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Immunology and Infection

एक दोहरी चैंबर पारगम्य समर्थन प्रणाली में कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड

Published: March 2, 2022 doi: 10.3791/63612
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2, 3, 4, 5, 2, 2,3, 1,3
1Department of Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 2Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 33D Health Solutions Inc., 4Office of New Animal Drug Evaluation, Center for Veterinary Medicine, Food and Drug Administration, 5Division of Applied Regulatory Science, Office of Clinical Pharmacology, Office of Translational Sciences, Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administration

Summary

यहां, हम एक दोहरे कक्ष, पारगम्य समर्थन प्रणाली में कुत्ते आंतों के ऑर्गेनोइड की संस्कृति का वर्णन करने वाला एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। पारगम्य समर्थन, मोनोलेयर रखरखाव और बाद में दवा पारगम्यता प्रयोगों में ऑर्गेनोइड सीडिंग का वर्णन किया गया है।

Abstract

पारगम्य समर्थन प्रणाली का उपयोग आमतौर पर पारंपरिक दो-आयामी (2 डी) सेल लाइनों के साथ संयोजन के रूप में किया जाता है कृत्रिम परिवेशीय उपकरण नए चिकित्सीय दवा उम्मीदवारों की मौखिक पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए। हालांकि, इन पारंपरिक सेल लाइनों के उपयोग की सीमाएं हैं, जैसे तंग जंक्शनों की परिवर्तित अभिव्यक्ति, आंशिक सेल भेदभाव और प्रमुख परमाणु रिसेप्टर्स की अनुपस्थिति। इन कमियों के बावजूद, विवो मौखिक पारगम्यता में मानव की भविष्यवाणी के लिए कैको -2 और एमडीसीके मॉडल को व्यापक रूप से स्वीकार और मान्य किया जाता है।

कुत्ते मनुष्यों के साथ गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल शरीर रचना विज्ञान और आंतों के माइक्रोफ्लोरा में उनकी समानता के कारण जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक प्रासंगिक अनुवादक मॉडल हैं। तदनुसार, और समानांतर दवा विकास के समर्थन में, कुत्तों और मनुष्यों दोनों में विवो दवा पारगम्यता विशेषताओं में भविष्यवाणी करने के लिए एक कुशल और सटीक इन विट्रो टूल का विस्तार अत्यधिक वांछनीय है। इस तरह का एक उपकरण कैनाइन आंतों ऑर्गेनॉइड सिस्टम हो सकता है, जो तीन आयामी (3 डी), वयस्क स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त स्व-इकट्ठे उपकला संरचनाओं की विशेषता है।

(1) पारगम्य समर्थन सीडिंग प्रोटोकॉल आवेषण में कैनाइन ऑर्गेनोइड को अलग करने और बोने के लिए प्रयोगात्मक तरीकों का वर्णन करता है। कैनाइन ऑर्गेनोइड अलगाव, संस्कृति और फसल को पहले इस विशेष अंक में प्रोटोकॉल के एक अलग सेट में वर्णित किया गया है। कैनाइन आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर के सामान्य रखरखाव के तरीकों पर (2) मोनोलेयर रखरखाव प्रोटोकॉल में अच्छी तरह से चर्चा की जाती है। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल ट्रांसएपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) माप और प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मोनोलेयर की संरचनात्मक अखंडता का आकलन करने के तरीकों का वर्णन करता है। अंत में, (3) पारगम्यता प्रायोगिक प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक परिणामों के कृत्रिम परिवेशीय सत्यापन सहित एक प्रयोग से सीधे पहले के कार्यों का वर्णन करता है।

कुल मिलाकर, कैनाइन ऑर्गेनॉइड मॉडल, एक दोहरे कक्ष सेल संस्कृति प्रौद्योगिकी के साथ संयुक्त, 2 डी प्रयोगात्मक मॉडल से जुड़ी सीमाओं को दूर करता है, जिससे कुत्ते और मानव रोगी दोनों में चिकित्सीय दवा उम्मीदवारों की स्पष्ट मौखिक पारगम्यता की भविष्यवाणियों की विश्वसनीयता में सुधार होता है।

Introduction

पारगम्य समर्थन प्रणाली का उपयोग आमतौर पर आंतों के उपकला बाधा 1,2 के माध्यम से चिकित्सीय दवा उम्मीदवारों की स्पष्ट पारगम्यता निर्धारित करने के लिए किया जाता है। उन्हें सेलुलर स्राव 3, सेलमाइग्रेशन 4 और दवा विषाक्तता5 का आकलन करने के लिए भी नियोजित किया जा सकता है। इन विट्रो मौखिक दवा पारगम्यता परख दवा की खोज और विकास प्रक्रिया2 में एक महत्वपूर्ण कदम है, व्यक्तिगत दवा उम्मीदवारों को दवा आर एंड डी जीवनचक्र6 के प्रारंभिक चरण में परीक्षण किया जा रहा है। पारगम्य समर्थन प्रणाली एक दोहरी-कक्ष सेल संस्कृति तंत्र है जिसमें एक मल्टीवेल प्लेट में रखे अर्ध-छिद्रपूर्ण झिल्ली के साथ एक सम्मिलित होता है। यह प्रणाली सम्मिलित 7 में उगाए गए सेल-मोनोलेयर के एपिकल और बेसोलेटरल पक्षों तक सीधी पहुंच की अनुमतिदेती है। इन प्रणालियों में उपयोग किया जाने वाला मोनोलेयर आमतौर पर गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल उपकला कोशिकाओं (जैसे, मानव कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा कैको -2 सेल लाइन) से प्राप्त होता है। सेल संस्कृतियां आंतों के उपकला कोशिकाओं के प्राकृतिक माइक्रोआर्किटेक्चर की नकल करते हुए ध्रुवीकृत अवस्था में बढ़ती हैं, जिससे आगे सेलुलर भेदभाव, समान माइक्रोएनाटॉमी और फ़ंक्शन7 सक्षम होता है। पारगम्य समर्थन डालने का विवरण चित्रा 1 में पाया जा सकता है। 2 डी सेल संस्कृतियों के साथ आवेषण की सीडिंग, पारंपरिक रूप से आंतों की दवा पारगम्यता का आकलन करने के लिए उपयोग की जाती है, अपेक्षाकृत सस्ती और संस्कृति के लिए आसान है9. ये प्रणालियां चिकित्सीय दवा उम्मीदवारों10,11 के आंतों के चयापचय की भविष्यवाणी करने की उनकी सीमित क्षमता सहित कई प्रमुख सीमाएं पेश करती हैं। यह दवा अवशोषण के सभी तंत्रों के लिए सच है, चाहे वह उपकला कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शनों के माध्यम से निष्क्रिय अवशोषण हो, प्रवाह के माध्यम से सक्रिय ट्रांसएपिथेलियल अवशोषण, या अपटेक ट्रांसपोर्टर (जैसे, पी-ग्लाइकोप्रोटीन, मोनोकार्बोक्सिलेट ट्रांसपोर्टर 1), और ड्रग्स जो एंटरोसाइट्स द्वारा चयापचय किए जाते हैं।

कुत्ते मनुष्यों के साथ एक सामान्य वातावरण और आहार साझा करतेहैं 12. कैनाइन आंतों की शारीरिक रचना और माइक्रोबायोम संरचना मनुष्यों13 से मिलती जुलती है, जिसे पिछले 36,000 वर्षों में पालतू बनाने और साझा आहार के लिए जिम्मेदार ठहराया गयाहै। दुर्भाग्य से, ये समानताएं रोग के विकास के लिए सामान्य कारण / ट्रिगर भी हो सकती हैं। कुत्ते मनुष्यों के समान पुरानी रुग्णताओं का विकास करते हैं, जैसे मोटापा15, सूजन आंत्र रोग16, कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा17, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर (जीआईएसटी) 18, और उनके सापेक्ष दीर्घायु19 से जुड़े विभिन्न अन्य विकृतियां। तदनुसार, वन हेल्थ इनिशिएटिव20 की भावना में इन पुरानी मल्टीफैक्टोरियल बीमारियों के रिवर्स ट्रांसलेशनल रिसर्च के लिए कैनाइन ऑर्गेनोइड का सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है।

कैको -2 कोशिकाएं दवा मौखिक अवशोषण परख21 के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली सेल लाइनें हैं। इन कोशिकाओं को वर्तमान में इन विट्रो आंतों की पारगम्यता परख2,22,23 के लिए "स्वर्ण मानक" मॉडल माना जाता है। कैको -2 सेल लाइन मानव आंतों के मार्ग में पाए जाने वाले प्रवाह और अपटेक ट्रांसपोर्टरों को व्यक्त करती है, हालांकि विभिन्न अभिव्यक्तिस्तरों 24,25,26 पर। कैको -2 कोशिकाओं को यह निर्धारित करने के लिए मॉडल के रूप में भी व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है कि क्या कोई दवा आंतों के प्रवाह ट्रांसपोर्टरों22,27 का सब्सट्रेट या अवरोधक है। यद्यपि कैको -2 कोशिकाएं कॉलोनिक मूल की हैं, वे एक एंटरोसाइट सेल की नकल करती हैं। दुर्भाग्य से, कैको -2 कोशिकाएं केवल छोटी आंत9 की उपकला परत से एक कोशिका प्रकार का प्रतिनिधित्व करती हैं, जो जटिल आंतों के उपकला कोशिका प्रकार की संरचना को सटीक रूप से दोहराने में विफल रहती हैं। उदाहरण के लिए, बलगम उत्पादन के लिए समर्पित गोब्लेट कोशिकाएं कैको -2 संस्कृतियों से अनुपस्थित हैं जैसे कि बलगम-दवा इंटरैक्शन का मूल्यांकन अन्य सेल लाइनों28 के साथ सहसंस्कृति के बिना नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, कैको -2 संस्कृतियां आमतौर पर आंत में मौजूद कई महत्वपूर्ण परमाणु रिसेप्टर्स को व्यक्त नहीं करती हैं, जैसे कि प्रेग्नेन एक्स रिसेप्टर (पीएक्सआर), स्टेरॉयड एक्स रिसेप्टर (एसएक्सआर), और संवैधानिक एंड्रोस्टेन रिसेप्टर (सीएआर) 29। नतीजतन, कैको -2 संस्कृतियां कुछ दवाओं द्वारा दवा ट्रांसपोर्टरों और एंजाइमों के प्रेरण को मॉडल करने में विफल रहती हैं जो इन रिसेप्टर्स (जैसे, रिफैम्पिन) 30 के प्रेरक हैं।

3 डी आंतों ऑर्गेनोइड तकनीक इन सीमाओं में से कुछ को संबोधित करतीहै 19. ऑर्गेनोइड वयस्क स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त स्व-इकट्ठे निर्माण हैं जिन्हें माइक्रोइनवेसिव तकनीकों का उपयोग करके काटे गए ऊतक नमूनों से स्थापित किया जा सकता है20. मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को आंतों की पारगम्यता मॉडल31,32 के लिए नियोजित किया जा रहा है। कैनाइन ऑर्गेनोइड मानव ऑर्गेनोइड के लिए एक प्रासंगिक विकल्प प्रदान करते हैं क्योंकि मानव स्टेम सेल अनुसंधान नैतिक मुद्दों द्वारा प्रतिबंधित है33. इसके अलावा, कैनाइन ऑर्गेनोइड कैनाइन ड्रग पारगम्यता, चयापचय, सक्रिय परिवहन और ड्रग-ड्रग इंटरैक्शन की खोज के लिए एक इन विट्रो सिस्टम प्रदान करते हैं। इस प्रौद्योगिकी अंतर को संबोधित करने के लिए, पारगम्य समर्थन प्रणाली में कुत्ते आंतों के ऑर्गेनोइड की सुसंगत और विश्वसनीय वृद्धि का वर्णन किया गया है34. कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड के साथ एक पारगम्यता परख संभावित रूप से वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले परख (कैको -2) की तुलना में छोटे दवा अणुओं के कुत्ते आंतों की पारगम्यता और चयापचय की भविष्यवाणी कर सकती है। इन महत्वपूर्ण विशेषताओं की पुष्टि इंट्रासेल्युलर चयापचय और सक्रिय परिवहन पर प्रेरकों के संभावित प्रभाव की खोज करने वाले भविष्य के काम के लिए इन विट्रो प्रणाली में इस उपन्यास को उधार देती है।

कैनाइन ऑर्गेनोइड आमतौर पर आंत की उपकला परत में मौजूद सभी सेल प्रकारों से बने होते हैं। एक कार्यात्मक और सूक्ष्म शारीरिक दृष्टिकोण से, वे मज़बूती से कुत्ते की आंत19,35 की उपकला परत के वातावरण को दोहराते हैं। इसके अलावा, बलगम, कुत्ते-विशिष्ट दवा ट्रांसपोर्टरों और एंजाइमों की उपस्थिति, और कुत्ते आंतों के ऑर्गेनोइड में समग्र सेलुलर भेदभाव कुत्तों34 में विवो में देखा जाता है। इस प्रकार, ऑर्गेनोइड को रोगग्रस्त पशु चिकित्सा रोगियों से अलग किया जा सकता है और कुत्ते की मौखिक दवा पारगम्यता19,36 पर विभिन्न रोग प्रक्रियाओं (जैसे, पुरानी आंतों की सूजन) के प्रभाव को मॉडल करने के लिए उपयोग किया जाता है। कुत्ते आंतों के ऑर्गेनोइड सिस्टम का उपयोग दवा पारगम्यता प्रयोगों के अलावा अन्य सेटिंग्स में भी किया जा सकता है। इन 3 डी संरचनाओं को रोगग्रस्त रोगियों से भी अलग किया जा सकता है जैसा कि पहले चंद्रा एट अल द्वारा सूजन आंत्र रोग, कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर19 के लिए वर्णित है।

पारगम्य समर्थन सीडिंग प्रोटोकॉल आवेषण में कुत्ते आंतों के ऑर्गेनोइड संस्कृतियों की स्थापना के तरीकों का वर्णन करता है। यह पहला प्रोटोकॉल बाह्य झिल्ली मैट्रिक्स में चढ़ाया स्थापित कुत्ते ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को अलग करने के तरीकों की रूपरेखा तैयार करता है। इसके अलावा, कोलेजन मैं और बाह्य झिल्ली मैट्रिक्स के साथ आवेषण के प्रीकोटिंग इस प्रोटोकॉल में चर्चा की है। पारगम्य समर्थन आवेषण में कैनाइन ऑर्गेनोइड को एम्बेड करना भी विस्तार से वर्णित है।

दूसरा प्रोटोकॉल मोनोलेयर रखरखाव प्रोटोकॉल है, जिसमें एक डालने में चढ़ाया गया कुत्ते 3 डी ऑर्गेनोइड का सामान्य रखरखाव शामिल है। संस्कृति को ताज़ा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ऑर्गेनोइड मीडिया की आवृत्ति और वॉल्यूम, और सेल संस्कृति क्षति को रोकने के तरीके, उपकला मोनोलेयर की संगमता का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक तरीकों के साथ इस दूसरे प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किए जाते हैं।

अंत में, पारगम्यता प्रायोगिक प्रोटोकॉल यह निर्धारित करने के तरीकों पर केंद्रित है कि पारगम्यता परख में कुत्ते आंतों 3 डी ऑर्गेनोइड प्रयोगात्मक उपयोग के लिए तैयार हैं और किसी भी प्रयोग का संचालन करने से पहले आवश्यक सत्यापन कदम। यह खंड मोनोलेयर संस्कृति के कक्षों में चिकित्सीय दवा उम्मीदवारों के इनक्यूबेशन और नमूने के साथ-साथ पारगम्यता प्रयोग के सेटअप और सफल निष्पादन का भी वर्णन करता है। मोनोलेयर अखंडता की निगरानी के लिए कम पारगम्यता फ्लोरोसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी-डेक्सट्रान) के उपयोग पर भी चर्चा की गई है। अंत में, एक प्रयोग के समापन के बाद परिणामों को मान्य करने के लिए एक इन विट्रो मूल्यांकन विधि का वर्णन किया गया है। पारगम्यता प्रयोग एक अत्यंत विशाल विषय हैं और हुबाट्स एट अल द्वारा बहुत अच्छी तरह से संक्षेप में प्रस्तुत किए गए हैं। प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो चित्रा 2 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: एक पारगम्य समर्थन प्रणाली पर कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड। पारगम्य समर्थन डालने को 24-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में तैनात किया गया है। माइक्रोपोरस झिल्ली अलग-अलग कुत्ते आंतों के ऑर्गेनोइड के बीजारोपण की अनुमति देती है, और ये कोशिकाएं अंततः एक ऑर्गेनोइड 2 डी मोनोलेयर बनाएंगी। यह तकनीक मोनोलेयर के एपी और बीएल दोनों पक्षों तक पहुंच की अनुमति देती है। ऑर्गेनोइड माध्यम पारगम्य समर्थन के एपी और बीएल दोनों कक्षों में पेश किया जाता है। दवा उम्मीदवार के अवशोषण (एपी→बीएल) और स्राव (बीएल→एपी) को सचित्र किया गया है, साथ ही दवा परिवहन के दो संभावित तरीके भी हैं। संक्षिप्त नाम: एपी = एपिकल; बीएल = बेसोलेटरल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: कैनाइन ऑर्गेनोइड पारगम्य समर्थन प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो। पारगम्य समर्थन डालने को बाह्य झिल्ली मैट्रिक्स और कोलेजन I के मिश्रण के साथ प्रीकोट किया जाता है और 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया जाता है। इनक्यूबेशन प्रक्रिया के दौरान, ऑर्गेनोइड संस्कृति अलग हो जाती है। व्यक्तिगत ऑर्गेनोइड कोशिकाओं को डालने में वरीयता दी जाती है, बेसोलेटरल चैंबर में माध्यम को बोने के तुरंत बाद जोड़ा जाता है, जबकि सीडिंग प्रक्रिया समाप्त होने के 24 घंटे बाद एपिकल चैंबर में मध्यम जोड़ा जाता है। ऑर्गेनोइड के रखरखाव और निगरानी में मोनोलेयर की अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए नियमित माध्यम परिवर्तन, टीईईआर मूल्य माप और प्रकाश माइक्रोस्कोपी शामिल हैं। प्रयोग से पहले, ऑर्गेनोइड को मीडिया से रॉक अवरोधक और जीएसकेआई को हटाकर विभेदित किया जाना चाहिए। टीईईआर मूल्यों को प्रयोग के दिन मापा जाता है, और कोशिकाओं को नुकसान के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से ऑर्गेनोइड मोनोलेयर का निरीक्षण किया जाता है। मध्यम तो एक उपयुक्त बफर के लिए आदान-प्रदान किया जाता है और प्रयोग से पहले ऊष्मायन किया जाता है। एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख का उपयोग आंतों की पारगम्यता प्रयोगों39 के दौरान मोनोलेयर अखंडता के मार्कर के रूप में किया जाता है। प्रयोग के बाद टीईईआर माप लिया जाता है, और प्रकाश माइक्रोस्कोपी 24 घंटे के बाद परिणामों को मान्य करेगा। संक्षिप्त नाम: टीईईआर = ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध; रॉक = रो-जुड़े किनेज; जीएससीआईβ = ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनेज बीटा; एफ = प्रतिदीप्ति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी (आईएसीयूसी -19-337) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुपालन में अनुसंधान को मंजूरी दी गई और प्रदर्शन किया गया; आईएसीयूसी-18-065; आईएसीयूसी-19-017)। निम्न अनुभाग (चरण 1.1-1.3) पारगम्य समर्थन सीडिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, और प्रक्रियाओं को चित्रा 3 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

Figure 3
चित्रा 3: पारगम्य समर्थन बोने प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो। पारगम्य समर्थन आवेषण सीएमजीएफ + आर / जी, कोलेजन आई, और बाह्य झिल्ली मैट्रिक्स के संयोजन के साथ प्रीकोटेड होते हैं और बाद में इनक्यूबेट किए जाते हैं। कैनाइन ऑर्गेनॉइड संस्कृति से मीडिया आकांक्षा और सेल रिकवरी समाधान के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट इनक्यूबेशन। संस्कृति को बाद में एक ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया जाता है, और ऑर्गेनोइड पृथक्करण ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज का उपयोग करके किया जाता है। एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए एक छलनी के माध्यम से पारित होने से अविभाजित ऑर्गेनोइड को हटा दिया जाता है, और सेल एकाग्रता को हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। कोशिकाओं को एक पारगम्य समर्थन डालने पर वरीयता दी जाती है, और सीएमजीएफ + आर / जी को बेसोलेटरल चैंबर में जोड़ा जाता है। संस्कृति को तब 24 घंटे के लिए ऊष्मायन किया जाता है, और शेष तरल को एपिकल चैंबर से हटा दिया जाता है और सीएमजीएफ + आर / जीएससीआईβ = ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनेज बीटा; सीएमजीएफ + आर/जी = रॉक अवरोधक और जीएसकेआईβ के साथ बढ़ाए गए विकास कारकों के साथ पूर्ण माध्यम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1. पारगम्य समर्थन बोने प्रोटोकॉल

  1. पारगम्य समर्थन आवेषण का प्रीकोटिंग
    1. तालिका 1 में दी गई जानकारी के अनुसार आरएचओ से जुड़े प्रोटीन किनेज (रॉक) अवरोधक और ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनेज-बीटा अवरोधक (जीएसकेआई) (सीएमजीएफ + आर / जी) के साथ बढ़ाए गए विकास कारकों के साथ पूर्ण माध्यम तैयार करें।
    2. एक बर्फ की बाल्टी तैयार करें और बर्फ पर बाह्य झिल्ली मैट्रिक्स को पिघलना शुरू करें। प्रीवार्म करने के लिए इनक्यूबेटर में आवेषण की आवश्यक संख्या युक्त एक 24-अच्छी तरह से प्लेट रखें। चूहे पूंछ कोलेजन मैं (3 मिलीग्राम / एमएल) ले लीजिए और प्रकाश से बचाने के दौरान बर्फ पर जगह है। सीएमजीएफ + आर / जी लीजिए और इसे बर्फ पर रखें।
    3. प्रत्येक डालने के लिए कोटिंग समाधान के 100 μL को अलग रखते हुए, प्रयोग के लिए आवश्यक आवेषण और रिक्त स्थान की कुल संख्या की गणना करें।
      नोट: आवश्यकता से अधिक कोटिंग समाधान तैयार करें; आवश्यकता से कम से कम 15% अधिक तैयारी करने की सिफारिश की जाती है।
    4. 15 एमएल ट्यूब में, सीएमजीएफ + आर / जी को बाह्य झिल्ली मैट्रिक्स (1%) और कोलेजन आई (1%) और धीरे-धीरे पिपेट मिश्रण के साथ मिलाएं।
    5. कोटिंग समाधान के 100 μL के साथ प्रत्येक पॉलिएस्टर डालने कोट और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस; 5% सीओ2 वातावरण) में आवेषण जगह।
    6. इनक्यूबेशन के बाद, सावधानीपूर्वक एक वैक्यूम एस्पिरेटर या एक P1000 विंदुक का उपयोग कर प्रत्येक डालने बंद कोटिंग समाधान की आकांक्षा, सम्मिलित फिल्टर परेशान नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है। गर्म रखने के लिए इनक्यूबेटर में एक प्रीकोटेड प्लेट रखें।
  2. कैनाइन ऑर्गेनोइड पृथक्करण
    नोट: कैनाइन ऑर्गेनोइड का उपयोग करें जो कम से कम चार दिनों के लिए सुसंस्कृत किए गए हैं। पृथक्करण शुरू करने से पहले, यह निर्धारित करने के लिए गेब्रियल एट अल .38 का संदर्भ लें कि नमूना कब स्वस्थ, घना और प्रयोग के लिए पर्याप्त है। प्रत्येक अच्छी तरह से चढ़ाना प्रक्रिया के लिए ऑर्गेनोइड के एक अतिरिक्त कुएं को अलग करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, अनुचित हेरफेर के कारण असमान ऑर्गेनोइड वृद्धि या क्षति के लिए ~ 20% द्वारा आवेषण की वांछित संख्या बढ़ाने की सिफारिश की जाती है। यदि एफआईटीसी-डेक्सट्रान का उपयोग करने की योजना बना रहे हैं, तो अतिरिक्त कुएं तैयार करें।
    1. जैव सुरक्षा कैबिनेट में एक बर्फ की बाल्टी और ठंडे 1 एक्स उन्नत डीएमईएम / एफ 12 स्टॉक की एक शीशी तैयार करें।
    2. विगलन शुरू करने के लिए बर्फ पर बाह्य झिल्ली मैट्रिक्स रखें, तेजी से विगलन से बचाने और जमने से बचने के लिए इसे बर्फ में डुबोएं। बाह्य झिल्ली मैट्रिक्स की चढ़ाना के लिए फ्रीजर में पिपेट युक्तियों (पी 200) का एक बॉक्स रखें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र प्रीचिल करें।
    4. फ्रीजर /रेफ्रिजरेटर से सीएमजीएफ + आर / जी को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ले जाएं। जब संभव हो तो प्रत्यक्ष प्रकाश जोखिम से बचें।
    5. बाह्य झिल्ली मैट्रिक्स को परेशान न करने का ध्यान रखते हुए कुओं की उचित संख्या (2-4 आवेषण प्रति 24-अच्छी तरह से प्लेट का 1 अच्छी तरह से) के लिए ऑर्गेनोइड संस्कृति के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट से सभी माध्यम निकालें।
      नोट: वॉल्यूम उपयोग किए गए सेल गिनती सिस्टम के आधार पर भिन्न हो सकता है।
    6. बाह्य झिल्ली मैट्रिक्स गुंबदों को भंग करने के लिए अच्छी तरह से प्रति प्रीचिल्ड सेल रिकवरी सॉल्यूशन के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    7. 30 मिनट के लिए रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में प्लेट सेते हैं।
    8. निलंबन विंदुक, सभी ऑर्गेनोइड इकट्ठा और भंग बाह्य झिल्ली मैट्रिक्स, और उन्हें एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित।
    9. अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 700 × ग्राम ) और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें जब तक कि स्तर 0.5 एमएल निशान तक नहीं पहुंच जाता, यह सुनिश्चित करें कि गोली को परेशान न करें।
    10. ट्रिप्सिन की तरह प्रोटीज के 1 एमएल जोड़ें और 8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं। कोशिकाओं मिश्रण करने के लिए इनक्यूबेशन अवधि के दौरान ट्यूब कई बार झटका।
    11. नमूने के साथ ट्यूब को जैव सुरक्षा कैबिनेट में वापस स्थानांतरित करें और ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज को निष्क्रिय करने और सेल पृथक्करण को रोकने के लिए धीरे-धीरे 7 मिलीलीटर प्रीचिल्ड एडवांस्ड डीएमईएम /
    12. एफ 12 के 1 एमएल के साथ एक 40 μm सेल छलनी को प्रीवेट करें। धीरे से मिश्रण को पाइप करें और निलंबन को फ़िल्टर करें; विंदुक अतिरिक्त उन्नत डीएमईएम / एफ 12 छलनी कुल्ला करने के लिए।
    13. ट्यूब अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 700 × ग्राम ) और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। गोली को परेशान न करें।
    14. संस्कृति माध्यम (सीएमजीएफ + आर / जी) के ~ 50-100 μL में सेल गोली को ऑर्गेनोइड के हर कुएं के लिए पुन: निलंबित करें जो असंबद्ध था।
    15. हेमोसाइटोमीटर या उपयुक्त मशीन का उपयोग करके निलंबन (~ 10 μL) के एक उप-नमूने की गणना करें और निलंबन में कुल सेल संख्या निर्धारित करें।
  3. कैनाइन ऑर्गेनोइड बोने
    1. पतला या एमएल प्रति ~ 75,000 कोशिकाओं की एक सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए सेल निलंबन ध्यान केंद्रित करें।
    2. हस्तांतरण के दौरान सेल आसंजन से बचने के लिए बीएसए (1%) प्रीकोटेड युक्तियों का उपयोग करके प्रत्येक डालने में निलंबन के बीज 100 μL। नियमित मीडिया परिवर्तन प्राप्त करते समय किसी भी ऑर्गेनोइड के बिना सेल-मुक्त रिक्त के रूप में एक लेपित डालने को जोड़ें।
    3. सम्मिलित करने के पार वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को फैलाने के लिए ~ 30 एस के लिए एक परिपत्र गति में प्लेट को धीरे-धीरे घुमाएं। प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कोशिकाओं के समान वितरण की पुष्टि करें।
    4. जी के 700 μL को बेसोलेटरल चैंबर में जोड़ें और प्लेट को24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस; 5% सीओ 2 वायुमंडल) में रखें।
    5. 24 घंटे के बाद, धीरे-धीरे एपिकल चैंबर से सेल निलंबन को हटा दें और इसे सीएमजीएफ + आर / जी के 200 μL के साथ प्रतिस्थापित करें।

2. ऑर्गेनोइड सेल मोनोलेयर रखरखाव प्रोटोकॉल

नोट:: निम्न अनुभाग (चरण 2.1-2.2) ऑर्गेनोइड सेल मोनोलेयर रखरखाव प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत प्रक्रियाओं का वर्कफ़्लो चित्रा 4 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। नोट लेने के लिए एक तालिका जो टीईईआर मूल्य माप के मानकीकरण में मदद कर सकती है , पूरक तालिका 1 में प्रस्तुत की गई है।

Figure 4
चित्रा 4: पारगम्य समर्थन संस्कृति रखरखाव का वर्कफ़्लो। टीईईआर मूल्यों को इलेक्ट्रोड (जांच) और एक वोल्ट / ओम मीटर का उपयोग करके मापा जाता है। कुओं में डालने से पहले जांच को 70% अल्कोहल के साथ रासायनिक रूप से निष्फल किया जाना चाहिए। रिक्त और ऑर्गेनोइड सेल आवेषण को मापा जाता है, और टीईईआर मूल्यों की गणना की जाती है। मध्यम को बाद में एपिकल और बेसोलेटरल दोनों कक्षों में ताज़ा किया जाता है, और डालने पर कैनाइन ऑर्गेनोइड संस्कृति को प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना की जाती है। या तो ऑर्गेनोइड संस्कृति या माइक्रोपोरस झिल्ली में आँसू नोट किए जाते हैं और प्रोटोकॉल के अनुसार संभाले जाते हैं। संक्षिप्त नाम: टीईईआर = ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. टीईईआर मूल्य माप
    नोट: टीईईआर मूल्य माप चॉपस्टिक लगाव के साथ एक उपकला वोल्ट / ओम मीटर का उपयोग करके किया जाता है। उपयोग के लिए निर्माता के निर्देश देखें। टीईईआर मान कैनाइन ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर की अखंडता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं।
    1. सेल संस्कृति विकास के दौरान हर वैकल्पिक दिन पर टीईईआर मूल्य माप लें।
    2. ओम मीटर और इसके इलेक्ट्रोड को जैव सुरक्षा कैबिनेट में ले जाएं। रासायनिक रूप से उपयोग करने से पहले 70% अल्कोहल में इलेक्ट्रोड को निष्फल करें। ओम के लिए फ़ंक्शन सेट करें। इलेक्ट्रोड सूखने तक कम से कम एक मिनट प्रतीक्षा करें।
    3. पहला माप लेने से पहले, तार इलेक्ट्रोड को बंदरगाह में डालें और बिजली चालू करें। सुनिश्चित करें कि मीटर चॉपस्टिक को मापने के बजाय तार इलेक्ट्रोड डालने के साथ 1,000 Ω प्रदर्शित करता है। यदि ऐसा नहीं है, तो डिवाइस को समायोजित करें।
    4. सेल मुक्त डालने (रिक्त) के एपिकल और बेसोलेटरल चैंबर में इलेक्ट्रोड डालें, इसलिए एपिकल चैंबर में छोटा इलेक्ट्रोड होता है, और बेसोलेटरल चैंबर में लंबा इलेक्ट्रोड होता है (जैसा कि चित्रा 4 में देखा गया है)। झिल्ली को स्पर्श न करें, लेकिन साथ ही, सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड माध्यम में डूबे हुए हैं।
    5. कुछ सेकंड तक प्रतीक्षा करें जब तक कि मूल्य स्थिर न हो जाए और प्रयोगशाला पुस्तक में मूल्य नोट करें। विभिन्न नमूनों को मापने के दौरान 70% अल्कोहल के साथ इलेक्ट्रोड को निष्फल करना सुनिश्चित करते हुए शेष कैनाइन ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर को मापें। ध्यान रखें कि इलेक्ट्रोड के साथ ऑर्गेनोइड मोनोलेयर को न छुएं।
    6. माप लेने के बाद, आखिरी बार 70% अल्कोहल के साथ इलेक्ट्रोड को निष्फल करें। अनुचित हेरफेर के कारण होने वाले नुकसान से उन्हें बचाना सुनिश्चित करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार उन्हें स्टोर करें।
    7. ईक्यू (1) का उपयोग करके प्रत्येक कुएं के लिए टीईईआर मूल्यों की गणना करें, जहां आरनमूना और आररिक्त क्रमशः मोनोलेयर और रिक्त कुओं से ओम (Ω) मान हैं, और क्षेत्र (सेमी²) सम्मिलित करने का है।
      Equation 1 (1)
  2. मोनोलेयर रखरखाव
    नोट: तालिका 2 में अनुशंसित मध्यम परिवर्तन योजना की समीक्षा करें।
    1. बाँझ डिस्पोजेबल 9 "पाश्चर पिपेट्स और एक वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके, धीरे-धीरे एपिकल और फिर बेसोलेटरल कक्षों से माध्यम की आकांक्षा करें। मध्यम सतह को स्पष्ट रूप से देखने के लिए प्लेट को झुकाएं। सेल मोनोलेयर को नुकसान को रोकने के लिए एपिकल चैंबर में माइक्रोपोरस झिल्ली के बहुत करीब आकांक्षा से बचें।
      नोट: नमूनों के बीच चलते समय एक नया पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। पिपेट भी इस प्रक्रिया के लिए एक संभावित प्रतिस्थापन हैं।
    2. धीरे-धीरे एपिकल या बेसोलेटरल चैंबर की दीवार के लिए लक्ष्य पी 1000 पिपेट का उपयोग करके सीएमजीएफ + आर / मोनोलेयर को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए एपिकल चैंबर में मध्यम परिवर्तन बहुत सावधानी से करें।
    3. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत हर दूसरे दिन कुओं की जांच करें, संस्कृति के स्वास्थ्य का मूल्यांकन करें और ऑर्गेनोइड मोनोलेयर या माइक्रोपोरस झिल्ली में आँसू की निगरानी करें। संस्कृति के विवरण को उजागर करने के लिए चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें।
      नोट: कैनाइन ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर आँसू के मामले में, मोनोलेयर को पुनर्प्राप्त करने और फिर से बढ़ने का समय दिया जाता है। माइक्रोपोरस झिल्ली आँसू के मामले में, कुएं को प्रयोग से बाहर रखा जाना चाहिए।

तालिका 2: ऑर्गेनोइड संस्कृतियों के लिए मीडिया परिवर्तन सिफारिश। सीएमजीएफ + आर / जी को हर दूसरे दिन कुओं के एपिकल और बेसोलेटरल चैंबर में हर दूसरे दिन बदल दिया जाता है। सप्ताहांत में लंबी संस्कृति अवधि बेसोलेटरल और एपिकल कक्षों दोनों में माध्यम की बढ़ती मात्रा की मांग करती है, जिसे शुक्रवार दोपहर को लागू किया जाता है और सोमवार को बदल दिया जाता है। संक्षिप्त नाम: रॉक = आरएचओ से जुड़े किनेज; जीएससीआईβ = ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनेज बीटा; सीएमजीएफ + आर/जी = रॉक अवरोधक और जीएसकेआईβ के साथ बढ़ाए गए विकास कारकों के साथ पूर्ण माध्यम। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

3. पारगम्यता प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल

नोट:: निम्न अनुभाग (चरण 3.1-3.5) पारगम्यता प्रायोगिक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो इन विट्रो पारगम्यता में एक दवा को मापने के लिए चित्रा 5 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

Figure 5
चित्रा 5: प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के वर्कफ़्लो। ऑर्गेनोइड माध्यम को आवेषण बोने के आठ से बारह दिनों के बीच सीएमजीएफ + आर / जी से सीएमजीएफ + में बदलना चाहिए, जिससे सेलुलर भेदभाव की अनुमति मिलती है। सीएमजीएफ + में माध्यम (एपिकल और बेसोलेटरल दोनों) को बदलने के बाद, टीईईआर मूल्यों को अभी भी बढ़ना चाहिए, जिसमें कैनाइन ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर लगभग संगम तक पहुंच रहा है। माध्यम को सीएमजीएफ + में बदलने के कम से कम चार दिन बाद, मोनोलेयर्स की तत्परता का मूल्यांकन किया जाता है। जब मोनोलेयर पूरी तरह से बन जाता है, और टीईईआर मान एक पठार चरण (आमतौर पर 1,500 और 2,500 Ω सेमी2 के बीच) तक पहुंचते हैं, तो मोनोलेयर को नए वातावरण में समायोजित करने की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए परिवहन बफर के लिए माध्यम का आदान-प्रदान किया जाता है। प्रयोग के समय 0 मिनट में, एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख किया जाता है, और 20 मिनट बेसोलेटरल नमूना एकत्र किया जाता है। परिणाम बाद में एक प्लेट रीडर पर विश्लेषण किया जाता है। प्रयोग के बाद, एपिकल और बेसोलेटरल चैंबर सामग्री को फिर से सीएमजीएफ + में बदल दिया जाता है, और टीईईआर मूल्य रीडिंग ली जाती है। मोनोलेयर को 24 घंटे के लिए ऊष्मायन किया जाता है, और मोनोलेयर की अखंडता का मूल्यांकन बार-बार टीईईआर माप के माध्यम से किया जाता है। संक्षिप्त नाम: टीईईआर = ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध; रॉक = रो-जुड़े किनेज; जीएससीआईβ = ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनेज बीटा; सीएमजीएफ + आर/जी = रॉक अवरोधक और जीएसकेआईβ के साथ बढ़ाए गए विकास कारकों के साथ पूर्ण माध्यम; सीएमजीएफ + = विकास कारकों के साथ पूर्ण माध्यम लेकिन रॉक अवरोधक या जीएसकेआईβ के बिना; एफआईटीसी = फ्लोरोसिन आइसोथियोसाइनेट; एफ = प्रतिदीप्ति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. ऑर्गेनोइड मोनोलेयर तत्परता का मूल्यांकन करना
    नोट: यह चरण बोने के 8-14 दिनों बाद होता है।
    1. प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कम से कम हर दूसरे दिन मोनोलेयर की जांच करें (मोनोलेयर की अखंडता की कल्पना करने के लिए चरण-विपरीत का उपयोग करें)। अगले चरण तक जारी रखें जब सेल मोनोलेयर अंतराल या आँसू के स्पष्ट संकेतों के बिना पूरी तरह से बनता है।
    2. जी से सीएमजीएफ + में ऑर्गेनोइड माध्यम बदलें + (मध्यम संरचना से रॉक अवरोधक और जीएसकेआई को छोड़कर)। प्रयोग से कम से कम चार दिन पहले माध्यम की अदला-बदली की सिफारिश की जाती है।
      नोट: यह कदम ऑर्गेनोइड मोनोलेयर के उचित भेदभाव की अनुमति देगा।
    3. लगभग हर दूसरे दिन टीईईआर मूल्यों को मापना जारी रखें। जब टीईईआर मान लगभग 1,500 से 2,000 Ω × सेमी² (चित्रा 6) पर पठार शुरू करते हैं, तो हर दिन टीईईआर मूल्यों को मापें।
      नोट: इस स्थिर अवस्था को लगभग 2-3 दिनों तक बनाए रखा जा सकता है, जो पारगम्यता परीक्षण करने के लिए समय की इष्टतम खिड़की है (आमतौर पर 11 से 13 दिनों में)। पठार टीईईआर मूल्य ऑर्गेनोइड, माप तापमान, नस्ल, उम्र और कुत्ते की बीमारी की स्थिति के आंतों के स्थानीयकरण के आधार पर थोड़ा दोलन कर सकते हैं।
    4. कई सेल परतों के लिए टीईईआर मूल्यों या ऑर्गेनोइड मोनोलेयर के अतिवृद्धि में तेजी से कमी से बचने के लिए दवा पारगम्यता परख को तुरंत शेड्यूल करें।
  2. प्रयोग की तैयारी
    नोट: इनक्यूबेटर शेकर्स का उपयोग प्रयोग के दौरान अनियंत्रित पानी की परत के प्रभाव से बचने के लिए किया जा सकता है। लगातार तापमान पर टीईईआर मूल्यों को मापें।
    1. प्रयोग के दिन, टीईईआर मूल्यों को मापें और पुष्टि करें कि मूल्य एक स्थिर अवस्था में पहुंच गए हैं और तेजी से गिरावट नहीं आ रही है।
    2. प्रयोग करने के लिए 20% आवेषण से सर्वश्रेष्ठ मोनोलेयर (प्रकाश माइक्रोस्कोपी और टीईईआर मूल्यों के माध्यम से) चुनें।
    3. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत मोनोलेयर का निरीक्षण करें और अधूरे, फटे, या अतिवृद्धि ऑर्गेनोइड मोनोलेयर को बाहर करें।
    4. परिवहन बफर तैयार करें और वांछित मूल्यों के लिए अपने पीएच को समायोजित करें।
      नोट: प्रयोगात्मक बफर की संरचना प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर भिन्न होती है। अक्सर इस्तेमाल किया जाने वाला बफर हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस), ग्लूकोज (12.5 एमएम), और 4- (2-हाइड्रॉक्सीथाइल) -1-पिपराज़ीनिथेनेसल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस, 25 एमएम) से बना है। यह रचना एक प्रयोग के दौरान ऑर्गेनोइड संस्कृति की व्यवहार्यता सुनिश्चित करती है।
    5. चयनित कुओं के एपिकल और बेसोलेटरल कक्षों से माध्यम को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
    6. एपिकल चैंबर में परिवहन बफर के 200 μL और बेसोलेटरल चैंबर में 800 μL जोड़ें।
      नोट: परिवहन बफर को पहले एपिकल चैंबर में जोड़ा जाना चाहिए और फिर माइक्रोपोरस झिल्ली से मोनोलेयर की टुकड़ी से बचने के लिए बेसोलेटरल चैंबर में जोड़ा जाना चाहिए।
    7. संतुलित करने के लिए 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस; 5% सीओ2 वातावरण) में प्लेट रखें।
      नोट: कैनाइन ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर अब दवा पारगम्यता प्रयोग के लिए तैयार हैं।
  3. विशिष्ट प्रयोगात्मक लेआउट-आईजीवाई एकाग्रता समाधान
    नोट: प्रयोगात्मक डिजाइन और लेआउट अनुसंधान प्रश्न के आधार पर बदल सकते हैं। एक ऑर्गेनोइड मोनोलेयर के माध्यम से इम्युनोग्लोबुलिन वाई (आईजीवाई) की पारगम्यता का उपयोग प्रोटोकॉल में एक उदाहरण के रूप में किया जाता है और इसे संशोधित किया जा सकता है। शब्द दाता कक्ष उस कक्ष को संदर्भित करता है जहां दवा शुरू में लागू होती है, जबकि प्राप्त कक्ष दाता कक्ष से दवा स्वीकार करने वाले कक्ष को संदर्भित करता है। एक विशिष्ट प्रयोग 2 घंटे (जैसे, 15, 30, 60, 90, 120 मिनट) से अधिक रिसीवर कक्षों में नमूने एकत्र करता है।
    1. वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए परिवहन बफर में भंग करके आईजीवाई समाधान (दवा या पसंद का विलेय) तैयार करें। आवश्यकता से अधिक दवा समाधान तैयार करें।
      नोट: कम जलीय घुलनशीलता वाली दवाओं को बफर में जोड़ने से पहले एक कार्बनिक विलायक (जैसे, इथेनॉल, डीएमएसओ) में भंग किया जा सकता है। विलायक की अंतिम एकाग्रता 1% से कम होनी चाहिए ताकि सेल मोनोलेयर को नुकसान न पहुंचे।
    2. प्रत्येक कुएं के दाता कक्ष (या तो एपिकल या बेसोलेटरल चैंबर) से बफर निकालें।
    3. सभी दाता कक्षों में आईजीवाई समाधान (दवा समाधान) जोड़ें। प्रारंभिक दवा एकाग्रता के माप के लिए समय 0 दाता समाधान के रूप में शेष समाधान का उपयोग करें।
    4. आवश्यक समय बिंदुओं पर, प्राप्त कक्ष से 50 μL निकालें और इसे एक लेबल ट्यूब में रखें। अंतिम समय बिंदु पर, दाता कक्ष से एक नमूना निकालें। प्रयोग के अंत में, दाता और रिसीवर विभाज्य को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें।
      नोट: यदि कई समय बिंदुओं की आवश्यकता होती है, तो प्राप्त कक्ष में बफर का प्रतिस्थापन किया जा सकता है लेकिन स्पष्ट पारगम्यता की गणना में इसका हिसाब होना चाहिए। रिसीवर कक्ष में एकाग्रता सिंक की स्थिति 44 को बनाए रखने के लिए प्रयोग के अंत में दाता कक्ष के 10% से अधिक तक नहींपहुंचनी चाहिए।
  4. ऑर्गेनोइड सेल मोनोलेयर गुणवत्ता नियंत्रण
    नोट: प्रयोग के दौरान मोनोलेयर अखंडता की पुष्टि करने के लिए एफआईटीसी-डेक्सट्रान समाधान का उपयोग किया जा सकता है। एफआईटीसी-डेक्सट्रान का उपयोग मोनोलेयर अखंडता परख के उदाहरण के रूप में किया जाता है। अन्य में लूसिफर पीला, पीईजी -4000, रेडियोलेबल मैनिटोल और इनुलिन44 शामिल हैं।
    1. समय 0 मिनट पर, एपिकल चैंबर की सामग्री की आकांक्षा करें और प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए ट्रिप्लिकेट में एफआईटीसी-डेक्सट्रान समाधान (5 मिलीग्राम / एमएल, 4 केडीए) के 250 μL के साथ प्रतिस्थापित करें।
      नोट: प्रकाश के लिए एफआईटीसी-डेक्सट्रान का पर्दाफाश न करें।
    2. 20 मिनट के बाद, बेसोलेटरल चैंबर से बफर को हटा दें।
    3. एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग कर बेसोलेटरल नमूने की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापें (एक अंशांकन वक्र का उपयोग करें; 485 एनएम पर उत्तेजना सेट और 528 एनएम पर उत्सर्जन मूल्य)।
      नोट: एफआईटीसी के पीऐप की गणना चर्चा में वर्णित विधि का उपयोग करके भी की जा सकती है।
    4. प्रयोग समाप्त होने के बाद, एपिकल और बेसोलेटरल कक्षों से अतिरिक्त बफर को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
    5. एपिकल चैंबर में सीएमजीएफ + के 200 μL और बेसोलेटरल चैंबर में 700 μL जोड़ें।
    6. व्यक्तिगत कुओं में टीईईआर मूल्यों को मापें।
    7. 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस; 5% सीओ 2 वातावरण) में प्लेट रखें।
    8. यदि लागू हो, तो 24 घंटे के बाद, प्रयोग के गुणवत्ता नियंत्रण भाग के दौरान मोनोलेयर को संभावित क्षति का आकलन करने के लिए टीईईआर मूल्यों को मापें। कैनाइन ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर की अखंडता की कल्पना करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें।
  5. डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए सेल मोनोलेयर को ठीक करना
    1. फॉर्मलिन-एसिटिक एसिड-अल्कोहल समाधान (एफएए, तालिका 1 में संरचना) तैयार करें।
    2. पी 1000 पिपेट या बाँझ डिस्पोजेबल 9 "पाश्चर पिपेट्स और एक वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके एपिकल और बेसोलेटरल कक्षों से परिवहन बफर या सीएमजीएफ + निकालें।
    3. एफएए के साथ एपिकल और बेसल कक्षों को भरें।
    4. 24 घंटे के बाद, एफएए की आकांक्षा करें और इसे 70% इथेनॉल के साथ बदलें।
    5. वाष्पीकरण को रोकने के लिए लचीली प्रयोगशाला फिल्म के साथ प्लेट लपेटें और तैयारी को अवरुद्ध करने के लिए आगे बढ़ें।

Figure 6
चित्रा 6: प्रयोगात्मक समूहों में टीईईआर मूल्य। टीईईआर मूल्यों को कुत्ते आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर के पांच समूहों में मापा गया था। तीन समूह कैनाइन जेजुनल एंटरॉइड से बने थे, और दो समूहों में कॉलोनोइड शामिल थे। प्रत्येक समूह में 12 से 22 प्रतिकृतियां शामिल थीं। जेजुनल एंटरॉइड संस्कृतियों के लिए टीईईआर मूल्यों को दिन 4 से दिन 14 तक दिखाया गया है, और कॉलोनॉइड संस्कृतियों को दिन 4 से दिन 12 तक दिखाया गया है (माप समाप्त हो गया क्योंकि ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर स्थिर-राज्य मूल्यों तक पहुंच गया, यह दर्शाता है कि मोनोलेयर प्रयोगात्मक उपयोग के लिए तैयार था)। त्रुटि सलाखों माप के एसईएम व्यक्त करते हैं। संक्षिप्त नाम: टीईईआर = ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

कैनाइन ऑर्गेनोइड की संस्कृति के लिए मानक संचालन प्रक्रियाओं को पहले33 वर्णित किया गया था, और इस विशेष अंक38 में कैनाइन ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल पर भी विस्तार से चर्चा की गई है। पारगम्य समर्थन पर सुसंस्कृत कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड को मोनोलेयर और सेल आबादी के माइक्रोएनाटॉमी की जांच करने के लिए तय और पैराफिन-एम्बेडेड किया गया था। पैराफिन-एम्बेडिंग प्रक्रिया पर पहले गेब्रियल एट अल 38 द्वारा चर्चा की गई थी। नियमित धुंधला (हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन) का प्रदर्शन किया गया है, और कैनाइन ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर ( चित्रा 7 देखें) में गोब्लेट कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एल्सियन ब्लू धुंधला तकनीक का उपयोग किया गया था।

Figure 7
चित्रा 7: कैनाइन आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर धुंधला हो जाना। पारगम्य समर्थन में कॉलोनिक मूल के कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड पैराफिन-एम्बेडेड और एच एंड ई और एबी के साथ दाग दिए गए हैं प्रतिनिधि छवियों को 40x (ए) और 60x (बी) आवर्धन पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लिया गया था। एच एंड ई धुंधला एक स्तंभ उपकला मोनोलेयर का पता चलता है, और कोशिकाओं के एपिकल भाग में माइक्रोविली को 60x आवर्धन पर देखा जा सकता है। एबी धुंधला आगे कुत्ते आंतों के ऑर्गेनोइड मोनोलेयर में गोबलेट कोशिकाओं (गहरे नीले) की उपस्थिति का खुलासा करता है। स्केल सलाखों = 20 μm (A), 50 μm (B)। संक्षिप्त नाम: एच एंड ई = हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन; एबी = एल्सियन ब्लू। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पारगम्यता प्रयोग के लिए तैयार होने के लिए पारगम्य समर्थन पर ऑर्गेनोइड संस्कृति को 10 से 14 दिनों के लिए उगाया जाना चाहिए। दवा उम्मीदवारों की पारगम्यता परीक्षण के लिए ऑर्गेनोइड संस्कृति की तत्परता की पुष्टि करने के लिए टीईईआर मूल्य माप के साथ संयोजन के रूप में प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है। स्वस्थ और रोगग्रस्त जानवरों से विभिन्न कुत्ते आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर की प्रतिनिधि प्रकाश सूक्ष्म छवियां चित्रा 8 में प्रस्तुत की गई हैं।

Figure 8
चित्रा 8: कैनाइन आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर माइक्रोस्कोपी। प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत देखे गए बढ़ते मोनोलेयर की छवियां। स्वस्थ दाताओं से प्राप्त ऑर्गेनोइड मोनोलेयर को जेजुनल एंटरॉइड (10x; 40x) और कॉलोनॉइड (20x; 40x) संस्कृतियों द्वारा दर्शाया जाता है। रोगग्रस्त दाताओं के ऑर्गेनोइड मोनोलेयर को ग्रहणी (5x; 10x) और इलियल (5x; 10x) एंटरॉइड्स द्वारा दर्शाया जाता है जो पीएलई के निदान वाले कुत्ते के रोगी से प्राप्त होते हैं। दोनों पीएलई ऑर्गेनोइड संस्कृतियां ऑर्गेनोइड के बोने के दौरान अनुचित सेल अलगाव के उदाहरण हैं, और इन संस्कृतियों का उपयोग 3 डी ऑर्गेनोइड की उपस्थिति के कारण दवा पारगम्यता परख के लिए नहीं किया जा सकता है। उचित मोनोलेयर गठन से विचलन के उदाहरण, जैसे मोनोलेयर आँसू (5x), जैविक नमूनों के लापरवाह हेरफेर के कारण होते हैं। ऑर्गेनोइड्स (10x; 20x) की लंबी संस्कृति डालने पर ऑर्गेनोइड के लंबे रखरखाव के कारण होती है जब ऑर्गेनोइड अपनी मूल 3 डी संरचना से मिलते जुलते होने लगते हैं। तुलना के लिए, दवा पारगम्यता अध्ययन के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले पारगम्य समर्थन पर पारंपरिक 2 डी सेल लाइनों की छवियां प्रस्तुत की जाती हैं (एमडीसीके -10 एक्स; 40 एक्स, और कैको -2-10 एक्स; 20 एक्स)। संक्षिप्त नाम: पीएलई = प्रोटीन खोने वाली एंटरोपैथी; एमडीसीके = मैडिन-डार्बी कैनाइन किडनी। स्केल बार = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 3% पैराफॉर्मलडिहाइड -3% ग्लूटाराल्डिहाइड में ऑर्गेनोइड मोनोलेयर भी तय किए गए थे। पारगम्य समर्थन पर ऑर्गेनोइड संस्कृति के अल्ट्रास्ट्रक्चर को चिह्नित करने के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग किया गया था। माइक्रोविली और तंग जंक्शनों की माइक्रोएनाटोमिकल संरचनाओं को चित्र 9 में देखा जा सकता है।

Figure 9
चित्रा 9: स्वस्थ कुत्ते आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर की टीईएम छवियां। टीईएम का उपयोग जेजुनल (ए), इलियल (बी), और कॉलोनिक (सी) ऑर्गेनोइड मोनोलेयर के सेलुलर माइक्रोआर्किटेक्चर को प्रकट करने के लिए किया गया था। पारगम्य समर्थन डालने की माइक्रोपोरस झिल्ली को पीले तीर के साथ चिह्नित किया जाता है। माइक्रोविली (नीला तीर) और तंग जंक्शनों (लाल तीर) की उपस्थिति छवियों में चित्रित की गई है। संक्षिप्त नाम: टीईएम = ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। स्केल सलाखों = 5 μm (ए), 2 μm (बी, सी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

टीईईआर माप और प्रकाश माइक्रोस्कोपी दोनों को यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि सिस्टम पारगम्यता परीक्षण के लिए तैयार है। टीईईआर एक स्थिर अवस्था में पहुंचने पर परख उपयोग के लिए तैयार है, जबकि प्रकाश माइक्रोस्कोपी ऑर्गेनोइड के नुकसान या अतिवृद्धि को बाहर करने में मदद करेगी। कैनाइन जेजुनल एंटरॉइड्स और कॉलोनोइड्स से युक्त पांच समूहों के विशिष्ट टीईईआर माप का सारांश चित्रा 6 में प्रस्तुत किया गया है।

तालिका 1: ऑर्गेनोइड मीडिया और एफएए की संरचना। सीएमजीएफ +, सीएमजीएफ + आर /जी, और एफएए की पूरी संरचना को इस तालिका में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। संक्षिप्त नाम: रॉक = आरएचओ से जुड़े किनेज; जीएससीआईβ = ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनेज बीटा; सीएमजीएफ + आर/जी = रॉक अवरोधक और जीएसकेआईβ के साथ बढ़ाए गए विकास कारकों के साथ पूर्ण माध्यम; सीएमजीएफ + = विकास कारकों के साथ पूर्ण माध्यम लेकिन रॉक अवरोधक या जीएसकेआईβ के बिना; एफएए = फॉर्मलिन-एसिटिक एसिड-अल्कोहल; ईजीएफ = एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर। यह तालिका 38 से अनुकूलित है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: पारगम्य समर्थन प्रणाली के कुत्ते ऑर्गेनोइड पर नोट लेने के लिए तालिका। संक्षिप्त नाम: टीईईआर = ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध; रॉक = रो-जुड़े किनेज; जीएससीआईβ = ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनेज बीटा; सीएमजीएफ + आर/जी = रॉक अवरोधक और जीएसकेआईβ के साथ बढ़ाए गए विकास कारकों के साथ पूर्ण माध्यम; सीएमजीएफ + = विकास कारकों के साथ पूर्ण माध्यम लेकिन रॉक अवरोधक या जीएसकेआईβ के बिना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

पारगम्य समर्थन तंत्र में कैनाइन आंतों ऑर्गेनोइड संस्कृतियां पारंपरिक दवा पारगम्यता परख40 को इन विट्रो कैनाइन मॉडल41 में एक उपन्यास के साथ जोड़ने वाली एक अनूठी अवधारणा है। विभिन्न प्रकार के कुत्ते आंतों के ऑर्गेनोइड का उपयोग किया जा सकता है और न्यूनतम समायोजन के साथ प्रयोग के लक्ष्य के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है। प्रति समूह 3-4 कुओं में ब्याज की दवा की कई सांद्रता का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। सांद्रता दवा की अपेक्षित आंतों की एकाग्रता पर आधारित हो सकती है। इसके अलावा, पिछले शोध का उपयोग करने से अध्ययन डिजाइन के लिए उपयुक्त समय बिंदु निर्धारित करने में मदद मिल सकती है। प्रतिकृति बढ़ाने और समस्या निवारण में सहायता करने के लिए अध्ययन डिजाइन का उचित प्रलेखन किया जाना चाहिए।

विधि42 की नवीनता के कारण इस तकनीक की कई सीमाएं हैं, ज्यादातर प्रयोगशालाओं में प्रयोगात्मक डिजाइन और प्रोटोकॉल के निष्पादन में मानकीकरण की कमी के कारण। मानकीकरण की इस कमी को अन्यसमूहों 43 द्वारा स्वीकार किया गया है, और कैनाइन 3 डी ऑर्गेनोइड मोनोलेयर प्रोटोकॉल इंटरलेबोरेटरी प्रजनन क्षमता का नेतृत्व करेंगे और इस प्रणाली में मानकीकरण पेश करेंगे। डेटा विश्लेषण के लिए मानकीकृत दृष्टिकोण प्रतिकृति में सुधार करते हैं और विभिन्न प्रयोगशालाओं में पारगम्य समर्थन प्रणाली में कैनाइन ऑर्गेनोइड का उपयोग करके प्रारंभिक दवा परीक्षण के परिणामों को मजबूत कर सकते हैं। कैनाइन 3 डी ऑर्गेनॉइड मॉडल में मॉडल दवाओं के इन विट्रो पीऐप मूल्यों की तुलना में विवो आंतों के अवशोषण में उनके ज्ञात मानव या कुत्ते की तुलना में डेटा सेट का भी अभाव है, जैसे कि कैको -2 कोशिकाएं44,45,46। एक बार इस तरह के डेटा उत्पन्न होने के बाद, इस कैनाइन ऑर्गेनोइड मॉडल का उपयोग दवा के विकास के दौरान आंतों की पारगम्यता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

यह महत्वपूर्ण है कि उचित रूप से पृथक कोशिकाओं के उच्च पर्याप्त घनत्व को बीज देने के लिए पारगम्य समर्थन प्रणाली पर ऑर्गेनोइड को बोते समय देखभाल की जाती है। सख्त मोनोलेयर में उगाए जाने पर सिस्टम के टीईईआर मूल्य अधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होते हैं। मोनोलेयर्स की लंबे समय तक संस्कृति से आंत के शारीरिक मूल्यों से आगे तक पहुंचने वाले टीईईआर मूल्यों में घातीय वृद्धि हो सकती है। ऐसी 3 डी संरचनाओं के एच एंड ई खंड तब झिल्ली के करीब एंटरोसाइट्स की परिवर्तित संरचनाओं के साथ एक दूसरे के ऊपर कोशिकाओं की कई परतों को दिखाते हैं।

कुत्ते आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर के सफल विस्तार के बाद, परिणामों का विश्लेषण दवा के स्पष्ट पारगम्यता गुणांक (पीऐप) सूत्र44 की गणना करके पारंपरिक 2 डी सेल परख के समान किया जा सकता है। पीऐप मान (ईक्यू (2) देखें) सेलुलर मोनोलेयर47 में परिवहन की दर का वर्णन करता है।

Equation 2 (2)

Equation 3 समय वक्र बनाम एकाग्रता की प्रारंभिक ढलान है (उदाहरण के लिए, एनएमओएल / ए डालने का क्षेत्र है (सेमी2), और सी0 दाता कक्ष37 में दवा या यौगिक की प्रारंभिक एकाग्रता है। मोनोलेयर अखंडता की विश्वसनीय मान्यता पारगम्यता परख का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है जिसके लिए मानकीकरण की आवश्यकता होती है। प्रकाश माइक्रोस्कोपी और टीईईआर माप को पारगम्य समर्थन प्रणाली में कुत्ते के ऑर्गेनोइड का आकलन करने और प्रयोग के सही समय को निर्धारित करने में मदद करने की सिफारिश की जाती है। इसके अतिरिक्त, शून्य आणविक पारगम्यता मार्करों (जैसे, एफआईटीसी-डेक्सट्रान, लूसिफर पीला, खूंटी -400) का उपयोग कार्यात्मक रूप से ऑर्गेनोइड मोनोलेयर अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। यदि परीक्षण किया गया यौगिक ट्रांसपोर्टर से प्रभावित होता है तो ध्यान दिया जाना चाहिए। पी-ग्लाइकोप्रोटीन (पी-जीपी) का उपयोग एक सामान्य प्रवाह पंप उदाहरण के रूप में किया जाता है। एक प्रसिद्धपी-जीपी जांच सब्सट्रेट की तुलना में एक प्रवाह अनुपात (पीऐप, बीएल-एपी / पी ऐप, एपी-बीएल) उत्पन्न किया जाना चाहिए।

प्रकाश माइक्रोस्कोपी (सादा या चरण विपरीत के साथ बढ़ाया) संभव सेलुलर अतिवृद्धि का आकलन करते समय 2 डी या 3 डी मोनोलेयर और फिल्टर डालने की अखंडता की जांच करने के लिए एक अमूल्य तरीका है। चित्रा 7 स्वस्थ कुत्ते आंतों ऑर्गेनोइड सेल संस्कृतियों को पहचानने के लिए एक गाइड के रूप में काम कर सकता है। टीईईआर मूल्य अंतरकोशिकीय जंक्शनों के गठन और एक बरकरार आंतों के उपकला में ऑर्गेनोइड संस्कृतियों के भेदभाव का एक महत्वपूर्ण उपाय है। कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड एंटरोसाइट्स और गोबलेट कोशिकाओं (चित्रा 6) में अंतर करते हैं। ये बलगम उत्पादक कोशिकाएं दवा-बलगम इंटरैक्शन के अध्ययन की अनुमति देती हैं, जिसे पारंपरिक 2 डी सेल संस्कृतियों48 का उपयोग करके प्राप्त करना मुश्किल रहा है। एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि पहले चंद्रा एट अल द्वारा कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड में की गई है।

टीईएम का उपयोग करके जेजुनल, इलियल और कॉलोनिक ऑर्गेनोइड से प्राप्त कैनाइन ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर का आगे लक्षण वर्णन प्रदान किया गया है। टीईएम छवियां सेलुलर माइक्रोआर्किटेक्चर दिखाती हैं, जिसमें तंग जंक्शन और माइक्रोविली गठन शामिल हैं, जो ट्रांसलेशनल मेडिसिन में इन ऑर्गेनोइड मॉडल की जटिलता और उपयोगिता को दर्शाते हैं। प्रयोगात्मक परिणामों के आधार पर, पारगम्य समर्थन पर ऑर्गेनोइड संस्कृतियों दिन 11 और दिन 13 पोस्ट बोने के बीच प्रयोग के लिए तैयार थे (चित्रा 9)। इस समय टीईईआर मान 1,500 और 2,500 Ω सेमी2 के बीच था। टीईईआर मूल्यों का पठार चरण समय की एक बहुत ही सीमित खिड़की के लिए रहता है जहां टीईईआर मूल्यों को धीरे-धीरे गिरावट शुरू करने से पहले प्रयोग शुरू किया जाना चाहिए। टीईईआर मूल्य भी महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक परिणामों को प्रदर्शित करने का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हो सकते हैं क्योंकि कुछ दवाएं या दवा उत्पाद एक्सिपिएंट्स मोनोलेयर (जैसे, तंग जंक्शन) के साथ बातचीत कर सकते हैं, जो टीईईआर मूल्य रीडआउट को बहुत प्रभावित कर सकते हैं। यह अकेले एक प्रयोग के लिए डेटा के रूप में काम कर सकता है।

एक दोहरे कक्ष सेल संस्कृति तंत्र में कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड परिणामी सेल मोनोलेयर की अनूठी वास्तुकला के कारण मौखिक दवा पारगम्यता के अलावा अन्य क्षेत्रों में लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, उनका उपयोग माइक्रोबायोलॉजी अनुसंधान (जैसे, जीआई माइक्रोबियल वनस्पतियों को बदलने का प्रभाव), वायरल अपटेक अध्ययन, ड्रग-ड्रग इंटरैक्शन और ड्रग ट्रांसपोर्ट मैकेनिज्म49 में किया जा सकता है। दाता कक्ष आमतौर पर परीक्षण दवा या पसंद के यौगिक से भरा होता है, और रिसीवर कक्ष से विभाज्य विभिन्न समय बिंदुओं पर लिया जाता है। इन विभाज्य का विश्लेषण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख, या अन्य तकनीकों का उपयोग करके किया जा सकता है ताकि उस मात्रा और गति को निर्धारित किया जा सके जिसके द्वारा विलेय मोनोलेयर के माध्यम से प्रवेश करता है।

इन अध्ययनों में दवा पारगम्यता का सटीक आकलन करने के लिए एक बरकरार मोनोलेयर की आवश्यकता होती है। इसके लिए आमतौर पर अनुपयोगी कुओं के लिए आवश्यक मोनोलेयर से अधिक बढ़ने की आवश्यकता होती है। ऑर्गेनोइड सेल मोनोलेयर का उपयोग मोनोलेयर के एपिकल या बेसल पक्ष से वायरल अपटेक को मापने के लिए भी किया जा सकता है, जिसमें वायरस के सेलुलर अपटेक का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख-उपयोग एंटीबॉडी सहित रीडआउट शामिल हैं। अंत में, ट्रांसपोर्टर-आधारित ड्रग-ड्रग इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए दाता कक्ष में कई दवाओं (यानी, सब्सट्रेट और अवरोधक) को लागू किया जा सकता है।

वर्तमान टिप्पणियों के आधार पर, ये विधियां न केवल संस्कृति आवेषण में कुत्ते के ऑर्गेनोइड पर लागू होंगी, बल्कि अन्य पशु चिकित्सा प्रजातियों और अंग प्रणालियों के लिए भी उपयुक्त होंगी, जिसमें पसंद की प्रजातियों या अंग मॉडल के अनुरूप मामूली संशोधनों की आवश्यकता होगी। कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड विकास के लिए प्रोटोकॉल को संस्कृति के अद्वितीय गुणों के आधार पर समायोजित किया जाना था। इस प्रकार, प्रोटोकॉल को किसी अन्य प्रजाति में समायोजित किया जा सकता है लेकिन प्रोटोकॉल में सूक्ष्म परिवर्तन की आवश्यकता होगी। संशोधन सेल सीडिंग घनत्व में परिवर्तन के साथ शुरू हो सकते हैं और ब्याज के ऑर्गेनोइड को ठीक से अलग करने के लिए मीडिया संरचना में परिवर्तन का विस्तार कर सकते हैं।

मानकीकरण, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के विस्तृत प्रलेखन, और सेल मोनोलेयर की लगातार निगरानी पारगम्य समर्थन परख में आवश्यक महत्वपूर्ण प्रथाएं हैं और कुत्ते प्रणाली तक सीमित नहीं हैं। ये संभावित प्रजातियां या अंग संशोधन क्षेत्र में आगे की प्रगति के लिए दस्तावेज और रिपोर्ट करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस मॉडल की कई सीमाएं हैं, उदाहरण के लिए, इसकी लागत आवश्यकताएं, अंतर-प्रयोगशाला परिवर्तनशीलता, और विवो में आंतों के अवशोषण की भविष्यवाणी करने की क्षमता पर सीमित डेटा। कुत्तों, कुछ मामलों में, मनुष्यों की तुलना में विभिन्न दवा ट्रांसपोर्टर और चयापचय एंजाइम50 के अधिकारी हैं।

इसके अलावा, इस तरह के मॉडल की उपयुक्तता निर्धारित करने के लिए अन्य निर्माताओं से विभिन्न प्रकार के अन्य दोहरे-कक्ष उपकरणों पर कैनाइन ऑर्गेनोइड सिस्टम का परीक्षण किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, विभिन्न फिल्टर झिल्ली रचनाओं की उपयुक्तता निर्धारित की जानी चाहिए)। एक और नुकसान यह है कि पांडुलिपि का दवा पारगम्यता प्रयोग भाग पिछले भागों की तुलना में कम वर्णनात्मक है। यह इस फ़ील्ड में जानकारी की अधिकता के कारण होता है। पांडुलिपि के इस हिस्से का लक्ष्य इन प्रयोगों की आधारशिलाओं के किनारों को नहीं काटते हुए इन विधियों का एक परिवर्तनीय तरीके से वर्णन करना था। पारगम्यता प्रयोगों पर अधिक विस्तृत जानकारी हुबात्श एट अल द्वारा एकत्र की गई है। इसके अतिरिक्त, पारगम्य आवेषण का उपयोग कोकल्चर, सेल माइग्रेशन और आक्रमण परख प्रयोगों में किया जा सकताहै 4.

अंत में, दोहरे कक्ष संस्कृति उपकरणों में कुत्ते आंतों के ऑर्गेनोइड में बायोमेडिकल क्षेत्रों और ट्रांसलेशनल मेडिसिन सहित अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोग करने की क्षमता है। प्रोटोकॉल एक प्रयोग की योजना बनाने और जीव विज्ञान के क्षेत्र में ऑर्गेनोइड मॉडल के लिए इंटरलेबोरेटरी डेटा निर्भरता को बढ़ावा देने के लिए कई रणनीतियां बनाते हैं।

Disclosures

के एलेनस्पैच लिफइंजिन एनिमल हेल्थ और 3 डी हेल्थ सॉल्यूशंस के सह-संस्थापक हैं। वह सेवा एनिमल हेल्थ, बायोइबेरिका, लाइफडायग्नोस्टिक्स, एंटेक डायग्नोस्टिक्स, डियरलैंड प्रोबायोटिक्स और मंगल ग्रह के लिए सलाहकार के रूप में कार्य करती है। जेपी मोचेल लिफइंजिन एनिमल हेल्थ और 3 डी हेल्थ सॉल्यूशंस के सह-संस्थापक हैं और सेवा पशु स्वास्थ्य और लोकाचार पशु स्वास्थ्य के लिए सलाहकार के रूप में कार्य करते हैं। यह लेख लेखकों के विचारों को दर्शाता है और इसे खाद्य एवं औषधि प्रशासन के समर्थन, दृष्टिकोण या नीतियों का प्रतिनिधित्व करने के लिए नहीं समझा जाना चाहिए। अन्य लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम नमूनों के समय पर प्रसंस्करण के लिए आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी के कर्मचारियों, अर्थात् हेली लैम्बर्ट, एमिली राहे, रोजलिन ब्रैनमैन, विक्टोरिया ग्रीन और जेनिफर ग्रोएल्ट्ज-थ्रश की पशु चिकित्सा नैदानिक प्रयोगशाला के प्रति आभार व्यक्त करना चाहते हैं। हम पारगम्यता प्रयोगों के लिए सामग्री प्रदान करने के लिए जोड़ी स्मिथ और बेथन वेलेंटाइन को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। हम चित्रा 9 के साथ उनकी मदद के लिए डेविड डियाज़-रेगनन को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। चित्रा 6 को छोड़कर, सभी आंकड़े BioRender.com में बनाए गए थे। लेखक संकाय स्टार्टअप, आईएसयू वीपीआर मिलर पुरस्कार, आईएसयू वीपीआर मिलर पुरस्कार और एनएसएफ एसबीआईआर उपवार्ड से आईएसयू # 1912948 के समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid media
 ROCK inhibitor (Y-27632) EMD Millipore Corp. SCM 075
[Leu15]-Gastrin I human Sigma G9145-.5MG
A-83-01 PeproTech 9094360
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
B27 supplement Gibco 17504-044
FBS Corning 35-010-CV
Glutamax Gibco 35050-061 glutamine substitute
HEPES VWR Life Science J848-500ML
Human R-Spondin-1 PeproTech 120-38-500UG
Murine EGF PeproTech 315-09-1MG
Murine Noggin PeproTech 250-38-250UG
Murine Wnt-3a PeproTech 315-20-10UG
N2 supplement Gibco 17502-048
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A9165-25G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Primocin InvivoGen ant-pm-1
SB202190 (P38 inhibitor) Sigma S7067-25MG
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) Reprocell 04-0004-base
TMS (trimethoprim sulfate) Sigma T7883-5G
Reagents
Acetic Acid, Glacial Fisher Chemical A38-500
alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous Acros Organics 170080010
Cell Recovery Solution Corning 354253
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL Gibco A10483-01
FITC-CM-Dextran Millipore Sigma 68059-1G
Formaldehyde (37%) Fisher Chemical F79P-4
Glutaraldehyde solution Sigma G5882
HBSS (1x) Gibco 14025-076
Matrigel Matrix For Organoid Culture Corning 356255 Extracellular Membrane Matrix
Paraformaldehyde, 97% Alfa Aesar A11313
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) Corning 21-040-CM
TrypLE Express Gibco 12604-021 Trypsin-like Protease
Materials and Equipment
15 mL Centrifuge Tube Corning 430766
9" Pasteur Pipets Fisherbrand 13-678-6B
Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile Corning 3470 Permeable Support
Millicell ERS (Probes) Millipore Sigma MERSSTX01
Millicell ERS-2 Voltohmmeter Millipore Sigma MERS00002
Panasonic incubator Panasonic MCO-170ML-PA
Parafilm M Wrapping Film Bemis Company Inc PM996/EMD Flexible Laboratory Film
Tissue Culture Plate 24 wells Fisherbrand FB012929

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 181 पारगम्य समर्थन दोहरे कक्ष कुत्ते ऑर्गेनोइड आंत स्टेम सेल ट्रांसलेशनल रिसर्च रिवर्स ट्रांसलेशनल रिसर्च वन हेल्थ इनिशिएटिव ड्रग डिस्कवरी ड्रग पारगम्यता
एक दोहरी चैंबर पारगम्य समर्थन प्रणाली में कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड
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Gabriel, V., Zdyrski, C., Sahoo, D.… More

Gabriel, V., Zdyrski, C., Sahoo, D. K., Dao, K., Bourgois-Mochel, A., Atherly, T., Martinez, M. N., Volpe, D. A., Kopper, J., Allenspach, K., Mochel, J. P. Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System. J. Vis. Exp. (181), e63612, doi:10.3791/63612 (2022).

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