Summary
Bu makalede, altın nanopartiküllerin ve kanser hücrelerinin hızlı hiperspektral görüntülenmesini sağlayan spektral odaklama modülü ve çift çıkışlı darbe lazerinin entegrasyonu sunulmaktadır. Bu çalışma, multimodal doğrusal olmayan optik tekniklerin ayrıntılarını standart bir lazer tarama mikroskobu üzerinde göstermeyi amaçlamaktadır.
Abstract
Canlı sistemlerde altın nanopartiküllerin (AuNP'ler) araştırılması, AuNP'ler ve biyolojik dokular arasındaki etkileşimi ortaya çıkarmak için gereklidir. Ayrıca, uyarılmış Raman saçılması (SRS), iki foton uyarılmış floresan (TPEF) ve geçici absorpsiyon (TA) gibi doğrusal olmayan optik sinyalleri bir görüntüleme platformuna entegre ederek, hücresel yapıların ve AuNP'lerin biyomoleküler kontrastını multimodal bir şekilde ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Bu makalede multimodal doğrusal olmayan optik mikroskopi sunulmakta ve kanser hücrelerinde AuNP'lerin kimyasal olarak spesifik görüntülenmesini gerçekleştirmek için uygulanmaktadır. Bu görüntüleme platformu, daha verimli işlevselleştirilmiş AuNP'ler geliştirmek ve tümörü, perisellüler veya hücresel alanları çevreleyen vaskülatürler içinde olup olmadıklarını belirlemek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.
Introduction
Altın nanopartiküller (AuNP'ler), biyouyumlu görüntüleme probları olarak, örneğin çeşitli biyomedikal uygulamalarda etkili yüzey geliştirilmiş Raman spektroskopisi (SERS) substratları olarak büyük potansiyel göstermiştir. Başlıca uygulamalar arasında biyoalgılama, biyogörüntüleme, yüzey geliştirilmiş spektroskopiler ve kanser tedavisi için fototermal tedavi gibi alanlarbulunmaktadır 1. Ayrıca, canlı sistemlerdeki AuNP'lerin araştırılması, AuNP'ler ve biyolojik sistemler arasındaki etkileşimi değerlendirmek ve anlamak için çok önemlidir. AuNP'lerin dokulardaki dağılımını araştırmak için başarıyla kullanılan Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) spektroskopisi2, lazer ablasyon endüktif olarak eşleşmiş kütle spektrometresi (LA-ICP-MS)3 ve manyetik rezonans görüntüleme (MRI)4 dahil olmak üzere çeşitli analitik teknikler vardır. Bununla birlikte, bu yöntemler zaman alıcı olmak ve karmaşık numune hazırlama3'ü içeren, uzun edinme süreleri gerektiren veya mikronun altındaki uzamsal çözünürlük 2,4'ün eksikliği gibi çeşitli dezavantajlardan muzdariptir.
Geleneksel görüntüleme teknikleriyle karşılaştırıldığında, doğrusal olmayan optik mikroskopi, canlı hücrelerin ve AuNP'lerin araştırılması için çeşitli avantajlar sunar: Doğrusal olmayan optik mikroskopi, daha derin görüntüleme derinliği elde eder ve IR'ye yakın ultra hızlı lazerlerin kullanımıyla içsel 3D optik kesitleme yeteneği sağlar. Görüntüleme hızının ve algılama duyarlılığının önemli ölçüde artmasıyla, iki foton uyarılmış floresan (TPEF) 5,6,7 ve ikinci harmonik jenerasyon (SHG) 8,9,10 mikroskopisinin canlı hücrelerde ve dokularda endojen biyomoleküllerin non-invaziv görüntülemesini daha da geliştirdiği gösterilmiştir. Ayrıca, geçici absorpsiyon (TA)11,12,13,14 ve uyarılmış Raman saçılması (SRS)15,16,17,18 gibi yeni pompa-prob doğrusal olmayan optik teknikleri kullanarak, hücresel yapıların ve AuNP'lerin etiketsiz biyokimyasal kontrastını elde etmek mümkündür. AuNP'leri dışsal etiketler kullanmadan görselleştirmek büyük önem taşımaktadır, çünkü nanopartiküllerin kimyasal pertürbasyonları fiziksel özelliklerini ve dolayısıyla hücrelerdeki alımlarını değiştirecektir.
Bu protokol, çift dalga boylu darbeli bir lazer için bir Spektral Odaklama Zamanlama ve Rekombinasyon Birimi (SF-TRU) modülünün uygulanmasını sunarak, AuNP'lerin ve kanser hücrelerinin hızlı multimodal görüntülemesini sağlar. Bu çalışma, entegre TPEF, TA ve SRS tekniklerinin ayrıntılarını bir lazer tarama mikroskobu üzerinde göstermeyi amaçlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lazer sistemini açma
- Kilitleme sistemini açın ve sistemi başlatmadan önce kol lazerini seçin.
- Çift çıkışlı femtosaniye lazeri kontrol etmek için PC'yi yazılımla açın.
- Çift çıkışlı femtosaniye lazer için yazılımı yükleyin; Bu yazılım, lazerin açılıp kapanmasını sağlar ve pompa ışınının dalga boyunu doğrudan kontrol eder.
- 3 sayısı için Güç simgesini basılı tutarak lazer emisyonunu açın.
- Lazer ısınana ve yazılımda lazer hazır ışık yeşil yanana kadar bekleyin.
- Pompa ışınının dalga boyu doğrudan yazılım üzerinden kontrol edilir; bu 680-1.300 nm arasında değişebilir. C-H Raman titreşim bölgesinde hücresel görüntüleme için 802 nm seçin.
- Ayarlanabilir pompa demetinin ve 1.045 nm Stokes ışınının deklanşörlerini, diyafram görüntülerini 3 sn boyunca basılı tutarak açın.
DİKKAT: Lazer güvenlik kılavuzu Çift çıkışlı femtosaniye lazer, sınıf IV kızılötesi darbeli bir lazerdir ve görme duyusunda kalıcı hasara neden olabilir. Bu nedenle, bu prosedür uygulanırken tüm lazer güvenliği yerel kurallarına uyulmalıdır: (i) Yalnızca lazer güvenliği eğitimi almış yetkili kullanıcılar prosedürü gerçekleştirebilir. (ii) Laboratuvara giriş, oda kapısında kilitli bir düğme bulunan manyetik kart erişimi yoluyla yapılır. (iii) Operasyonun çoğu için, lazer ışınları tamamen kapalıdır. (iv) Lazer ışını açığa çıktığında, lazer güvenlik gözlükleri takılmalıdır (hem pompanın hem de Stokes ışınlarının OD 7+ blokajını sağlayan LG9 lazer güvenlik gözlüklerini kullanın).
2. Spektral Odaklama Zamanlaması ve Rekombinasyon Ünitesini (SF-TRU) Açma
- ATM yazılımını, SF-TRU ünitesindeki gecikme aşamalarını ve lazer zayıflatıcıları kontrol eden lazer yazılımı ile aynı PC'ye yükleyin.
NOT: Bu ünite, pompanın ve Stokes kirişlerinin mekansal olarak üst üste bindiğinden emin olmaktan, pompa ve Stokes kirişlerindeki dağılımı kontrol etmekten ve pompa ile Stokes kirişleri arasındaki zaman gecikmesini kontrol etmekten sorumludur. Hem pompa hem de Stokes kirişlerinin polarizasyonu dikeydir. Her kirişin SF-TRU'dan çıkmadan önce polarizasyonları bağımsız olarak kontrol etmek için yarım dalga plakası ile donatıldığını unutmayın. - Hem pompanın hem de Stokes lazerlerinin %<10 (pompa) ve %<15'e (Stokes ışınları) düşürüldüğünden emin olun. Kirişler zayıflatılmazsa, lazer gücü sisteme zarar verebilir ve biyolojik örnekleri yakabilir.
- Hücresel görüntüleme için, optimum lazer ayarlarını numunede 12 mW ve 30 mW'a karşılık gelen %6 (pompa) ve %10 (Stokes) olarak ayarlayın.
- SF-TRU'nun iki ayarı vardır: femtosaniye (fs) modu ve pikosaniye (ps) modu.
- Fs modu için, kutunun her iki tarafındaki düğmeleri itin (bu, dağılım ızgaralarını ışın yolundan kaldırır).
- ps modu için, kutunun her iki tarafındaki düğmeleri dışarı çekin (bu, dağılım ızgaralarını ışın yoluna yerleştirir).
- Hiperspektral görüntüleme için ps modunu seçin.
- Bu sistemde C-H görüntüleme için pompa ve Stokes ışınlarının geçici olarak üst üste binmesi için gecikme aşamasının doğru konumda olduğundan emin olun.
- Pompanın ve Stokes kirişinin dağılım ayarlarının doğru olduğundan emin olun; 802 nm pompa için bu, pompa kirişi için 5 mm ve Stokes ışını için 30 mm'dir.
3. SRS görüntüleme için Stokes ışınının modüle edilmesi
- SRS algılaması için, Stokes ışınının yoğunluğunu modüle edin.
- Işın modülasyonu için sinyal üretecini açın.
- Aşağıdaki gibi önceki ayarları hatırlayın:
ÇIKIŞ 1: Kare dalga: Frekans = 19.5 MHz, Genlik = 1.4 V.
ÇIKIŞ 2: Kare dalga: Frekans = 19.5 MHz, Genlik = 300 mV. - 1 ve 2 numaralı çıkışları açın.
- Çıkış 1'i bir BNC kablosuyla SF-TRU kutusundaki EOM için bir amplifikatöre bağlayın.
- Çıkış 2'yi bir BNC kablosuyla SRS algılaması için kullanılan kilitli amplifikatöre bağlayın.
- Güç kaynağını portal üzerindeki amplifikatöre açın.
4. Kilitli amplifikatörün açılması
- SRS görüntüleme için, geniş alan fotodiyot ve amaca yönelik olarak üretilmiş bir kilitleme amplifikatöründen oluşan SRS algılama modülünü kullanın.
- Güç kaynağını portal üzerindeki kilitli amplifikatöre açın.
- PC'ye kilitli amplifikatör "SRS algılama modülü" yazılımını yükleyin.
- Yazılımda aşağıdaki ayarları seçin: Faz = 0°, Ofset = -80 mW, Kazanç = 58 dB.
- Yazılımda kilitli amplifikatör entegrasyon süresi sabitini seçin: hücre görüntüleme için 2 μs'lik zaman sabiti kaliteli görüntüler verir.
5. Lazer tarama mikroskobu üzerinde çalışma
- Uzaktan kumanda kutusu dışındaki tüm ekipmanların fişlerini açın. Portal üst kısmında bulunan kontrol kutusunda bekleme yanana kadar bekleyin.
- Portal üzerindeki uzaktan kumanda kutusunu açın ve kutunun arkasını açın. Uzak ışık mavi yanana kadar bekleyin (kontrol kutusunda) ve İşlemi Başlat'a basın.
- Lazer tarama mikroskobunun bilgisayarını açın.
- Konfokal mikroskop yazılımını çalıştırın.
- Bilgisayar yazılımı aracılığıyla mikroskopun ışık yolunu kontrol edin.
NOT: SRS görüntülemeye uygun hale getirmek için mikroskopta bazı değişiklikler yapılmıştır: (i) Işın yolunda, lazer ışınlarının tarama ünitesine girdiği filtre tekerleğine 775 nm kısa geçiş eklenmiştir, bu bilgisayar yazılımındaki Lightpath sekmesinden seçilebilir. (ii) Algılama için konfokal mikroskobun dahili PMT'lerini kullanmak yerine, iletilen ışık yoluna hem SRS hem de CARS algılamasına izin veren ısmarlama bir dedektör eklenmiştir. (iii) Bu dedektörlerden gelen çıkışlar, portal üzerindeki Analog kutuya bağlanır. PMT'den gelen CARS sinyali bir BNC kablosuyla CD1'e bağlanır ve kilitleme amplifikatöründen gelen SRS sinyali bir BNC kablosuyla CD2'ye bağlanır. - Odağı dokunmatik ekrandan, uzaktan kumanda düğmelerinden veya bilgisayar yazılımından kontrol edin.
- Yazılımda istediğiniz görüntü ayarlarını seçin; buna yakınlaştırma, piksel cinsinden görüntü boyutu ve piksel bekleme süresi dahildir.
- Görüntüleme hızının (piksel bekleme süresi), kilitli amplifikatör yazılımında ayarlanan entegrasyon süresinden daha yüksek olduğundan emin olun.
NOT: GÖRÜNTÜLEME IÇIN BIR NA 1.2 SUYA DALDIRMA HEDEFI KULLANILMIŞTIR.
6. Bir numunenin mikroskop aşamasına monte edilmesi
- Hücre örneklerini aşağıdaki gibi görüntüleme için hazırlayın.
- RPMI-1640'taki Kültür 4T1 fare meme karsinomu hücreleri% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile desteklenir. Ortamı her 2 günde bir değiştirin ve hücreleri% 70-80 birleşimde geçirin.
NOT: 8-10. bölümler, burada açıklanan deneyler boyunca kullanılmıştır. - Görüntüleme deneyleri için, 37 ° C'de,% 5 CO 2'de 24 saat boyunca kare kapaklar üzerinde 1 x 105 hücreyi inkübeedin. Daha sonra, hücreleri önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve 4 saat boyunca altın nanopartiküllerle (hücre kültürü ortamında 1:100 seyreltme, stok konsantrasyonu: 2.3 x 10 10 partikül / mL, çap:60 nm) inkübe edin.
- Görüntülemeden önce, hücreleri buz gibi soğuk PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca PBS'de% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Hücreleri PBS 3x ile yıkayın ve ardından görüntüleme için iki kapak kapağı arasına monte edin.
- RPMI-1640'taki Kültür 4T1 fare meme karsinomu hücreleri% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile desteklenir. Ortamı her 2 günde bir değiştirin ve hücreleri% 70-80 birleşimde geçirin.
- Lazer ışınlarını hedef ile numune arasındaki numuneye odaklayan suya daldırma hedefinin üzerine bir damla damıtılmış su damlacığı yerleştirin. Ardından, örneği mikroskop aşamasına yerleştirin.
- NA 1.4'lü bir kondenser, ileriye doğru yayılan ışığı toplar. Görüntüleme için kondenser ile numune arasına bir damla su damlası uygulayın. Maksimum ışık miktarını toplamak için kondenserin yüksekliğini numunenin yaklaşık 1 mm yukarısına ayarlayın.
- SRS dedektörü, koleksiyon optik yolundan içeri ve dışarı kaydırılmasını sağlayan hareketli bir montaj üzerindedir. Beyaz ışık kullanarak numuneye odaklanmak için, SRS dedektörünü ışın yolunun dışına taşıyın.
- Dedektörü, SRS görüntüleme için hazır olacak şekilde ışın yoluna geri yerleştirin.
7. Raman kaymasını değiştirme ve hiperspektral veri yığını toplama
NOT: Görüntülemenin gerçekleştiği Raman kayması, SF-TRU kutusundaki gecikme aşaması konumuna ve lazer sisteminden gelen pompa ışınının dalga boyuna bağlıdır.
- Raman kaymasındaki büyük değişiklikler için, lazer dalga boyunu değiştirin. Örneğin, 2.800–3.100 cm-1 arasındaki CH titreşimlerini görüntülemek için 802 nm'yi seçin, oysa amide I zirvesi için yaklaşık 1.600 cm-1 görüntüleme için 898 nm'deki pompa ışınını seçin. Bunu yazılım aracılığıyla ayarlayın.
- Raman vardiyasında küçük ayarlamalar yapmak için, SF-TRU ünitesindeki gecikme aşamasını tarayın.
- SF-TRU milimetre (mm) cinsinden gecikme aşaması konumları verir. Gecikme aşaması konumunu mm'den cm-1'e dönüştürmek için, bir polistiren boncuk örneği kullanarak kalibrasyon hiperspektral taramasını gerçekleştirin ve kalibrasyon taramasında bulunan tepe konumlarını kendiliğinden Raman kurulumunda alınanlarla karşılaştırın. Bu, mm cinsinden gecikme aşaması konumunu cm-1'deki Raman kaymasına dönüştüren doğrusal bir denklem sağlayacaktır.
- Hiperspektral tarama oluşturmak için, farklı gecikme aşaması konumlarında bir dizi görüntü alın.
- Görüntü alımını ve gecikme aşamasının hareketini senkronize etmek için, SF-TRU sistemine TTL sinyalleri göndermek ve almak üzere analog üniteyi kullanın.
NOT: Bunu yapmak için, analog kutu aşağıdaki bağlantılara sahiptir: (i) TRIG OUT VD1—bu, SF-TRU'ya bir BNC aracılığıyla bağlanır ve gecikme aşamasına +1 artışla hareket etmesini söylemek için bir TTL sinyali gönderir. (ii) TRIG In 1—burada, gecikme aşaması hareketini bitirdiğinde BNC üzerinden bir sinyal alınır ve bu, zaman serisindeki bir sonraki görüntüyü tetiklemek için kullanılır. - Hiperspektral veri kümesi için, konfokal mikroskop yazılımında aşağıdaki ayarları seçin:
- Tetikleyici sekmesinde, TTL tetikleyicisiyle başla (AÇIK) ve Tetikleyici (her kare) seçeneğini belirleyin.
- Seri sekmesinde, zaman serisini AÇIK ve z serisini KAPALI olarak ayarlayın.
- ATM yazılımındaki adım sayısıyla eşleşecek şekilde zaman serisindeki kare sayısını ayarlayın (burada 101 adım kullanılmıştır).
- ATM yazılımında, Çalıştır sekmesine gidin.
- Hiperspektral taramanın başlatılması ve durdurulması için gecikme aşaması konumlarını milimetre cinsinden ayarlayın. CH yüksek dalga sayısı bölgesi için başlangıç konumu = 90,25 mm ve durma konumu = 92,25 mm kullanın.
- Adım sayısının konfokal mikroskop yazılımındaki kare sayısıyla eşleştiğinden emin olun.
- Doğru ayarları kontrol ettikten sonra, önce konfokal mikroskop yazılımında hiperspektral yığını başlatın. Al'a gidin ve Taramayı Başlat'a tıklayın. Ardından, ATM yazılımında Başlat'a tıklayın. Bu, seçilen başlangıç ve bitiş konumları arasındaki gecikme aşaması konumunda artımlı artışlarla bir dizi görüntünün toplanmasını başlatır
- Hiperspektral görüntü serisini çok çerçeveli bir .tif dosyası olarak dışa aktarın ve kalibrasyonu gerçekleştirmek için uygun bir yazılım paketi kullanın.
- Kalibrasyon tamamlandıktan sonra, gecikme aşaması konumunu Raman kaymalarına dönüştürmek için doğrusal kalibrasyon denklemini kullanın.
- CH titreşim bölgesindeki (2.800–3.100 cm-1) görüntüleme ile amide I titreşim bölgesi 1.500–1.700 cm-1 arasında geçiş yapmak için aşağıdakileri yapın.
- Lazer yazılımındaki pompa dalga boyunu 802 nm'den 898 nm'ye değiştirin.
- ATM yazılımındaki Stokes dağılım ayarını 30 mm'den 5 mm'ye değiştirin.
- SF-TRU kutusunun içindeki pompa ışını dağılım yolundaki aynada küçük bir ayar yapın. Bu, ayna açısını artımlı bir miktarda değiştiren ayna yuvasındaki alt düğmeyi ayarlayarak yapılır.
- Amid I bölgesi üzerinde hiperspektral tarama yaparken, ATM yazılımındaki başlangıç ve bitiş konumlarını sırasıyla 89 ve 91 mm olarak ayarlayın
DİKKAT: Lazer ışını açığa çıkacağı için bu adım için lazer güvenlik gözlükleri takılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spektral Odaklama Zamanlaması ve Rekombinasyon Birimi (SF-TRU) modülü, çift çıkışlı femtosaniye lazer ve modifiye lazer tarama mikroskobu arasında tanıtıldı. Bu çalışmada kullanılan ayarlanabilir ultra hızlı lazer sistemi, sabit bir 1.045 nm dalga boyunda bir ışın ve 680-1.300 nm aralığında ayarlanabilir diğer ışın sağlayan iki çıkış portuna sahiptir. SF-TRU modülünün ve multimodal görüntüleme platformunun ayrıntılı bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. SF-TRU, iki femtosaniye lazer ışınını pikosaniye darbelerine cıvıl Hiperspektral uyarılmış Raman saçılması (SRS) görüntülemesi, pikosaniye pompası ile Stokes darbeleri arasındaki gecikme taranarak gerçekleştirilir.
Tüm numuneler, modifiye edilmiş ters çevrilmiş mikroskop üzerinde yüksek sayısal açıklıklı (NA) bir objektif aracılığıyla darbeli lazerler tarafından aydınlatılır. SRS ve TPEF sinyalleri, yüksek bir NA kondenseri ile ileri yönde toplanır. SRS mikroskobu için, pompa ve Stokes ışınları olarak sırasıyla ayarlanabilir (680–1.300 nm) ve sabit (1.045 nm) lazer çıkışları kullanılır. SRS görüntülemeyi gerçekleştirmek için geniş alanlı bir fotodiyot ve kilitli amplifikatörün kombinasyonu kullanılırken, Stokes ışını iki filtreyle (890/210 bant geçişli ve 950 nm kısa geçirgen filtreler) engellenir. Spektral odaklamalı SRS yaklaşımının pikosaniye lazer tabanlı sistemlere göre önemli bir avantajı, cıvıl cıvıl pompa ile Stokes darbeleri arasındaki zaman gecikmesini kontrol ederek Raman kaymasını ayarlama yeteneğidir. Bu yaklaşım, pompayı ve Stokes dalga boylarını değiştirmeden birkaç yüz dalga sayısı aralığında Raman kaymalarının hızlı bir şekilde araştırılmasını sağlayarak çok daha hızlı hiperspektral görüntülemeye izin verir.
Spektral çözünürlüğün ve kimyasal seçiciliğin performansını doğrulamak için, önce polistiren (PS) mikrosferlerinin örneği görüntülenir (Şekil 2). Numunedeki lazer güçleri (60x NA 1.2 suya daldırma hedefinden sonra), 1.045 nm Stokes ışını için 10 mW ve 802 nm pompa ışını için 20 mW'dir. SRS spektrumu, karelerdeki her pikselde çıkarılabilir. Şekil 2B, PS boncuklarının hiperspektral SRS spektrumunu göstermektedir. Karşılaştırma için, PS boncuklarının spontan Raman spektrumu Şekil 2A'da gösterilmiştir. PS mikrosferlerinin SRS ve spontan Raman spektrumları, yanlardaki göreceli yoğunluk farklılıkları dışında neredeyse aynıdır. Bu spektroskopik ölçümler, SRS görüntüleme için optik gecikme çizgisi aşamasının (mm) Raman dalga sayılarına (cm-1) dönüştürülmesini sağlar.
Karbon-hidrojen germe titreşim bandındaki majör biyomoleküllerin Raman spektrumları 2.800-3.050 cm-1 aralığında olduğundan, 4T1 kanser hücrelerinin SRS görüntülemesi 2.852 cm-1 (lipit), 2.930 cm-1 (protein), 2.968 cm-1 (DNA) ve Şekil 3'te gösterildiği gibi bindirme görüntülerinde gerçekleştirilir. Farklı Raman bantlarının SRS görüntüleri, 512 x 512 piksel kare boyutunda 4 μs'lik bir piksel bekleme süresiyle elde edilir.
Son olarak, bu yöntem altın nanopartiküllerle (AuNP'ler) dozlanan 4T1 kanser hücrelerinin multimodal görüntülemesine daha da genişledi ve AuNP'lerin kanser hücrelerindeki dağılımlarını daha kesin bir şekilde görüntülememizi sağladı. Elde edilen SRS (CH2 ve CH3 kanalları), TPEF (LysoTracker floresan probları) ve TA (rezonans dışı SRS kanalı) görüntüleri Şekil 4'te gösterilmiştir.
Şekil 1: Hiperspektral multimodal görüntüleme platformunun şeması. Multimodal doğrusal olmayan optik mikroskopinin illüstrasyonu. DM, dikroik ayna; DS, gecikme aşaması; EOM, elektro-optik modülatör; FG, fonksiyon üreteci; FL, filtre; G, ızgara; LIA, kilitli amplifikatör; M, ayna; OBJ, amaç; PD, fotodiyot; PMT, fotoçarpan tüpü; SF-TRU, Spektral Odaklama Zamanlaması ve Rekombinasyon Ünitesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Polistiren (PS) mikrosferlerinin spektrumları. PS mikrosferlerinin spontan (A) Raman spektrumu, (B) hiperspektral SRS spektrumu ile iyi bir uyum göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 4T1 kanser hücrelerinin spektroskopik SRS görüntülemesi. 2.852 cm−1, 2.930 cm−1, 2.968 cm−1 boyutlarındaki SRS görüntüleri ve bindirme görüntüsü. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 4T1 kanser hücreleri tarafından altın nanopartikül alımının multimodal görüntülenmesi. 2.852 cm−1 (CH2), 2.928 cm−1 (CH3), 3.080 cm−1 (rezonans dışı, sadece TA sinyali kalmış), TPEF ve bindirme görüntüsünde hiperspektral SRS görüntüleri. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada SF-TRU modülü ve ultra hızlı çift çıkışlı lazer sisteminin kombinasyonu sunulmuş ve multimodal mikrospektroskopi için uygulamaları gösterilmiştir. Altın nanopartiküllerin (AuNP'ler) kanser hücreleri tarafından alımını araştırma yeteneği ile multimodal görüntüleme platformu, lazer ışınları AuNP'ler tarafından emildiğinde hipertermik kanser tedavilerine hücresel yanıtları görselleştirebilir.
Ayrıca, hızlı kimyasal olarak spesifik görüntüleme ve yüksek spektral çözünürlük, spektral odaklama tekniği kullanılarak, her lazer ışınındaki cıvıltıları kontrol etmek için iki set ızgara çifti kullanılarak elde edilir. Cıvıltı için sabit uzunlukta cam çubukların kullanımıyla karşılaştırıldığında, ızgara çiftleri, ilgilenilen Raman çizgilerinin spektral çözünürlüğünü ve çizgi genişliklerini eşleştirmeye izin verir19.
Ayrıca, bu sistem, mikroskop içindeki hizalamayı etkilemeden ızgaraları ışın yollarından çıkarmak için özel olarak tasarlanmış manuel kaydırıcılar kullanılarak femtosaniyeden cıvıl cıvıl pikosaniye rejimlerine kolayca geçirilebilir. Yüksek hassasiyet ve spektral çözünürlük elde etmek için, SRS tipik olarak dar bantlı pikosaniye pompası ve Stokes darbeleri kullanılarak uygulanır. Bununla birlikte, pikosaniye lazerler, femtosaniye lazerlerle elde edilebilen daha yüksek pik güç seviyeleri gerektiren çoklu foton uyarımı için yeterli değildir. Multimodal yetenekler, yöntemin çoklu foton görüntüleme20, tutarlı Raman saçılması21 ve pompa probu spektroskopisi gibi çeşitli uygulamalar için kullanılmasına izin verir.
Gösterilen cihazın performansını daha da artırmak için kullanılabilecek birkaç strateji vardır. Örneğin, daha hızlı motorlu bir gecikme hattı aşaması ve veri toplama yazılımı, multimodal görüntüleme platformunun verimini artırabilen daha yüksek bir görüntüleme hızı sunar. Ek olarak, mevcut kurulum, 5 cm−1'e kadar spektral çözünürlüğe sahip ~ 300 cm−1 spektral aralığı kapsıyordu. Spektral aralığı daha da genişletmek için, hiperspektral SRS mikroskopisi22 için daha geniş spektral bant genişliğine sahip modifiye edilmiş bir lazer sistemi kullanılmıştır.
Toplu olarak, bu multimodal ve invaziv olmayan görüntüleme platformu, nanotıp hakkında yeni bilgiler sağlar ve hücrelerin, biyolojik dokuların ve nanopartiküllerin yüksek içerikli multimodal moleküler görüntülemesine yeni bir yol açar23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu araştırma EPSRC Grants: Raman Nanotheranostics (EP / R020965 / 1) ve CONTRAST tesisi (EP / S009957 / 1) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
References
- Tabish, T. A., et al. Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy. Advanced Science. 7 (15), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1903441 (2020).
- Tian, F., et al. Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging. Biomaterials. 106, 87-97 (2016).
- Jenkins, S. V., et al. Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages. Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).
- Huang, J., et al. Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics. Advanced Materials. 27 (34), Deerfield Beach, Fla. 5049-5056 (2015).
- Dilipkumar, A., et al. Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging. Advanced science. 6 (8), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1801735 (2019).
- Wang, C. -C., et al. Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging. Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).
- Chrabaszcz, K., et al. Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer. The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).
- Tsai, T. H., et al. Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo. Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).
- Wang, C. -C., et al. Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy. Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).
- Li, F. -C., et al. Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging. Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).
- Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).
- Chong, S., Min, W., Xie, X. S. Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).
- Chen, T., et al. Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells. Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).
- Liu, J., Irudayaraj, J. M. Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy. Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Wang, C. -C., et al. In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).
- Wang, C. -C., Yoong, F. -Y., Penfield, S., Moger, J. Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy. Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).
- Wang, C. -C., Wu, R. -J., Lin, S. -J., Chen, Y. -F., Dong, C. -Y. Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy. Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).
- Wang, C. -C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering. Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Cui, L., et al. In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).
- Ma, J., Sun, M. Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials. Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).
- Sun, L., Chen, Y., Sun, M. Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence. The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).
