Mykorrhizakartor som ett verktyg för att utforska koloniseringsmönster och svampstrategier i rötterna till Festuca rubra och Zea mays

Summary

Protokollet beskriver här metoderna för bedömning av de arbuskulära mykorrhizakoloniseringsmönstren och strategin i rötter för två arter: Zea mays och Festuca rubra. Användningen av MycoPatt-metoden möjliggör beräkning av parametrar, omvandling av mykorrhizastrukturer till digitala data och kartläggning av deras verkliga position i rötter.

Abstract

Arbuskulära mykorrhizasvampar är symbionter i växternas rötter. Deras roll är att upprätthålla värdutveckling och upprätthålla näringsjämvikten i ekosystemen. Koloniseringsprocessen är beroende av flera faktorer som markekologi, svamparnas och värdens genetiska mångfald och agronomiska metoder. Deras synkroniserade verkan leder till utvecklingen av ett komplext hyphalnätverk och leder till sekundär utveckling av vesiklar och arbuscules i rotcellerna. Syftet med denna forskning var att analysera effektiviteten hos mykorrhizamönstren (MycoPatt) för positionering av svampstrukturer i rötterna till Festuca rubra och Zea mays. Ett annat mål var att utforska svampkoloniseringsstrategin som avslöjas av mykorrhizakartor över varje art. Förvärvet och monteringen av flera mikroskopiska bilder möjliggör mykorrhizal koloniseringsbedömning i både majs- och rödsvingelväxter för att ge information om den realistiska positionen för de utvecklade strukturerna. De observerade mykorrhizamönstren belyser den variabla effektiviteten hos varje växt när det gäller att utveckla förbindelser med jordsymbiotiska svampar, orsakade av applicerade behandlingar och tillväxtstadium. Mycorrhizal detaljerade kartor erhållna genom MycoPatt-metoden är användbara för tidig upptäckt av växteffektivitet vid symbiotisk förvärv från jorden.

Introduction

Arbuskulära mycorrhiza (AM) svampar är en kategori av jordburna endofyter som ständigt är ett intresseområde för forskare. Deras närvaro i rötterna hos de flesta växter och deras engagemang i näringscykler gör dem till viktiga komponenter i stabiliteten i varje ekosystem där örtartade växter finns ^1,2. Genom sitt extraradikulära mycelium fungerar AM som en svampförlängning för växtrötter, särskilt i svåråtkomliga områden³. Huvudaktiviteten är i värdväxtrötter, där AM utvecklar stora hyphae-nätverk och specifika intracellulära strukturer som kallas arbuscules. Bristen på värdspecificitet gör det möjligt för symbionten att kolonisera flera arter samtidigt. Denna förmåga ger AM rollen som resursallokering och näringsreglering i ekosystemet; Svampen ger också stöd i växtöverlevnad och hjälper till med växtprestanda 4,5,6,7. Reaktionen av AM-arter på värdrötter är synlig i förlängningen och placeringen av det intraradikulära myceliet och närvaron och formen av arbuskulerna utvecklas intracellulärt. De intracellulära arbuskulerna fungerar som en utbytespunkt mellan de två symbionterna och representerar områden som kännetecknas av snabba överföringsprocesser. Strukturerna som AM producerar är artberoende, och förutom arbuscules, i rötterna, utvecklar de också vesiklar, sporer och hjälpceller.

Det finns många utmaningar i bedömningen av AM-symbionter i växtrötter ^8,9. Den första är deras ständiga utveckling under hela vegetationsperioden för värdar, vilket leder till flera förändringar i hyphal-arbuskulära strukturen. De olika stadierna av arbuskulär tillväxt, fram till deras kollaps, är tydligt närvarande i rötter, men de senescenta AM-strukturerna smälts ibland, vilket gör dem endast delvis synliga¹⁰. Den andra utmaningen representeras av färgningsmetoden och protokollet, den stora mångfalden av rotsystem, dimensionen av deras celler och skillnaderna i tjocklek, vilket gör det svårt att föreslå en enhetlig metod. Den sista utmaningen representeras av bedömningen och poängsättningen av AM-kolonisering. Det finns många metoder som poängsätter AM med olika grader av objektivitet, och de flesta av dem är fortfarande begränsade till mikroskopitekniker. De enkla är baserade på närvaron / frånvaron av strukturer i rotbarken, medan de mer komplexa är baserade på visuell poängsättning och användning av koloniseringsklasser, med integrationen av koloniseringsfenomenets frekvens och intensitet. Mycket data har producerats under de senaste decennierna om mykorrhizastatusen för flera arter, men de flesta metoderna är begränsade till det observerade värdet av kolonisering utan att peka på den verkliga positionen för varje struktur i rotbarken. Som ett svar på nödvändigheten av mer exakta resultat på AM-kolonisering utvecklades en metod baserad på mikroskopisk analys av mykorrhizamönster (MycoPatt) i rötter för att i digital form montera de detaljerade mykorrhizakartorna¹¹. Metoden möjliggör också den objektiva beräkningen av koloniseringsparametrar och bestämningen av den faktiska positionen för varje struktur i roten.

Positionen för AM-svampstrukturerna kan vara viktig för att svara på följande två frågor. Den första är relaterad till analysen av koloniseringen i ett specifikt ögonblick från en växts vegetationscykel. I detta sammanhang är det mycket användbart att observera arbuskulära / vesikelöverflödet, rapportera hur de ligger i roten och ge en mycket tydlig koloniseringsbild och parametrar. Den andra är relaterad till detektering av svampstrategi och dess orientering och till och med prognosen för dess framtida utveckling. En applikation av MycoPatt kan vara för växter som analyseras dagligen, var 2-3: e dag, varje vecka eller under olika tillväxtstadier. I detta sammanhang är placeringen av vesiklarna/arbuskulerna viktig för att bättre förstå den biologiska mekanismen för AM-kolonisering. Dessa parametrar och observationer är mycket användbara för att komplettera de matematiska parametrarna.

Syftet med denna artikel är att demonstrera MycoPatt-systemets förmåga att utforska den inhemska AM-svampens koloniseringspotential och strategi i Zea mays (majs) rötter under olika utvecklingsstadier och i Festuca rubra (röd svängning) rötter under olika långsiktiga befruktningsförhållanden. För att uppfylla syftet analyserades två stora databaser från två experiment. Majsexperimentet etablerades vid Cojocna (46°44′56" lat. N och 23°50′0" långt. E), i den experimentella didaktiska gården vid universitetet för jordbruksvetenskap och veterinärmedicin Cluj på ett phaeoziom med en lerig konsistensjord¹². Rödsvingelexperimentet är en del av en större experimentplats som etablerades 2001 i Ghețari, Apusenibergen (46°49'064" lat. N och 22°81'418'' lång. E), på en preluvosol (terra rossa) jordtyp^13,14. Majs samlades i fem olika tillväxtfenofaser¹²: B1 = 2-4 löv (som kontrollpunkt för början av mykorrhizakolonisering); B2 = 6 löv; B3 = 8-10 löv; B4 = cobbildning; B5 = fysiologisk mognad. Från och med 2-4 lövstadiet (A0) applicerades en organisk behandling, vilket resulterade i en tvågraderingsfaktor (A1 = kontroll och A2 = behandlad). Rötter av rödsvingel samlades vid blomningen från ett experiment med fem långsiktiga befruktningar^13,14: V1 = kontroll^, icke-befruktad; V2 = 10 t·^ha-1 gödsel; V3 = 10 t·ha-1 gödsel + N 50 kg·ha-1, P₂O₅ 25 kg·ha-1,_K2O 25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 gödsel + N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1. Fem växter samlades in i varje utvecklingssteg från varje befruktningsvariant. Färgningsprotokollen och deras prestanda när det gäller provbehandlingstid och färgkvalitet analyserades. Förhållandet mellan AM-hyphae-utveckling och närvaron av dess strukturer i rötter analyserades separat för varje art och fortsatte med identifieringen av de mest tillåtna rötterna för kolonisering. De specifika koloniseringsmönstren för varje rotsystem analyserades baserat på koloniseringskartor och värdet på AM-parametrar.

Majs är en årlig växt, vilket innebär kontinuerlig tillväxt av rötterna, och det var den främsta anledningen till att applicera MycoPatt i odlingsstadierna. Rödsvingel är en flerårig växt från en gräsmark som behandlats under lång tid med olika gödningsmedel. Dess rötter har en kortare utveckling på 1 år, och antesen betraktas som vegetationspunkten när växten ändrar sin ämnesomsättning från vegetativ till generativ. För att fånga dessa växter under dessa intensiva aktivitetsperioder valdes ovannämnda tidpunkter. Provtagning under vegetationsperioden är svår för denna art när den odlas i naturliga gräsmarker.

Protocol

1. Val av biologiskt material, rotprovtagning och lagring

1. Samla hela roten av växter med en spade (figur 1A) separat för varje variant och replikera. Ta försiktigt, för hand, bort de stora jordaggregaten från rötterna. Tvätta hela rotsystemet och mät det på en skala med 1 cm x 1 cm celler (figur 1B). Skär rötterna separat för varje växt och lägg dem i en plastpåse.
2. Samla alla rena rötter från varje växt i en plastpåse och samla alla prover från en variant i en större påse. Skriv på varje påse scenens/variantens namn och provtagningsdatum. Förvara rötterna i kyl eller frys vid en temperatur mellan −4 °C och −20 °C tills de bearbetas.

2. Rotbearbetning, rensning och färgning för mikroskopi

OBS: Använd handskar, en mask och en mikrobiologisk / kemisk huva för detta steg i protokollet.

1. Se till att rotupptiningsprocessen görs långsamt vid rumstemperatur. För alla bearbetningssteg, använd små burkar (30-50 ml) för att minska mängden nödvändiga medel.
2. Utför följande fyra steg i den långsamma rensnings- och färgningsproceduren¹⁵. Gör alla steg vid rumstemperatur. Denna metod möjliggör bearbetning av ett stort antal prover samtidigt utan användning av ett vattenbad för kokning.
   1. Rotröjning: Placera alla rötter från en växt i en burk. Förbered en 10% NaOH-lösning med kranvatten och häll den i varje burk tills den helt täcker rötterna. Skaka burkarna kraftigt i 1 min eller 2 min för att producera en homogen dispersion av clearinglösning i rötterna. Upprepa denna procedur efter 24 timmar och lämna rötterna i clearinglösningen i minst 48 timmar.
      OBS: Rena rötter har en ljusgul (upp till vit) aspekt, och konsistensen är mjuk (de kan lätt krossas genom att trycka med en pincett).
   2. Rotsköljning: För innehållet i en burk i taget genom en sil. Återvinn röjningslösningen. Skölj rötterna flera gånger i kranvatten tills röjningslösningen är helt borttagen.
      OBS: Om rensningslösningen inte är helt borttagen kommer det att påverka kvaliteten på färgningsproceduren.
   3. Rotfärgning: Placera de sköljda rötterna i en ren burk. Förbered en 5%:5% bläckvinägerlösning med kranvatten (5 ml blått bläck + 5 ml 9% ättiksyra + 90 ml kranvatten). Häll lösningen i varje burk tills den helt täcker rötterna. Skaka burkarna kraftigt i 1 min eller 2 min för att producera en homogen dispersion av färgningslösningen i rötterna. Upprepa denna procedur efter 24 timmar och lämna rötterna i denna lösning i 48 timmar.
      OBS: Färgade rötter har en intensiv blå färg.
   4. Rot partiell avfärgning: Skölj de färgade rötterna i kranvatten i 1-2 min. Skaka burkarna kraftigt för att ta bort den extra färgningslösningen. Upprepa proceduren om färgningen är för intensiv och inte tillåter en tydlig mikroskopisk utvärdering.
      OBS: Färgade rötter kan förvaras i kranvatten i upp till 1 vecka vid rumstemperatur utan att ändra färgningskvaliteten (figur 2). Under längre perioder kan rötter bibehållas i upp till 2-3 månader i en 5% kommersiell äppelvinägerlösning (5% ättiksyra).

3. Rotbehandling för mikroskopi

1. Rotsegmentering: Placera de färgade rötterna från varje prov på en skalad skärbräda (figur 3A). Skär rötterna i 1 cm segment (figur 3B). Välj 15 segment för varje variant.
2. Skonsam krossningsmetod för segmentberedning: Sprid rötterna på en bild. Använd en lamineringspåse för att täcka rötterna och krossa dem försiktigt från en kant (figur 3C,D). Använd ett mjukt plastverktyg, t.ex. pincett, skalpellhandtag, penna eller en penna med suddgummi, för att långsamt visa rötterna på bilden. Ta försiktigt bort lamineringspåsen och täck provet med en täckskiva (figur 3E).
   OBS: Rötter har en rörformig form, så det är nödvändigt att separera dem i ett tvådimensionellt plan. Denna åtgärd förutsätter separation av rötter på mittpunkten, vilket leder till visning av de två delarna av den inre diametern. Användningen av lamineringspåsar i det mjuka krossningsförfarandet möjliggör visning av rötterna, som har en cylinderform, i två delar-en till vänster och en till höger-mot deras mittpunkt. På detta sätt analyseras hela roten på djupet, och koloniseringsgraden är parametern som visar den volymetriska koloniseringen (beskrivs i det ursprungliga arbetet med MycoPatt¹¹). I grund och botten skär vi en cylinder i hälften, och efter det bygger vi om den matematiskt.
3. Tillsätt vatten i ett hörn av rutschkanan med en pipett och låt vattnet långsamt spridas på rutschkanan (figur 3F). Ta bort det extra vattnet med en pappershandduk.

4. Mikroskopisk analys av rotproverna

1. Använd ett mikroskop utrustat med en kamera med bra upplösning.
2. Analysera bilderna med början från en extremitet. Fånga varje mikroskopiskt fält. Byt namn på varje bild som tagits med en kod som tillåter den verkliga eftermonteringen av rotdelar. För tjocka rötter, använd 10x eller 40x förstoring, och för tunna rötter, använd 40x förstoring. Använd samma mål och förstoring för hela uppsättningen rötter från en art.

5. Bildmontering efter mikroskopi

1. Använd presentationsprogramvara för att designa ett ritbord för bildmontering. Ställ in bredden 2-3 cm bredare än bildbredden. Lägg till alla tagna bilder från ett segment i den ordning de fångas och rekonstruera hela rotsegmentets längd (figur 4A).
   1. I korthet samlar du totalt 15 bilder för varje 1 cm segment och organiserar dem vertikalt, börjar med 1 till 15, i presentationsprogramvaran för att rekonstruera segmentet.
2. Justera bilderna i mitten. Använd den lodräta justeringen för att säkerställa att varje bild följer den föregående. På alla bilder placerar du ett rutnät med 10 celler x 150 celler för att täcka hela rotsegmentet.
   1. Dessutom, på varje enskild bild, placera ett 10 x 10 rutnät, och i varje cell i detta rutnät, infoga ett nummer från ett till sex om en AM-struktur är synlig eller lämna tomt om ingen AM-struktur finns. På detta sätt är processens noggrannhet maximal utan att några fel i placeringen av AM-strukturerna observeras.
3. Lägg till en tabell för ett rutnät med 10 celler i bredd och 150 celler i längd (15 kvadrater med 10 celler x 10 celler). Ändra tabellbreddens dimensioner till bildernas bredd. Ändra längden på tabellen så att den omfattar alla bilder (bild 4B).

6. Poängsättning av mykorrhizakolonisering

1. Använd det unika numret för att poängsätta varje typ av struktur enligt beskrivningen i mykorrhizamönstermetoden¹¹: 1 för hyfer; 2 för arbuscules; 3 för vesiklar; 4 för sporer; 5 för hjälpceller; och 6 för ingångspunkter (figur 4C). Poängsätt varje observerad mykorrhizastruktur från varje cell i de tidigare applicerade rutnäten (figur 4D).

7. Rådataanalys och resultatutvinning

1. Infoga alla erhållna poäng i MycoPatt-kalkylbladet¹¹. Använd kopierings-/inklistringsfunktionen för att överföra alla poäng från presentationen till det första arket som heter rawdata (bild 5).
2. Primär analys av resultat: Använd det tredje arket med namnet parametrar i MycoPatt-kalkylbladsverktyget för att visualisera resultaten som procentsatser (%) separat i tre former (figur 6A-C). Använd kolumnerna A till K för att analysera den horisontella bilden av kolonisering; kolumner M till W för att analysera den vertikala bilden av kolonisering; och kolumnerna Y till AI för att analysera den tvärgående (genomsnittliga) koloniseringen för var och en av de 15 10 x 10 rutorna (linjerna 2-17) och den slutliga genomsnittliga koloniseringen (linjerna 19-20).
   OBS: Den tvärgående genomsnittliga koloniseringen används för beräkning av de verkliga koloniseringsparametrarna, relaterade till både horisontell och vertikal analys. På detta sätt kan inga fel göras jämfört med om endast den horisontella eller vertikala analysen används (beskrivs i detalj i originalverket¹¹). Även denna uppsättning parametrar beräknas för hela ytan av det mikroskopiska fältet.
   1. Använd definitionerna och formlerna, specifika för varje parameter, för att analysera resultaten¹¹. Använd följande koloniseringsparametrar: koloniseringsfrekvens (%), koloniseringsintensitet (%), arbuscules (%) och vesiklar (%), sporer (%) och hjälpceller (%), ingångspunkter (%), andelen icke-mykorrhizaområden (%), total koloniseringsgrad (%) och rapporten om mykorrhiza/ icke-mykorrhizaområden.
      OBS: Om arbuscules, vesiklar, sporer, hjälpceller och ingångspunkter saknas i analyserade prover, kommer MycoPatt-kalkylbladet att poängsätta dem som noll (0).
3. Produktion och extraktion av mykorrhizakartor: Visualisera bilden som erhållits från omvandlingen av mykorrhizastrukturkod till färger i det andra arket i MycoPatt-namngivna grafer (Figur 7A). Exportera den resulterande bilden i diagrambladet som en bild (bild 7B). Använd färgkoden i legenden för analys av mykorrhizamönster.
4. Mykorrhizakartanalys: Identifiera de viktigaste strukturerna och deras sammansättning på mykorrhizakartor. Beskriv det mykorrhizakoloniseringsmönster som observerats i de analyserade rötterna. Beskriva mykorrhizakoloniseringsstrategin baserat på observerad strukturell utveckling i roten, förgreningsmönstret och arbuscule / vesikelutveckling.

Representative Results

Korrekt användning av den mjuka krossningsmetoden för rötterna efter färgningsförfarandena ger goda detaljer om mykorrhizastrukturer, både för Zea mays (Figur 8A-C) och Festuca rubra (Figur 9A-E), god kontrast mellan mykorrhizastrukturer och rotceller och en bekräftelse av stelen på grund av den blå färgen. Om rensnings- och färgningsförfarandena inte lyckas är rotprover svåra att krossa och visar inte tydligt mykorrhizastrukturer (figur 10A-E). Upprepa i så fall hela rensningsfärgningsproceduren.

Användningen av mykorrhizamönstermetoden och MycoPatt-verktyget möjliggjorde en fullständig utforskning av koloniseringsmekanismen. Metoden ger en djup, småskalig utforskning av koloniseringsmönster och strategier för varje art (figur 11 och figur 12) med ett ytterligare visuellt uttryck för koloniseringsparametrar (tabell 1 och tabell 2). De två studierna utförda på Zea mays, beskrivs utförligt av Pop-Moldovan et ^al.12, och Festuca rubra, detaljerade av Corcoz et al. ^13,14, tillhandahöll en stor databas med observationer, mykorrhizakartor och koloniseringsparametrar. Båda databaserna poängsatte koloniseringsfrekvens (%), koloniseringsintensitet (%), arbuscules (%) och vesiklar (%), andelen icke-mykorrhizaområden (%), total koloniseringsgrad (%) och rapporten om mykorrhiza/ icke-mykorrhizaområden som koloniseringsparametrar. För Zea mays bestod databasen av 5 850 radposter i kalkylbladsdatabasen, sammanställda i 390 koloniseringskartor. Zea mays-experimentet föreslog rapporten om mykorrhiza/ icke-mykorrhizaområden som en parameter för beskrivningen av växling och störning mellan koloniserade områden i rötterna. Tillvägagångssättet möjliggör en djupgående analys av koloniseringsmekanismen och dess utveckling längs rötterna. Festuca rubra tillhandahöll en databas med 4 500 radposter i kalkylbladet, sammanställd i 300 kartor. Ett nytt index föreslogs, rapporten arbuscules/vesiklar, som vidare användes som en indikator på koloniseringsstrategin. Den övergripande bedömningen av koloniseringsstrategin föreslog fyra olika scenarier för mykorrhizautveckling: 1) förökningsstrategi, 2) överföringsstrategi, 3) lagringsstrategi och 4) växtresistensstrategi. För extraktion av de mest representativa mykorrhizakartorna utforskades båda databaserna baserat på transformerade medelvärden för koloniseringens frekvens och intensitet, vilket resulterade i extraktion av tre olika kartor för varje analyserad variant (tabell 1 och tabell 2). De tre kartorna representerar AM-koloniseringen från rotsegmenten som har de närmaste värdena till följande: genomsnittet (Av) för varje variant, som beräknas baserat på alla tillgängliga data för en variant; Av−, som representerar ett värde beräknat med skillnaden mellan medelvärde och medelvärde/2 (Av−Av/2) och visar en lägre normal koloniseringspotential; och Av+, som representerar ett värde beräknat med summan mellan medelvärde och medelvärde/2 (Av+Av/2) och visar en högre normal koloniseringspotential. Användningen av denna extraktionsformel tillåter användaren att undvika ytterligheterna (högsta eller lägsta) av koloniseringen. Metoden tillåter extraktion av de mest möjliga fallen av mykorrhizal kolonisering.

Zea mays presenterade mycket fluktuerande koloniseringspotential, vilket berodde på växtens utvecklingsstadium (tabell 1, figur 11). Värdena för koloniseringsfrekvensen varierade kraftigt mellan 3,67% -69,60%, med stöd av värden vid 50% för koloniseringens intensitet. Den främsta orsaken till detta fenomen är att rotsystemet kontinuerligt utvecklas under hela vegetationsperioden. Arbuscules presenterade maximala värden i utvecklingsstadiet med 6 löv (B2), med en minskning av följande tillväxtsteg. Vesiklar uppträdde sporadiskt, med värden lägre än 1%. Utforskningen av mykorrhizamönster avslöjade att hyfer utvecklades i olika delar av rötterna, med begränsad förlängning. Stora diskontinuiteter mellan koloniserade områden observerades, med en oregelbunden utveckling av hyfer runt den centrala koloniseringspunkten. Koloniseringsstrategin visade stora variationer i intervallet för växtresistensen mot de proliferativa och överföringsstrategierna. Steget med 6 blad (B2), följt av stadiet av cobbildning (B4), uppvisade en överföringsstrategi för kolonisering, som upprätthölls av de mykorrhiserade / icke-mykorrhiserade områdesrapporterna som var lägre än 0,14. Det enda fallet med en synlig hög överföringsstrategi registrerades i B2-scenen när stora områden av rötter presenterade arbuscules. Deras övergripande positionering visade en tydlig åtskillnad mellan området där arbuskuler utvecklades och området där arbuskuler befann sig i ett framväxande stadium. Det mest homogena genomsnittliga koloniseringsmönstret observerades i B5-utvecklingsstadiet, med konstanta icke-koloniserade områden mellan de koloniserade. Den övergripande bedömningen av detta visuella fenomen motsvarade den slutliga vegetationsperioden, med små värden av arbuscules, vilket indikerade regressionen av dessa strukturer.

Festuca rubra är en dominerande art i bergsgräsmarker med ett flerårigt rotsystem. På grund av denna anpassning sker de flesta koloniseringsprocesserna inuti rötterna, och utvecklingen av hyphalnätverk är korrelerad med en låg utvecklingshastighet hos rötterna (tabell 2, figur 12). På grund av appliceringen av gödselmedel presenterade koloniseringsparametrarna höga skillnader mellan varianter. Skillnaderna i koloniseringsfrekvensen var 65%, upprätthållna av en skillnad på 36% i de registrerade intensiteterna. Varje variant visade ett annat koloniseringsmönster, korrelerat med den långsiktiga tillämpningen av behandlingar och åtföljd av avariation mellan 0,09-0,96 i rapporten om mykorrhiserade / icke-mykorrhiserade områden och 0-9,43 i rapporten om arbuscules / vesiklar. Kontrollvarianten (V1) visade en genomsnittlig lagringsorienterad strategi, med ett begränsat område som begränsade utvecklingen av arbuscules för Av+ koloniseringskartan. Den förenklade bilden av koloniseringen (Av−) visade linjär såväl som lateral utveckling av hyferna, som var helt inriktad på oregelbunden kolonisering för de två övre modellerna (Av− och Av+). Tillämpningen av organiska behandlingar (V2) inducerade dubbel, linjär och oregelbunden hyphalutveckling i rötterna. Koloniseringsstrategin som identifierades för den organiska behandlingen visade en orientering mot en lagringsstrategi, förknippad med det långsamma utsläppet av gödsel i jorden och dess uthållighet från en säsong till en annan. Av + -modellen presenterade den högsta koloniseringspotentialen, med en intensiv närvaro av vesiklar. Rapporten om mykorrhiserade / icke-mykorrhiserade områden presenterade homogen kolonisering, med sällsynta diskontinuiteter mellan koloniserade områden. I motsats till detta inducerade appliceringen av mineralgödselmedel (V4) regressionen av mykorrhizal kolonisering. De koloniserade områdena uppvisade ett oregelbundet mönster, med stora okoloniserade diskontinuiteter mellan dem. Den observerade strategin var i allmänhet inriktad på en växtresistens, med små områden där antingen en punktlig lagrings- eller överföringsstrategi var synlig. Den jämförande analysen mellan lågmineraliska organiska (V3) och högmineraliska organiska (V5) behandlingar visade en kontinuerlig regression av kolonisering och förskjutningar i koloniseringsstrategin, anpassad mellan de två motsatta behandlingarna (V2 och V4). Alla koloniserade områden utvecklades oregelbundet runt en central punkt, med en homogen närvaro av icke-koloniserade områden. Koloniseringsstrategin var inriktad på en proliferativ överföring, med närvaro av vesiklar i begränsade områden. De största icke-koloniserade diskontinuiteterna identifierades i varianten med en högre mängd mineralgödsel (V5).

Figur 1: Rotprovtagningsförfaranden . (A) Extraktion av prover med jord för att skydda rötternas integritet. (B) Mätningar av rotsystemet efter det första röjningsförfarandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Färgade rötter som hålls i en burk med kranvatten tills de bearbetas. Rötter behåller sin färg i upp till 1 vecka vid rumstemperatur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Rotbearbetning . (A) Förvara alla rötter från ett prov i vatten i en petriskål. (B) Skär rötterna i segment med en längd på 1 cm. (C–D) Tryck försiktigt på lamineringspåsen för att krossa rötterna och visa dem långsamt på en bild. (E-F) Täck rotsegmenten med en täckglas och tillsätt en droppe kranvatten i ett hörn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bild 4: Bildbehandling . (A) Lägg till alla bilder som tagits från ett prov i en presentation. Justera alla bilder för att rekonstruera den mikroskopiska vyn av varje rot. (B) Lägg till en tabell för att förbereda rutnätet, med en bredd på 10 celler x 10 celler längd för varje bild. Ställ in de inre gränserna på ingen. Den inre gränsen kommer fortfarande att vara synlig, men deras transparens kommer inte att störa mykorrhizaanalysen. (C–D) Använd förklaringen om MycoPatt för att poängsätta varje struktur som visas på bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Införande av data i MycoPatt. Kopiera hela databasen med observationer från presentationen till MycoPatt. Klistra in det som siffror. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: Extrahering av rådata och primär dataanalys. (A) Koloniseringsbedömning för alla 10 horisontella celler från en rad. (B) Koloniseringsbedömning för alla 10 celler från en kolumn (vertikal) i var och en av de 10 cellerna x 10 celler kvadrater från MycoPatt. (C) Bedömning av tvärgående kolonisering och beräkning av genomsnittliga koloniseringsparametrar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7: Extraktion av kartor över mykorrhizamönster . (A) För hela datauppsättningen finns en stor karta med 10 celler x 150 celler tillgänglig i grafbladet i MycoPatt. (B) Extrahera koloniseringskartan som en bild. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8: Mikroskopiska bilder av AMF-strukturer i bearbetade rötter av Zea-mays. (A) Hyphal-nätverk intercellulär och intracellulär utveckling av arbuscules. (B) Tätt hyphalnätverk med många arbuscules som utvecklas intracellulärt. (C) Serier av vesiklar av olika dimensioner. Förkortningar: H = hyfer; A = arbuscules; V = vesiklar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9: Mikroskopiska bilder av AMF-strukturer i bearbetade rötter av Festuca rubra. (A) Flera hyphalnätverk med vesiklar och arbuskuler utvecklade i separata områden. (B) Detalj av ett lindat hyphalnät. C) Uppgift om en ingångspunkt och två lindade hyfer. (D) Detalj av en vesikel i slutet av en lindad hypha. (E) Detalj av en intracellulär arbuscule, detalj av en lindad hypha och närvaron av en vesikel i slutet av en hypha. Förkortningar: H = hyfer; A = arbuscules; V = vesiklar; Ep = ingångspunkter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 10: Oklara mikroskopiska bilder av AMF-strukturer i rötter av Festuca rubra (A-C) och Zea mays (D-E) i ofullständiga rensade och färgade rötter. (A) Oklar färgad rot med ett lågt antal hyfer synliga och rötternas ursprungliga färg synlig. (B) Hyfer av blå och intensiv blå färggradient med oklar åtskillnad mellan rotcellerna och hyfer. (C) Rensa färgat bindestreck i bildens övre del och ofullständiga färgade hyfer i bildens nedre del. (D) Intensivt färgad rot och hyfer, vilket gör det omöjligt att identifiera AM-strukturer. (E) Detalj av en intensiv färgad rot med artefakter som finns i cellerna, vilket gör det omöjligt att identifiera AM-strukturer. Förkortningar: H = hyfer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 11: Mykorrhizakoloniseringsmönster (Av, Av− och Av+) i rötter av behandlade Zea-mays. Förkortningar: A0 = behandlingsmoment; A1 = kontrollvariant (ingen behandling)/A2 = behandlad variant; B1 = 2-4 löv (som en kontrollpunkt för början av mykorrhizal kolonisering); B2 = 6 löv; B3 = 8-10 löv; B4 = cobbildning; B5 = fysiologisk mognad. Variantkombinationer är A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; och A1B5/A2-B5. Den fullständiga beskrivningen av behandlingar finns i Pop-Moldovan et ^al.12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 12: Mykorrhizakoloniseringsmönster (Av, Av− och Av+) i rötter av långtidsbehandlad Festuca rubra. Förkortningar: V1 = kontroll, icke-befruktad; V2 = 10 t·ha⁻¹ gödsel; V3 = 10 t·ha−1 gödsel + N 50 kg·^ha-1, P₂O₅ 25 kg·ha−1,_K2O25kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P2O5 50 kg·ha−1,_K2O50kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 gödsel + N 100 kg·^ha-1, P₂O₅ 50 kg·ha−1,_K2O50kg·ha⁻¹. Den fullständiga beskrivningen av behandlingar finns i tidigare arbete^13,14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Värden för mykorrhizakoloniseringsparametrar i rötter av Zea-mays baserat på utvecklingsstadium. Förklaring: A0 = ögonblick för behandlingsapplikation; A1 = kontrollvariant (ingen behandling)/A2 = behandlad variant; B1 = 2-4 löv (som en kontrollpunkt för början av mykorrhizal kolonisering); B2 = 6 löv; B3 = 8-10 löv; B4 = cobbildning; B5 = fysiologisk mognad. Variantkombinationer är A0-B1; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; och A1B5/A2-B5. Den fullständiga beskrivningen av behandlingar finns i Pop-Moldovan et ^al.12. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tabell 2: Värden för mykorrhizala koloniseringsparametrar i rötter av Festuca rubra baserat på tillämpad befruktning. Förklaring: V1 = kontroll, icke-befruktad; V2 = 10 t·ha⁻¹ gödsel; V3 = 10 t·ha−1 gödsel + N 50 kg·^ha-1, P₂O₅ 25 kg·ha−1,_K2O25kg·ha⁻¹; V4 = N 100 kg·ha−1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1 K₂O 50 kg·ha⁻¹; V5 = 10 t·ha−1 gödsel + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha−1K₂O 50 kg·ha⁻¹. Den fullständiga beskrivningen av behandlingar finns i tidigare arbete^13,14. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tabell 3: Detaljerade protokollsteg från fältprovtagning av rötter till rådataanalys och extraktion av mykorrhizakartor. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

Studier om mykorrhizakolonisering är avgörande för ny strategiutveckling inom det agronomiska området. Potentialen hos flera odlade växter att bilda en symbiotisk förening med arbuskulära mykorrhizas gjorde dem till en viktig komponent i agroekosystemets hållbara utveckling och upprätthållandet av dess hälsa 16,17,18,19,20. Således finns det ett behov av en bättre förståelse för koloniseringsmekanismen och svampstrategierna, som ger viktiga data om hur en växt kan ansluta till näringsnätverk från jorden, dess utbyte och dess överlevnadspotential. Därför är detta i det smarta jordbrukssammanhanget ett måste under detta århundrade, det är viktigt att göra en djupgående bedömning av koloniseringen, och studier måste ge en realistisk bild av svamppositionen i rötterna.

Rotmykorrhizamönstermetoden ger en så djup skanning av rötterna, men den har både begränsningar och fördelar¹¹. De begränsningar som presenteras är det stora antalet prover som måste poängsättas när en växt analyseras för första gången, nödvändigheten av bildmanipulation och manuell tilldelning av mykorrhizastrukturer i rötter, men alla dessa kan övervinnas av flera långsiktiga fördelar. Den stora databasen som härrör från tillämpningen av denna metod och integrationen av mikroskopi med MycoPatt-verktyget ger stabilitet, statistisk försäkran om resultat och flerårighet när det gäller resultatjämförelse. Mykorrhizamönsteridentifiering för rötterna till en specifik växt kommer att underlätta efterföljande studier när det gäller jämförelse. Det förbättrar också identifieringen av nya mönster, vilket kan ge information om utvecklingen av koloniseringsmekanismer och svampstrategi. Beräkningen av genomsnittliga koloniseringsparametrar baserade på horisontell och vertikal utveckling möjliggör förvärv av mer realistiska och komplexa värden jämfört med de visuella uppskattningsmetoderna, som rutnätskorsning, rotsegmentuppskattning och förstorad korsning ^9,11. Sammantaget tillåter mykorrhizamönstermetoden bedömning av svampframsteg och förgrening i rötter och identifiering av nya punkter för extern kolonisering och förlängning av hyfer längs rötterna. Det tillåter positionering av arbuscules och vesiklar och tilldelar dem en realistisk position och dimension i det globala mönstret.

Korrekt tillämpning av MycoPatt-metoden är beroende av att varje steg i protokollet har slutförts (tabell 3). För högre effektivitet är hela flödet av metoden utformat för att utföras av en eller flera personer med olika träningsnivåer. På detta sätt extraheras flera resultat från varje steg och kontinuerlig analys är möjlig. För val av biologiskt material, rotprovtagning och lagringssteget är det nödvändigt att en högutbildad person korrekt identifierar arten, oavsett dess tillväxtstadium. När arten har identifierats kan rotprovtagningen göras av vilken person som helst, med minimal träning för borttagning av mjuka jordpartiklar. Det andra steget, rotbearbetning, röjning och färgning för mikroskopi, kräver utbildade personer; Processen har flera verifieringssteg, och varje steg är nödvändigt för att proceduren ska lyckas. Flera prover kan bearbetas samtidigt i de två första stegen. Rotbearbetning för mikroskopi (steg 3) och mikroskopisk analys av rotprover (steg 4) är mycket viktiga på grund av den höga uppmärksamhet som krävs för att skära segmenten i 1 cm bitar i kombination med deras mjuka krossning för glidberedning. Mikroskopi behöver uppmärksamhet för kalibrering av ljus och programvaran för att få högkvalitativa bilder. Båda stegen kräver högutbildade personer eller medelutbildade under överinseende av en expert. Bildmontering efter mikroskopi kräver högutbildad personal för korrekt överlappning och ordning på bilder för att rekonstruera segmentet. Poängsättning av mykorrhizakolonisering är ett steg som kräver en specialist på AM-svampar för att identifiera deras strukturer och koloniseringsprestanda, samt att fördela poäng för varje struktur på rutnätade bilder. Det sista steget, rådataanalys och extrahering av resultat kräver en högutbildad dataanalytiker som sammanställer databaserna och hanterar statistiken bakom datafiltrering och extrahering av de mest relevanta kartorna. Detta steg kan kombineras med mykorrhizaspecialistens arbete för maximal effektivitet i processen. Sammantaget tillåter hela flödet involvering av flera specialister inom en tvärvetenskaplig studie, vilket leder till högkvalitativa resultat.

Liksom alla nya metoder måste mykorrhizamönstermetoden utvecklas och förbättras. Det finns några ändringar som i framtiden kommer att göra den här metoden enklare att använda och ge flera resultat. Om det görs med den långsamma rensnings- och färgningstekniken tillåter denna metod manipulering av flera prover åt gången för att pausa / starta om analysen efter varje steg i proceduren och få flera digitala databaser. En viktig förbättring kommer att vara användningen av högpresterande skannrar för snabbare bildförvärv och, efter utvecklingen av lämpliga och effektiva verktyg för mykorrhizastrukturigenkänning, automatiseringen av denna process. I samband med teknikutveckling kommer snabb förvärv av mykorrhizamönster att upprätthålla framtida studier inom området.

Det finns flera svårigheter vid användning av automatisk programvara. 1) På grund av de olika positionerna för AM-strukturer - hyfer och vesiklar - utanför rotcellerna och arbuskulerna inuti rotcellerna är det svårt att kalibrera och träna programvara för att känna igen dem i samma bild. 2) För montering av bilderna från ett segment kommer programvaran inte alltid att anpassa bilderna för att återskapa segmentet, och det är möjligt att det kan placera dem slumpmässigt, vilket kommer att förändra processen. 3) Ett annat problem är att programvara inte kan diskriminera om vissa delar av två bilder är identiska eller om vissa fält överlappades i mikroskopiprocedurerna. Således måste processen utföras manuellt av utbildade experter.

Sammantaget analyserades 60 cm rot från varje variant från flera växter. Det nuvarande manuskriptet är utformat för att presentera konceptet att använda MycoPatt-systemet och verktyget, och resultaten presenterar funktionaliteten hos denna metod. Jämfört med denna metod har rutnätskorsningsmetoden högre subjektivitet på grund av slumpmässig placering av färgade rötter. Vi tror att det kommer att bli nödvändigt för framtiden att för varje anläggning i AM fastställa antalet segment som ska användas. Detta är forskning som måste göras av alla forskare inom mykorrhizaområdet. En av artiklarna som jämförde flera metoder⁹ presenterade en liknande koloniseringshastighet på 50 upp till 200 rotsegment / växt. Deras slutsatser uppgav att en mer objektiv metod behövs för att analysera varje segment. Baserat på vår forskning minskar MycoPatt subjektiviteten till 0. Varje segment skannas och analyseras på djupet. Dessutom kan en bilddatabas för alla analyserade segmentresultat utvecklas med denna metod. Detta kan också användas för att analysera data om det behövs.

Hela metoden ger resultat som är nödvändiga för flera forsknings- och kommersiella områden. Växtförädlare försöker ständigt skapa mer resistenta sorter och hybrider som anpassar sig till specifika markförhållanden. I detta sammanhang kommer växtförädlingsprocesser att gynnas när det gäller växtanslutning till mykorrhizanätverk från jorden från de första urvalsstadierna. Mykorrhizamönsteranalys kommer att visa skillnaderna mellan hybrider när det gäller mykorrhizaskörd från jord och acklimatisering till platsförhållanden. Forskare inom avelsområdet kan använda denna metod för att upptäcka, även från de tidiga stadierna av urvalsprocesserna, lämpligheten hos nya sorter / hybrider för jordmykorrhizaförhållanden. På så sätt kommer det att finnas sorter/hybrider som lätt anpassar sig till ett stort antal förhållanden och tekniker men också sorter/hybrider med lägre acceptans och hög specificitet för smala förhållanden. För gräsmarksekosystem passar mykorrhizamönstermetoden perfekt för flera applikationer: en bättre förståelse för växtöverlevnad i olika vegetationssammansättningar relaterade till svampstöd; analys av specifika koloniseringsmönster i endemiska och hotade arter; Exogena arters invasiva potential. och dominans-kodominansfluktuationerna på grund av tillämpningen av olika ingångar²¹. Mönstren kan användas vidare av inokulumproducenter som behöver beräkna de potentiella doserna baserat på aktiva förökar och ingångspunkter. Dessutom kan mycket specifika biogödsel utvecklas som innehåller lämplig inokulum för växter som delar samma könsorgan. I forskning representerar mykorrhizamönster en mycket jämförande studie, både ur visuell och numerisk synvinkel. Det finns flera databaser 22,23,24 som presenterar mykorrhizaarter och de strukturer de kan utveckla i testväxternas rötter^, men ingen av dem presenterar hittills hela koloniseringsbilden. Alla dessa krav och behovet av mer realistiska och tillämpbara studier stöder integrationen av mykorrhizamönstermetoden i jord-mikrob-växtinteraktionsstudier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb