Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vurdering af åben sandsynlighed for den mitokondrielle permeabilitetsovergangspore i indstillingen af coenzym Q-overskud

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63646
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, Columbia University Medical Center

Summary

Denne metode udnytter bidraget fra den mitokondrielle permeabilitetsovergangspore til protonlækage med lav konduktans for at bestemme spændingstærsklen for poreåbning hos neonatale skrøbelige X-syndrommus med øget kardiomyocytmitokondrie-coenzym Q-indhold sammenlignet med vildtypekontrol.

Abstract

Den mitokondrielle permeabilitetsovergangspore (mPTP) er en spændingsgated, ikke-selektiv, indre mitokondriemembran (IMM) megakanal, der er vigtig for sundhed og sygdom. mPTP medierer lækage af protoner over IMM under åbning med lav konduktans og hæmmes specifikt af ciclosporin A (CsA). Coenzym Q (CoQ) er en regulator af mPTP, og vævsspecifikke forskelle er fundet i CoQ-indhold og åben sandsynlighed for mPTP i forhjerne og hjertemitokondrier i en nyfødt musemodel af skrøbeligt X-syndrom (FXS, Fmr1 knockout). Vi udviklede en teknik til at bestemme spændingstærsklen for mPTP-åbning i denne mutante stamme og udnyttede mPTP's rolle som en protonlækagekanal.

For at gøre dette blev iltforbrug og membranpotentiale (ΔΨ) samtidigt målt i isolerede mitokondrier ved hjælp af polarografi og en tetraphenylphosphonium (TPP+) ionselektiv elektrode under lækageåndedræt. Tærsklen for mPTP-åbning blev bestemt ved begyndelsen af CsA-medieret hæmning af protonlækage ved specifikke membranpotentialer. Ved hjælp af denne tilgang blev forskelle i spændingsgating af mPTP præcist defineret i forbindelse med CoQ-overskud. Denne nye teknik vil muliggøre fremtidig undersøgelse for at forbedre forståelsen af fysiologisk og patologisk regulering af lavledningsåbning af mPTP.

Introduction

mPTP medierer permeabilitetsovergangen (PT), hvorved IMM bliver brat gennemtrængelig for små molekyler og opløst 1,2. Dette slående fænomen er en tydelig afvigelse fra IMM's karakteristiske uigennemtrængelighed, som er grundlæggende for at fastslå den elektrokemiske gradient, der er nødvendig for oxidativ fosforylering3. PT er i modsætning til andre mitokondrielle transportmekanismer en højkonduktans, uspecifik og ikke-selektiv proces, der tillader passage af en række molekyler op til 1,5 kDa 4,5. mPTP er en spændingsgated kanal inden for IMM, hvis åbning ændrer ΔΨ, ATP-produktion, calciumhomeostase, reaktiv iltart (ROS) produktion og cellelevedygtighed4.

Ved den patologiske ekstrem fører ukontrolleret og langvarig højkonduktansåbning af mPTP til sammenbrud af den elektrokemiske gradient, matrixhævelse, udtømning af matrixpyridinnukleotider, ydre membranbrud, frigivelse af intermembranproteiner (herunder cytokrom c) og i sidste ende celledød 4,6. En sådan patologisk mPTP-åbning har været impliceret i hjerteiskæmi-reperfusionsskade, hjertesvigt, traumatisk hjerneskade, forskellige neurodegenerative sygdomme og diabetes 1,7. MPTP-åbning med lav konduktans er imidlertid fysiologisk og fører i modsætning til åbning med høj konduktans ikke til dyb depolarisering eller mitokondriel hævelse4.

Lavledningsåbning af poren begrænser permeabiliteten til ~ 300 Da, tillader passage af protoner uafhængigt af ATP-syntese og er en potentiel kilde til fysiologisk protonlækage5. Fysiologisk mPTP-åbning forårsager et kontrolleret fald i ΔΨ, øger elektronfluxen gennem åndedrætstransportkæden og resulterer i en kort burst eller flash af superoxid, hvilket bidrager til ROS-signalering8. Regulering af en sådan forbigående mPTP-åbning er vigtig for calciumhomeostase og normal cellulær udvikling og modning 4,9,10,11. Forbigående poreåbning i udviklende neuroner udløser for eksempel differentiering, mens lukningen af mPTP inducerer modning i umodne kardiomyocytter 4,5.

Selvom den funktionelle betydning af mPTP i sundhed og sygdom er veletableret, er dens præcise molekylære identitet stadig debatteret. Fremskridtene med hensyn til mPTP's molekylære struktur og funktion er blevet grundigt gennemgået andetsteds12. Kort fortalt er mPTP's høj- og lavkonduktanstilstande i øjeblikket blevet antaget at være medieret af forskellige enheder12. Spidskandidaterne er F1/F0 ATP-syntasen (ATP-syntasen) og adeninnukleotidtransportøren (ANT) til henholdsvis høj- og lavledningsmodus12.

På trods af manglen på konsensus om den nøjagtige identitet af den poredannende komponent i mPTP er visse nøgleegenskaber blevet detaljeret. Et veletableret træk ved mPTP er, at det reguleres af den elektrokemiske gradient, således at depolarisering af IMM fører til poreåbning13. Tidligere arbejde har vist, at redoxtilstanden for vicinale thiolgrupper ændrer mPTP'ens spændingsgating, således at oxidation åbner poren ved relativt højere ΔΨs, og thiolgruppereduktion resulterer i lukket mPTP-sandsynlighed14. Identiteten af den proteinholdige spændingssensor er imidlertid ukendt.

Forskellige små molekyler, der modulerer porens åbne sandsynlighed, er blevet identificeret. For eksempel kan mPTP stimuleres til at åbne med calcium, uorganisk fosfat, fedtsyrer og ROS og kan hæmmes af adeninnukleotider (især ADP), magnesium, protoner og CsA 5,12. Virkningsmekanismerne for nogle af disse regulatorer er blevet belyst. Mitokondrielt calcium udløser mPTP-åbning i det mindste delvist ved at binde til β-underenheden af ATP-syntase15. ROS kan aktivere mPTP ved at reducere dets affinitet for ADP og forbedre dets affinitet for cyclophilin D (CypD), den bedst undersøgte proteinholdige mPTP-aktivator16. Mekanismen for aktivering af mPTP med uorganisk fosfat og fedtsyrer er mindre klar. Hvad angår endogene hæmmere, menes ADP at hæmme mPTP ved binding ved ANT- eller ATP-syntasen, mens magnesium udøver sin hæmmende virkning ved at fortrænge calcium fra dets bindingssted 15,17,18,19.

Lav pH hæmmer mPTP-åbningen ved protonering af histidin 112 af den regulatoriske oligomycinfølsomhedsoverledende protein (OSCP) underenhed af ATP-syntasen 12,20,21. Den prototypiske farmakologiske hæmmer af mPTP, CsA, virker ved at binde CypD og forhindre dets tilknytning til OSCP22,23. Tidligere arbejde har også vist, at en række CoQ-analoger interagerer med mPTP, hæmmer det eller aktiverer det24. I det seneste arbejde fandt vi tegn på en patologisk åben mPTP, overdreven protonlækage og ineffektiv oxidativ fosforylering på grund af en CoQ-mangel i forhjernemitokondrier hos nyfødte FXS-museunger25.

Lukning af poren med eksogen CoQ blokerede den patologiske protonlækage og inducerede morfologisk modenhed af dendritiske rygsøjler25. Interessant nok havde FXS-kardiomyocytter hos de samme dyr for høje CoQ-niveauer og lukket mPTP-sandsynlighed sammenlignet medvildtypekontroller 26. Selvom årsagen til disse vævsspecifikke forskelle i CoQ-niveauer er ukendt, understreger resultaterne konceptet om, at endogen CoQ sandsynligvis er en nøgleregulator for mPTP. Der er dog et stort hul i vores viden, fordi mekanismen for CoQ-medieret hæmning af mPTP forbliver ukendt.

Regulering af mPTP er en kritisk determinant for cellesignalering og overlevelse4. Således er detektering af mPTP-åbning inden for mitokondrier nøglen, når man overvejer specifikke patofysiologiske mekanismer. Typisk bestemmes tærsklen for poreåbning med høj konduktans ved hjælp af calcium for at udløse permeabilitetsovergangen. En sådan calciumbelastning fører til sammenbrud af membranpotentialet, hurtig afkobling af oxidativ phosphorylering og mitokondriel hævelse27,28. Vi forsøgte at udvikle en metode til at detektere mPTP-åbning med lav konduktans in situ uden at inducere den i sig selv.

Tilgangen udnytter mPTP's rolle som en protonlækagekanal. For at gøre dette blev Clark-Type og TPP+ ionselektive elektroder anvendt til samtidig at måle henholdsvis iltforbrug og membranpotentiale i isolerede mitokondrier under lækageåndedræt29. Tærsklen for mPTP-åbning blev bestemt ved begyndelsen af CsA-medieret hæmning af protonlækage ved specifikke membranpotentialer. Ved hjælp af denne tilgang blev forskelle i spændingsgating af mPTP i forbindelse med CoQ-overskud præcist defineret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Institutional Animal Care and Use Committee of Columbia University Medical Center godkendelse blev opnået for alle beskrevne metoder. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) og kontrolmus (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) mus, der blev anvendt som modelsystemer til denne undersøgelse, blev kommercielt erhvervet (se materialetabellen). Fem til elleve dyr blev brugt i hver forsøgsgruppe. Postnatal dag 10 (P10) mus blev brugt til at modellere for et tidspunkt i menneskets barndom.

1. Mitokondriel isolering fra musehjerte

  1. Forbered buffere til mitokondrieisolering og respirationsforsøg som beskrevet i tabel 1. Opbevares ved 4 °C, hvis det er lavet på forhånd.
    1. Forbered 15 % densitetsgradientmedium: Fortynd kommerciel densitetsgradientmedium til 80 % volumen/volumen (v/v) med densitetsgradientfortyndingsmiddel. Yderligere fortynd 80% densitetsgradientmedium 15% v/v ved tilsætning af mitokondriel isolationsbuffer (MI)/bovin serumalbumin (BSA).
  2. Isoler mitokondrier fra frisk, ikke frosset væv til disse forsøg og brug på forberedelsesdagen, typisk inden for fem timer26. Udfør alle isolationstrin på is.
    1. Halshug musen og udspeg hjertet. Vask straks 1-2 gange i en petriskål med iskold MI/BSA. Skær atriumet af og hak vævet.
    2. Overfør hakket hjertevæv til en glasglashomogenisator indeholdende 1 ml MI / BSA. Homogeniser med en løsere (A) pestle (10 slag), derefter en strammere (B) pestle (10 slag).
    3. Homogenatet centrifugeres ved 1.100 × g i 2 minutter ved 4 °C for at fjerne nukleart og cellulært affald.
    4. Tag supernatanten forsigtigt uden at røre ved nogen fluffy pellet, og læg den forsigtigt oven på 700 μL 15% densitetsgradientmedium i et centrifugerør. Centrifuge ved 18.500 × g i 15 minutter ved 4 °C.
    5. Pelleten suspenderes igen i 1 ml saccharosebuffer (SB)/BSA og centrifugeres ved 10.000 × g i 10 minutter ved 4 °C.
    6. Fjern og kassér supernatanten helt. Brug pillen i SB/BSA til et endeligt volumen på 55 μL.
    7. Kvantificer mitokondrieproteinindholdet ved hjælp af et standardassay såsom proteinassayet bicinchoninsyre (BCA).

2. Mitokondrielt iltforbrug (O2) og ΔΨ

  1. Oxygenelektrode samling og kalibrering
    1. Opsæt og kalibrer iltelektroden (se materialetabellen) i henhold til producentens anvisninger.
      1. Placer en dråbe 50% kaliumchlorid (KCl) elektrolytopløsning oven på elektrodeskivens kuppel.
      2. Anbring et lille stykke ~ 2 cm2 cigaretpapir afstandsstykke dækket med et lidt større stykke af den tilvejebragte polytetrafluorethylen (PTFE) membran over elektrolytdråben.
      3. Brug det medfølgende applikatorværktøj til at skubbe den lille elektrodeskive O-ring over elektrodens kuppel.
        BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er luftbobler, og at membranen er glat.
    2. Påd reservoiret godt med elektrolytopløsningen.
    3. Placer den større O-ring i fordybningen omkring elektrodeskiven godt.
    4. Installer disken i elektrodekammeret, og tilslut den til styreenheden.
    5. Tilsæt 2 ml luftmættet deioniseret vand til reaktionskammeret og den PTFE-belagte magnet til kammeret.
    6. Tilslut kammeret til bagsiden af styreenheden.
    7. Temperaturen indstilles til 37 °C og omrøringshastigheden til 100.
    8. Lad systemtemperaturen være ligestillet i 10 minutter, før kalibreringen påbegyndes.
    9. Under fanen Kalibrering skal du vælge Kalibrering af væskefase for at udføre kalibrering af væskefase. Bekræft, at temperaturen er indstillet til 37 °C, omrøringshastigheden er 100, og trykket indstilles til atmosfærisk tryk (101,32 kPa).
    10. Tryk på OK , og vent på, at signalet plateau.
    11. Når et plateau er nået, skal du trykke på OK.
    12. Etabler nulO2 i kammeret ved at tilsætte en lille mængde (~ 20 mg) natriumdithionit.
    13. Tryk på OK , og vent på, at signalet plateau.
    14. Når et plateau er nået, skal du trykke på Gem for at acceptere kalibreringen.
  2. TPP+-selektiv elektrodesamling
    1. Fyld TPP+- selektiv elektrodespids med 10 mM TPP-opløsning ved hjælp af den medfølgende sprøjte og fleksible nål, og pas på at undgå luftbobler.
    2. Saml det TPP+-selektive elektrodeapparat, herunder referenceelektroden og elektrodeholderen, (se materialetabellen) i overensstemmelse med producentens anvisninger.
    3. Løsn kort elektrodeholderhætten, og indsæt den interne referenceelektrode i TPP+-spidsen. Stram hætten for at fastgøre spidsen. Tilslut det medfølgende kabel til elektrodeholderen og kontrolboksens hjælpeport.
    4. Indsæt TPP+-selektiv elektrode og referenceelektroder i den tilpassede stempelenhed til ionselektive elektroder. Tilslut referenceelektroden til kontrolboksens referenceport.
    5. Indsæt TPP+-selektive elektroder og referenceelektroder i den tilpassede stempelenhed til ionselektive elektroder.
  3. Forberedelse af reaktionskammer
    1. Reaktionsblandingen tilsættes reaktionskammeret: 10 mM succinat (komplekst II-substrat), 5 μM rotenon (kompleks I-hæmmer), 80 ng ml-1 nigericin (for at kollapse pH-gradient over IMM), 2,5 μg ml-1 oligomycin (for at inducere respirationstilstand 4-respiration) og respirationsbuffer (RB)/BSA-reaktionsbuffer til et endeligt volumen på 1 ml. Pas på at undgå at indføre luftbobler i kammeret.
    2. Luk kammeret med den tilpassede stempelenhed med TPP+-selektiven og referenceelektroden på plads. Vælg GO for at starte optagelsen. Når kammeret er lukket, indføres yderligere reagenser direkte i reaktionsopløsningen ved hjælp af separate mikrosyringer modificeret med plastrør for at justere nålelængden.
  4. TPP+ kalibrering
    1. Når der er opnået et stabilt spændingssignal, kalibreres den TPP+-selektive elektrode ved at tilsætte 1 μM trin af en 0,1 mM TPP-opløsning til en endelig koncentration på 3 μM. Bemærk, at der er et logaritmisk fald i TPP + spændingssignalet med hver tilføjelse.
      BEMÆRK: Kalibrer den TPP+-selektive elektrode ved starten af hvert forsøg.
  5. Dataindsamling
    1. LadO2- og TPP+- sporene stabilisere sig, og tilsæt 100 μg frisklavede kardiomyocytmitokondrier til reaktionskammeret til en endelig koncentration på 0,1 mg ml-1 via reagenstilsætningsporten i stempelenheden. Overhold faldet iO2-niveauerne i kammeret, når mitokondrier får energi og forbrugerO2 og den pludselige stigning i TPP + spændingssignalet, da mitokondrierne genererer et membranpotentiale og optager TPP + fra opløsningen.
    2. Tilsæt 2,5 μg ml-1 oligomycin for at fremkalde tilstand 4-åndedræt.
      BEMÆRK: O2 forbrugshastigheder repræsenterer nu hastigheden af protonlækage respiration. Oligomycin kan tilsættes til reaktionskammeret før TPP+ som et alternativ.
  6. Vurdering af den åbne sandsynlighed for mPTP
    1. Bemærk, at ΔΨ falder over tid under lækageåndedræt. Når den ønskede ΔΨ er nået, tilsættes 1 μM CsA (mPTP-hæmmer) til reaktionskammeret for at vurdere den åbne sandsynlighed for mPTP ved den specifikke ΔΨ.
    2. Mål effekten af CsA påO2-forbrug og ΔΨ før og efter CsA-tilføjelse
    3. Bestem spændingsafhængigheden af mPTP-åbningen ved at variere ΔΨ, hvor CsA tilføjes i successive eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TypiskeO2-forbrugs- og ΔΨ-kurver, der genereres i disse eksperimenter, er vist (figur 1A,B). Det logaritmiske fald i spændingssignalet med TPP+-kalibrering vises i starten af hvert eksperiment. Fraværet af dette logaritmiske mønster kan tyde på et problem med den selektive TPP+-elektrode. Mitokondrier genererer typisk ΔΨ umiddelbart efter tilsætning til åndedrætsbuffer. ΔΨ kan fortolkes ud fra ændringer i TPP+-spænding baseret på Nernst-ligningen (logaritmisk forhold mellem [TPP+ inde i mitokondriematrix] og [ekstern TPP+])30. Bemærk, at fysiologisk ΔΨ tilnærmer sig 2 μM TPP+ niveauet af standardkurven. Spændingstærskler blev således defineret i forhold til 2 μM TPP+ standarden (betegnet som Δ mV TPP+ spændingssignal).

For eksempel blev "høj ΔΨ" defineret som ~Δ0 mV (på 2 μM TPP + -niveauet), en "mellemliggende ΔΨ" blev sat til ~ Δ5 mV (under 2 μM TPP +), og "lav ΔΨ" blev sat til ~ Δ10 mV (under 2 μM TPP +) (figur 1A, B). I pilotforsøg udviste mitokondrier ved Δ0 mV 100% mPTP lukket sandsynlighed, og dem ved Δ10 mV udviste 100% åben sandsynlighed; repræsentative grafer er vist i figur 1A,B. Δ5 mV-tærsklen blev således vilkårligt valgt som en mellemliggende ΔΨ. Bemærk, at i disse eksperimenter, ved tilsætning af mitokondrier til reaktionskammeret, er mitokondrier i tilstand 2 respiration, hvor de udsættes for overskydende substrat. Mitokondrier stimuleres ikke til at komme ind i tilstand 3 med ADP; som følge heraf, når oligomycin er tilsat, overgår de direkte til tilstand 4 oligomycin (lækageåndedræt). Som følge heraf observeres en mærkbar forskel i iltforbruget typisk ikke efter oligomycin-tilsætning, hvilket tyder på, at ATP-syntasen bidrager minimalt til åndedrættet under tilstand 2 (figur 1A,B). For at evaluere mPTP'ens åbne eller lukkede status sammenlignesO2-forbrugshastigheden og membranpotentialet lige før og lige efter CsA-tilsætning (figur 1C). Et fald iO2-forbrugshastigheden og en stigning og stabilisering af ΔΨ som reaktion på CsA indikerer lukning af en åben mPTP (blokade af poremedieret protonlækage) (figur 1C, sorte kurver).

Når mPTP er lukket, er der intet fald iO2-forbrugshastigheden , og ΔΨ stiger og stabiliseres ikke, men fortsætter med at falde (figur 1C, røde kurver). De eksperimentelle resultater viser lignende lukkede og åbne mPTP-sandsynligheder ved henholdsvis høje og lave ΔΨ'er i FVB-kontrol og Fmr1 KO hjertemitokondrier (figur 1D). Disse fund er i overensstemmelse med mPTP'ens kendte spændingsfølsomme egenskaber, hvor poren har tendens til at være lukket ved høje ΔΨs og åbne ved lav ΔΨs13. Ved hjælp af denne metode demonstrerede vi således pålideligt den sædvanlige spændingsafhængighed af mPTP i begge stammer. Interessant nok viste Fmr1 KO hjertemitokondrier ved den mellemliggende ΔΨ (Δ5 mV-tærskel) øget lukket mPTP-sandsynlighed sammenlignet med FVB-kontroller (figur 1D). Således viste Fmr1 KO hjertemitokondrier et skift i gating således, at poren krævede en lavere ΔΨ for at åbningen kunne udløses. Dette er i overensstemmelse med den tidligere konstatering af, at Fmr1 KO'er har forhøjede niveauer af CoQ og en relativt lukket mPTP26. Metoden identificerede således en optimal ΔΨ-tærskel for at løse forskelle i mPTP-åbning. Det er vigtigt, at definitionen af denne ΔΨ-tærskel vil muliggøre yderligere undersøgelse for bedre at forstå, hvordan CoQ regulerer mPTP, og hvordan CoQ-mangel fører til patologisk poreåbning i FXS.

Figure 1
Figur 1: Påvisning af mPTP-åben sandsynlighed med lav konduktans. (A, B) Repræsentative kurver for samtidigtO2-forbrug (rødt, tal er hastigheder i nmol påO2 ml-1 min-1 mg protein-1) med ΔΨ (sort, [TPP+]). Pile angiver tilsætning af TPP +, mitokondrier, oligomycin og CsA. Der vises høj-, mellem- og lavspændingstærskler i forhold til kalibreringsniveauet på 2 μM TPP+. Tilføjelse af CsA ved høje (A) og lave (B) spændingstærskler vises. C) Forstørret sektion af O2-forbrugskurverne (øvre) og ΔΨ (nedre) i (A) og (B) ved CsA-tilføjelsen, der illustrerer lukket mPTP (rød) ved høj ΔΨ (ufølsom over for CsA) og åben mPTP (sort) ved lav ΔΨ (følsom over for CsA). (D) Sammenfattende grafer over mPTP åben og lukket status ved høj, lav og mellemliggende ΔΨs vises for FVB-kontroller (sort) og Fmr1 KO'er (grå). Fem til 11 dyr blev evalueret ved hver ΔΨ-tærskel; p-værdier blev beregnet ved hjælp af en chi-kvadreret test, *p < 0,05. Forkortelser: ΔΨ = mitokondriemembranpotentiale; mPTP = mitokondriel permeabilitetsovergangspore; TPP+ = tetraphenylphosphonium; mito = mitokondrier; oligo = oligomycin; CsA = ciclosporin A; ΔΨ = ; KO = knockout. Klik her for at se en større version af denne figur.

Komponent MI/BSA* SB/BSA* Tæthedsgradientfortyndingsfortyndingsmiddel RB/BSA*
Mannitol 225 mM - - -
Saccharose 75 mM 250 mM 1 m 200 mM
HEPES 5 mM 5 mM 50 mM 5 mM
EGTA 1 mM 0,1 mM 10 mM -
KCl - - - 25 mM
KH2PO4 - - - 2 mM
MgCl2 - - - 5 mM
pH** 7.4 7.4 - 7.2
BSA*** 0.10% 0.10% - 0.02%
AP5A*** - - - 30 mM

Tabel 1: Buffere og løsninger.
* Filtrer gennem 0,2 μm filtre
**Juster pH med 3 M kaliumhydroxid efter behov.
Betegner bufferkomponenter, der tilføjes lige før mitokondrieisolering.
Forkortelser: MI = mitokondriel isolationsbuffer; SB = saccharosebuffer; RB = Respirationsbuffer; BSA = fedtsyrefrit bovin serumalbumin; HEPES = 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre; EGTA = ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraeddikesyre; KCl = kaliumchlorid; KH2PO4 = kaliumdihydrogenphosphat; MgCl2 = magnesiumchlorid; AP5A = P1,P5-diadenosin-5' pentaphosphatpentanatrium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette papir beskriver en metode til vurdering af den åbne sandsynlighed for mPTP. Specifikt blev spændingstærsklen for mPTP-åbning med lav konduktans bestemt ved at vurdere effekten af CsA-hæmning på protonlækage over en række ΔΨ'er. Ved hjælp af denne teknik kunne vi identificere forskelle i spændingsgating af mPTP mellem FXS-mus og FVB-kontroller i overensstemmelse med deres forskelle i vævsspecifikt CoQ-indhold. Afgørende for succesen med denne metode er, at mitokondrier er friskisolerede inden brug og er af god kvalitet. Mitokondrier, der enten er beskadiget under isolation eller for gamle, vil ikke være i stand til at generere passende ΔΨ og vil typisk blive afkoblet. Bemærk, at mens matrix pH typisk bidrager til protonmotivkraften, bruges nigericin til at kollapse ΔpH på tværs af IMM i disse eksperimenter, som tidligere beskrevet i standardprotokoller, der vurderer protonlækage29. Derfor svarer protondrivkraften i dette tilfælde til ΔΨ, hvilket forenkler den eksperimentelle tilgang.

En anden vigtig overvejelse er, at nogle af de hæmmere, der anvendes i respirationsblandingen (såsom rotenon, oligomycin og CsA), er vanskelige at skylle væk mellem eksperimenter, fordi de klæber til reaktionskammerets plastoverflader, herunder de ionselektive elektroder. Kammeret skal vaskes rutinemæssigt med ethanol og en suspension af råt tilberedte fryseoptøede mitokondrier for at "moppe" disse hæmmere fra kammeret og reducere sandsynligheden for inhibitoroverførsel, der kan påvirke eksperimenternes reproducerbarhed.

Da mitokondrier skal være frisklavede for at bevare deres integritet, er denne metode ikke modtagelig for analyser med høj kapacitet. Derudover er der brug for relativt store mængder mitokondrier til hvert forsøg. For P10-dyr kan der typisk isoleres nok mitokondrier fra et organ til at udføre et enkelt eksperiment. Derfor er det normalt ikke muligt at teste forskellige betingelser på det samme parti mitokondrier. Hvis der udføres forsøg med ældre dyr, er denne begrænsning mindre af et problem i betragtning af den relativt større størrelse af væv og organer.

Der findes en række velbeskrevne metoder til at studere den åbne sandsynlighed for mPTP i isolerede intakte mitokondrier. Teknikker, såsom hævelse af mitokondrielle matrixer og calciumbelastnings- eller retentionskapacitetsassays, udløser nødvendigvis PT med høj konduktans og tillader således ikke undersøgelse af fysiologisk lavkonduktansåbning, der er af interesse for disse eksperimenter28. Patch-clamp-teknikken giver en kraftfuld og direkte metode til at studere spændingsafhængigheden af høj- eller lavkonduktanstilstande i mPTP31,32. Det er dog en besværlig teknik, hvor kun en enkelt mitokondrier og en enkelt eksperimentel tilstand kan studeres ad gangen, hvilket gør sammenlignende undersøgelser vanskeligere32,33.

Derudover lyseres den ydre mitokondriemembran typisk, og den indre mitokondriemembran brister typisk i de patch-clamp-metoder, der anvendes til isolerede mitokondrier, hvilket kan resultere i tab af mPTP-regulatoriske faktorer, der ikke er tæt forbundet med IMM31. Lavkonduktansåbningen af mPTP er også blevet undersøgt ved hjælp af en række fluorescensteknikker, der typisk anvender en tetramethylrhodaminester (til vurdering af ændringer i ΔΨ) enten alene eller i kombination med calcein, hvis intramitokondrielle fluorescens er modtagelig for koboltslukning, når mPTP er åben 8,34. I fluorescensbaserede tilgange, hvor ændringer i ΔΨ udtrykkes som relative ændringer i fluorescens, giver fremgangsmåden imidlertid typisk ikke mulighed for præcis måling af ΔΨ 8,34.

Denne metode giver en ny alternativ tilgang til vurdering af mPTP'ens åbning med lav konduktans i forhold til ΔΨ. Ved hjælp af denne tilgang kan efterforskere studere reguleringen af fysiologisk og patologisk mPTP-spændingsgating. Denne teknik lover også at hjælpe med at forstå mPTP's udviklingsmæssige rolle i organmodning, da den kan anvendes på forskellige væv og forskellige udviklingsstadier. Denne fremgangsmåde kan let anvendes til at studere spændingsgating af mPTP i FXS-museforhjernevæv, som tidligere udviste nedsat CoQ-niveau25. Desuden foreslår vi, at denne teknik også kan bruges til at studere, hvordan andre midler, endogene eller eksogene, påvirker spændingsgating af mPTP. Det vil således vise sig at være et nyttigt redskab til at udvide forståelsen af mPTP's bidrag til sundhed og sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde støttes af følgende bevillinger: NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost Award til Department of Anesthesiology (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.) og NIH/NINDS R01NS112706 (R.J.L.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific 15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 PP systems 941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. Fisher Scientific 14-170-11B to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free Sigma A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm World Precision Inst. LLC DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips World Precision Inst. LLC KWIK-2  ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA) Sigma 324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FXS mice, Fmr1 KO 
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk Cole-Parmer EW-07938-30 microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle Cole-Parmer EW-07938-02 microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete PP systems OXYTHERM+R oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma 1374248
Mannitol Sigma M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) Sigma D4022-10MG
Percoll Sigma P1644 medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl) Sigma P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma 5.43841
Sucrose Sigma S0389
TPP+ Electrode Tips (3) World Precision Inst. LLC TIPTPP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
  2. Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
  3. Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W. Molecular Biology of the Cell. Alberts, B., et al. 14, Garland Science. Chapter 14 767-830 (2002).
  4. Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).
  5. Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
  6. Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
  7. Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
  8. Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
  9. Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
  10. Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
  11. Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
  12. Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
  13. Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
  14. Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
  15. Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
  16. Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
  17. Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
  18. Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
  19. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  20. Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
  21. Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
  22. Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
  23. Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
  24. Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
  25. Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
  26. Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
  27. Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 11 187-196 (2018).
  28. Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
  29. Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 9 157-170 (2018).
  30. Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 6 109-119 (2018).
  31. Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
  32. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
  33. Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
  34. Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).

Tags

Biologi udgave 184
Vurdering af åben sandsynlighed for den mitokondrielle permeabilitetsovergangspore i indstillingen af coenzym Q-overskud
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. … More

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. J. Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess. J. Vis. Exp. (184), e63646, doi:10.3791/63646 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter