Summary
여기에서, 우리는 이중 챔버, 투과성 지원 시스템에서 송곳니 장 오가노이드의 배양을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 투과성 지지체에서의 오가노이드 시딩, 단층 유지, 및 후속 약물 투과성 실험이 기재되어 있다.
Abstract
투과성 지지 시스템은 전형적으로 새로운 치료 약물 후보물질의 경구 투과성을 평가하기 위한 시험관내 도구로서 전통적인 2차원(2D) 세포주와 함께 사용된다. 그러나, 이러한 종래의 세포주의 사용은 타이트한 접합의 변경된 발현, 부분 세포 분화, 및 주요 핵 수용체의 부재와 같은 한계를 갖는다. 이러한 단점에도 불구하고, Caco-2 및 MDCK 모델은 인간 생체내 경구 투과성의 예측을 위해 널리 받아들여지고 검증된다.
개는 위장 해부학 및 인간과의 장내 미생물과의 유사성으로 인해 생물 의학 연구를위한 관련 번역 모델입니다. 따라서, 병행 약물 개발을 지지하며, 개와 인간 모두에서 생체내 약물 투과성 특성을 예측하기 위한 효율적이고 정확한 시험관내 도구의 정교화가 매우 바람직하다. 이러한 도구는 성체 줄기세포로부터 유래된 3차원(3D), 자기조립된 상피 구조를 특징으로 하는 송곳니 장내 오가노이드 시스템일 수 있다.
(1) 투과성 지원 시딩 프로토콜은 인서트에서 송곳니 오가노이드를 해리시키고 시딩하는 실험적 방법을 설명합니다. 송곳니 오가노이드 분리, 배양 및 수확은 이전에이 특별한 문제에서 별도의 프로토콜 세트에 설명되어 있습니다. 송곳니 장내 오가노이드 단일층의 일반적인 유지를 위한 방법은 (2) 단층 유지 프로토콜에서 철저하게 논의된다. 추가적으로, 이 프로토콜은 경상피 전기 저항(TEER) 측정 및 광 현미경을 통해 단층의 구조적 완전성을 평가하는 방법을 기술한다. 마지막으로, (3) 투과성 실험 프로토콜은 실험 결과의 시험관내 검증을 포함하여 실험 직전에 선행하는 작업들을 기술한다.
전반적으로, 이중 챔버 세포 배양 기술과 결합 된 송곳니 오가노이드 모델은 2D 실험 모델과 관련된 한계를 극복함으로써 송곳니와 인간 환자 모두에서 치료 약물 후보의 명백한 구강 투과성에 대한 예측의 신뢰성을 향상시킵니다.
Introduction
투과성 지지 시스템은 전형적으로 장 상피 장벽 1,2를 통해 치료 약물 후보의 겉보기 투과성을 결정하기 위해 사용된다. 이들은 또한 세포 분비3, 세포 이동4 및 약물 독성5를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 시험관내 경구 약물 투과성 분석은 약물 발견 및 개발 과정2의 핵심 단계이며, 개별 약물 후보는 약물 R & D 수명주기6의 초기 단계에서 테스트됩니다. 투과성 지지체 시스템은 멀티웰 플레이트에 배치된 반다공성 멤브레인을 갖는 삽입물로 구성된 이중 챔버 세포 배양 장치이다. 이 시스템은 인서트(7)에서 성장한 세포-단일층의 정점 및 기저측 측에 직접 접근할 수 있게 한다. 이들 시스템에 사용되는 단층은 전형적으로 위장관 상피 세포 (예를 들어, 인간 결장직장 선암종 Caco-2 세포주)8로부터 유래된다. 세포 배양물은 장 상피 세포의 자연적인 미세 구조를 모방하는 편광 상태에서 성장하여, 추가적인 세포 분화, 유사한 미세해부학 및 기능을 가능하게한다7. 투과성 지지 인서트에 대한 자세한 내용은 그림 1에서 확인할 수 있습니다. 전통적으로 장내 약물 투과성을 평가하기 위해 사용되었던 2D 세포 배양물을 사용한 인서트의 시딩은 비교적 저렴하고 배양하기 쉽다9. 이들 시스템은 치료 약물 후보(10,11)의 장 대사를 예측하는 그들의 제한된 능력을 포함하는 몇 가지 주요 한계를 제시한다. 이것은 상피 세포 사이의 타이트한 접합을 통한 수동 흡수, 유출을 통한 활성 경상피 흡수, 또는 흡수 수송체 (예를 들어, P-당단백질, 모노카르복실레이트 수송체 1) 및 장세포에 의해 대사되는 약물에 대한 모든 약물 흡수에 대해 참말이다.
개는 인간과 공통된 환경과 식단을 공유합니다12. 송곳니 장 해부학 및 미생물 구성은 지난 36,000 년 동안 가축화 및 공유 식단에 기인 한 인간 13의 것과 매우 유사합니다14. 불행히도, 이러한 유사성은 또한 질병 발달을위한 일반적인 원인 / 트리거가 될 수 있습니다. 개들은 비만 15, 염증성 장 질환 16, 결장직장 선암종17, 위장관 간질 종양 (GIST)18 및 상대적 장수와 관련된 다양한 다른 병리와 같은 인간과 유사한 만성 이환을 일으킨다 19. 따라서, 송곳니 오가노이드는 One Health Initiative20의 정신으로 이러한 만성 다인자 질환의 역번역 연구에 성공적으로 사용될 수 있다.
Caco-2 세포는 약물 경구 흡수 분석(21)에 가장 많이 사용되는 세포주이다. 이들 세포는 현재 시험관내 장 투과성 검정2,22,23에 대한 "황금 표준" 모델로 간주된다. Caco-2 세포주는24,25,26 발현 수준이 다르지만 인간 장내에서 발견되는 유출 및 흡수 수송체를 발현한다. Caco-2 세포는 또한 약물이 장 유출 수송체22,27의 기질 또는 억제제인지 여부를 결정하기 위한 모델로서 널리 사용된다. Caco-2 세포는 결장 기원이지만 장세포 세포를 모방합니다. 불행히도, Caco-2 세포는 소장9의 상피층으로부터 하나의 세포 유형만을 나타내며, 이는 복잡한 장 상피 세포 유형 조성물을 정확하게 재구성하지 못한다. 예를 들어, 점액 생산에 전념하는 잔 세포는 Caco-2 배양물에서 부재하므로 점액-약물 상호작용은 다른 세포주(28)와의 공동 배양 없이는 평가될 수 없다. 더욱이, Caco-2 배양물은 장내에 전형적으로 존재하는 몇몇 중요한 핵 수용체, 예컨대 프레그난 X 수용체 (PXR), 스테로이드 X 수용체 (SXR), 및 구성적 안드로스탄 수용체 (CAR)29를 발현하지 않는다. 결과적으로, Caco-2 배양물은 이들 수용체(예를 들어, 리팜핀)30의 유도제인 특정 약물에 의한 약물 수송체 및 효소의 유도를 모델링하지 못한다.
3D 장 오가노이드 기술은 이러한 제한 사항 중 일부를 해결합니다19. 오가노이드는 미세침습적 기술(20)을 사용하여 수확된 조직 샘플로부터 확립될 수 있는 성체 줄기 세포로부터 유래된 자기조립된 작제물이다. 인간-유도된 만능 줄기 세포는 장 투과성 모델31,32에 채용되고 있다. 송곳니 오가노이드는 인간 줄기 세포 연구가 윤리적 인 문제33에 의해 제한되기 때문에 인간 오가노이드에 대한 관련 대안을 제공합니다. 또한, 송곳니 오가노이드는 송곳니 약물 투과성, 신진 대사, 활성 수송 및 약물 - 약물 상호 작용을 탐구하기위한 시험관 내 시스템을 제공합니다. 이러한 기술 격차를 해결하기 위해, 투과성 지지 시스템에서 송곳니 장 오가노이드의 일관되고 신뢰할 수 있는 성장이 설명되었다(34). 송곳니 장내 오가노이드를 사용한 투과성 분석은 현재 사용되는 분석법 (Caco-2)과 비교하여 송곳니 장 투과성 및 작은 약물 분자의 신진 대사를 잠재적으로 예측할 수 있습니다. 이러한 중추적 인 특징의 확인은이 새로운 시험관 내 시스템을 세포 내 신진 대사 및 활성 수송에 대한 유도제의 잠재적 인 영향을 탐구하는 미래의 연구에 제공합니다.
송곳니 오가노이드는 장의 상피층에 전형적으로 존재하는 모든 세포 유형으로 구성된다. 기능적 및 미세 해부학 적 관점에서 볼 때, 그들은 송곳니 장19,35의 상피층의 환경을 안정적으로 복제합니다. 더욱이, 점액, 송곳니 특이적 약물 수송체 및 효소의 존재, 및 송곳니 장내 오가노이드에서의 전반적인 세포 분화는 개34에서 생체내에서 보여지는 것과 필적한다. 따라서, 오가노이드는 병든 수의학 환자로부터 단리될 수 있고, 송곳니 경구 약물 투과성(19,36)에 대한 다양한 질병 과정(예를 들어, 만성 장 염증)의 효과를 모델링하는데 사용될 수 있다. 송곳니 장 오가노이드 시스템은 약물 투과성 실험 이외의 다른 설정에서도 사용할 수 있습니다. 이들 3D 구조물은 또한 염증성 장 질환, 결장직장 선암종, 및 위장관 간질 종양(19)에 대해 Chandra et al.에 의해 이전에 기술된 바와 같이 병든 환자로부터 단리될 수 있다.
투과성 지원 시딩 프로토콜은 삽입물에 송곳니 장내 오가노이드 배양을 확립하는 방법을 설명합니다. 이 첫 번째 프로토콜은 세포외 막 매트릭스에 도금 된 확립 된 송곳니 오가노이드 배양물을 해리시키는 방법을 설명합니다. 또한, 콜라겐 I 및 세포외 막 매트릭스를 사용한 삽입물의 예비코팅이 이 프로토콜에서 논의된다. 투과성 지지 인서트에 송곳니 오가노이드를 임베딩하는 것 또한 상세히 설명된다.
두 번째 프로토콜은 인서트에 도금 된 송곳니 3D 오가노이드의 일반적인 유지 보수를 포함하는 단층 유지 보수 프로토콜입니다. 배양물을 새로 고치는 데 사용되는 오가노이드 배지의 빈도 및 부피 및 세포 배양 손상을 방지하는 방법은 상피 단일층의 합류성을 평가하기 위한 실험 방법과 함께 이 두 번째 프로토콜에서 제시된다.
마지막으로, 투과성 실험 프로토콜은 투과성 분석에서 송곳니 장 3D 오가노이드가 실험용으로 준비되었는지 여부와 실험을 수행하기 전에 필요한 검증 단계를 결정하는 방법에 중점을 둡니다. 이 섹션에서는 또한 단층 배양의 챔버에서 치료 약물 후보의 인큐베이션 및 샘플링과 함께 투과성 실험의 설정 및 성공적인 실행에 대해 설명합니다. 단층 무결성을 모니터링하기 위해 낮은 투과성 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC-dextran)의 사용이 또한 논의된다. 마지막으로, 실험 종료 후 결과를 검증하기 위한 시험관내 평가 방법이 기재되어 있다. 투과성 실험은 매우 방대한 주제이며 Hubatsch et al.37에 의해 매우 잘 요약되어 있습니다. 프로토콜의 워크플로우는 그림 2에 요약되어 있습니다.
그림 1: 투과성 지지 시스템의 송곳니 장 오가노이드. 투과성 지지 인서트는 24웰 플레이트의 웰에 위치한다. 미세 다공성 멤브레인은 해리 된 송곳니 장 오가노이드의 시딩을 허용하며,이 세포는 결국 오가노이드 2D 단일층을 형성합니다. 이 기술은 단층의 AP 및 BL 측면 모두에 대한 액세스를 허용합니다. 오가노이드 배지는 투과성 지지체의 AP 및 BL 챔버 둘 다에 도입된다. 약물 후보의 흡수 (AP→BL) 및 분비 (BL→AP)뿐만 아니라 두 가지 가능한 약물 수송 모드가 예시된다. 약어: AP = apical; BL = 기저측방. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 송곳니 오가노이드 투과성 지원 프로토콜의 워크플로우. 투과성 지지체 삽입물은 세포외 막 매트릭스와 콜라겐 I의 혼합물로 예비코팅되고 1시간 동안 인큐베이션된다. 인큐베이션 과정 동안, 오가노이드 배양물은 해리된다. 개별 오가노이드 세포는 인서트에 시딩되고, 기저측성 챔버 내의 배지는 시딩 직후에 첨가되고, 정점 챔버에 배지는 시딩 과정이 끝난 후 24시간 후에 첨가된다. 오가노이드의 유지 및 모니터링에는 단층의 무결성을 평가하기 위한 정기적인 중간 변화, TEER 값 측정 및 광 현미경이 포함됩니다. 실험 전에, 오가노이드는 배지로부터 ROCK 억제제 및 GSKiβ를 제거함으로써 분화되어야 한다. TEER 값은 실험 당일에 측정되며, 오가노이드 단층은 광 현미경을 통해 세포 손상을 검사합니다. 이어서, 배지는 적절한 완충액으로 교환되고 실험 전에 인큐베이션된다. FITC-덱스트란 분석은 단층 완전성의 마커로서 장 투과성 실험39 동안 사용된다. TEER 측정은 실험 후에 취해지고, 광 현미경은 24 시간 후에 결과를 검증합니다. 약어: TEER = 경상피 전기 저항; ROCK = 로-관련 키나제; GSKiβ = 글리코겐 신타아제 베타; F = 형광. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
이 연구는 아이오와 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017). 다음 섹션(단계 1.1-1.3)에서는 투과성 지원 시드 프로토콜에 대해 설명하고 절차는 그림 3에 요약되어 있습니다.
그림 3: 투과성 지원 시드 프로토콜의 워크플로. 투과성 지지체 인서트는 CMGF+ R/G, 콜라겐 I 및 세포외 막 매트릭스의 조합으로 예비코팅되고 이어서 인큐베이션된다. 송곳니 오가노이드 배양물로부터의 배지는 흡인되고 세포 회수 용액으로 대체되고, 이어서 4°C에서 30분 인큐베이션되었다. 배양물은 이어서 튜브로 옮겨지고, 오가노이드 해리는 트립신-유사 프로테아제를 사용하여 수행된다. 해리되지 않은 오가노이드는 단일 세포 현탁액을 달성하기 위해 스트레이너를 통한 통과에 의해 제거되고, 세포 농도는 혈구측정기 또는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 결정된다. 세포는 투과성 지지 인서트에 시딩되고, CMGF+ R/G는 기저 측방 챔버에 첨가된다. 이어서, 배양물을 24시간 동안 인큐베이션하고, 나머지 액체는 정점 챔버로부터 제거되고 CMGF+ R/G. 약어로 대체된다: ROCK = 로-관련 키나아제; GSKiβ = 글리코겐 신타아제 베타; CMGF + R / G = ROCK 억제제 및 GSKiβ로 강화 된 성장 인자가있는 완전한 배지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 투과성 지원 시딩 프로토콜
- 투과성 지지 인서트의 프리코팅
- 표 1의 내용에 따라 Rho 관련 단백질 키나제 (ROCK) 억제제 및 글리코겐 신타아제 키나제 베타 저해제 (GSKiβ) (CMGF + R/G)로 강화된 성장 인자가 있는 완전한 배지를 준비한다.
- 얼음 양동이를 준비하고 얼음 위에서 세포외 막 매트릭스를 해동하기 시작하십시오. 필요한 수의 인서트가 들어있는 24웰 플레이트를 인큐베이터에 넣어 예열합니다. 쥐 꼬리 콜라겐 I (3 mg / mL)를 모아서 빛으로부터 보호하면서 얼음 위에 놓습니다. CMGF + R / G를 수집하여 얼음 위에 놓습니다.
- 실험에 필요한 인서트 및 블랭크의 총 수를 계산하고, 각 인서트에 대해 코팅 용액의 100 μL를 따로 보관하십시오.
참고 : 필요한 것보다 더 많은 코팅 용액을 준비하십시오. 필요한 것보다 적어도 15 % 더 많이 준비하는 것이 좋습니다. - 15mL 튜브에서 CMGF+ R/G를 세포외 막 매트릭스(1%) 및 콜라겐 I(1%)과 혼합하고 부드럽게 피펫 믹스합니다.
- 각 폴리에스테르 인서트를 코팅 용액 100 μL로 코팅하고, 인서트를 인큐베이터(37°C; 5%CO2 분위기)에 1시간 동안 배치한다.
- 인큐베이션 후, 진공 흡입기 또는 P1000 피펫을 사용하여 각 인서트를 조심스럽게 코팅 용액을 떼어내고, 인서트 필터를 방해하지 않도록 주의한다. 예비코팅 된 플레이트를 인큐베이터에 넣어 따뜻하게 유지하십시오.
- 송곳니 오가노이드 해리
참고 : 적어도 나흘 동안 배양 된 송곳니 오가노이드를 사용하십시오. 해리를 시작하기 전에 Gabriel et al.38 을 참조하여 샘플이 건강하고, 밀도가 높으며, 실험에 충분한 시기를 결정한다. 모든 우물 도금 절차에 대해 하나의 여분의 오가노이드를 해리시키는 것이 좋습니다. 또한, 부적절한 조작으로 인한 고르지 않은 오가노이드 성장 또는 손상을 설명하기 위해 원하는 삽입물 수를 ~ 20 % 늘리는 것이 좋습니다. FITC-dextran을 사용할 계획이라면 추가 우물을 준비하십시오.- 얼음 양동이와 차가운 1x Advanced DMEM/F12 재고 바이알을 생물 안전 캐비닛에 준비하십시오.
- 세포외 막 매트릭스를 얼음 위에 올려 놓고 해동을 시작하고 얼음에 잠기면 빠른 해동으로부터 보호하고 응고를 피할 수 있습니다. 피펫 팁(P200)의 박스를 세포외 막 매트릭스의 도금을 위해 냉동실에 놓는다.
- 냉장 원심분리기를 4°C로 예냉시킨다.
- CMGF+ R/G를 냉동실/냉장고에서 37°C 수조로 옮깁니다. 가능하면 직사광선 노출을 피하십시오.
- 적절한 수의 웰(2-4개의 인서트 당 24-웰 플레이트의 1웰)에 대해 오가노이드 배양으로 24-웰 플레이트로부터 모든 배지를 제거하면서 세포외 막 매트릭스를 방해하지 않도록 주의한다.
주: 볼륨은 사용되는 셀 카운팅 시스템에 따라 달라질 수 있습니다. - 웰 당 0.5 mL의 미리 냉각된 세포 회수 용액을 첨가하여 세포외 막 매트릭스 돔을 용해시킨다.
- 플레이트를 30분 동안 냉장고(4°C)에서 인큐베이션한다.
- 현탁액을 피펫하고, 모든 오가노이드를 수집하고, 용해된 세포외 막 매트릭스를 수집하고, 이를 15 mL 튜브로 옮긴다.
- 원심분리기(4°C에서 5분 동안 700 × g ) 수준이 0.5 mL 마크에 도달할 때까지 상청액을 제거하고, 펠렛을 방해하지 않도록 하였다.
- 트립신 유사 프로테아제 1 mL를 첨가하고, 37°C 수조에서 8분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 동안 튜브를 여러 번 플릭하여 세포를 혼합하십시오.
- 샘플이 있는 튜브를 다시 생물안전 캐비닛으로 옮기고 미리 냉각된 고급 DMEM/F12 7mL를 천천히 첨가하여 트립신과 같은 프로테아제를 비활성화하고 세포 해리를 중지합니다.
- 40μm 셀 스트레이너를 1mL의 고급 DMEM/F12로 미리 적셔서 적시합니다. 혼합물을 부드럽게 피펫팅하고 현탁액을 여과하는 단계; 피펫 추가 고급 DMEM/F12 스트레이너를 헹구십시오.
- 튜브(700 × g 를 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 펠렛을 방해하지 마십시오.
- 세포 펠릿을 ∼50-100 μL의 배지 (CMGF+ R/G)에 재현탁시켜 분리된 오가노이드의 모든 웰에 대해 재현탁시킨다.
- 혈구측정기 또는 적절한 기계를 사용하여 현탁액(∼10 μL)의 서브샘플을 계수하고, 현탁액 중의 총 세포 수를 결정한다.
- 송곳니 오가노이드 파종
- 세포 현탁액을 희석 또는 농축하여 mL당 ∼75,000 세포의 세포 농도를 얻었다.
- 100 μL의 현탁액을 각 인서트에 시드하고 BSA (1%) 예비코팅 팁을 사용하여 전사 동안 세포 부착을 피한다. 하나의 코팅 된 인서트를 정기적 인 배지 변경을받는 동안 오가노이드가 자라지 않고 세포가없는 블랭크로 추가하십시오.
- 플레이트를 ~30초 동안 원형 운동으로 부드럽게 소용돌이치며 시딩된 세포를 삽입물을 가로질러 분산시킨다. 광 현미경을 통해 세포의 균일 한 분포를 확인하십시오.
- 700μL의 CMGF + R/G를 기저측 챔버에 첨가하고, 플레이트를 인큐베이터(37°C; 5%CO2 분위기)에 24시간 동안 배치한다.
- 24시간 후, 세포 현탁액을 정점 챔버에서 부드럽게 제거하고 200μL의 CMGF + R/G로 교체하십시오.
2. 오가노이드 세포 단층 유지 프로토콜
참고: 다음 섹션(단계 2.1-2.2)에서는 오가노이드 셀 단층 유지 관리 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜에 제시된 절차의 워크플로우는 그림 4에 요약되어 있습니다. TEER 값 측정의 표준화에 도움이 될 수 있는 메모 작성 표가 보충 표 1에 나와 있습니다.
그림 4: 투과성 지원 문화 유지 관리의 워크플로우. TEER 값은 전극(프로브)과 볼트/옴 미터를 사용하여 측정됩니다. 프로브는 웰에 삽입하기 전에 70% 알코올로 화학적으로 멸균해야 합니다. 블랭크 및 오가노이드 셀 인서트가 측정되고 TEER 값이 계산됩니다. 배지는 후속적으로 정점 및 기저측성 챔버 모두에서 상쾌해지고, 인서트 상의 송곳니 오가노이드 배양은 광 현미경을 사용하여 시각화된다. 오가노이드 배양 또는 미세 다공성 막의 눈물은 프로토콜에 따라 기록되고 처리됩니다. 약어: TEER = 경상피 전기 저항. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- TEER 값 측정
참고: TEER 값 측정은 젓가락이 부착된 상피 전압/옴 미터를 사용하여 수행됩니다. 제조업체의 사용 지침을 참조하십시오. TEER 값은 송곳니 오가노이드 단일층의 완전성에 대한 정보를 제공합니다.- 세포 배양 성장 동안 모든 대안 일에 TEER 값 측정을 수행하십시오.
- 상피 볼트 / 옴 미터와 전극을 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 사용하기 전에 70 % 알코올에서 전극을 화학적으로 살균하십시오. 함수를 Ohms로 설정합니다. 전극이 건조 될 때까지 적어도 한 분 정도 기다리십시오.
- 첫 번째 측정을 수행하기 전에 와이어 전극을 포트에 삽입하고 전원을 켭니다. 미터가 젓가락을 측정하는 대신 와이어 전극 인서트와 함께 1,000 Ω를 표시하는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 장치를 조정하십시오.
- 무세포 인서트(블랭크)의 정점 및 기저측 챔버에 전극을 삽입하여 정점 챔버에 더 짧은 전극을 포함하고 기저측 챔버에 더 긴 전극이 포함되도록 합니다( 그림 4에서 볼 수 있음). 멤브레인을 만지지 말고 동시에 전극이 매체에 잠겨 있는지 확인하십시오.
- 값이 안정화될 때까지 몇 초 동안 기다렸다가 랩 북의 값을 기록해 둡니다. 나머지 송곳니 오가노이드 단층을 측정하여 다른 샘플을 측정 할 때 70 % 알코올로 전극을 살균하십시오. 오가노이드 단층을 전극에 닿지 않도록주의하십시오.
- 측정이 끝나면 마지막으로 70 % 알코올로 전극을 멸균하십시오. 부적절한 조작으로 인한 손상으로부터 보호하고 제조업체의 지침에 따라 보관하십시오.
- Eq(1)을 사용하여 모든 웰에 대한 TEER 값을 계산합니다. 여기서 R샘플 과 R 블랭크는 각각 단층 및블랭크 웰의 옴(Ω) 값이고 면적(cm²)은 인서트의 값입니다.
(1)
- 단층 유지 보수
참고: 표 2의 권장 매체 변경 계획을 검토하십시오.- 멸균 일회용 9 "파스퇴르 피펫과 진공 흡인기를 사용하여 정점과 기저 측부 챔버에서 배지를 부드럽게 흡인하십시오. 플레이트를 기울여 중간 표면을 명확하게 볼 수 있습니다. 세포 단층의 손상을 방지하기 위해 정점 챔버의 미세 다공성 멤브레인에 너무 가깝게 흡인하지 마십시오.
참고: 샘플 사이를 이동할 때 새 파스퇴르 피펫을 사용하십시오. 피펫도 이 절차를 대체할 수 있습니다. - 정점 또는 기저측 챔버의 벽을 목표로하는 P1000 피펫을 사용하여 CMGF + R / G를 천천히 추가하십시오. 단층 손상을 피하기 위해 정점 챔버에서 매체 변화를 매우 조심스럽게 수행하십시오.
- 광현미경으로 이틀에 한 번씩 웰을 점검하고, 배양물의 상태를 평가하고, 오가노이드 단층 또는 미세다공막의 눈물을 모니터링한다. 위상차 현미경을 사용하여 배양의 세부 사항을 강조 표시합니다.
참고 : 송곳니 오가노이드 단층 눈물의 경우, 단층은 회복되고 다시 자랄 시간이 주어집니다. 미세 다공성 막 눈물의 경우, 웰은 실험에서 제외되어야합니다.
- 멸균 일회용 9 "파스퇴르 피펫과 진공 흡인기를 사용하여 정점과 기저 측부 챔버에서 배지를 부드럽게 흡인하십시오. 플레이트를 기울여 중간 표면을 명확하게 볼 수 있습니다. 세포 단층의 손상을 방지하기 위해 정점 챔버의 미세 다공성 멤브레인에 너무 가깝게 흡인하지 마십시오.
(1)표 2: 오가노이드 배양에 대한 미디어 변경 권장 사항. CMGF + R / G는 모든 대안의 날에 격일로 우물의 정점 및 기저 측 챔버에서 변경됩니다. 주말 동안 더 긴 배양 기간은 금요일 오후에 적용되고 월요일에 변경되는 basolateral 및 apical 챔버 모두에서 배지의 양을 증가시켜야합니다. 약어: ROCK = 로-관련 키나아제; GSKiβ = 글리코겐 신타아제 베타; CMGF + R / G = ROCK 억제제 및 GSKiβ로 강화 된 성장 인자가있는 완전한 배지. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
3. 투과성 실험 프로토콜
참고: 다음 섹션(단계 3.1-3.5)에서는 투과성 실험 프로토콜에 대해 설명합니다. 약물의 시험관내 투과성을 측정하기 위한 실험 프로토콜 워크플로우는 도 5에 요약되어 있다.
그림 5: 실험 프로토콜의 워크플로우. 오가노이드 배지는 삽입물을 시딩한 후 여덟 일에서 열두 일 사이에 CMGF+ R/G에서 CMGF+로 변경해야 세포 분화가 가능합니다. 배지 (정점 및 기저측 모두)를 CMGF +로 변경 한 후에도 TEER 값은 여전히 증가해야하며 송곳니 오가노이드 단층은 거의 합류점에 도달해야합니다. 배지가 CMGF+로 변경된 후 적어도 나흘 후, 단층의 준비 상태가 평가된다. 단층이 완전히 형성되고 TEER 값이 고원상 (전형적으로 1,500 내지 2,500 Ω.cm2 사이)에 도달하면, 매체는 단층이 새로운 환경에 적응할 수 있도록 30분 동안 수송 완충액으로 교환된다. 실험의 시간 0분에, FITC-덱스트란 분석이 수행되고, 20분 기저측성 샘플이 수집된다. 결과는 이어서 플레이트 판독기 상에서 분석된다. 실험 후, 정점 및 기저측 챔버 내용물이 다시 CMGF+로 변경되고 TEER 값 판독값이 취해집니다. 단일층은 24시간 동안 인큐베이션되고, 단일층의 무결성은 반복된 TEER 측정을 통해 평가된다. 약어: TEER = 경상피 전기 저항; ROCK = 로-관련 키나제; GSKiβ = 글리코겐 신타아제 베타; CMGF+R/G = ROCK 억제제 및 GSKiβ로 강화된 성장 인자를 갖는 완전한 배지; CMGF+ = 성장 인자가 있지만 ROCK 억제제 또는 GSKiβ가 없는 완전한 배지; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; F = 형광. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 오가노이드 단층 준비 상태 평가
참고: 이 단계는 시드 후 8-14일 후에 발생합니다.- 적어도 격일로 광학 현미경으로 단층을 확인하십시오 (단층의 무결성을 시각화하기 위해 위상 대비를 사용하십시오). 세포 단일층이 틈새 또는 눈물의 명백한 징후없이 완전히 형성 될 때 다음 단계를 계속하십시오.
- 오가노이드 배지를 CMGF+ R/G에서 CMGF+로 변경합니다(배지 조성에서 ROCK 억제제 및 GSKiβ 제외). 실험 최소 나흘 전에 배지를 교체하는 것이 좋습니다.
참고: 이 단계는 오가노이드 단일층의 적절한 분화를 가능하게 할 것이다. - 대략 격일로 TEER 값을 계속 측정하십시오. TEER 값이 약 1,500~2,000 Ω ×cm²에서 고원으로 시작하면(그림 6) 매일 TEER 값을 측정합니다.
참고: 이 정상 상태는 약 2-3일 동안 유지될 수 있으며, 이는 투과도 테스트를 수행하는 최적의 기간입니다(보통 11-13일). 고원 TEER 값은 오가노이드의 장 국소화, 측정 온도, 품종, 연령 및 개 질병 상태에 따라 약간 진동 할 수 있습니다. - TEER 값의 급격한 감소 또는 오가노이드 단일층이 여러 세포층으로 과증식하는 것을 피하기 위해 약물 투과성 분석을 즉시 예약하십시오.
- 실험 준비
참고 : 인큐베이터 쉐이커는 실험하는 동안 교반되지 않은 물 층의 영향을 피하기 위해 사용할 수 있습니다. 일정한 온도에서 TEER 값을 측정합니다.- 실험 당일에 TEER 값을 측정하고 값이 정상 상태에 도달했으며 빠르게 감소하지 않는지 확인합니다.
- 실험을 수행하기 위해 20% 초과의 인서트 중에서 최상의 단층(광 현미경 및 TEER 값을 통해)을 선택하십시오.
- 광학 현미경으로 단층을 관찰하고 불완전하거나 찢어지거나 자란 오가노이드 단층을 배제하십시오.
- 수송 완충액을 준비하고 pH를 원하는 값으로 조정한다.
참고: 실험 버퍼의 구성은 실험 설정에 따라 다릅니다. 자주 사용되는 완충액은 행크의 균형 소금 용액 (HBSS), 포도당 (12.5 mM) 및 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페라진 에탄 술폰산 (HEPES, 25 mM)으로 구성됩니다. 이 조성물은 실험 동안 오가노이드 배양의 생존력을 보장한다. - 선택된 웰의 정점 및 기저 측부 챔버에서 배지를 조심스럽게 흡인하십시오.
- 200 μL의 수송 완충액을 정점 챔버에 첨가하고 800 μL를 기저 측방 챔버에 첨가한다.
참고 : 전송 버퍼는 먼저 정점 챔버에 추가 한 다음 미세 다공성 멤브레인에서 단층이 분리되지 않도록 기저 측방 챔버에 추가해야합니다. - 플레이트를 30분 동안 인큐베이터(37°C; 5%CO2 분위기)에 놓고 평형화시킨다.
참고 : 송곳니 오가노이드 단층은 이제 약물 투과성 실험을 위해 준비되었습니다.
- 일반적인 실험 레이아웃 - IgY 농도 용액
참고 : 실험 디자인 및 레이아웃은 연구 질문에 따라 변경 될 수 있습니다. 오가노이드 단일층을 통한 면역글로불린 Y(IgY)의 투과성은 일례로서 프로토콜에 사용되고, 변형될 수 있다. 용어 공여체 챔버는 약물이 초기에 적용되는 챔버를 지칭하는 반면, 수용 챔버는 공여체 챔버로부터 약물을 수용하는 챔버를 지칭한다. 전형적인 실험은 2 h (예를 들어, 15, 30, 60, 90, 120 분)에 걸쳐 수신기 챔버에서 샘플을 수집한다.- IgY 용액(약물 또는 용질)을 원하는 최종 농도로 수송 완충액에 용해시켜 준비한다. 필요한 것보다 더 많은 약물 용액을 준비하십시오.
참고: 수성 용해도가 낮은 약물은 완충액에 첨가하기 전에 먼저 유기 용매 (예 : 에탄올, DMSO)에 용해 될 수 있습니다. 용매의 최종 농도는 세포 단일층을 손상시키지 않도록 1% 미만이어야 한다. - 각 웰의 공여체 챔버 (정점 또는 기저 측부 챔버)에서 버퍼를 제거하십시오.
- IgY 용액 (약물 용액)을 모든 공여체 챔버에 첨가하십시오. 나머지 용액을 초기 약물 농도의 측정을 위한 시간 0 공여체 용액으로서 사용한다.
- 필요한 시점에서 수용 챔버에서 50μL를 제거하고 라벨이 붙은 튜브에 놓습니다. 마지막 시점에서 기증자 챔버에서 샘플을 제거하십시오. 실험이 끝나면 공여체 및 수신기 분취량을 -20°C 냉동고로 옮깁니다.
참고: 많은 시점이 필요한 경우, 수신 챔버 내의 버퍼 교체가 수행될 수 있지만 겉보기 투과성의 계산에서 고려되어야 한다. 수신기 챔버 내의 농도는 싱크 조건(44)을 유지하기 위해 실험 종료시에 공여체 챔버의 10% 이상에 도달하지 않아야 한다.
- IgY 용액(약물 또는 용질)을 원하는 최종 농도로 수송 완충액에 용해시켜 준비한다. 필요한 것보다 더 많은 약물 용액을 준비하십시오.
- 오가노이드 셀 단층 품질 관리
참고: FITC-덱스트란 용액은 실험 중에 단층 무결성을 확인하는 데 사용될 수 있습니다. FITC-덱스트란은 단층 완전성 분석의 예로서 사용된다. 다른 것들은 루시퍼 옐로우, PEG-4000, 방사성 표지된 만니톨, 및 이눌린44를 포함한다.- 시간 0분에서, 정점 챔버의 내용물을 흡인하고, 각 실험군에 대해 삼중의 FITC-덱스트란 용액 (5 mg/mL, 4 kDa)의 250 μL로 대체한다.
참고: FITC-덱스트란을 빛에 노출시키지 마십시오. - 20분 후, 기저측성 챔버로부터 버퍼를 제거하였다.
- 형광 플레이트 판독기를 사용하여 기저측성 샘플의 형광 강도를 측정한다(보정 곡선 사용; 485nm에서의 여기 세트 및 528nm에서의 방출 값 사용).
참고:FITC 의 P 앱은 토론에 설명된 방법을 사용하여 계산할 수도 있습니다. - 실험이 끝난 후, 정점 및 기저 측부 챔버에서 과도한 버퍼를 조심스럽게 흡인하십시오.
- 200μL의 CMGF+를 정점 챔버에 첨가하고 700μL를 기저측방 챔버에 첨가한다.
- 개별 웰에서 TEER 값을 측정합니다.
- 플레이트를 24시간 동안 인큐베이터(37°C; 5%CO2 분위기)에 놓는다.
- 적용 가능한 경우, 24시간 후, TEER 값을 측정하여 실험의 품질 관리 부분 동안 단층에 대한 가능한 손상을 평가한다. 광 현미경을 사용하여 송곳니 오가노이드 단층의 무결성을 시각화하십시오.
- 시간 0분에서, 정점 챔버의 내용물을 흡인하고, 각 실험군에 대해 삼중의 FITC-덱스트란 용액 (5 mg/mL, 4 kDa)의 250 μL로 대체한다.
- 다운스트림 분석을 위한 셀 단층 고정
- 포르말린-아세트산-알코올 용액(FAA, 표 1의 조성물)을 준비한다.
- P1000 피펫 또는 멸균 일회용 9" 파스퇴르 피펫과 진공 흡입기를 사용하여 정점 및 기저측 챔버에서 수송 버퍼 또는 CMGF+를 제거합니다.
- 정점과 기저 챔버를 FAA로 채 웁니다.
- 24시간 후, FAA를 흡인하고 70% 에탄올로 교체한다.
- 증발을 방지하기 위해 유연한 실험실 필름으로 플레이트를 감싸고 블록 준비를 진행하십시오.
그림 6: 실험군의 TEER 값. TEER 값은 송곳니 장내 오가노이드 단일층의 다섯 그룹으로 측정되었다. 세 그룹은 송곳니 제준 엔테로이드로 구성되었고, 두 그룹은 콜로노이드로 구성되었다. 각 그룹에는 12~22번의 반복실험이 포함되었다. 제준 엔테로이드 배양물에 대한 TEER 값은 제4일째부터 14일째까지 표시되고, 콜로노이드 배양물은 제4일째부터 제12일째까지 표시됩니다(측정은 오가노이드 단일층이 정상 상태 값에 도달함에 따라 종료되었으며, 단층이 실험적 사용을 위해 준비되었음을 나타냄). 에러 바는 측정의 SEM을 표현한다. 약어: TEER = 경상피 전기 저항. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
송곳니 오가노이드의 배양을 위한 표준 작동 절차는 이전에 기술되었고, 33, 송곳니 오가노이드 프로토콜은 또한 이 특별 호38에서 상세히 논의되었다. 투과성 지지체 상에서 배양된 송곳니 장내 오가노이드를 고정시키고 파라핀-포매하여 단층 및 세포 집단의 미세해부학을 조사하였다. 파라핀-포매화 과정은 이전에 Gabriel et al.38에 의해 논의되었다. 일상적인 염색 (헤마톡실린 및 에오신)이 수행되었으며, 알시안 블루 염색 기술은 송곳니 오가노이드 단층에서 잔 세포를 검출하는 데 사용되었습니다 ( 그림 7 참조).
도 7: 송곳니 장 오가노이드 단층 염색. 투과성 지지체 내의 결장 기원의 송곳니 장 오가노이드는 파라핀을 포매하고 H&E 및 AB로 염색하였다. 대표적인 이미지는 40x(A) 및 60x(B) 배율에서 광 현미경을 사용하여 촬영되었다. H & E 염색은 원주형 상피 단층을 나타내며 세포의 정점 부분의 미세 융모는 60x 배율로 관찰 될 수 있습니다. AB 염색은 송곳니 장 오가노이드 단일층에서 잔 세포 (진한 파란색)의 존재를 추가로 밝혀냅니다. 스케일 바 = 20 μm (A), 50 μm (B). 약어: H&E = 헤마톡실린과 에오신; AB = 알시안 블루. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
투과성 지지체 상의 오가노이드 배양물을 투과성 실험을 위해 준비하기 위해 10 내지 14일 동안 성장시켜야 한다. 광 현미경은 TEER 값 측정과 함께 사용되어 약물 후보의 투과성 테스트를위한 오가노이드 배양의 준비 상태를 확인합니다. 건강하고 병든 동물로부터의 상이한 송곳니 장내 오가노이드 단층의 대표적인 광 현미경 이미지가 도 8에 제시된다.
그림 8 : 송곳니 장 오가노이드 단층 현미경. 가벼운 현미경에서 볼 수 있듯이 성장하는 단층의 이미지. 건강한 공여체로부터 유래된 오가노이드 단층은 제준 엔테로이드(10x; 40x) 및 콜로노이드(20x; 40x) 배양물로 대표된다. 병든 기증자의 오가노이드 단층은 PLE로 진단된 송곳니 환자로부터 유래된 십이지장(5x; 10x) 및 장폐색(5x; 10x) 엔테로이드로 표현된다. 두 PLE 오가노이드 배양물 모두 오가노이드의 시딩 동안 부적절한 세포 단리의 예이며, 이들 배양물은 3D 오가노이드의 존재 때문에 약물 투과성 분석에 사용될 수 없었다. 단층 눈물 (5x)과 같은 적절한 단층 형성으로부터의 편차의 예는 생물학적 샘플의 신중한 조작에 의해 야기된다. 오가노이드 (10x; 20x)의 장기간의 문화는 오가노이드가 원래의 3D 구조와 유사하기 시작할 때 인서트에서 오가노이드가 오래 유지되기 때문에 발생합니다. 비교를 위해, 약물 투과성 연구에 일반적으로 사용되는 투과성 지지체 상의 전통적인 2D 세포주의 이미지가 제시된다(MDCK-10x; 40x, 및 Caco-2-10x; 20x). 약어: PLE = 단백질-손실 장병증; MDCK = 마딘 - 다비 송곳니 신장. 스케일 막대 = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
오가노이드 단층은 또한 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 중의 3% 파라포름알데히드-3% 글루타르알데히드에 고정되었다. 투과 전자 현미경 (TEM)은 투과성 지지체 상의 오가노이드 배양물의 초구조를 특성화하기 위해 사용되었다. 미세 융모와 단단한 접합부의 미세 해부학 적 구조는 그림 9에서 볼 수 있습니다.
그림 9: 건강한 송곳니 장 오가노이드 단일층의 TEM 이미지. TEM은 제주날 (A), 장막 (B) 및 결장 (C) 오가노이드 단일층의 세포 미세구조를 밝히기 위해 사용되었다. 투과성 지지체 인서트의 미세다공막은 노란색 화살표로 표시되어 있다. 미세 융모 (파란색 화살표)와 단단한 접합부 (빨간색 화살표)의 존재가 이미지에 묘사되어 있습니다. 약어 : TEM = 투과 전자 현미경. 스케일 바 = 5 μm (A), 2 μm (B, C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
TEER 측정과 광 현미경 모두 수행하여 시스템이 투과성 테스트를 수행할 준비가 되었는지 확인해야 합니다. 이 분석은 TEER가 정상 상태에 도달하면 사용할 준비가되며, 가벼운 현미경 검사는 오가노이드의 손상 또는 과성장을 배제하는 데 도움이됩니다. 송곳니 제준 엔테로이드 및 콜로노이드로 구성된 다섯 그룹의 전형적인 TEER 측정치의 요약이 도 6에 제시되어 있다.
표 1: 오가노이드 매질 및 FAA의 조성. CMGF +, CMGF + R / G 및 FAA의 전체 구성이이 표에 요약되어 있습니다. 약어: ROCK = 로-관련 키나아제; GSKiβ = 글리코겐 신타아제 베타; CMGF+R/G = ROCK 억제제 및 GSKiβ로 강화된 성장 인자를 갖는 완전한 배지; CMGF+ = 성장 인자가 있지만 ROCK 억제제 또는 GSKiβ가 없는 완전한 배지; FAA = 포르말린-아세트산-알코올; EGF = 표피 성장 인자. 이 테이블은 38에서 조정되었습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 송곳니 오가노이드에 대한 투과성 지지 시스템에 대한 메모 작성을 위한 표. 약어: TEER = 경상피 전기 저항; ROCK = 로-관련 키나제; GSKiβ = 글리코겐 신타아제 베타; CMGF+R/G = ROCK 억제제 및 GSKiβ로 강화된 성장 인자를 갖는 완전한 배지; CMGF+ = 성장 인자가 있지만 ROCK 억제제 또는 GSKiβ가 없는 완전한 배지. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
투과성 지지 장치 내의 송곳니 장내 오가노이드 배양물은 전통적인 약물 투과성 분석법(40 )과 신규한 시험관내 송곳니 모델(41)을 연결하는 독특한 개념이다. 다양한 유형의 송곳니 장 오가노이드를 사용하고 최소한의 조정으로 실험의 목표에 따라 평가할 수 있습니다. 그룹당 3-4 웰에서 관심있는 약물의 여러 농도를 테스트하는 것이 좋습니다. 농도는 약물의 예상 장 농도를 기준으로 할 수 있습니다. 또한, 이전 연구를 사용하면 연구 설계에 적합한 시점을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 재현성을 높이고 문제 해결을 돕기 위해 연구 설계에 대한 적절한 문서화가 이루어져야합니다.
이 기술은 방법42의 참신함으로 인해 몇 가지 한계가 있으며, 주로 실험 설계의 표준화가 부족하고 실험실에서 프로토콜을 실행하기 때문입니다. 이러한 표준화의 부족은 다른 그룹(43)에 의해 인정되었으며, 송곳니 3D 오가노이드 단층 프로토콜은 실험실 간 재현성을 유도하고 이 시스템에 표준화를 도입할 것이다. 데이터 분석에 대한 표준화 된 접근 방식은 재현성을 향상시키고 다른 실험실의 투과성 지원 시스템에서 송곳니 오가노이드를 사용하여 예비 약물 테스트 결과를 강화할 수 있습니다. 송곳니 3D 오가노이드 모델은 또한 Caco-2 세포44,45,46과 마찬가지로 모델 약물의 시험관내 Papp 값을 알려진 인간 또는 개 생체 내 장 흡수와 비교하는 데이터 세트가 부족합니다. 일단 이러한 데이터가 생성되면,이 송곳니 오가노이드 모델은 약물 개발 동안 장 투과성을 평가하기 위해 활용 될 수있다.
적절하게 해리 된 세포의 높은 밀도를 시드하기 위해 투과성 지지 시스템에 오가노이드를 시드 할 때주의를 기울이는 것이 중요합니다. 시스템의 TEER 값은 엄격한 단층에서 성장할 때 더 신뢰할 수 있고 재현 가능합니다. 단층의 장기간의 배양은 장의 생리적 값으로부터 더 멀리 도달하는 TEER 값의 기하 급수적 인 증가로 이어질 수 있습니다. 그런 다음 이러한 3D 구조의 H & E 섹션은 막에 더 가까운 장세포의 변경된 구조로 서로 위의 여러 층의 세포를 보여줍니다.
송곳니 장내 오가노이드 단일층의 성공적인 확장 후, 약물의 겉보기 투과성 계수(Papp) 식44를 계산함으로써 기존의 2D 세포 분석과 동일한 방식으로 결과를 분석할 수 있다. Papp 값(Eq(2) 참조)은 셀룰러 단일층(47)을 가로지르는 수송 속도를 기술한다.
(2)
는 
농도 대 시간 곡선의 초기 기울기(예를 들어, nmol/s)이다. A는 삽입물의 면적(cm2)이고, C0는 공여체 챔버(37) 내의 약물 또는 화합물의 초기 농도이다. 단층 무결성에 대한 신뢰할 수 있는 인식은 표준화가 필요한 투과도 분석의 중요한 부분입니다. 광 현미경 및 TEER 측정은 투과성 지원 시스템에서 송곳니 오가노이드를 평가하고 실험의 정확한 타이밍을 결정하는 데 도움이 되는 것이 좋습니다. 추가적으로, 제로 분자 투과성 마커 (예를 들어, FITC-덱스트란, 루시퍼 옐로우, PEG-400)는 오가노이드 단층 완전성을 기능적으로 평가하는데 사용될 수 있다. 테스트 된 화합물이 운송업자의 영향을받는 경우주의를 기울여야합니다. P-당단백질(P-gp)은 일반적인 유출 펌프의 예로서 사용된다. 잘 알려진 P-gp 프로브 기판과 비교하여 유출 비율 (P app, BL-AP / Papp, AP-BL)을 생성해야합니다.
광 현미경 (위상 대비로 일반 또는 강화)은 가능한 세포 과성장을 평가하면서 2D 또는 3D 단층 및 필터 삽입물의 무결성을 확인하는 데 매우 중요한 방법입니다. 도 7은 건강한 송곳니 장내 오가노이드 세포 배양물을 인식하기 위한 가이드로서 작용할 수 있다. TEER 값은 세포간 접합의 형성과 오가노이드 배양물을 온전한 장 상피로 분화시키는 중요한 척도이다. 송곳니 장 오가노이드는 장세포와 잔 세포로 분화됩니다 (그림 6). 이러한 점액-생성 세포는 약물-점액 상호작용의 연구를 허용하며, 이는 전통적인 2D 세포 배양물(48)을 사용하여 달성하기 어려웠다. 장내분비 세포의 존재는 Chandra et al.33에 의해 송곳니 장 오가노이드에서 이전에 확인되었다.
TEM을 사용하는 제주날, 장폐색 및 결장 오가노이드로부터 유래된 송곳니 오가노이드 단층의 추가적인 특성화가 제공된다. TEM 이미지는 단단한 접합부와 미세 융모 형성을 포함한 세포 미세 구조를 보여 주며 번역 의학에서 이러한 오가노이드 모델의 복잡성과 유용성을 더욱 보여줍니다. 실험 결과에 기초하여, 투과성 지지체 상의 오가노이드 배양물을 시딩 후 11일째와 13일째 사이에 실험을 위해 준비하였다(도 9). 이 시점의 TEER 값은 1,500에서 2,500 사이Ω.cm2 사이였습니다. TEER 값의 고원 단계는 TEER 값이 천천히 감소하기 시작하기 전에 실험을 시작해야하는 매우 제한된 시간 동안 지속됩니다. TEER 값은 또한 일부 약물 또는 약물 제품 부형제가 TEER 값 판독에 큰 영향을 줄 수 있는 단층(예를 들어, 타이트한 접합부)과 상호작용할 수 있기 때문에 중요한 실험 결과를 표시하는 데 중요한 부분이 될 수 있다. 이것만으로도 실험을위한 데이터 역할을 할 수 있습니다.
이중 챔버 세포 배양 장치에서 송곳니 장내 오가노이드는 생성된 세포 단일층의 독특한 구조로 인해 경구 약물 투과성 이외의 분야에 적용될 수 있다. 예를 들어, 이들은 미생물학 연구 (예를 들어, GI 미생물 세균총의 변경의 영향), 바이러스 흡수 연구, 약물 - 약물 상호 작용 및 약물 수송 메커니즘(49)에 사용될 수 있다. 공여체 챔버는 전형적으로 선택된 시험 약물 또는 화합물로 충전되고, 수신기 챔버로부터의 분취량은 다양한 시점에서 취해진다. 이들 분취량은 고성능 액체 크로마토그래피, 질량 분광법, 효소-결합 면역흡착 분석, 또는 다른 기술을 사용하여 분석될 수 있고, 용질이 단층을 통해 투과하는 양 및 속도를 결정할 수 있다.
이러한 연구는 약물 투과성을 정확하게 평가하기 위해 손상되지 않은 단층이 필요합니다. 이것은 일반적으로 사용할 수없는 우물을 설명하는 데 필요한 것보다 많은 단층 층을 성장시켜야합니다. 오가노이드 세포 단층은 또한 단층의 정점 또는 기저 측에서 바이러스 흡수를 측정하기 위해 사용될 수 있으며, 바이러스의 세포 흡수를 검출하기 위해 면역 형광 분석을 활용하는 항체를 포함한 판독 값을 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 다수의 약물(즉, 기질 및 억제제)을 공여자 챔버에 적용하여 수송체-기반 약물-약물 상호작용을 식별할 수 있다.
현재의 관찰에 기초하여, 이러한 방법은 배양 인서트의 송곳니 오가노이드에 적용 할 수있을뿐만 아니라 다른 수의학 종 및 장기 시스템에도 적합 할 것이며, 선택한 종 또는 장기 모델에 가장 적합한 사소한 수정이 필요합니다. 송곳니 장 오가노이드 성장을위한 프로토콜은 배양물의 고유 한 특성에 따라 조정되어야했습니다. 따라서, 프로토콜은 다른 종으로 조정될 수 있지만, 프로토콜에 대한 미묘한 변경이 필요할 것이다. 변형은 세포 시딩 밀도의 변화로 시작하고, 관심있는 오가노이드를 적절하게 분화시키기 위해 배지 조성물의 변화로 확장될 수 있다.
표준화, 실험 절차에 대한 상세한 문서화 및 세포 단층의 일관된 모니터링은 투과성 지원 분석 전반에 걸쳐 필요한 중요한 관행이며 송곳니 시스템에 국한되지 않습니다. 이러한 가능한 종 또는 장기 수정은 현장에서의 추가 발전을 위해 문서화하고보고하는 데 중요합니다. 이 모델은 비용 요구 사항, 실험실 간 변동성 및 생체 내 장 흡수를 예측하는 능력에 대한 제한된 데이터와 같은 몇 가지 제한 사항을 가지고 있습니다. 개들은 어떤 경우에는 인간보다 다른 약물 수송체와 대사 효소를 가지고있습니다 50.
또한, 송곳니 오가노이드 시스템은 그러한 모델의 적합성을 결정하기 위해 다른 제조업체로부터의 다양한 다른 이중 챔버 장치 상에서 시험되어야 한다(예를 들어, 상이한 필터 멤브레인 조성물의 적합성이 결정되어야 함). 또 다른 단점은 원고의 약물 투과성 실험 부분이 이전 부분보다 덜 설명적이라는 것입니다. 이는 이 필드의 과도한 정보 때문에 발생합니다. 원고의이 부분의 목표는 이러한 실험의 초석의 가장자리를 자르지 않고 수정 가능한 방식으로 이러한 방법을 설명하는 것이 었습니다. 투과성 실험에 대한 보다 상세한 정보는 Hubatsch et al.37에 의해 수집되었다. 추가적으로, 투과성 삽입물은 공동 배양, 세포 이동, 및 침윤 분석 실험4에 사용될 수 있다.
결론적으로, 이중 챔버 배양 장치의 송곳니 장 오가노이드는 생물 의학 분야 및 번역 의학을 포함한 광범위한 응용 분야에서 사용될 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 실험을 계획하고 생물학 분야의 오가노이드 모델에 대한 실험실 간 데이터 신뢰성을 촉진하기위한 몇 가지 전략을 수립합니다.
Disclosures
K. Allenspach는 LifEngine Animal Health and 3D Health Solutions의 공동 설립자입니다. 그녀는 Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics 및 Mars의 컨설턴트로 활동하고 있습니다. J.P. Mochel은 LifEngine Animal Health and 3D Health Solutions의 공동 설립자이며 Ceva Animal Health 및 Ethos Animal Health의 컨설턴트로 활동하고 있습니다. 이 기사는 저자의 견해를 반영하며 식품 의약품 안전청의 승인, 견해 또는 정책을 나타내는 것으로 해석되어서는 안됩니다. 다른 저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 아이오와 주립 대학 직원의 수의학 진단 실험실, 즉 헤일리 램버트, 에밀리 라헤, 로잘린 브라나만, 빅토리아 그린, 제니퍼 그롤츠-아구창에게 샘플의 적시 처리에 대한 감사를 표하고 싶습니다. 우리는 또한 투과성 실험을위한 재료를 제공 한 Jodi Smith와 Bethann Valentine에게 감사드립니다. 또한 그림 9에 도움을 준 David Diaz-Reganon에게도 감사드립니다. 그림 6을 제외한 모든 수치는 BioRender.com 로 작성되었습니다. 저자는 교수진 스타트업, ISU VPR 밀러 상, ISU VPR 밀러 어워드, NSF SBIR 서브어워드에서 ISU # 1912948에 대한 지원을 인정하고자 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organoid media | |||
| ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| TMS (trimethoprim sulfate) | Sigma | T7883-5G | |
| Reagents | |||
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
| alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous | Acros Organics | 170080010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
| FITC-CM-Dextran | Millipore Sigma | 68059-1G | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14025-076 | |
| Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
| Materials and Equipment | |||
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 9" Pasteur Pipets | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning | 3470 | Permeable Support |
| Millicell ERS (Probes) | Millipore Sigma | MERSSTX01 | |
| Millicell ERS-2 Voltohmmeter | Millipore Sigma | MERS00002 | |
| Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Flexible Laboratory Film |
| Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |
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