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Immunology and Infection

Organoïdes intestinaux canins dans un système de soutien perméable à double chambre

Published: March 2, 2022 doi: 10.3791/63612
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2, 3, 4, 5, 2, 2,3, 1,3
1Department of Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 2Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 33D Health Solutions Inc., 4Office of New Animal Drug Evaluation, Center for Veterinary Medicine, Food and Drug Administration, 5Division of Applied Regulatory Science, Office of Clinical Pharmacology, Office of Translational Sciences, Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administration

Summary

Nous présentons ici un protocole décrivant la culture d’organoïdes intestinaux canins dans un système de soutien perméable à double chambre. L’ensemencement organoïde dans les supports perméables, l’entretien monocouche et les expériences ultérieures de perméabilité aux médicaments sont décrits.

Abstract

Le système de support perméable est généralement utilisé en conjonction avec des lignées cellulaires bidimensionnelles (2D) traditionnelles comme outil in vitro pour évaluer la perméabilité orale de nouveaux candidats médicaments thérapeutiques. Cependant, l’utilisation de ces lignées cellulaires conventionnelles présente des limites, telles que l’expression altérée des jonctions serrées, la différenciation cellulaire partielle et l’absence de récepteurs nucléaires clés. Malgré ces lacunes, les modèles Caco-2 et MDCK sont largement acceptés et validés pour la prédiction de la perméabilité orale in vivo chez l’homme.

Les chiens sont un modèle translationnel pertinent pour la recherche biomédicale en raison de leurs similitudes dans l’anatomie gastro-intestinale et la microflore intestinale avec les humains. En conséquence, et à l’appui du développement parallèle de médicaments, l’élaboration d’un outil in vitro efficace et précis pour prédire les caractéristiques de perméabilité in vivo des médicaments chez le chien et l’homme est hautement souhaitable. Un tel outil pourrait être le système organoïde intestinal canin, caractérisé par des structures épithéliales tridimensionnelles (3D) auto-assemblées dérivées de cellules souches adultes.

Le (1) Permeable Support Seeding Protocol décrit les méthodes expérimentales de dissociation et d’ensemencement des organoïdes canins dans les inserts. L’isolement, la culture et la récolte d’organoïdes canins ont déjà été décrits dans un ensemble distinct de protocoles dans ce numéro spécial. Les méthodes d’entretien général de la monocouche organoïde intestinale canine sont discutées en détail dans le (2) Protocole d’entretien monocouche. De plus, ce protocole décrit des méthodes pour évaluer l’intégrité structurelle de la monocouche via des mesures de résistance électrique transépithéliale (TEER) et la microscopie optique. Enfin, le (3) protocole expérimental de perméabilité décrit les tâches précédant directement une expérience, y compris la validation in vitro des résultats expérimentaux.

Dans l’ensemble, le modèle organoïde canin, combiné à une technologie de culture cellulaire à double chambre, surmonte les limites associées aux modèles expérimentaux 2D, améliorant ainsi la fiabilité des prédictions de la perméabilité orale apparente des candidats médicaments thérapeutiques chez le patient canin et humain.

Introduction

Les systèmes de soutien perméables sont généralement utilisés pour déterminer la perméabilité apparente des candidats médicaments thérapeutiques à travers la barrière épithéliale intestinale 1,2. Ils peuvent également être utilisés pour évaluer la sécrétion cellulaire3, la migration cellulaire4 et la toxicité du médicament5. Les tests de perméabilité aux médicaments in vitro par voie orale sont une étape clé du processus de découverte et de développement de médicaments2, les candidats médicaments individuels étant testés au début du cycle de vie de la R&D des médicaments6. Le système de support perméable est un appareil de culture cellulaire à double chambre composé d’un insert avec une membrane semi-poreuse placée dans une plaque multipuit. Ce système permet un accès direct aux côtés apical et basolatéral d’une monocouche cellulaire cultivée dans l’insert7. La monocouche utilisée dans ces systèmes est généralement dérivée de cellules épithéliales gastro-intestinales (p. ex. lignée cellulaire d’adénocarcinome colorectal humain Caco-2)8. Les cultures cellulaires se développent dans un état polarisé imitant la microarchitecture naturelle des cellules épithéliales intestinales, permettant une différenciation cellulaire supplémentaire, une microanatomie similaire et une fonction7. Les détails de l’insert de support perméable se trouvent à la figure 1. L’ensemencement des inserts avec des cultures cellulaires 2D, traditionnellement utilisées pour évaluer la perméabilité intestinale aux médicaments, est relativement abordable et facile à cultiver9. Ces systèmes présentent plusieurs limites majeures, notamment leur capacité limitée à prédire le métabolisme intestinal des candidats médicaments thérapeutiques10,11. Cela est vrai pour tous les mécanismes d’absorption des médicaments, qu’il s’agisse de l’absorption passive par les jonctions serrées entre les cellules épithéliales, de l’absorption transépithéliale active par efflux ou des transporteurs d’absorption (par exemple, la P-glycoprotéine, transporteur de monocarboxylate 1) et des médicaments métabolisés par les entérocytes.

Les chiens partagent un environnement et un régime alimentaire communs avec les humains12. L’anatomie intestinale canine et la composition du microbiome ressemblent beaucoup à celles des humains13, ce qui a été attribué à la domestication et aux régimes alimentaires partagés au cours des 36 000 dernières années14. Malheureusement, ces similitudes peuvent également être des causes / déclencheurs courants du développement de la maladie. Les chiens développent des morbidités chroniques similaires à celles des humains, telles que l’obésité15, la maladie inflammatoire de l’intestin16, l’adénocarcinome colorectal17, la tumeur stromale gastro-intestinale (GIST)18 et diverses autres pathologies associées à leur longévité relative19. En conséquence, les organoïdes canins peuvent être utilisés avec succès pour la recherche translationnelle inverse de ces maladies multifactorielles chroniques dans l’esprit de l’initiative One Health20.

Les cellules Caco-2 sont les lignées cellulaires les plus utilisées pour les tests d’absorption orale de médicaments21. Ces cellules sont actuellement considérées comme le modèle « étalon-or » pour les tests de perméabilité intestinale in vitro 2,22,23. La lignée cellulaire Caco-2 exprime l’efflux et les transporteurs d’absorption trouvés dans le tractus intestinal humain, bien qu’à des niveaux d’expression différents 24,25,26. Les cellules Caco-2 sont également largement utilisées comme modèles pour déterminer si un médicament est un substrat ou un inhibiteur des transporteurs d’efflux intestinal22,27. Bien que les cellules Caco-2 soient d’origine colique, elles imitent une cellule entérocytaire. Malheureusement, les cellules Caco-2 ne représentent qu’un seul type de cellule de la couche épithéliale de l’intestin grêle9, qui ne parvient pas à récapituler avec précision la composition complexe du type de cellules épithéliales intestinales. Par exemple, les cellules de gobelet dédiées à la production de mucus sont absentes des cultures Caco-2, de sorte que les interactions mucus-médicament ne peuvent être évaluées sans coculture avec d’autres lignées cellulaires28. De plus, les cultures de Caco-2 n’expriment pas plusieurs des récepteurs nucléaires importants généralement présents dans l’intestin, tels que le récepteur X du prégnane (PXR), le récepteur X des stéroïdes (SXR) et le récepteur constitutif de l’androstane (CAR)29. Par conséquent, les cultures de Caco-2 ne parviennent pas à modéliser l’induction des transporteurs de médicaments et des enzymes par certains médicaments qui sont inducteurs de ces récepteurs (par exemple, la rifampicine)30.

La technologie organoïde intestinale 3D répond à certaines de ces limitations19. Les organoïdes sont des constructions auto-assemblées dérivées de cellules souches adultes qui peuvent être établies à partir d’échantillons de tissus prélevés à l’aide de techniques micro-invasives20. Des cellules souches pluripotentes d’origine humaine sont utilisées pour les modèles de perméabilité intestinale31,32. Les organoïdes canins offrent une alternative pertinente aux organoïdes humains parce que la recherche sur les cellules souches humaines est limitée par des questions éthiques33. En outre, les organoïdes canins fournissent un système in vitro pour explorer la perméabilité canine aux médicaments, le métabolisme, le transport actif et les interactions médicamenteuses. Pour combler cette lacune technologique, la croissance constante et fiable des organoïdes intestinaux canins dans un système de soutien perméable a été décrite34. Un test de perméabilité avec des organoïdes intestinaux canins peut potentiellement prédire la perméabilité intestinale canine et le métabolisme de petites molécules médicamenteuses par rapport aux tests actuellement utilisés (Caco-2). La confirmation de ces caractéristiques essentielles prête ce nouveau système in vitro à des travaux futurs explorant l’impact potentiel des inducteurs sur le métabolisme intracellulaire et le transport actif.

Les organoïdes canins sont composés de tous les types de cellules généralement présents dans la couche épithéliale de l’intestin. D’un point de vue fonctionnel et microanatomique, ils reproduisent de manière fiable l’environnement de la couche épithéliale de l’intestin canin19,35. En outre, la présence de mucus, de transporteurs de médicaments et d’enzymes spécifiques à la canine et la différenciation cellulaire globale dans les organoïdes intestinaux canins sont comparables à ce qui est observé in vivo chez les chiens34. Ainsi, les organoïdes peuvent être isolés chez des patients vétérinaires malades et utilisés pour modéliser l’effet de divers processus pathologiques (par exemple, inflammation intestinale chronique) sur la perméabilité canine orale aux médicaments19,36. Le système organoïde intestinal canin peut également être utilisé dans d’autres contextes que les expériences de perméabilité aux médicaments. Ces structures 3D peuvent également être isolées chez des patients malades, comme décrit précédemment par Chandra et al. pour les maladies inflammatoires de l’intestin, l’adénocarcinome colorectal et la tumeur stromale gastro-intestinale19.

Le protocole d’ensemencement perméable décrit les méthodes permettant d’établir des cultures organoïdes intestinales canines dans les inserts. Ce premier protocole décrit les méthodes de dissociation des cultures organoïdes canines établies plaquées dans la matrice de la membrane extracellulaire. De plus, le prérevêtement des inserts avec du collagène I et la matrice de la membrane extracellulaire est discuté dans ce protocole. L’intégration d’organoïdes canins dans les inserts de support perméables est également décrite en détail.

Le deuxième protocole est le protocole de maintenance monocouche, qui comprend l’entretien général des organoïdes 3D canins plaqués dans un insert. La fréquence et les volumes des milieux organoïdes utilisés pour rafraîchir la culture, ainsi que les moyens de prévenir les dommages à la culture cellulaire, sont présentés dans ce deuxième protocole, ainsi que des méthodes expérimentales pour évaluer la confluence de la monocouche épithéliale.

Enfin, le protocole expérimental de perméabilité se concentre sur les moyens de déterminer si les organoïdes 3D intestinaux canins dans un test de perméabilité sont prêts pour une utilisation expérimentale et les étapes de vérification nécessaires avant de mener une expérience. Cette section décrit également la mise en place et l’exécution réussie d’une expérience de perméabilité, ainsi que l’incubation et l’échantillonnage de candidats médicaments thérapeutiques dans les chambres de la culture monocouche. L’utilisation de l’isothiocyanate de fluorescéine à faible perméabilité (FITC-dextran) pour surveiller l’intégrité des monocouches est également discutée. Enfin, une méthode d’évaluation in vitro pour valider les résultats après la conclusion d’une expérience est décrite. Les expériences de perméabilité sont un sujet extrêmement vaste et sont très bien résumées par Hubatsch et al.37. Le flux de travail des protocoles est résumé à la figure 2.

Figure 1
Figure 1 : Organoïdes intestinaux canins sur un système de soutien perméable. L’insert de support perméable est positionné dans un puits d’une plaque de 24 puits. La membrane microporeuse permet l’ensemencement d’organoïdes intestinaux canins dissociés, et ces cellules finiront par former une monocouche organoïde 2D. Cette technologie permet d’accéder à la fois aux côtés AP et BL de la monocouche. Le milieu organoïde est introduit dans les chambres AP et BL du support perméable. L’absorption (AP→BL) et la sécrétion (BL→AP) du candidat médicament sont illustrées, ainsi que deux modes possibles de transport du médicament. Abréviations: AP = apical; BL = basolatéral. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Flux de travail des protocoles de support perméable organoïde canin. L’insert de support perméable est prélaqué avec un mélange de la matrice de membrane extracellulaire et de collagène I et incubé pendant 1 h. Au cours du processus d’incubation, la culture organoïde est dissociée. Les cellules organoïdes individuelles sont ensemencées dans l’insert, le milieu dans la chambre basolatérale est ajouté immédiatement après l’ensemencement, tandis que le milieu à la chambre apicale est ajouté 24 heures après la fin du processus d’ensemencement. L’entretien et la surveillance des organoïdes comprennent des changements réguliers de milieu, des mesures de valeur TEER et la microscopie optique pour évaluer l’intégrité de la monocouche. Avant l’expérience, les organoïdes doivent être différenciés en retirant l’inhibiteur de ROCK et GSKiβ du milieu. Les valeurs TEER sont mesurées le jour de l’expérience et la monocouche organoïde est inspectée par microscopie optique pour détecter les dommages aux cellules. Le milieu est ensuite échangé contre un tampon approprié et incubé avant l’expérience. Le test FITC-dextran est utilisé lors d’expériences de perméabilité intestinale39 comme marqueur de l’intégrité monocouche. Les mesures TEER sont prises après l’expérience, et la microscopie optique validera les résultats après 24 h. Abréviations : TEER = résistance électrique transépithéliale ; ROCK = kinase rho-associée; GSKiβ = glycogène synthase kinase bêta; F = fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

La recherche a été approuvée et réalisée conformément au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de l’Iowa (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017). La section suivante (étapes 1.1 à 1.3) décrit le protocole d’amorçage du support perméable, et les procédures sont résumées à la figure 3.

Figure 3
Figure 3 : Flux de travail du protocole d’amorçage de support perméable. Les inserts de support perméables sont prélaqués avec une combinaison de CMGF+ R / G, de collagène I et de la matrice de membrane extracellulaire, puis incubés. Les milieux issus de la culture organoïdale canine sont aspirés et remplacés par une solution de récupération cellulaire, suivie d’une incubation de 30 minutes à 4 °C. La culture est ensuite transférée dans un tube et la dissociation organoïde est effectuée à l’aide de protéase de type trypsine. Les organoïdes non dissociés sont éliminés par passage à travers une passoire pour obtenir une suspension unicellulaire, et la concentration cellulaire est déterminée à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé. Les cellules sont ensemencées sur un insert de support perméable et le CMGF+ R/G est ajouté à la chambre basolatérale. La culture est ensuite incubée pendant 24 h, et le liquide restant est retiré de la chambre apicale et remplacé par CMGF+ R/G. Abréviations : ROCK = kinase rho-associée ; GSKiβ = glycogène synthase kinase bêta; CMGF + R/G = Milieu complet avec des facteurs de croissance améliorés avec un inhibiteur de ROCK et GSKiβ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Protocole d’ensemencement de support perméable

  1. Prérevêtement des inserts de support perméables
    1. Préparer un milieu complet avec des facteurs de croissance améliorés avec un inhibiteur de la protéine kinase associée rho (ROCK) et un inhibiteur de la glycogène synthase kinase-bêta (GSKiβ) (CMGF + R / G) selon les informations du tableau 1.
    2. Préparez un seau à glace et commencez à décongeler la matrice de la membrane extracellulaire sur la glace. Placez une plaque de 24 puits contenant le nombre nécessaire d’inserts dans l’incubateur à préchauffer. Recueillir le collagène I de la queue de rat (3 mg/mL) et le placer sur la glace tout en le protégeant de la lumière. Collectez cmGF + R / G et placez-le sur la glace.
    3. Calculer le nombre total d’inserts et d’ébauches nécessaires à l’expérience, en gardant de côté 100 μL de la solution de revêtement pour chaque insert.
      REMARQUE: Préparer plus de solution de revêtement que nécessaire; il est recommandé de préparer au moins 15 % de plus que nécessaire.
    4. Dans un tube de 15 mL, mélanger cmGF+ R/G avec la matrice de membrane extracellulaire (1%) et le collagène I (1%) et mélanger doucement le pipt.
    5. Enduisez chaque insert en polyester de 100 μL de la solution de revêtement et placez les inserts dans l’incubateur (37 °C; 5% d’atmosphère de CO2 ) pendant 1 h.
    6. Après l’incubation, aspirez soigneusement la solution de revêtement de chaque insert à l’aide d’un aspirateur à vide ou d’une pipette P1000, en prenant soin de ne pas perturber le filtre d’insertion. Placez une plaque prélaquée dans l’incubateur pour garder au chaud.
  2. Dissociation organoïde canine
    REMARQUE: Utilisez des organoïdes canins qui ont été cultivés pendant au moins quatre jours. Avant de commencer la dissociation, reportez-vous à Gabriel et al.38 pour déterminer quand un échantillon est sain, dense et suffisant pour l’expérimentation. Il est recommandé de dissocier un puits supplémentaire d’organoïdes pour chaque procédure de placage de puits. En outre, il est recommandé d’augmenter le nombre souhaité d’inserts d’environ 20% pour tenir compte de la croissance inégale des organoïdes ou des dommages causés par une manipulation incorrecte. Si vous prévoyez d’utiliser FITC-dextran, préparez des puits supplémentaires.
    1. Préparez un seau à glace et un flacon de stock froid 1x Advanced DMEM/F12 dans l’armoire de biosécurité.
    2. Placez la matrice de la membrane extracellulaire sur la glace pour commencer à dégeler, immergez-la dans la glace pour la protéger contre la décongélation rapide et éviter la solidification. Placez une boîte d’embouts de pipette (P200) dans le congélateur pour le placage de la matrice de membrane extracellulaire.
    3. Précoûter une centrifugeuse réfrigérée à 4 °C.
    4. Déplacez le CMGF+ R/G du congélateur/réfrigérateur vers un bain-marie à 37 °C. Évitez l’exposition directe à la lumière lorsque cela est possible.
    5. Retirer tout milieu de la plaque de 24 puits avec culture organoïde pour un nombre approprié de puits (1 puits d’une plaque de 24 puits par 2-4 inserts) tout en prenant soin de ne pas perturber la matrice de la membrane extracellulaire.
      REMARQUE: Le volume peut varier en fonction du système de comptage de cellules utilisé.
    6. Ajouter 0,5 mL de solution de récupération cellulaire précrotée par puits pour dissoudre les dômes de la matrice de membrane extracellulaire.
    7. Incuber la plaque au réfrigérateur (4 °C) pendant 30 min.
    8. Pipette la suspension, recueillir tous les organoïdes et la matrice de membrane extracellulaire dissoute, et les transférer dans un tube de 15 mL.
    9. Centrifuger (700 × g pendant 5 min à 4 °C) et retirer le surnageant jusqu’à ce que le niveau atteigne la barre des 0,5 mL, en veillant à ne pas déranger la pastille.
    10. Ajouter 1 mL de protéase de type trypsine et incuber au bain-marie à 37 °C pendant 8 min. Faites glisser le tube plusieurs fois pendant la période d’incubation pour mélanger les cellules.
    11. Transférez le tube avec l’échantillon dans une armoire de biosécurité et ajoutez lentement 7 mL de DMEM/F12 avancé précroché pour inactiver la protéase de type trypsine et arrêter la dissociation cellulaire.
    12. Préemballez une passoire cellulaire de 40 μm avec 1 mL de DMEM/F12 avancé. Pipeter doucement le mélange et filtrer la suspension à travers; pipette supplémentaire Advanced DMEM/F12 pour rincer la passoire.
    13. Centrifuger le tube (700 × g pendant 5 min à 4 °C) et retirer le surnageant. Ne pas déranger la pastille.
    14. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans environ 50 à 100 μL de milieu de culture (CMGF+ R/G) pour chaque puits d’organoïdes dissocié.
    15. Compter un sous-échantillon de la suspension (~10 μL) à l’aide d’un hémocytomètre ou d’une machine appropriée et déterminer le nombre total de cellules dans la suspension.
  3. Ensemencement organoïde canin
    1. Diluer ou concentrer la suspension cellulaire pour obtenir une concentration cellulaire d’environ 75 000 cellules par mL.
    2. Ensemencez 100 μL de la suspension dans chaque insert à l’aide d’embouts prélaqués BSA (1%) pour éviter l’adhérence cellulaire pendant le transfert. Ajoutez un insert enduit en tant qu’ébauche sans cellule sans qu’aucun organoïde ne se développe tout en recevant des changements de support réguliers.
    3. Faites tourbillonner doucement la plaque dans un mouvement circulaire pendant environ 30 s pour disperser les cellules ensemencées à travers l’insert. Confirmez par microscopie optique la distribution uniforme des cellules.
    4. Ajouter 700 μL de CMGF + R/G dans la chambre basolatérale et placer la plaque dans l’incubateur (37 °C; 5 % de CO2 sous atmosphère) pendant 24 h.
    5. Après 24 h, retirer délicatement la suspension cellulaire de la chambre apicale et la remplacer par 200 μL de CMGF + R/G. Renvoyer la plaque à l’incubateur.

2. Protocole de maintenance monocouche de cellules organoïdes

REMARQUE : La section suivante (étapes 2.1 à 2.2) décrit le protocole de maintenance monocouche des cellules organoïdes. Le flux de travail des procédures présentées dans ce protocole est résumé à la figure 4. Un tableau pour la prise de notes qui peut aider à la normalisation des mesures de la valeur TEER est présenté dans le tableau supplémentaire 1.

Figure 4
Figure 4 : Flux de travail de la maintenance de la culture de support perméable. Les valeurs TEER sont mesurées à l’aide d’électrodes (sondes) et d’un volt/ohmmètre. Les sondes doivent être stérilisées chimiquement avec de l’alcool à 70 % avant d’être insérées dans les puits. Les inserts de cellules vierges et organoïdes sont mesurés et les valeurs TEER sont calculées. Le milieu est ensuite rafraîchi dans les chambres apicales et basolatérales, et la culture organoïde canine sur l’insert est visualisée à l’aide de la microscopie optique. Les déchirures en culture organoïde ou en membrane microporeuse sont notées et traitées conformément au protocole. Abréviation : TEER = résistance électrique transépithéliale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Mesure de la valeur TEER
    REMARQUE: Les mesures de la valeur TEER sont effectuées à l’aide d’un volt / ohmmètre épithélial avec fixation par baguette. Consultez les instructions d’utilisation du fabricant. Les valeurs TEER fournissent des informations sur l’intégrité de la monocouche organoïde canine.
    1. Prenez des mesures de la valeur TEER tous les jours alternatifs pendant la croissance de la culture cellulaire.
    2. Déplacez le volt/ohmmètre épithélial et ses électrodes vers l’armoire de biosécurité. Stériliser chimiquement les électrodes dans de l’alcool à 70% avant utilisation. Réglez la fonction sur Ohms. Attendez au moins une minute jusqu’à ce que les électrodes sèchent.
    3. Avant de prendre la première mesure, insérez l’électrode de fil dans le port et allumez l’alimentation. Assurez-vous que le compteur affiche 1 000 Ω avec l’insert d’électrode de fil au lieu de mesurer des baguettes. Si ce n’est pas le cas, ajustez l’appareil.
    4. Insérez les électrodes dans la chambre apicale et basolatérale de l’insert sans cellule (vierge), de sorte que la chambre apicale contienne l’électrode la plus courte et que la chambre basolatérale contienne l’électrode la plus longue (comme le montre la figure 4). Ne touchez pas la membrane, mais en même temps, assurez-vous que les électrodes sont immergées dans le milieu.
    5. Attendez quelques secondes jusqu’à ce que la valeur se stabilise et notez la valeur dans un livre de laboratoire. Mesurez les monocouches organoïdes canines restantes, en vous assurant de stériliser les électrodes avec 70% d’alcool lors de la mesure de différents échantillons. Veillez à ne pas toucher la monocouche organoïde avec l’électrode.
    6. Après avoir pris les mesures, stérilisez les électrodes avec 70% d’alcool pour la dernière fois. Assurez-vous de les protéger contre les dommages causés par une manipulation inappropriée et de les stocker conformément aux instructions du fabricant.
    7. Calculez les valeurs TEER pour chaque puits en utilisant Eq (1), oùl’échantillon R et leblanc R sont les valeurs ohm (Ω) des puits monocouches et vierges, respectivement, et la surface (cm²) est celle de l’insert.
      Equation 1 (1)
  2. Entretien monocouche
    REMARQUE : Passez en revue le plan de changement moyen recommandé dans le tableau 2.
    1. À l’aide de pipettes Pasteur stériles jetables de 9 po et d’un aspirateur sous vide, aspirer doucement le milieu des chambres apicales, puis basolatérales. Inclinez la plaque pour voir clairement la surface moyenne. Évitez d’aspirer trop près de la membrane microporeuse dans la chambre apicale pour éviter d’endommager la monocouche cellulaire.
      REMARQUE: Utilisez une nouvelle pipette Pasteur lorsque vous vous déplacez entre les échantillons. Les pipettes sont également un remplacement possible de cette procédure.
    2. Ajouter lentement CMGF+ R/G à l’aide de pipettes P1000 visant une paroi de la chambre apicale ou basolatérale. Effectuez le changement de milieu dans la chambre apicale très soigneusement pour éviter d’endommager la monocouche.
    3. Vérifiez les puits tous les deux jours au microscope optique, évaluez la santé de la culture et surveillez les déchirures dans la monocouche organoïde ou la membrane microporeuse. Utilisez la microscopie à contraste de phase pour mettre en évidence les détails de la culture.
      REMARQUE: Dans le cas de déchirures monocouches organoïdes canines, la monocouche a le temps de récupérer et de repousser. Dans le cas de déchirures microporeuses de la membrane, le puits doit être exclu de l’expérience.

Tableau 2 : Recommandation de changement de média pour les cultures organoïdes. CMGF+ R/G est changé dans la chambre apicale et basolatérale des puits tous les deux jours tous les jours alternatifs. La période de culture plus longue du week-end exige un volume accru de milieu dans les chambres basolatérales et apicales, qui est appliqué un vendredi après-midi et modifié le lundi. Abréviations : ROCK = kinase rho-associée ; GSKiβ = glycogène synthase kinase bêta; CMGF + R/G = Milieu complet avec des facteurs de croissance améliorés avec un inhibiteur de ROCK et GSKiβ. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

3. Protocole expérimental de perméabilité

REMARQUE : La section suivante (étapes 3.1 à 3.5) décrit le protocole expérimental de perméabilité. Le flux de travail du protocole expérimental pour mesurer la perméabilité in vitro d’un médicament est résumé à la figure 5.

Figure 5
Figure 5 : Flux de travail du protocole expérimental. Le milieu organoïde doit être changé de CMGF+ R/G à CMGF+ entre huit et douze jours après l’ensemencement des inserts, ce qui permet une différenciation cellulaire. Après avoir changé le milieu (apical et basolatéral) en CMGF+, les valeurs TEER devraient encore augmenter, la monocouche organoïde canine atteignant presque la confluence. Au moins quatre jours après le passage du milieu au CMGF+, l’état de préparation des monocouches est évalué. Lorsque la monocouche est complètement formée et que les valeurs TEER atteignent une phase de plateau (généralement entre 1 500 et 2 500 Ω,cm2), le milieu est échangé contre le tampon de transport pendant 30 minutes pour permettre à la monocouche de s’adapter au nouvel environnement. Au moment 0 min de l’expérience, le test FITC-dextran est effectué et l’échantillon basolatéral de 20 min est prélevé. Les résultats sont ensuite analysés sur un lecteur de plaques. Après l’expérience, le contenu de la chambre apicale et basolatérale est à nouveau changé en CMGF+, et les lectures de valeur TEER sont prises. Les monocouches sont incubées pendant 24 h et l’intégrité de la monocouche est évaluée par des mesures TEER répétées. Abréviations : TEER = résistance électrique transépithéliale ; ROCK = kinase rho-associée; GSKiβ = glycogène synthase kinase bêta; CMGF + R/G = Milieu complet avec des facteurs de croissance améliorés avec un inhibiteur de ROCK et GSKiβ; CMGF+ = Milieu complet avec des facteurs de croissance mais sans inhibiteur de ROCK ou GSKiβ; FITC = isothiocyanate de fluorescéine; F = fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Évaluation de l’état de préparation des monocouches organoïdes
    REMARQUE: Cette étape se produit 8-14 jours après l’ensemencement.
    1. Vérifiez la monocouche au moins tous les deux jours au microscope optique (utilisez le contraste de phase pour visualiser l’intégrité de la monocouche). Passez à l’étape suivante lorsque la monocouche cellulaire est complètement formée sans lacunes ni signes apparents de déchirures.
    2. Changer le milieu organoïde de CMGF+ R/G en CMGF+ (en excluant l’inhibiteur de ROCK et GSKiβ de la composition du milieu). Il est recommandé d’échanger le support au moins quatre jours avant l’expérience.
      REMARQUE: Cette étape permettra une différenciation correcte de la monocouche organoïde.
    3. Continuez à mesurer les valeurs TEER environ tous les deux jours. Lorsque les valeurs TEER commencent à plafonner à environ 1 500 à 2 000 Ω × cm² (Figure 6), mesurez les valeurs TEER tous les jours.
      REMARQUE: Cet état d’équilibre peut être maintenu pendant environ 2-3 jours, ce qui est la fenêtre de temps optimale pour effectuer des tests de perméabilité (généralement aux jours 11 à 13). Les valeurs TEER du plateau peuvent légèrement osciller en fonction de la localisation intestinale des organoïdes, de la température de mesure, de la race, de l’âge et de l’état pathologique du chien.
    4. Planifiez immédiatement le test de perméabilité au médicament pour éviter une diminution rapide des valeurs TEER ou une prolifération de la monocouche organoïde à plusieurs couches cellulaires.
  2. Préparation à l’expérience
    REMARQUE: Les agitateurs d’incubateur peuvent être utilisés pendant l’expérience pour éviter les effets de la couche d’eau non assourdie. Mesurez les valeurs TEER à des températures constantes.
    1. Le jour de l’expérience, mesurez les valeurs TEER et confirmez que les valeurs ont atteint un état stable et ne diminuent pas rapidement.
    2. Choisissez les meilleures monocouches (via la microscopie optique et les valeurs TEER) parmi les inserts en excès de 20% pour effectuer l’expérience.
    3. Observez les monocouches au microscope optique et excluez les monocouches organoïdes incomplètes, déchirées ou envahies par la végétation.
    4. Préparez le tampon de transport et ajustez son pH aux valeurs souhaitées.
      REMARQUE: La composition du tampon expérimental diffère en fonction de la configuration expérimentale. Un tampon fréquemment utilisé est composé de solution saline équilibrée (HBSS) de Hank, de glucose (12,5 mM) et d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES, 25 mM). Cette composition assure la viabilité de la culture organoïde au cours d’une expérience.
    5. Aspirer soigneusement le milieu des chambres apicales et basolatérales des puits sélectionnés.
    6. Ajouter 200 μL de tampon de transport à la chambre apicale et 800 μL à la chambre basolatérale.
      REMARQUE: Le tampon de transport doit d’abord être ajouté à la chambre apicale, puis à la chambre basolatérale pour éviter le détachement de la monocouche de la membrane microporeuse.
    7. Placer la plaque dans l’incubateur (37 °C; 5% d’atmosphère de CO2 ) pendant 30 min pour équilibrer.
      REMARQUE: Les monocouches organoïdes canines sont maintenant prêtes pour l’expérience de perméabilité au médicament.
  3. Schéma expérimental typique -Solution de concentration IgY
    REMARQUE : La conception expérimentale et la mise en page peuvent changer en fonction de la question de recherche. La perméabilité de l’immunoglobuline Y (IgY) à travers une monocouche organoïde est utilisée dans le protocole à titre d’exemple et peut être modifiée. Le terme chambre donneuse fait référence à la chambre où le médicament est initialement appliqué, tandis que la chambre réceptrice fait référence à la chambre acceptant le médicament de la chambre donneuse. Une expérience typique recueille des échantillons dans les chambres réceptrices sur 2 h (par exemple, 15, 30, 60, 90, 120 min).
    1. Préparer la solution d’IgY (médicament ou soluté de votre choix) en la dissolvant dans le tampon de transport jusqu’à la concentration finale souhaitée. Préparez plus de solution médicamenteuse que nécessaire.
      REMARQUE : Les médicaments à faible solubilité aqueuse peuvent d’abord être dissous dans un solvant organique (p. ex. éthanol, DMSO) avant d’être ajoutés au tampon. La concentration finale du solvant doit être inférieure à 1% afin de ne pas endommager la monocouche cellulaire.
    2. Retirez le tampon de la chambre donneuse (chambre apicale ou basolatérale) de chaque puits.
    3. Ajouter la solution d’IgY (solution médicamenteuse) à toutes les chambres du donneur. Utilisez la solution restante comme solution donneuse de temps 0 pour la mesure de la concentration initiale du médicament.
    4. Aux points de temps requis, retirez 50 μL de la chambre de réception et placez-les dans un tube étiqueté. Au dernier moment, retirez un échantillon de la chambre du donneur. À la fin de l’expérience, transférer les aliquotes du donneur et du récepteur dans un congélateur à -20 °C.
      REMARQUE: Si de nombreux points temporels sont nécessaires, le remplacement du tampon dans la chambre de réception peut être effectué, mais doit être pris en compte dans le calcul de la perméabilité apparente. La concentration dans la chambre réceptrice ne doit pas atteindre plus de 10% de la chambre donneuse à la fin de l’expérience pour maintenir les conditions de l’évier44.
  4. Contrôle de la qualité des monocouches de cellules organoïdes
    REMARQUE: La solution fitc-dextran peut être utilisée pour confirmer l’intégrité de la monocouche pendant l’expérience. FITC-dextran est utilisé comme exemple de test d’intégrité monocouche. D’autres incluent le jaune Lucifer, le PEG-4000, le mannitol radiomarqué et l’inuline44.
    1. À temps 0 min, aspirer le contenu de la chambre apicale et remplacer par 250 μL de solution de FITC-dextran (5 mg/mL, 4 kDa) en triple pour chaque groupe expérimental.
      REMARQUE: N’exposez pas FITC-dextran à la lumière.
    2. Après 20 min, retirez le tampon de la chambre basolatérale.
    3. Mesurer l’intensité de fluorescence de l’échantillon basolatéral à l’aide d’un lecteur de plaque de fluorescence (utiliser une courbe d’étalonnage; excitation réglée à 485 nm et valeur d’émission à 528 nm).
      REMARQUE:L’application P de FITC peut également être calculée à l’aide de la méthode décrite dans la discussion.
    4. Une fois l’expérience terminée, aspirez soigneusement l’excès de tampon des chambres apicales et basolatérales.
    5. Ajouter 200 μL de CMGF+ dans la chambre apicale et 700 μL dans la chambre basolatérale.
    6. Mesurer les valeurs TEER dans les puits individuels.
    7. Placer la plaque dans l’incubateur (37 °C; 5% de CO2 sous atmosphère) pendant 24 h.
    8. Le cas échéant, après 24 h, mesurer les valeurs TEER pour évaluer les dommages possibles à la monocouche pendant la partie de l’expérience consacrée au contrôle de la qualité. Utilisez la microscopie optique pour visualiser l’intégrité de la monocouche organoïde canine.
  5. Fixation de monocouches cellulaires pour l’analyse en aval
    1. Préparer une solution de formol-acide acétique-alcool (FAA, composition dans le tableau 1).
    2. Retirez le tampon de transport ou CMGF+ des chambres apicales et basolatérales à l’aide d’une pipette P1000 ou de pipettes Pasteur stériles jetables de 9 pouces et d’un aspirateur à vide.
    3. Remplissez les chambres apicales et basales avec FAA.
    4. Après 24 h, aspirez la FAA et remplacez-la par de l’éthanol à 70%.
    5. Enveloppez la plaque avec un film de laboratoire flexible pour éviter l’évaporation et procédez à la préparation des blocs.

Figure 6
Figure 6 : Valeurs TEER dans les groupes expérimentaux. Les valeurs TEER ont été mesurées dans cinq groupes de monocouches organoïdes intestinales canines. Trois groupes étaient composés d’entéroïdes jéjunaux canins, et deux groupes étaient constitués de colonoïdes. Chaque groupe comprenait 12 à 22 répétitions. Les valeurs TEER pour les cultures entéroïdes jéjunales sont indiquées du jour 4 au jour 14, et les cultures de colonoïdes sont montrées du jour 4 au jour 12 (les mesures se sont terminées lorsque la monocouche organoïde a atteint des valeurs à l’état d’équilibre, indiquant que la monocouche était prête pour une utilisation expérimentale). Les barres d’erreur expriment le MEB des mesures. Abréviation : TEER = résistance électrique transépithéliale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Representative Results

Les procédures opérationnelles normalisées pour la culture des organoïdes canins ont déjà été décrites33, et le Protocole des organoïdes canins a également été discuté en détail dans ce numéro spécial38. Les organoïdes intestinaux canins cultivés sur des supports perméables ont été fixés et incorporés à la paraffine pour examiner la microanatomie de la monocouche et des populations cellulaires. Le processus d’incorporation de la paraffine a déjà été discuté par Gabriel et al.38. Une coloration de routine (hématoxyline et éosine) a été effectuée et la technique de coloration Alcian Blue a été utilisée pour détecter les cellules de gobelet dans la monocouche organoïde canine (voir la figure 7).

Figure 7
Figure 7 : Coloration monocouche organoïde intestinale canine. Les organoïdes intestinaux canins d’origine colique dans le support perméable ont été incorporés à la paraffine et colorés avec H & E et AB. Des images représentatives ont été prises en microscopie optique à un grossissement de 40x (A) et 60x (B). La coloration H & E révèle une monocouche épithéliale en colonnes, et les microvillosités dans la partie apicale des cellules peuvent être observées à un grossissement de 60x. La coloration AB dévoile en outre la présence de cellules de gobelet (bleu foncé) dans la monocouche organoïde intestinale canine. Barres d’échelle = 20 μm (A), 50 μm (B). Abréviations : H&E = hématoxyline et éosine ; AB = Bleu Alcian. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La culture organoïde sur le support perméable doit être cultivée pendant 10 à 14 jours pour être prête pour une expérience de perméabilité. La microscopie optique est utilisée conjointement avec les mesures de la valeur TEER pour confirmer l’état de préparation de la culture organoïde aux tests de perméabilité des candidats médicaments. Des images microscopiques lumineuses représentatives de différentes monocouches organoïdes intestinales canines d’animaux sains et malades sont présentées à la figure 8.

Figure 8
Figure 8 : Microscopie monocouche organoïde intestinale canine. Images de monocouches en croissance vues sous microscopie optique. Les monocouches organoïdes dérivées de donneurs sains sont représentées par des cultures entéroïdes jéjunales (10x; 40x) et colonoïdes (20x; 40x). Les monocouches organoïdes des donneurs malades sont représentées par des entéroïdes duodénaux (5x; 10x) et iléaux (5x; 10x) dérivés d’un patient canin diagnostiqué avec PLE. Les deux cultures organoïdes PLE sont des exemples d’isolement cellulaire inapproprié pendant l’ensemencement d’organoïdes, et ces cultures n’ont pas pu être utilisées pour des tests de perméabilité aux médicaments en raison de la présence d’organoïdes 3D. Des exemples d’écarts par rapport à la formation correcte de monocouches, tels que les déchirures monocouches (5x), sont causés par une manipulation imprudente des échantillons biologiques. La culture prolongée d’organoïdes (10x; 20x) est causée par le long entretien des organoïdes sur l’insert lorsque les organoïdes commencent à ressembler à leur structure 3D d’origine. À titre de comparaison, des images de lignées cellulaires 2D traditionnelles sur les supports perméables couramment utilisés pour les études de perméabilité aux médicaments sont présentées (MDCK-10x; 40x et Caco-2-10x; 20x). Abréviations : PLE = entéropathie perdante de protéines; MDCK = rein canin de Madin-Darby. Barres d’échelle = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Des monocouches organoïdes ont également été fixées dans 3 % de paraformaldéhyde-3 % de glutaraldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). La microscopie électronique à transmission (TEM) a été utilisée pour caractériser l’ultrastructure de la culture organoïde sur les supports perméables. Les structures microanatomiques des microvillosités et des jonctions serrées peuvent être vues à la figure 9.

Figure 9
Figure 9 : Images TEM de monocouches organoïdes intestinales canines saines. La TEM a été utilisée pour révéler la microarchitecture cellulaire des monocouches organoïdes jéjunales (A), iléales (B) et coliques (C). La membrane microporeuse de l’insert de support perméable est marquée d’une flèche jaune. La présence de microvillosités (flèche bleue) et de jonctions serrées (flèche rouge) est délimitée dans les images. Abréviation : TEM = Microscopie électronique à transmission. Barres d’échelle = 5 μm (A), 2 μm (B, C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les mesures TEER et la microscopie optique doivent être effectuées pour s’assurer que le système est prêt pour les tests de perméabilité. Le test est prêt à l’emploi lorsque TEER atteint un état stable, tandis que la microscopie optique aidera à exclure les dommages ou la prolifération des organoïdes. Un résumé des mesures TEER typiques de cinq groupes constitués d’entéroïdes jéjunaux canins et de colonoïdes est présenté à la figure 6.

Tableau 1 : Composition des milieux organoïdes et FAA. La composition complète de CMGF+, CMGF+ R/G et FAA est résumée dans ce tableau. Abréviations : ROCK = kinase rho-associée ; GSKiβ = glycogène synthase kinase bêta; CMGF + R/G = Milieu complet avec des facteurs de croissance améliorés avec un inhibiteur de ROCK et GSKiβ; CMGF+ = Milieu complet avec des facteurs de croissance mais sans inhibiteur de ROCK ou GSKiβ; FAA = formol-acide acétique-alcool; EGF = facteur de croissance épidermique. Ce tableau est adapté de 38. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 1 : Tableau pour la prise de notes sur l’organoïde canin du système de support perméable. Abréviations : TEER = résistance électrique transépithéliale ; ROCK = kinase rho-associée; GSKiβ = glycogène synthase kinase bêta; CMGF + R/G = Milieu complet avec des facteurs de croissance améliorés avec un inhibiteur de ROCK et GSKiβ; CMGF+ = Milieu complet avec des facteurs de croissance mais sans inhibiteur de ROCK ou GSKiβ. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Les cultures organoïdes intestinales canines dans l’appareil de support perméable sont un concept unique reliant les tests traditionnels de perméabilité aux médicaments40 avec un nouveau modèle canin in vitro 41. Différents types d’organoïdes intestinaux canins peuvent être utilisés et évalués en fonction de l’objectif de l’expérience avec un minimum d’ajustements. Il est recommandé de tester plusieurs concentrations du médicament d’intérêt dans 3 à 4 puits par groupe. Les concentrations peuvent être basées sur la concentration intestinale attendue du médicament. De plus, l’utilisation de recherches antérieures peut aider à déterminer les points temporels appropriés pour la conception de l’étude. Une documentation appropriée de la conception de l’étude doit être faite pour accroître la reproductibilité et aider au dépannage.

Cette technologie présente plusieurs limites en raison de la nouveauté de la méthode42, principalement en raison du manque de normalisation dans la conception expérimentale et l’exécution du protocole dans les laboratoires. Ce manque de normalisation a été reconnu par d’autres groupes43, et les protocoles de monocouche organoïde 3D canine conduiront à la reproductibilité interlaboratoire et introduiront la normalisation dans ce système. Les approches normalisées de l’analyse des données améliorent la reproductibilité et peuvent renforcer les résultats des tests préliminaires de dépistage de drogues à l’aide des organoïdes canins dans le système de soutien perméable dans différents laboratoires. Le modèle organoïde 3D canin manque également d’ensembles de données comparant les valeurs del’application P in vitro des médicaments modèles à leur absorption intestinale in vivo humaine ou canine connue, un peu comme les cellules Caco-2 44,45,46. Une fois ces données générées, ce modèle organoïde canin peut être utilisé pour évaluer la perméabilité intestinale pendant le développement du médicament.

Il est crucial de prendre soin lors de l’ensemencement des organoïdes sur le système de support perméable pour ensemencer une densité suffisamment élevée de cellules dissociées de manière appropriée. Les valeurs TEER du système sont plus fiables et reproductibles lorsqu’elles sont cultivées en monocouches strictes. La culture prolongée des monocouches peut entraîner une augmentation exponentielle des valeurs TEER s’éloignant des valeurs physiologiques de l’intestin. Les sections H & E de ces structures 3D montrent ensuite plusieurs couches de cellules les unes au-dessus des autres avec des structures altérées d’entérocytes plus proches de la membrane.

Après une expansion réussie de la monocouche organoïde intestinale canine, les résultats peuvent être analysés de la même manière que les tests cellulaires 2D traditionnels en calculant le coefficient de perméabilité apparente (Papp) d’un médicament de formule44. La valeur del’application P (voir Eq (2)) décrit le taux de transport à travers la monocouche cellulaire47.

Equation 2 (2)

Le Equation 3 est la pente initiale de la concentration par rapport à la courbe temporelle (p. ex., nmol/s). A est la zone de l’insert (cm2), et C0 est la concentration initiale du médicament ou du composé dans la chambre du donneur37. La reconnaissance fiable de l’intégrité monocouche est un élément crucial du test de perméabilité nécessitant une normalisation. La microscopie optique et les mesures TEER sont recommandées pour évaluer les organoïdes canins dans un système de support perméable et aider à déterminer le bon moment de l’expérience. De plus, des marqueurs de perméabilité moléculaire nulle (p. ex., FITC-dextran, jaune de Lucifer, PEG-400) peuvent être utilisés pour évaluer fonctionnellement l’intégrité des monocouches organoïdes. Une attention particulière doit être portée si le composé testé est affecté par un transporteur. La P-glycoprotéine (P-gp) est utilisée comme exemple courant de pompe d’efflux. Un rapport d’efflux doit être généré (application P, application BL-AP / P, AP-BL) par rapport à un substrat de sonde P-gp bien connu.

La microscopie optique (simple ou améliorée avec contraste de phase) est une méthode inestimable pour vérifier l’intégrité de la monocouche 2D ou 3D et de l’insert filtrant tout en évaluant une éventuelle prolifération cellulaire. La figure 7 peut servir de guide pour reconnaître les cultures saines de cellules organoïdes intestinales canines. Les valeurs TEER sont une mesure importante de la formation de jonctions intercellulaires et de la différenciation des cultures organoïdes en un épithélium intestinal intact. Les organoïdes intestinaux canins se différencient en entérocytes et en cellules de gobelet (Figure 6). Ces cellules productrices de mucus permettent d’étudier les interactions médicament-mucus, ce qui a été difficile à réaliser en utilisant des cultures cellulaires 2Dtraditionnelles 48. La présence de cellules entéroendocrines a déjà été confirmée dans les organoïdes intestinaux canins par Chandra et al.33.

Une caractérisation plus approfondie des monocouches organoïdes canines dérivées d’organoïdes jéjunaux, iléaux et coliques à l’aide de TEM est fournie. Les images TEM montrent la microarchitecture cellulaire, y compris les jonctions serrées et la formation de microvillosités, illustrant davantage la complexité et l’utilité de ces modèles organoïdes en médecine translationnelle. Sur la base des résultats expérimentaux, les cultures organoïdes sur le support perméable étaient prêtes à être expérimentées entre les jours 11 et 13 après l’ensemencement (figure 9). Les valeurs TEER à ce point temporel variaient entre 1 500 et 2 500Ω,cm 2. La phase de plateau des valeurs TEER dure pendant une période de temps très limitée où l’expérience doit être commencée avant que les valeurs TEER ne commencent à diminuer lentement. Les valeurs TEER peuvent également être un élément crucial de l’affichage de résultats expérimentaux importants, car certains médicaments ou excipients de produits pharmaceutiques peuvent interagir avec la monocouche (par exemple, des jonctions serrées), ce qui peut avoir un impact considérable sur les lectures de valeur TEER. Cela seul peut servir de données pour une expérience.

Les organoïdes intestinaux canins dans un appareil de culture cellulaire à double chambre peuvent être appliqués dans des domaines autres que la perméabilité orale aux médicaments en raison de l’architecture unique de la monocouche cellulaire résultante. Par exemple, ils peuvent être utilisés dans la recherche en microbiologie (p. ex., l’impact de la modification de la flore microbienne gastro-intestinale), les études sur l’absorption virale, les interactions médicamenteuses et les mécanismes de transport des médicaments49. La chambre du donneur est généralement remplie du médicament d’essai ou du composé de votre choix, et les aliquotes de la chambre du récepteur sont prélevées à différents moments. Ces aliquotes peuvent être analysées à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance, de la spectrométrie de masse, du dosage immuno-enzymatique ou d’autres techniques pour déterminer la quantité et la vitesse auxquelles le soluté pénètre à travers la monocouche.

Ces études nécessitent une monocouche intacte pour évaluer avec précision la perméabilité au médicament. Cela nécessite généralement des monocouches en croissance supérieures à celles nécessaires pour tenir compte des puits inutilisables. Les monocouches de cellules organoïdes peuvent également être utilisées pour mesurer l’absorption virale du côté apical ou basal d’une monocouche, avec des lectures comprenant des tests d’immunofluorescence utilisant des anticorps pour détecter l’absorption cellulaire du virus. Enfin, plusieurs médicaments (c.-à-d. substrat et inhibiteur) peuvent être appliqués à la chambre donneuse pour identifier les interactions médicamenteuses à base de transporteurs.

Sur la base des observations actuelles, ces méthodes seront non seulement applicables aux organoïdes canins dans les inserts de culture, mais conviendront également à d’autres espèces vétérinaires et systèmes d’organes, avec des modifications mineures nécessaires pour s’adapter au mieux à l’espèce ou au modèle d’organe de choix. Les protocoles pour la croissance organoïde intestinale canine ont dû être ajustés en fonction des propriétés uniques de la culture. Ainsi, le protocole peut être ajusté à une autre espèce mais nécessitera des modifications subtiles du protocole. Les modifications peuvent commencer par des changements à la densité d’ensemencement cellulaire et s’étendre à des changements dans la composition du milieu pour différencier correctement les organoïdes d’intérêt.

La normalisation, la documentation détaillée des procédures expérimentales et la surveillance cohérente des monocouches cellulaires sont des pratiques cruciales nécessaires dans les essais de soutien perméable et ne se limitent pas au système canin. Ces modifications possibles d’espèces ou d’organes sont essentielles pour documenter et rendre compte des progrès futurs dans le domaine. Ce modèle présente plusieurs limites, par exemple ses exigences en matière de coûts, sa variabilité interlaboratoire et ses données limitées sur la capacité de prédire l’absorption intestinale in vivo. Les chiens, dans certains cas, possèdent des transporteurs de médicaments et des enzymes métabolisantes différents de ceux des humains50.

De plus, le système organoïde canin doit être testé sur une variété d’autres appareils à double chambre d’autres fabricants afin de déterminer la pertinence d’un tel modèle (p. ex., la pertinence de différentes compositions de membrane filtrante doit être déterminée). Un autre inconvénient est que la partie du manuscrit consacrée à l’expérience de perméabilité aux médicaments est moins descriptive que les parties précédentes. Ceci est dû à un excès d’informations dans ce domaine. L’objectif de cette partie du manuscrit était de décrire ces méthodes de manière modifiable sans couper les bords des pierres angulaires de ces expériences. Des informations plus détaillées sur les expériences de perméabilité ont été recueillies par Hubatsch et al.37. De plus, les inserts perméables peuvent être utilisés dans les expériences de coculture, de migration cellulaire et de test d’invasion4.

En conclusion, les organoïdes intestinaux canins dans les appareils de culture à double chambre ont le potentiel d’être utilisés dans un large éventail d’applications, y compris les domaines biomédicaux et la médecine translationnelle, pour n’en nommer que quelques-uns. Les protocoles créent plusieurs stratégies pour planifier une expérience et promouvoir la fiabilité des données interlaboratoires pour les modèles organoïdes dans le domaine de la biologie.

Disclosures

K. Allenspach est cofondateur de LifEngine Animal Health et 3D Health Solutions. Elle est consultante pour Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics et Mars. J.P. Mochel est co-fondateur de LifEngine Animal Health et 3D Health Solutions et est consultant pour Ceva Animal Health et Ethos Animal Health. Cet article reflète les points de vue des auteurs et ne doit pas être interprété comme représentant l’approbation, le point de vue ou les politiques de la Food and Drug Administration. Les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Nous tenons à exprimer notre gratitude aux employés du Laboratoire de diagnostic vétérinaire de l’Université d’État de l’Iowa, à savoir Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victoria Green et Jennifer Groeltz-Thrush, pour le traitement rapide des échantillons. Nous tenons également à remercier Jodi Smith et Bethann Valentine d’avoir fourni du matériel pour les expériences de perméabilité. Nous tenons également à remercier David Diaz-Reganon pour son aide avec la figure 9. À l’exception de la figure 6, toutes les figures ont été créées dans BioRender.com. Les auteurs souhaitent reconnaître le soutien du Faculty Startup, du prix ISU VPR Miller, du prix ISU VPR Miller et du sous-prix NSF SBIR à l’ISU # 1912948.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid media
 ROCK inhibitor (Y-27632) EMD Millipore Corp. SCM 075
[Leu15]-Gastrin I human Sigma G9145-.5MG
A-83-01 PeproTech 9094360
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
B27 supplement Gibco 17504-044
FBS Corning 35-010-CV
Glutamax Gibco 35050-061 glutamine substitute
HEPES VWR Life Science J848-500ML
Human R-Spondin-1 PeproTech 120-38-500UG
Murine EGF PeproTech 315-09-1MG
Murine Noggin PeproTech 250-38-250UG
Murine Wnt-3a PeproTech 315-20-10UG
N2 supplement Gibco 17502-048
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A9165-25G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Primocin InvivoGen ant-pm-1
SB202190 (P38 inhibitor) Sigma S7067-25MG
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) Reprocell 04-0004-base
TMS (trimethoprim sulfate) Sigma T7883-5G
Reagents
Acetic Acid, Glacial Fisher Chemical A38-500
alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous Acros Organics 170080010
Cell Recovery Solution Corning 354253
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL Gibco A10483-01
FITC-CM-Dextran Millipore Sigma 68059-1G
Formaldehyde (37%) Fisher Chemical F79P-4
Glutaraldehyde solution Sigma G5882
HBSS (1x) Gibco 14025-076
Matrigel Matrix For Organoid Culture Corning 356255 Extracellular Membrane Matrix
Paraformaldehyde, 97% Alfa Aesar A11313
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) Corning 21-040-CM
TrypLE Express Gibco 12604-021 Trypsin-like Protease
Materials and Equipment
15 mL Centrifuge Tube Corning 430766
9" Pasteur Pipets Fisherbrand 13-678-6B
Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile Corning 3470 Permeable Support
Millicell ERS (Probes) Millipore Sigma MERSSTX01
Millicell ERS-2 Voltohmmeter Millipore Sigma MERS00002
Panasonic incubator Panasonic MCO-170ML-PA
Parafilm M Wrapping Film Bemis Company Inc PM996/EMD Flexible Laboratory Film
Tissue Culture Plate 24 wells Fisherbrand FB012929

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Gabriel, V., Zdyrski, C., Sahoo, D. K., Dao, K., Bourgois-Mochel, A., Atherly, T., Martinez, M. N., Volpe, D. A., Kopper, J., Allenspach, K., Mochel, J. P. Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System. J. Vis. Exp. (181), e63612, doi:10.3791/63612 (2022).

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