler af forskellige dimensioner. Forkortelser: H = hyfer; A = arbuscules; V = vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 9: Mikroskopiske billeder af AMF-strukturer i forarbejdede rødder af Festuca rubra. (A) Flere hyphal-netværk med vesikler og arbuscules udviklet i separate områder. (B) Detaljer om et oprullet hyphal-netværk. (C) Detalje af et indgangspunkt og to oprullede hyfer. (D) Detalje af en vesikel for enden af en oprullet hyfa. (E) Detalje af en intracellulær arbuscule, detaljer af en oprullet hypha og tilstedeværelsen af en vesikel i slutningen af en hypha. Forkortelser: H = hyfer; A = arbuscules; V = vesikler; Ep = indgangspunkter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 10: Uklare mikroskopiske billeder af AMF-strukturer i rødder af Festuca rubra (AC) og Zea mays (D-E) i ufuldstændige ryddede og farvede rødder. (A) Uklar farvet rod med et lavt antal hyfer synlige og den oprindelige farve af rødder synlig. (B) Hyphae af blå og intens blå farvegradient med uklar skelnen mellem rodcellerne og hyfer. (C) Klart farvet hyphalnetværk i den øverste del af billedet og ufuldstændige farvede hyfer i den nederste del af billedet. (D) Intens farvet rod og hyfer, hvilket gør det umuligt at identificere AM-strukturer. (E) Detalje af en intens farvet rod med artefakter til stede i cellerne, hvilket gør identifikation af AM-strukturer umulig. Forkortelser: H = hyfer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 11: Mycorrhizal koloniseringsmønstre (Av, Av− og Av+) i rødder af behandlede Zea-mays. Forkortelser: A0 = behandlingstidspunkt; A1 = kontrolvariant (ingen behandling)/A2 = behandlet variant B1 = 2-4 blade (som kontrolpunkt for starten af mycorrhizal kolonisering); B2 = 6 blade; B3 = 8-10 blade; B4 = kolbdannelse; B5 = fysiologisk modenhed. Variantkombinationer er A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; og A1B5/A2-B5. Den fulde beskrivelse af behandlinger findes i Pop-Moldovan et ^al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 12: Mycorrhizal koloniseringsmønstre (Av, Av− og Av+) i rødder af langtidsbehandlede Festuca rubra. Forkortelser: V1 = kontrol, ikke-befrugtet; V2 = 10 t·^ha-1 gødning; V3 = 10 t·ha−1 husdyrgødning + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha−1, K₂O 25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1, K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 husdyrgødning + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1, K₂O 50 kg·ha⁻¹. Den fulde beskrivelse af behandlinger findes i tidligere arbejde^13,14. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Værdier af mycorrhizal koloniseringsparametre i rødder af Zea mays baseret på udviklingsstadium. Forklaring: A0 = behandlingstidspunkt; A1 = kontrolvariant (ingen behandling)/A2 = behandlet variant B1 = 2-4 blade (som kontrolpunkt for starten af mycorrhizal kolonisering); B2 = 6 blade; B3 = 8-10 blade; B4 = kolbdannelse; B5 = fysiologisk modenhed. Variantkombinationer er A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; og A1B5/A2-B5. Den fulde beskrivelse af behandlinger findes i Pop-Moldovan et ^al.12. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Værdier af mycorrhizal koloniseringsparametre i rødder af Festuca rubra baseret på påført befrugtning. Forklaring: V1 = kontrol, ikke-befrugtet; V2 = 10 t·^ha-1 gødning; V3 = 10 t·ha−1 husdyrgødning + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha−1, K₂O 25 kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 husdyrgødning + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹. Den fulde beskrivelse af behandlinger findes i tidligere arbejde^13,14. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Detaljerede protokoltrin fra feltprøvetagning af rødder til rådataanalyse og mycorrhizal kortudtrækning. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Undersøgelser af mycorrhizal kolonisering er afgørende for ny strategiudvikling på det agronomiske område. Potentialet for flere dyrkede planter til at danne en symbiotisk tilknytning til arbuskulære mycorrhizas gjorde dem til en vigtig komponent i agroøkosystemets bæredygtige udvikling og opretholdelsen af dets sundhed 16,17,18,19,20. Der er således behov for en bedre forståelse af koloniseringsmekanismen og svampestrategierne, som giver væsentlige data om, hvordan en plante kan forbinde med ernæringsmæssige netværk fra jorden, dens udbytte og dens overlevelsespotentiale. Derfor er dette i smart landbrugssammenhæng et must-have i dette århundrede, det er vigtigt at foretage en dybdegående vurdering af kolonisering, og undersøgelser skal give et realistisk billede af svampepositionen i rødderne.

Rodmycorrhizal mønstre-metoden giver en så dyb scanning af rødderne, men den kommer med både begrænsninger og fordele¹¹. De præsenterede begrænsninger er det store antal prøver, der skal scores, når en plante analyseres for første gang, nødvendigheden af billedmanipulation og den manuelle tildeling af mycorrhizale strukturer i rødder, men alle disse kan overvindes af flere langsigtede fordele. Den store database, der er resultatet af anvendelsen af denne metode og integrationen af mikroskopi med MycoPatt-værktøjet, giver stabilitet, statistisk sikkerhed for resultater og flerhed med hensyn til sammenligning af resultater. Mycorrhizal mønsteridentifikation for rødderne af en bestemt plante vil lette efterfølgende undersøgelser med hensyn til sammenligning. Det forbedrer også identifikationen af nye mønstre, som kan give information om udviklingen af koloniseringsmekanismer og svampestrategi. Beregningen af gennemsnitlige koloniseringsparametre baseret på vandret og vertikal udvikling tillader erhvervelse af mere realistiske og komplekse værdier sammenlignet med de visuelle estimeringsmetoder, som gitterskæringspunkt, rodsegmentestimering og forstørret skæringspunkt ^9,11. Samlet set tillader mycorrhizal mønstermetoden vurdering af svampefremspring og forgrening i rødder og identifikation af nye punkter for ekstern kolonisering og udvidelse af hyfer langs rødderne. Det tillader positionering af arbuscules og vesikler og tildeler dem en realistisk position og dimension i det globale mønster.

Den korrekte anvendelse af MycoPatt-metoden afhænger af en vellykket gennemførelse af hvert trin i protokollen (tabel 3). For højere effektivitet er hele metodens flow designet til at blive udført af en eller flere personer med forskellige træningsniveauer. På denne måde ekstraheres flere resultater fra hvert trin, og kontinuerlig analyse er mulig. Til udvælgelse af biologisk materiale, rodprøvetagning og opbevaringstrin er det nødvendigt, at en højtuddannet person korrekt identificerer arten, uanset dens vækststadium. Når arten er identificeret, kan rodprøvetagningen udføres af enhver person med minimal træning til skånsom fjernelse af jordpartikler. Det andet trin, rodbehandling, rydning og farvning til mikroskopi, kræver uddannede personer; Processen har flere verifikationstrin, og hvert trin er nødvendigt for procedurens succes. Flere prøver kan behandles på samme tid i de første to trin. Rodbehandling til mikroskopi (trin 3) og mikroskopisk analyse af rodprøver (trin 4) er meget vigtige på grund af den store opmærksomhed, der kræves for at skære segmenterne i 1 cm stykker kombineret med deres blide knusning til diasforberedelse. Mikroskopi har brug for opmærksomhed til kalibrering af lys og softwaren til at opnå billeder af høj kvalitet. Begge trin kræver højtuddannede personer eller mellemuddannede personer under tilsyn af en ekspert. Postmikroskopi billedsamling kræver højtuddannet personale til korrekt overlapning og rækkefølge af billeder for at rekonstruere segmentet. Scoring af mycorrhizal kolonisering er et trin, der kræver en specialist i AM-svampe for at identificere deres strukturer og koloniseringsydelse samt at tildele scoringer for hver struktur på gitterbilleder. Det sidste trin, rådataanalyse og resultatudtræk kræver en højtuddannet dataanalytiker, der udarbejder databaserne og styrer statistikken bag datafiltrering og udtræk af de mest relevante kort. Dette trin kan kombineres med mycorrhizal-specialistens arbejde for maksimal effektivitet af processen. Samlet set tillader hele strømmen involvering af flere specialister i en tværfaglig undersøgelse, hvilket fører til resultater af høj kvalitet.

Som enhver ny metode skal mycorrhizal mønstermetoden udvikle sig og forbedres. Der er nogle ændringer, der i fremtiden vil gøre denne metode lettere at bruge og give flere resultater. Hvis det gøres ved hjælp af den langsomme rydnings- og farvningsteknik, tillader denne metode manipulation af flere prøver ad gangen for at pause / genstarte analysen efter hvert trin i proceduren og få flere digitale databaser. En vigtig forbedring vil være brugen af performant scannere til hurtigere billedoptagelse og efter udviklingen af egnede og effektive værktøjer til mycorrhizal strukturgenkendelse, automatiseringen af denne proces. I forbindelse med teknikudvikling vil hurtig erhvervelse af mycorrhizal mønstre opretholde fremtidige undersøgelser på området.

Der er flere vanskeligheder ved brugen af automatisk software. 1) På grund af de forskellige positioner af AM-strukturer - hyfer og vesikler - uden for rodcellerne og arbuskulerne inde i rodcellerne, er det vanskeligt at kalibrere og træne software til at genkende dem i samme billede. 2) Til samling af billederne fra et segment vil softwaren ikke altid justere billederne for at genskabe segmentet, og det er muligt, at det kan placere dem tilfældigt, hvilket vil ændre processen. 3) Et andet problem er, at software ikke kan diskriminere, hvis nogle dele af to billeder er identiske, eller hvis nogle felter blev overlappet i mikroskopiprocedurerne. Således skal processen udføres manuelt af uddannede eksperter.

Samlet set blev 60 cm rod fra hver variant analyseret fra flere planter. Det nuværende manuskript er designet til at præsentere konceptet med at bruge MycoPatt-systemet og værktøjet, og resultaterne præsenterer funktionaliteten af denne metode. Sammenlignet med denne metode har gitterskæringsmetoden højere subjektivitet på grund af den tilfældige placering af farvede rødder. Vi mener, at det i fremtiden vil være nødvendigt at fastlægge antallet af segmenter, der skal anvendes, for hvert AM-anlæg. Dette er forskning, der skal udføres af alle forskere inden for mycorrhizas. En af de artikler, der sammenlignede flere metoder⁹ , præsenterede en lignende koloniseringshastighed på 50 op til 200 rodsegmenter / plante. Deres konklusioner sagde, at der er behov for en mere objektiv metode til at analysere hvert segment. Baseret på vores forskning reducerer MycoPatt subjektiviteten til 0. Hvert segment scannes og analyseres i dybden. Der kan også udvikles en billeddatabase for alle analyserede segmentresultater ved hjælp af denne metode. Dette kan også bruges til at genanalysere dataene, hvis det er nødvendigt.

Hele metoden giver resultater, der er nødvendige for flere forsknings- og kommercielle områder. Planteforædlere forsøger konstant at skabe mere resistente sorter og hybrider, der tilpasser sig specifikke jordforhold. I denne sammenhæng vil planteforædlingsprocesser drage fordel med hensyn til planteforbindelse til mycorrhizale netværk fra jorden fra de indledende udvælgelsesfaser. Mycorrhizal mønsteranalyse vil vise forskellene mellem hybrider med hensyn til mycorrhizal høst fra jord og akklimatisering til stedforhold. Forskere på avlsområdet kan bruge denne metode til at opdage, selv fra de tidlige stadier af udvælgelsesprocesserne, egnetheden af nye sorter / hybrider til jordmykorrhizaforhold. På denne måde vil der være sorter/hybrider, der let tilpasser sig et stort antal forhold og teknologier, men også sorter/hybrider med lavere accept og høj specificitet for snævre forhold. For græsarealøkosystemer passer mycorrhizal mønstermetoden perfekt til flere applikationer: en bedre forståelse af planteoverlevelse i forskellige vegetationssamlinger relateret til svampestøtte; analyse af specifikke koloniseringsmønstre i endemiske og truede arter eksogene arters invasive potentiale og udsvingene i dominans-kodominans som følge af anvendelsen af forskellige input²¹. Mønstrene kan yderligere bruges af podeproducenter, der har brug for at beregne de potentielle doser baseret på aktive propaguler og indgangspunkter. Der kan også udvikles meget specifikke biogødninger, der indeholder egnet podning til planter, der deler de samme kønsorganer. I forskning repræsenterer mycorrhizal mønstre en meget sammenlignende undersøgelse, både fra et visuelt og numerisk synspunkt. Der er flere databaser^22,23,24, der præsenterer mycorrhizal arter og de strukturer, de kan udvikle i rødderne af testerplanter^, men ingen af dem præsenterer til dato det fulde koloniseringsbillede. Alle disse krav og behovet for mere realistiske og anvendelige undersøgelser understøtter integrationen af mycorrhizal mønstre-metoden i jord-mikrobe-plante-interaktionsundersøgelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb