Genom-dækkende profilering af transkriptionsfaktor-DNA-bindende interaktioner i Candida albicans: En omfattende CUT &RUN-metode og dataanalysearbejdsgang

Summary

Denne protokol beskriver en eksperimentel metode og dataanalysearbejdsgang for spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease (CUT & RUN) i det humane svampepatogen Candida albicans.

Abstract

Regulatoriske transkriptionsfaktorer styrer mange vigtige biologiske processer, herunder cellulær differentiering, reaktioner på miljøforstyrrelser og belastninger og værtspatogeninteraktioner. Bestemmelse af den genom-brede binding af regulatoriske transkriptionsfaktorer til DNA er afgørende for at forstå funktionen af transkriptionsfaktorer i disse ofte komplekse biologiske processer. Spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease (CUT&RUN) er en moderne metode til genom-dækkende kortlægning af in vivo-protein-DNA-bindingsinteraktioner, der er et attraktivt alternativ til den traditionelle og udbredte kromatinimmunfældning efterfulgt af sekventeringsmetode (ChIP-seq). CUT&RUN er modtagelig for en eksperimentel opsætning med højere gennemstrømning og har et væsentligt højere dynamisk område med lavere sekventeringsomkostninger pr. prøve end ChIP-seq. Her beskrives en omfattende CUT&RUN-protokol og tilhørende dataanalysearbejdsgang, der er skræddersyet til genom-dækkende analyse af transkriptionsfaktor-DNA-bindende interaktioner i det humane svampepatogen Candida albicans. Denne detaljerede protokol omfatter alle nødvendige eksperimentelle procedurer, fra epitopmærkning af transkriptionsfaktorkodende gener til biblioteksforberedelse til sekventering; Derudover inkluderer den en tilpasset beregningsarbejdsgang til CUT & RUN-dataanalyse.

Introduction

Candida albicans er et klinisk relevant, polymorft humant svampepatogen, der findes i en række forskellige vækstformer, såsom den planktoniske (fritflydende) vækstform og som samfund af tæt klæbende celler beskyttet af en ekstracellulær matrix, kendt som biofilmtilstanden for vækst ^1,2,3. I lighed med andre udviklingsmæssige og cellulære processer er biofilmudvikling et vigtigt C. albicans virulenstræk, der vides at blive kontrolleret på transkriptionsniveau af regulatoriske transkriptionsfaktorer (TF'er), der binder til DNA på en sekvensspecifik måde⁴. For nylig har kromatinregulatorer og histonmodifikatorer også vist sig som vigtige regulatorer af C. albicans biofilmdannelse⁵ og morfogenese⁶ ved at formidle DNA-tilgængelighed. For at forstå den komplekse biologi af dette vigtige svampepatogen er effektive metoder til bestemmelse af genom-wide lokalisering af specifikke TF'er under forskellige udviklingsmæssige og cellulære processer værdifulde.

Kromatinimmunfældning efterfulgt af sekventering (ChIP-seq) er en meget anvendt metode til at undersøge protein-DNA-interaktioner i C. albicans ^5,6 og har stort set erstattet den mere klassiske kromatinimmunfældning efterfulgt af mikroarray (ChIP-chip)^9-metoden. Både ChIP-seq- og ChIP-chip-metoder kræver imidlertid et stort antal inputceller¹⁰, hvilket kan være en komplicerende faktor, når man undersøger TF'er i forbindelse med specifikke prøver og vækstformer, såsom biofilm indsamlet fra patienter eller dyremodeller for infektion. Derudover giver kromatinimmunfældningsassayet (ChIP) ofte en betydelig mængde baggrundssignal i hele genomet, hvilket kræver et højt berigelsesniveau for målet af interesse for at adskille signal tilstrækkeligt fra støj. Mens ChIP-chip-analysen stort set er forældet i dag, gør de sekventeringsdybder, der er nødvendige for ChIP-seq, dette assay uoverkommeligt dyrt for mange forskere, især dem, der studerer flere TF'er og / eller kromatin-associerede proteiner.

Spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease (CUT&RUN) er et attraktivt alternativ til ChIP-seq. Det blev udviklet af Henikoff-laboratoriet i 2017 for at omgå begrænsningerne ved ChIP-seq og kromatin endogen spaltning efterfulgt af sekventering af ChEC-seq^11,12, en anden metode til at identificere protein-DNA-interaktioner på et genom-bredt niveau, samtidig med at der tilvejebringes højopløselig, genom-dækkende kortlægning af TF'er og kromatin-associerede proteiner¹³ . CUT&RUN er afhængig af den målrettede fordøjelse af kromatin i permeabiliserede kerner ved hjælp af tekerede mikrokoknukleaser efterfulgt af sekventering af de fordøjede DNA-fragmenter ^9,10. Da DNA-fragmenter specifikt genereres på loci, der er bundet af et protein af interesse, snarere end at blive genereret i hele genomet via tilfældig fragmentering som i ChIP-assays, resulterer CUT&RUN-tilgangen i stærkt reducerede baggrundssignaler og kræver således 1/10^th af sekventeringsdybden sammenlignet med ChIP-seq^{11,13, 14}. Disse forbedringer fører i sidste ende til betydelige reduktioner i sekventeringsomkostningerne og reduktioner i det samlede antal inputceller, der er nødvendige som udgangsmateriale for hver prøve.

Her beskrives en robust CUT&RUN-protokol, der er blevet tilpasset og optimeret til bestemmelse af genom-wide lokalisering af TF'er i C. albicans celler isoleret fra biofilm og planktoniske kulturer. Der præsenteres også en grundig dataanalysepipeline, som muliggør behandling og analyse af de resulterende sekvensdata og kræver, at brugerne har minimal ekspertise inden for kodning eller bioinformatik. Kort fortalt beskriver denne protokol epitopmærkning af TF-kodende gener, høst af biofilm og planktoniske celler, isolering af intakte permeabiliserede kerner, inkubation med primære antistoffer mod det specifikke protein eller epitopmærkede protein af interesse, tethering af de kimære A / G-mikrokoknuklease (pAG-MNase) fusionsproteiner til de primære antistoffer, genomisk DNA-genopretning efter kromatinfordøjelse og forberedelse af genomiske DNA-biblioteker til sekventering.

Den eksperimentelle CUT&RUN-protokol efterfølges af en specialbygget dataanalysepipeline, der tager rå DNA-sekventeringslæsninger i FASTQ-format og implementerer alle nødvendige behandlingstrin for at give en komplet liste over signifikant berigede loci bundet af TF af interesse (målrettet mod det primære antistof). Bemærk, at flere trin i den beskrevne biblioteksforberedelsesprotokol er specielt tilpasset og optimeret til CUT&RUN-analyse af TF'er (i modsætning til nukleosomer). Mens de data, der præsenteres i dette manuskript, blev genereret ved hjælp af TF-specifikke tilpasninger af et kommercielt CUT&RUN-sæt, er disse protokoller også blevet valideret ved hjælp af individuelt fremskaffede komponenter (dvs. pAG-MNase-enzym og magnetiske DNA-oprensningsperler) og internt forberedte buffere, hvilket kan reducere eksperimentelle omkostninger betydeligt. De omfattende eksperimentelle og dataanalyseprotokoller er beskrevet detaljeret nedenfor i et trin-for-trin format. Alle reagenser og kritisk udstyr samt buffer- og medieopskrifter er opført i henholdsvis materialetabellen og supplerende fil 1.

Protocol

1. Epitopmærkning af C. albicans stammer

1. Upload genet af interesse sammen med dets 1 kb opstrøms og nedstrøms flankerende sekvenser fra Candida Genome Database til primerdesignværktøjet (se table of Materials). Design et guide-RNA (gRNA) ved at fremhæve 50 bp opstrøms og nedstrøms fra stopkodonen, og klik på gRNA-udvælgelsesværktøjet til højre. Vælg Design og analysér guider. Brug Ca22-genomet (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploid)) og et NGG-protospacer-motiv (SpCas9, 3' side) tilstødende motiv (PAM) til vejledningsparametrene, og klik på Udfør. Figur 1 beskriver arbejdsgangen for epitopmærkning af et C. albicans gen af interesse med forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP).
   1. På den efterfølgende side skal du bekræfte målområdet for gRNA-design og trykke på den grønne knap. Sorter gRNA'er efter On-Target Score.
      BEMÆRK: Primerdesignværktøjet beregner on-target og off-target scores for at kvantificere gRNA'ernes specificitet. En ideel guide har en on-target score på >60, en off-target score på ~ 33 og overlapper stopkodonen. Dette muliggør høj gRNA-specificitet, mens ablerer gRNA-målretning efter GFP-integration. Et gRNA med en off-target score på ~ 50 indikerer allelisk variation; således genkendes kun en allel af gRNA'et.
   2. Tilføj sekvenserne (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') og (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') til henholdsvis 5' og 3' enderne af 20 bp gRNA-målsekvensen, hvilket skaber et 60 bp primer/oligonukleotid. Alternativt kan du kopiere 20 bp-sekvensen til gRNA-regnemaskinen leveret af Nguyen et ^al.15. Bestil 60 bp brugerdefineret gRNA-oligonukleotid.
   3. Forstærk det "universelle A-fragment" med 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCC-3') og 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') og det "unikke B-fragment" med det brugerdefinerede 60 bp gRNA-oligonukleotid (100 mM) fra trin 1.1.2. og 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGTTTAAACACCG-3') ved anvendelse af henholdsvis pADH110 (plasmiddepot-ID# 90982) og pADH139 (plasmiddepot-ID# 90987) som skabelon-DNA. Anvend PCR-reaktions- og cykelbetingelserne i tabel 1.
      BEMÆRK: pADH139 er specifik for stammer, der bærer den heterologe Candida maltosa LEU2-markør . Hvis der anvendes en stamme med en enkelt kopi af C. albicans LEU2-genet, erstattes pADH119 (plasmiddepot ID# 90985) i stedet for pADH139.
   4. Bekræft vellykket forstærkning ved at kontrollere 5 μL af PCR på en 1% agarosegel. Se efter ~ 1 kb A og B fragment amplicons.
   5. Bland 1 μL hvert af A- og B-fragmenterne, og sy dem sammen ved hjælp af PCR-reaktions- og cykelbetingelserne i tabel 2 for at skabe et C-fragment i fuld længde.
   6. Der tilsættes 0,5 μL 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') og 0,5 μL 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3') til hver PCR-reaktion, blandes godt ved pipettering, og de cykelbetingelser, der er anført i tabel 3, afsluttes.
      BEMÆRK: Hvis pADH119 anvendes i stedet for pADH139, erstattes AHO1238 (5'-TGTATTTTTTTAAAATTTTAGTGACTGTTTC-3') i stedet for AHO1453.
   7. Bekræft korrekt syning og forstærkning af C-fragmentet ved at kontrollere 5 μL af PCR på en 1% agarosegel. Kig efter en ~ 2 kb amplicon. C-fragmentet opbevares ved -20 °C, indtil det er klar til brug.
      BEMÆRK: Hvis syning og forstærkning resulterer i flere, uspecifikke bånd eller udtværing, skal du udføre en PCR-oprydning af A- og B-fragmenterne og gentage fra trin 1.1.5.
2. Tilføj hele den CTG-optimerede monomere eGFP med linkersekvens (RIPLING)¹⁶ (pCE1, plasmid repository ID# 174434) umiddelbart opstrøms for stopkodonen for det gen, der er af interesse, ved hjælp af primerdesignværktøjet, hvilket skaber en C-terminal translationel fusion. Brug denne konstruktion til at designe oligonukleotider til forstærkning af donor-DNA 'dna (dDNA) fra pCE1.
   1. Design et fremadrettet oligonukleotid med 18-22 bp homologi til linkersekvensen og >50 bp homologi til 3' enden af den åbne læseramme (ORF).
      BEMÆRK: Homologien på 18-22 bp skaber en udglødningstemperatur til forstærkning mellem 55 °C og 58 °C. Hvis oligonukleotid i fuld længde danner primerdimerer, skal homologien justeres til linkersekvensen/GFP eller genomet i overensstemmelse hermed.
   2. Opret et omvendt oligonukleotid med 18-22 bp homologi til 3' slutningen af GFP og >50 bp homologi til den nedstrøms ikke-kodende sekvens af ORF, der skal mærkes.
   3. Bestil disse oligonukleotider og amplificer dDNA'et ved hjælp af de medfølgende touchdown PCR-cykelforhold i tabel 4.
3. Design to sæt koloni PCR (cPCR) oligonukleotider til bekræftelse af integrationen af GFP ved at forstærke på tværs af de flankerende integrationssteder. Vælg først det fremadrettede dDNA-oligonukleotid ved hjælp af primerdesignværktøjet, og klik på primerknappen til højre.
   1. Klik på Opret primere | | Tm Param og bekræft, at algoritmen er indstillet til SantaLucia 1998. Klik på Brug markering for at indtaste koordinaterne for det fremadrettede oligonukleotid, der er designet i 1.2.1 som målsekvens.
   2. Indstil den optimale primertemperatur til 55 °C og den maksimale ampliconstørrelse til 900 bp, og klik på knappen Generer primere øverst til højre.
   3. Vælg det oligonukleotidpar med den laveste strafscore, og bekræft, at primerne forstærkes på tværs af 5' integrationsstedet. Sørg for, at den fremadrettede cPCR-primer ligger opstrøms for den fremadrettede dDNA-primersekvens og den omvendte cPCR-primer fuldt ud inden for eGFP-tagget eller linkersekvensen.
   4. Gentag trin 1.3-1.3.3. med det omvendte dDNA-oligonukleotid for at skabe det andet sæt cPCR-oligonukleotider, der forstærker på tværs af 3 'integrationsstedet. Sørg for, at den fremadrettede cPCR-primer ligger helt inden for eGFP-tagget eller linkersekvensen og den omvendte cPCR-primer nedstrøms for den omvendte dDNA-primersekvens.
   5. Bestil disse oligonukleotider.
4. Fordøje 2.500 ng pADH140, som indeholder Cas9 (plasmid repository ID# 90988), med restriktionsenzym for hvert gen, der skal GFP-mærkes. Indstil det samlede volumen af hver fordøjelse til 15 μL; justere vandmængden i overensstemmelse hermed baseret på pADH140-plasmidkoncentrationen. Brug de fordøjelsesbetingelser, der er angivet i tabel 5. Det fordøjede plasmid opbevares ved -20 °C, indtil det er klar til brug.
   BEMÆRK: Hvis en stamme transformeres med en enkelt kopi af C. albicans LEU2-genet, erstattes pADH137 (plasmiddepot ID# 90986) i stedet for pADH140 i stedet for pADH140.
5. Denaturer 12 μL 10 mg/ml laksesæd-DNA for hvert gen, der vil blive GFP-mærket ved 99 °C i 10 minutter og hurtigt afkøles til ≤4 °C. Opbevares ved -20 °C, indtil de er klar til brug.
6. Stribe en C. albicans LEU2 hemizygot nourseothricin-følsom stamme på gær peptone dextrose (YPD) plader og inkubere ved 30 ° C i to dage.
7. Vælg en enkelt koloni og overfør den til 4 ml flydende YPD. Inkuber i 12-16 timer ved 30 °C med omrystning ved 250 o/min.
8. Den optiske densitet ved 600 nm (OD₆₀₀) af den natlige (12-16 timer) kultur måles i et spektrofotometer ved hjælp af en engangskuvette (1 ml, 1 cm stilængde).
9. Fortynd overnight-kulturen i en Erlenmeyer-kolbe til en OD₆₀₀ på 0,1 i YPD. Konto for 5 ml pr. reaktion og inkluder yderligere 5 ml til kontrol af OD₆₀₀ senere.
   BEMÆRK: Kulturens volumen afhænger af antallet af transformationsreaktioner.
10. Inkuber den fortyndede natkultur i en rystende inkubator ved 30 °C med omrystning ved 250 o / min, indtil den når en OD₆₀₀ på 0,5-0,8.
11. Centrifuge ved 4.000 × g ved stuetemperatur i 5 minutter; fjern og kassér supernatanten.
12. Resuspend cellepillen i 1 ml sterilt vand via skånsom pipetteblanding med filterspidser og overfør til et sterilt 1,5 ml mikrofugerør.
13. Pellet cellerne ved centrifugering ved 4.000 × g ved stuetemperatur i 1 min; fjern og kassér supernatanten. Genophæv i 1 ml sterilt vand og gentag i alt to vaske.
14. Resuspend pelleten i 1/100^th af det volumen, der anvendes i trin 1.10. For eksempel, hvis der blev brugt 15 ml, skal pillen genudsættes i 150 μL sterilt vand.
15. I et separat rør for hver transformationsreaktion blandes 50 μL C-fragment, 50 μL dDNA, 2.500 ng restriktionsenzymfordøjet pADH140 og 10 μL denatureret laksesæd-DNA.
16. Tilsæt 50 μL af celleopslæmningen fra trin 1.14 og bland ved pipettering.
17. Lav et lager af pladeblandingen (supplerende fil 1) til n + 1 transformationer.
18. Tilsæt 1 ml af pladeblandingen til celle/DNA-blandingen og bland ved at invertere 5 gange.
    BEMÆRK: Tryk på bunden af rørene, mens du vender om for at løsne eventuel resterende væske.
19. Blandingen anbrings i en inkubator ved 30 °C natten over (12-16 timer) uden at ryste.
20. Varmechok cellerne i 15 minutter ved 44 °C i et vandbad.
21. Centrifugering af 1,5 ml mikrofugerør ved 5.000 × g ved stuetemperatur i 2 minutter.
22. Fjern PLATE-blandingen ved vakuumaspiration ved hjælp af sterile pipettespidser, og pas på at undgå at forstyrre cellepillen.
23. Resuspend cellepillen i 1 ml YPD, pellet ved centrifugering ved 4.000 × g ved stuetemperatur i 1 minut, og fjern og kassér supernatanten. Gentag til en anden vask, resuspend cellepillen i 1 ml YPD, og overfør suspensionen til et 10 ml rundbundet engangskulturrør indeholdende yderligere 1 ml YPD (2 ml endeligt volumen). Cellerne genvindes ved 30 °C med omrystning ved 250 o/min i 5 timer.
24. Centrifuger rørene ved 4.000 × g ved stuetemperatur i 5 minutter; fjern og kassér supernatanten.
25. Resuspend cellepillen i 100 μL sterilt vand og plade på YPD suppleret med 200 μg/ml nourseothricin (NAT200). Inkuber ved 30 °C i 2-3 dage.
26. Aliquot 100 μL af 20 mM NaOH i brøndene på en 96-brønds PCR-plade, hvor hver brønd svarer til en individuel koloni, der voksede på NAT200-pladerne. Brug en steril tandstikker eller pipettespids til at vælge individuelle transformerede kolonier, lappe dem på en ny NAT200-plade og hvirvle de resterende celler i en brønd med 20 mM NaOH. Gentag for de resterende kolonier for at skabe cellelysat, der anvendes som DNA-skabelon til cPCR-reaktionen.
27. Forsegl PCR-pladen og inkuber i 10 minutter ved 99 °C i en termocyklist med opvarmet låg.
28. Opsæt to cPCR-reaktioner med oligonukleotiderne designet i trin 1.3-1.3.5. Opskaler antallet af reaktioner efter behov. PCR-reaktionen udføres med cellelysat fremstillet i trin 1.26 efter cyklusbetingelser og PCR-reaktionsblandinger fra tabel 6. Kør 10-20 μL fra hver brønd på en 1% agarosegel. Kig efter kolonier med forstærkning af de to cPCR-primersæt, der angiver korrekt inkorporeret GFP dDNA.
29. Restreak kolonier, der inkorporerede GFP på syntetisk komplet (SC) medier, der mangler leucin. Inkuber i en 30 °C inkubator i 2-3 dage. Pluk individuelle kolonier og patch på YPD og YPD suppleret med 400 μg / ml nourseothricin (NAT400) plader. Identificer kolonier, der ikke vokser på NAT400-plader efter 24 timer, som dem, der med succes har mistet CRISPR-komponenterne.
30. Bekræft, at GFP-tagget bevares ved at gentage trin 1.25-1.28 ved hjælp af celler fra YPD-patchpladen. Hvis de korrekte bånd er til stede, podes i 4 ml YPD og vokses natten over (12-16 timer) som beskrevet i trin 1.7.
31. Bland natten over-kulturen af den nye GFP-mærkede stamme med filtersteriliseret 50% glycerol i forholdet 1:1 i et sterilt kryorør. Opbevares ved -80 °C og hviler på YPD-plader efter behov.
    BEMÆRK: Det anbefales at validere de GFP-mærkede stammer ved at bekræfte nuklear lokalisering af den mærkede TF via fluorescerende mikroskopi og bekræfte en vildtypefænotype i et passende fænotypisk assay.

2. Prøveforberedelse af biofilmkulturer

1. Streak C. albicans GFP-mærkede stamme(r) på YPD agar plader og inkubere ved 30 °C i 2-3 dage. Brug en enkelt isoleret koloni fra agarpladen til at inokulere i 4 ml YPD flydende medium. Inkuber ved 30 °C med omrystning natten over (12-16 timer). Bestem OD₆₀₀ for overnatningskulturen (-erne).
   BEMÆRK: Det anbefales at anvende tre biologiske replikater pr. prøve til CUT&RUN-eksperimenterne.
2. Inokuler en steril 12-brønds ubehandlet cellekulturplade med natten over-kulturen til en endelig OD₆₀₀ på 0,5 (svarende til 2 × 10⁷ celler / ml) i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medium til et endeligt volumen på 2 ml. Inkuber i 90 minutter ved 37 °C i en mikropladeinkubator med rystelser ved 250 o/min.
   BEMÆRK: Det anbefales at anvende en cellekulturplade med 12 brønde pr. stamme med en brønd, der ikke er beregnet som en medium-alene kontamineringskontrol. Denne protokol er blevet anvendt med succes ved hjælp af så lidt som 1/10^th af en 12-brønds cellekulturpladebrønde (eller så få som 5 millioner celler). Brug af et højere antal celler øger det samlede DNA-udbytte, hvilket typisk resulterer i sekventeringsbiblioteker af høj kvalitet.
3. Fjern ikke-udyrerede celler ved aspiration ved hjælp af sterile pipettespidser, der er fastgjort via fleksible plastrør til et vakuumfældeapparat. Vask de klæbende celler en gang med 2 ml sterilt 1x fosfatbufret saltvand (PBS). Tilsæt 2 ml frisk RPMI-1640 medium til brøndene og inkuber i 24 timer ved 37 ° C med rystelser ved 250 o / min.
   BEMÆRK: Skift pipettespidser mellem brønde af forskellig stamme og/eller tilstand. Skrab ikke bunden af brønden med spidsen, mens du aspirerer.
4. Ved afslutningen af 24 timers inkubationen opsamles og samles væsken og biofilmmaterialet fra hver af de 11 podede brønde i et enkelt, sterilt 50 ml konisk rør. Gentag efter behov med uafhængige puljer, hvis du behandler mere end en stamme eller væksttilstand samtidigt.
   BEMÆRK: Skrab bunden og kanterne af hver brønd med en pipettefilterspids for at løsne celler, der forbliver klæbet til overfladen. Brug pipetten til at homogenisere biofilmene.
5. Pelletsprøver ved centrifugering ved 4.000 × g ved stuetemperatur i 5 minutter. Dekanter så meget af supernatanten som muligt, og pas på at minimere forstyrrelse af pelleten. Snap-freeze pillen i flydende nitrogen og opbevar ved -80 °C umiddelbart efter opsamling eller fortsæt direkte til trin 4 (isolering af kerner).

3. Prøveforberedelse af planktoniske kulturer

1. Streak C. albicans GFP-mærkede stamme(r) på YPD agar plader og inkubere ved 30 °C i 2-3 dage. Brug en enkelt isoleret koloni fra agarpladen til at inokulere i 4 ml YPD flydende medium. Inkuber ved 30 °C med omrystning natten over (12-16 timer). Bestem OD₆₀₀ for overnatningskulturen (-erne).
2. Tilbagefortyndede kulturer natten over til OD₆₀₀ på 0,1 i 50 ml RPMI-1640 flydende medium og inkuberes ved 30 °C med omrystning ved 225 o / min i 2-5 timer, indtil OD₆₀₀ er mellem 0,5 og 0,8.
   BEMÆRK: Celler skal gennemgå mindst to fordoblinger, før de høstes. Betingelser, der anvendes til planktoniske kulturer, kan justeres efter behov.
3. Pellet prøverne ved centrifugering ved 4.000 × g ved stuetemperatur i 5 minutter. Dekanter så meget af supernatanten som muligt, og pas på at minimere forstyrrelse af pelleten. Snap-freeze pillen i flydende nitrogen og opbevar ved -80 °C umiddelbart efter opsamling eller fortsæt direkte til trin 4 (isolering af kerner).

4. Isolering af kerner

BEMÆRK: På forsøgsdagen skal du forberede frisk Ficoll-buffer, tilsætte 2-mercaptoethanol og proteasehæmmer til alikvote(r) i Resuspension-bufferen og tilsætte proteasehæmmer til alikvote(r) i SPC-bufferen (se supplerende fil 1). For at resuspendere pellets skal du forsigtigt pipette ved hjælp af enten 200 μL eller 1 ml pipettespidser for at undgå at beskadige cellerne eller kernerne. Inden kerneisoleringen påbegyndes, skal du tænde for varmeblokken for at forvarme den til 30 °C. Alle pipettespidser og -rør i resten af denne protokol skal være certificeret DNA/RNA og DNase/RNase-fri, og det anbefales at anvende filterspidser til alle efterfølgende pipetteringstrin.

1. Resuspend pellet(s) i 1 ml stuetemperatur Resuspension Buffer og overfør til et sterilt 1,5 ml mikrofugerør. Pellet ved 2.000 × g ved stuetemperatur i 2 minutter i en bordcentrifuge og fjern supernatanten.
   BEMÆRK: Fjern supernatanten ved hjælp af enten 200 μL eller 1 ml pipettespids, og sørg for at minimere forstyrrelse af pellets.
2. Resuspend pellet(s) i 200 μL stuetemperatur Resuspension Buffer. Fra den resuspenderede pellet overføres en 5 μL alikvote til et nyt PCR-rør og opbevares ved 4 °C til senere brug.
   BEMÆRK: Denne alikvote vil blive brugt som en kontrol under et efterfølgende kvalitetskontroltrin for at evaluere kvaliteten af de isolerede kerner.
3. Pellet ved 2.000 × g i 2 min og fjern og kassér supernatanten ved hjælp af en pipette. Gentag vasketrinnet to gange ved hjælp af 200 μL Resuspension Buffer.
4. Centrifuge ved 2.000 × g ved stuetemperatur i 2 min og fjerne supernatanten. Der tilsættes 300 μL Resuspension Buffer og 10 μL lyticaseopløsning (50 mg/ml, se materialetabellen). Inkuber i 30 minutter ved 30 °C i en varmeblok.
   BEMÆRK: Alternativt kan et vandbad opvarmet til 30 °C også anvendes i stedet for en varmeblok. De her anvendte spheroplasting betingelser er blevet optimeret til at være effektive for både gær og hyphal celler af C. albicans. Det anbefales at optimere spheroplastingbetingelserne, når denne protokol anvendes på C. albicans-celler med mutationer, der påvirker cellevægsintegriteten eller andre cellulære morfologier. I løbet af dette 30 minutters inkubationstrin har brugeren mulighed for at gennemføre trin 5 (Concanavalin A Bead Activation) på forhånd for at spare tid.
   1. KRITISK TRIN: Efter 30 minutters inkubationstrin overføres en 5 μL alikvote til et nyt PCR-rør. Til de 5 μL isolerede kerner og 5 μL alikvote intakte celler, der er lagret ved 4 °C fra trin 4.2, tilsættes 1 μL calcofluor hvid (et fluorescerende cellevægsfarvestof) og 1 μL SYTO 13 (en nukleinsyreplet). Inkuber ved 30 °C i mørke i 30 min.
   2. Kontroller visuelt integriteten og renheden af de isolerede kerner ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Kig efter isolerede kerner, der viser fremtrædende farvede intakte kerner (ved hjælp af et 488-509 nm excitationsfilter) og sørg for, at der ikke er nogen cellevægsfarvning af calcofluor hvidt farvestof (ved hjælp af et 390-420 nm excitationsfilter). I de intakte kontrolceller skal du kigge efter fremtrædende cellevægsfarvning af det kalcofluor hvide farvestof (ved hjælp af et 390-420 nm excitationsfilter) og farvede intakte kerner (ved hjælp af et 488-509 nm excitationsfilter).
5. Centrifuge ved 2.000 × g ved 4 °C i 5 min og fjerne supernatanten. Resuspend pillen i 500 μL iskold Resuspension Buffer ved hjælp af 1 ml filterspidser ved at pipere forsigtigt op og ned 5 gange. Centrifuge ved 2.000 × g ved 4 °C i 5 min. og fjerne supernatanten ved hjælp af en 1 ml pipette. Gensuspend pillen med 1 ml frisklavet iskold Ficoll Buffer.
   BEMÆRK: Opbevar prøverne og bufferne på is fra dette punkt og fremefter.
6. Centrifugering af prøverne ved 5.000 × g ved 4 °C i 10 minutter og supernatanten fjernes. Resuspend pellet i 500 μL iskold SPC Buffer.
   BEMÆRK: Fra dette tidspunkt skal du håndtere kernerne ekstremt forsigtigt for at undgå at beskadige dem.
7. Centrifugering af prøverne ved 5.000 × g ved 4 °C i 10 minutter og fjerner så meget af supernatanten som muligt uden at forstyrre pillen. Placer rørene, der indeholder de pelleterede kerner, på is, og fortsæt til trin 5. Hvis trin 5 allerede var afsluttet på forhånd i trin 4.4, skal du fortsætte til trin 6 eller snap-fryse pellets i flydende nitrogen og opbevare dem ved -80 °C umiddelbart efter indsamling.

5. Concanavalin A perle aktivering

BEMÆRK: Dette er et kritisk skridt. Fra dette tidspunkt har brugerne mulighed for at fortsætte med protokollen ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt CUT&RUN-sæt eller kildenøglekomponenter individuelt og forberede buffere internt. Hvis du bruger det kommercielle kit, er alle buffere og reagenser, der anvendes nedenfor, inkluderet i sættet, medmindre andet er angivet. Individuelle katalognumre til indkøb af reagenser uafhængigt findes også i materialetabellen. Nedkøl alle buffere på is inden brug. Når trin 5 er afsluttet, anbefales det at fortsætte til trin 6 med det samme. Undgå flere fryse-optøning af isolerede kerner, da det vides at øge DNA-skader og kan føre til resultater af dårlig kvalitet.

1. Forsigtigt resuspend concanavalin A (ConA) perlerne ved hjælp af en pipette. Overfør 22 μL ConA-perlesuspension pr. prøve, der skal behandles i et enkelt 1,5 ml mikrofugerør. Anbring røret på et magnetisk stativ, indtil perleopslæmningen er klar; fjern og kassér supernatanten ved hjælp af en pipette.
   BEMÆRK: Når du udfører CUT&RUN for i alt 10 prøver, skal du f.eks. overføre 220 μL af ConA-perlesuspensionen til et 1,5 ml mikrofugerør.
2. Fjern røret, der indeholder ConA-perlerne, fra magnetstativet, og tilsæt straks 200 μL iskold perleaktiveringsbuffer og bland forsigtigt med en pipette. Anbring røret på magnetstativet, indtil perleopslæmningen er klar; fjern og kassér supernatanten ved hjælp af en pipette. Gentag dette trin for i alt to vaske.
3. Resuspend perlerne i 22 μL iskold perleaktiveringsbuffer pr. prøve af kerner, der skal behandles. Opbevar perlerne på is, indtil det er nødvendigt.
   BEMÆRK: Gennemstrømningen af de efterfølgende trin afhænger af antallet og kapaciteten af tilgængelige magnetiske rørstativer. Behandling af 32 prøver i to 16-brønds rørstativer er et håndterbart antal for de fleste brugere af denne protokol. Højere gennemstrømning er dog mulig for mere erfarne brugere, eller hvis robotvæskehåndteringssystemer er tilgængelige.

6. Binding af kerner til aktiverede perler

BEMÆRK: Nedkøl alle buffere på is inden brug. Alle buffere suppleret med proteasehæmmere skal fremstilles friske på forsøgsdagen. Det anbefales at bruge 0,2 ml strimmelrør i de efterfølgende trin.

1. Resuspend de pelleterede kerner fra trin 4 i 100 μL iskold SPC Buffer og overfør til en ny 8-rør 0,2 ml strimmel. Tilsæt 20 μL af de aktiverede perler til hver prøve og pipette forsigtigt for at blande. Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter uden omrøring.
2. Anbring rørene på magnetstativet, indtil opslæmningen er klar; fjern og kassér supernatanten ved hjælp af en pipette. Fjern rørene fra magnetstativet, og tilsæt 200 μL iskold vaskebuffer til hver prøve. Genophænd perlerne ved forsigtigt at pipettere op og ned 5 gange. Overfør 100 μL alikvoter fra hver prøve til en ny 8-rørs 0,2 ml strimmel.
   1. KRITISK TRIN: Opdel hver CUT&RUN-prøve i to separate alikvoter. Brug en af alikvoterne til det negative kontrolantistof (f.eks. IgG-negativt kontrolantistof) og det andet til målantistoffet mod det protein, der er af interesse (f.eks. Anti-GFP-antistof).
      BEMÆRK: Begge prøver er nødvendige for, at beregningsrørledningen nøjagtigt kan identificere berigelsessignaler, der er specifikke for TF af interesse. En yderligere kontrol ved hjælp af anti-GFP-antistoffer med en umærket stamme kan også udføres. Denne kontrol har vist resultater, der kan sammenlignes med brugen af IgG-antistoffer i en GFP-mærket stamme. Derfor anbefales det for enkelhedens skyld at bruge standard IgG-kontrollen til alle eksperimenter.

7. Primær antistofbinding

BEMÆRK: pAG-MNase fusionsprotein binder godt til kanin, ged, æsel, marsvin og mus IgG-antistoffer¹⁷. Generelt er de fleste kommercielle ChIP-seq-certificerede kommercielle antistoffer kompatible med CUT&RUN-procedurer. Mængden af primært antistof, der anvendes, afhænger af antistoffets effektivitet, og titrering af antistoffet (f.eks. 1:50, 1:100, 1:200 og 1:400 endelig fortynding) kan være nødvendig, hvis det pågældende antistof ikke tidligere er blevet testet i ChIP- eller CUT&RUN-eksperimenter. Nedkøl alle buffere på is inden brug. Alle buffere, der anvendes til antistofbindingstrin, skal fremstilles friske på forsøgsdagen.

1. Anbring rørene på et magnetisk stativ, og vent, indtil opslæmningen er helt klar; fjern og kassér supernatanten ved hjælp af en pipette. Tilsæt 50 μL af antistofbufferen og bland forsigtigt ved pipettering.
2. Tilsæt 3 μL af anti-GFP polyklonale antistof (eller 0,5 μg, hvis der anvendes et uprøvet antistof). Inkuber rørene på en nøddeblander ved 4 °C i 2 timer.
   BEMÆRK: Nogle CUT&RUN-protokoller rapporterer øget udbytte ved at tilføje et sekundært antistof før pAG-MNase-tilføjelse¹⁴; der blev imidlertid ikke observeret nogen signifikant forbedring ved hjælp af dette tilføjede trin, og det er derfor ikke inkluderet i denne protokol.
3. Centrifugering af rørene ved 100 × g ved stuetemperatur i 5 s, anbring rørene på et magnetisk stativ, og når opslæmningen er klar, fjernes og kasseres supernatanten ved hjælp af en pipette. Mens rørene, der indeholder perlerne, stadig er på magnetstativet, tilsættes 200 μL iskold cellepermeabiliseringsbuffer direkte på perlerne. Fjern og kassér supernatanten ved hjælp af en pipette. Gentag i alt to vaske med den iskolde cellepermeabiliseringsbuffer.
4. Tilsæt 50 μL iskold cellepermeabiliseringsbuffer til hvert rør og bland forsigtigt ved pipettering.
   BEMÆRK: Perler aggregeres ofte på dette tidspunkt, men kan let spredes ved at blande forsigtigt ved hjælp af en 200 μL pipette.

8. Binding af pAG-MNase til antistof

1. Der tilsættes 2,5 μL pAG-Mnase (20x stam) til hver prøve og blandes forsigtigt ved pipettering. Anbring prøverne (let forhøjet i ~ 45 ° vinkel) på en nutator ved 4 ° C. Tænd for nutatoren og inkuber prøverne i 1 time.
2. Strimmelrørene centrifugeres kortvarigt ved 100 × g ved stuetemperatur i 5 s, rørene anbringes på et magnetisk stativ, og når opslæmningen er klar, fjernes og kasseres supernatanten ved hjælp af en pipette.
   BEMÆRK: Dette trin er kritisk. Overførselsantistof, der forbliver i hætten eller siderne af rørene efter dette trin, vil øge mængden af baggrundssignal betydeligt.
3. Mens rørene, der indeholder perlerne, stadig er på magnetstativet, tilsættes 200 μL iskold cellepermeabiliseringsbuffer, lad opslæmningen rydde og fjern og kassér supernatanten ved hjælp af en pipette. Gentag dette trin for i alt to vaske med cellepermeabiliseringsbufferen.
4. Tilsæt 100 μL af den iskolde cellepermeabiliseringsbuffer til prøverne og pipetter forsigtigt op og ned 5 gange.

9. Målrettet kromatinfordøjelse og frigivelse

1. Inkuber rørene, der indeholder prøven/prøverne, i et vådt isbad i 5 minutter. Der tilsættes 3 μL 100 mM_CaCl2 i hver prøve ved hjælp af en flerkanalspipette. Rør forsigtigt op og ned 5 gange, returner straks rørene til det våde isbad og inkuber i 30 minutter.
2. Tilsæt 66 μL stopbufferen til hver prøve og hvirvel forsigtigt for at blande. Inkubere prøver i 10 minutter ved 37 °C i et tørt bad.
   BEMÆRK: Det anbefales at tilføje 1,5 pg heterologt E. coli spike-in DNA pr. prøve i stopbufferen. Tilføjelsen af 1,5 pg E. coli spike-in DNA resulterer i 1.000-10.000 kortlagte spike-in læsninger for 1-10 millioner kortlagte eksperimentelle læsninger¹⁴. Spike-in DNA bruges til at kalibrere sekventeringsdybden og er især vigtig for at sammenligne prøver i en serie. Tilsætning af spike-in E. coli anbefales stærkt, men ikke afgørende. Det kommercielle CUT&RUN-sæt indeholder E. coli spike-in DNA, men det kan også købes separat.
3. Anbring rørene på magnetstativet, og overfør 160 μL af supernatanten til et 1,5 ml mikrofugerør. 80 μL af prøven overføres til et nyt 2 ml mikrofugerør og opbevares ved -20 °C, hvis der er behov for en backupprøve. Fortsæt til trin 10 med prøven på 80 μL.

10. Oprydning af indsamlede DNA-prøver

BEMÆRK: Inkuber DNA-oprensningsperler ved stuetemperatur i 30 minutter før brug. Prechill 100% isopropanol på is. Når du blander prøverne, pipette op og ned 10 gange.

1. Vortex DNA Purification Perler til homogenisering af perlesuspensionen. Tilsæt 50 μL (~ 0,6x prøvevolumen) af de resuspenderede perler til hver prøve. Pipette-bland og inkuber prøverne på en nutator i 5 minutter ved stuetemperatur.
   BEMÆRK: Forholdet mellem DNA-oprensningsperler og anvendt prøve er kritisk. Ved hjælp af 0,6x volumen DNA Purification Bead-opløsning i forhold til prøven gør det muligt for de magnetiske perler at binde sig til store DNA-fragmenter frigivet fra beskadigede kerner. CUT&RUN-berigede DNA-fragmenter er meget mindre end disse store DNA-fragmenter og bevares således i supernatanten på dette trin.
2. Anbring rørene på et magnetisk stativ og overfør 130 μL af supernatanten indeholdende DNA'et til en 0,2 ml 8-rørsstrimmel. Tilsæt yderligere 30 μL DNA-oprensningsperler til prøven/prøverne (det samlede volumen er 160 μL).
3. Tilsæt 170 μL (~ 1x prøvevolumen) iskold 100% isopropanol, bland godt ved pipettering op og ned 10 gange, og inkuber på is i 10 minutter.
   BEMÆRK: Det er afgørende, at 100% iskold isopropanol anvendes til dette trin til DNA-rensningsperlerne for effektivt at fange de CUT&RUN-berigede små fragmenter.
4. Placer rørene på magnetstativet, og når gyllen er ryddet, skal du forsigtigt fjerne og kassere supernatanten ved hjælp af en pipette.
5. Mens rørene er på magnetstativet, tilsættes 200 μL frisklavet, stuetemperatur 80% ethanol til rørene og inkuberes ved stuetemperatur i 30 s. Fjern forsigtigt og kassér supernatanten ved hjælp af en pipette. Gentag dette trin for i alt to vaske med 80% ethanol.
6. Drej hurtigt rørene ved 100 × g, læg rørene tilbage på magnetstativet, og fjern eventuel resterende ethanol ved hjælp af en pipette, efter at opslæmningen er ryddet. Lufttør perlerne i 5 min, mens rørene forbliver på magnetstativet med låget åbent.
   BEMÆRK: Overskrid ikke 5 minutters tørretid, da dette kan reducere det endelige DNA-udbytte betydeligt.
7. Fjern rørene fra magnetstativet og eluer DNA'et fra perlerne ved at tilsætte 17 μL 0,1x Tris-EDTA (TE) ved pH 8. Bland godt og inkuber rørene i 5 minutter ved stuetemperatur.
8. Placer rørene på magnetstativet, indtil opslæmningen bliver klar. Når opslæmningen er ryddet, overføres forsigtigt 15 μL af supernatanten til et sterilt 0,2 ml PCR-rør.
9. Koncentrationen af det indsamlede DNA måles ved hjælp af et fluorometer efter producentens protokol.
   BEMÆRK: Typisk er koncentrationen af det indsamlede DNA ~ 1 ng / μL. Nogle gange er koncentrationen af det indsamlede DNA for lav til at kvantificere ved hjælp af et fluorometer. Dette er ikke en indikator for et mislykket eksperiment. Fortsæt med biblioteksforberedelsen uanset koncentrationen af det indsamlede DNA.
10. Fortsæt til trin 11, eller opbevar prøverne ved -20 °C, indtil de er klar.

11. Biblioteksforberedelse til sekventering

BEMÆRK: Følgende trin bruger et kommercielt tilgængeligt biblioteksforberedelsessæt. Når du udfører trin ved hjælp af Ligation Master Mix, skal du minimere berøring af rørene og altid holde dem på is.

1. Ved hjælp af 0,1x TE ved pH 8 bringes det samlede volumen af CUT&RUN DNA'et op til 50 μL. Lav en masterblanding af 3 μL End Prep Enzyme Mix og 7 μL End Prep Reaction Buffer pr. Prøve. Tilsæt 10 μL mastermix til CUT&RUN DNA'et og bland grundigt ved at pipettere op og ned 5 gange.
2. Udfør et hurtigt spin ved 100 × g for at samle al væske fra siderne af røret. Anbring rørene i en termocyklist med det opvarmede låg indstillet til ≥75 °C, og kør cykelforholdene i tabel 7.
   BEMÆRK: Afhængigt af startindgangs-DNA-koncentrationerne indsamlet fra trin 10 skal du følge den krævede adapterfortynding fra tabel 8.
3. Der tilsættes 2,5 μL adapter pr. prøve, og bland grundigt ved at pipettere op og ned 10 gange.
   BEMÆRK: Det er vigtigt, at adapteren tilsættes prøven og blandes grundigt, inden ligationsmasterblandingen tilsættes.
4. Lav en masterblanding af 30 μL Ligation Master Mix og 1 μL Ligation Enhancer. Der tilsættes 31 μL af masterblandingen til prøven/prøverne. Bland grundigt ved at pipettere op og ned 10 gange.
5. Inkuber ved 20 °C i 15 min. i en termocyklist med det opvarmede låg slukket.
   BEMÆRK: Det er afgørende, at prøverne opbevares på is og først overføres til termocyklisten, når termocyklisten har nået 20 °C.
6. Udfør en hurtig centrifugering ved 100 × g for at opsamle al væske fra siderne af røret, tilsæt 3 μL Uracil Excision Enzyme, og inkuber rørene i termocyklineren ved 37 °C i 15 minutter med det opvarmede låg indstillet til ≥47 °C.
   BEMÆRK: Dette er et sikkert stoppested; Prøverne opbevares ved -20 °C eller fortsættes direkte til trin 11.7. Hvis du fortsætter direkte til trin 11.7, skal du inkubere DNA-renseperlerne ved stuetemperatur i 30 minutter før brug.
7. Tilsæt 154,4 μL (~ 1,6x prøvevolumen) af DNA-oprensningsperlerne til adapterens ligationsreaktion fra trin 11.6. Pipette-bland og inkuber prøverne i 5 minutter ved stuetemperatur.
8. Placer rørene på magnetstativet, og når gyllen er ryddet, skal du forsigtigt fjerne og kassere supernatanten ved hjælp af en pipette.
9. Tilsæt 200 μL frisklavet, stuetemperatur 80% ethanol til rørene og inkuber ved stuetemperatur i 30 s. Fjern og kassér forsigtigt supernatanten ved hjælp af en pipette, og gentag dette trin for i alt to vaske med 80% ethanol.
10. Drej rørene kort ved 100 × g. Placer rørene tilbage på magnetstativet, og fjern eventuel resterende ethanol ved hjælp af en pipette. Lufttør perlerne i 5 min, mens rørene forbliver på magnetstativet med låget åbent.
    BEMÆRK: Overskrid ikke 5 minutters tørretid, da dette kan reducere det endelige DNA-udbytte betydeligt.
11. Fjern rørene fra magnetstativet og eluer DNA'et fra perlerne ved at tilsætte 17 μL 0,1x TE ved pH 8. Bland godt og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
12. Placer rørene på magnetstativet, indtil opslæmningen bliver klar. Når opslæmningen er ryddet, overføres forsigtigt 15 μL af supernatanten til et sterilt 0,2 ml PCR-rør.
13. Lav en masterblanding af 25 μL DNA Polymerase Master Mix og 5 μL Universal Forward Library Amplification Primer (10 μM) pr. Prøve.
    BEMÆRK: Forbered en ekstra prøve af mastermix for at tage højde for pipetteringstab.
14. Tilsæt 30 μL af masterblandingen til 15 μL adapterligeret DNA-prøve. Tilsæt 5 μL Omvendt unikt indekseret biblioteksforstærkningsprimer (10 μM) til hver prøve for at bringe det endelige volumen til i alt 50 μL. Bland grundigt ved at pipettere op og ned 10 gange. Udfør PCR-cykelbetingelserne i tabel 9.
    BEMÆRK: Inkuber DNA-renseperlerne ved stuetemperatur i 30 minutter før brug.
15. Vortex DNA-oprensningsperlerne til at suspendere igen. Tilsæt 35 μL (~ 0,7x prøvevolumen) af de resuspenderede perler til de PCR-amplificerede DNA-prøver. Bland og inkuber prøverne på en nutator i 5 minutter ved stuetemperatur.
16. Placer rørene på magnetstativet, og når opslæmningen er klar, overføres supernatanten, der indeholder DNA'et, til et nyt 0,2 ml 8-brønds PCR-strimmelrør.
17. Tilsæt 119 μL (~ 1,4x prøvevolumen) perler til prøven, og bland ved pipettering op og ned 5 gange. Inkuber prøverne på en nutator i 5 minutter ved stuetemperatur.
18. Placer rørene på magnetstativet, og når gyllen er ryddet, skal du forsigtigt fjerne og kassere supernatanten ved hjælp af en pipette.
19. Tilsæt 200 μL frisklavet, stuetemperatur 80% ethanol til rørene og inkuber ved stuetemperatur i 30 s. Fjern forsigtigt og kassér supernatanten ved hjælp af en pipette; gentag trinnet for i alt to vaske med 80% ethanol.
20. Drej rørene kort ved 100 × g. Placer rørene tilbage på magnetstativet, og fjern eventuel resterende ethanol ved hjælp af en pipette. Lufttør perlerne i 5 min, mens rørene forbliver på magnetstativet med låget åbent.
    BEMÆRK: Overskrid ikke 5 minutters tørretid, da dette kan reducere det endelige DNA-udbytte betydeligt.
21. Fjern rørene fra magnetstativet og eluer DNA'et fra perlerne ved at tilsætte 14 μL 0,1x TE ved pH 8. Bland godt og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
22. Placer rørene på magnetstativet, indtil opslæmningen bliver klar. Når opslæmningen er ryddet, overføres forsigtigt 13 μL af supernatanten til et sterilt 0,2 ml PCR-rør.
23. Forbered frisk 1x Tris-borat-EDTA (TBE) og indsæt præfabrikeret, kommerciel 10% acrylamid TBE gel i gelelektroforeseapparatet fyldt med 1x TBE.
24. I den første brønd tilsættes 2 μL DNA-stige med lav rækkevidde. Bland 3 μL 6x ilægningsfarvestof med 13 μL af den prøve, der tidligere er indsamlet fra trin 11.22. Tilsæt forsigtigt 15 μL i hver brønd af gelen. Kør gelen i 90 min ved 70 V.
    BEMÆRK: Det anbefales at lade en brønd i gelen være tom mellem hver prøve, da dette reducerer sandsynligheden for krydskontaminering af prøven. Erfarne brugere kan finde det hensigtsmæssigt at bruge alle brønde, samtidig med at krydskontaminering omhyggeligt undgås, især ved behandling af et stort antal prøver.
25. Fjern gelstøbningen fra gelboksen. Åbn gelstøbningen i henhold til producentens anvisninger, fjern forsigtigt gelen fra gelstøbningen, og læg den inde i en gelholderbakke indeholdende 100 ml 1x TBE.
    BEMÆRK: Sørg for forsigtigt at fjerne gelen fra gelstøbningen for at undgå at rive gelen, da den er tynd og skrøbelig. Det er vigtigt at forvæde handsker og gelen med 1x TBE, når gelen håndteres. Gelholderbakken skal være lidt større end gelens størrelse (ca. 0,5" på hver side). Plastlågene, der er forsynet med 96-brønds PCR-røropbevaringsbokse, er praktiske holdebakker til standard minigelstørrelser.
26. Tilsæt 10 μL af nukleinsyregelpletten til bakken og hvirvl forsigtigt. Dæk med folie for at beskytte mod lys og inkubere statisk ved stuetemperatur i 10 minutter.
27. Skyl gelen to gange med 100 ml deioniseret ledningsvand. Forestil dig gelen under blåt lysbelysning ved hjælp af et gult filterdæksel (figur 2).
    BEMÆRK: Succesfulde biblioteker viser en udtværing mellem 100 og 500 bp. Der vil også være et fremtrædende ~ 125 adapter dimer band. Tilstedeværelsen af adapterdimerer er ikke en indikator for dårlig bibliotekskvalitet. Denne mængde adapterdimerer er uundgåelig for CUT&RUN-eksperimenter, der udføres på TF'er med lav overflod, og er en konsekvens af den lave mængde inputmateriale, der bruges til at forberede disse biblioteker. Brug ikke ultraviolet lys, som kan beskadige DNA'et.
28. Som vist i figur 2 skal du for hvert bibliotek skære gelen lidt over det ~ 125 bp fremtrædende adapterdimerbånd (sørg for at undgå at røre ved adapterens dimerbånd) og under 400 bp stigemærket.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå ~ 125 adapter dimer båndet. Selv små mængder adapterdæmpere vil reducere bibliotekskvaliteten betydeligt.
29. Punktere bunden af et 0,65 ml rør ved hjælp af en 22 G nål og placere det punkterede rør inde i et sterilt 2 ml mikrofugerør. Overfør gelskiven til det punkterede rør inde i 2 ml mikrofugerøret.
30. Centrifugering af 2 ml mikrofugerøret indeholdende det punkterede rør på 0,65 ml og prøve ved 10.000 × g ved stuetemperatur i 2 minutter for at opsamle gelopslæmningen inde i 2 ml mikrofugerøret.
    BEMÆRK: Det punkterede rør skal nu være tomt og kan kasseres. Hvis det punkterede rør stadig har nogen gel tilbage indeni, skal du placere det punkterede rør tilbage inde i 2 ml mikrofugerøret og centrifuge igen ved 10.000 × g ved stuetemperatur i yderligere 2 minutter.
31. Til gelopslæmningen inde i 2 ml mikrofugerøret tilsættes 300 μL iskold gelelutningsbuffer og blandes på en møtrik ved stuetemperatur i mindst 3 timer eller natten over (12-16 timer).
32. Overfør al væske- og gelopslæmning til en 0,22 μm filtersøjle. Centrifuge ved 10.000 × g ved stuetemperatur i 1 min; det indsamlede volumen skal være ~ 300 μL.
33. Tilsæt 450 μL (~ 1,5x prøvevolumen) DNA-oprensningsperler, inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter på en nutator, og læg derefter prøven på magnetstativet, indtil opslæmningen er klar.
    BEMÆRK: Inkuber DNA-renseperlerne ved stuetemperatur i 30 minutter før brug.
34. Fjern og kassér 500 μL af supernatanten, og sørg for ikke at forstyrre perlerne.
35. Fjern prøven fra magnetstativet og bland perlerne ved at pipettere op og ned 5 gange. Overfør 200 μL af prøven til et nyt PCR-striprør.
36. Placer strimmelrøret på magnetstativet, og når gyllen er ryddet, skal du forsigtigt fjerne og kassere supernatanten ved hjælp af en pipette.
37. Tilsæt 200 μL frisklavet, stuetemperatur 80% ethanol til rørene og inkuber ved stuetemperatur i 30 s. Fjern forsigtigt og kassér supernatanten ved hjælp af en pipette; Gentag dette trin for i alt to vaske med 80% ethanol.
38. Drej rørene kort ved 100 × g. Placer rørene tilbage på magnetstativet, og fjern eventuel resterende ethanol ved hjælp af en pipette. Lufttør perlerne i op til 5 min, mens rørene forbliver på magnetstativet med låget åbent.
    BEMÆRK: Overskrid ikke 5 minutters tørretid, da dette kan reducere det endelige DNA-udbytte betydeligt.
39. Fjern rørene fra magnetstativet og eluer DNA'et fra perlerne ved at tilsætte 17 μL 0,1x TE ved pH 8. Bland godt og inkuber rørene i 5 minutter ved stuetemperatur.
40. Placer rørene på magnetstativet, indtil opslæmningen bliver klar. Når opslæmningen er ryddet, overføres forsigtigt 15 μL af supernatanten til et sterilt 0,2 ml PCR-rør.
41. Mål den endelige biblioteksmængde ved hjælp af fluorometeret; Brug dette endelige bibliotek til sekventering.
    BEMÆRK: Op til 48 biblioteker kan samles og sekventeres sammen i en enkelt bane ved hjælp af en sekventeringsplatform, der giver mindst 300 millioner 40 bp eller længere parrede læsninger.

12. CUT&RUN sekvensanalyse

BEMÆRK: Dette afsnit præsenterer den beregningsprotokol, der bruges til at analysere CUT&RUN-sekvensdataene. Protokollen begynder med opsætning af det beregningsmæssige virtuelle miljø og leder brugerne gennem udførelsen af kommandoerne på deres lokale maskine. Denne protokol fungerer på alle beregningsressourcer, såsom lokale maskiner, virtuelle cloudservere og højtydende computerklynger. Alle CUT&RUN-data, der præsenteres i dette papir, kan tilgås på NCBI GEO under tiltrædelsesnummer GSE193803.

1. Download kildekoden til CUT&RUN-analysen fra https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis.
   BEMÆRK: Arbejdsprocessen fungerer bedst på et MacOS- eller Linux OS-system. Windows-brugere kan køre arbejdsgangen ved hjælp af GitBash (se tabellen over materialer).
   1. Download koden direkte fra GitHub-siden ved at klikke på den grønne kodeknap | Download ZIP-indstillingen . Pak mappen ud til et relevant sted på den lokale maskine.
2. Installer Conda-miljøet (se tabellen over materialer), og kør kun én gang.
   BEMÆRK: Denne arbejdsgang bruger Conda-kommandolinjeværktøjsmiljøet til at installere al nødvendig software og værktøjer.
3. Når Conda er installeret (kun kørt én gang), skal du oprette et virtuelt miljø ved hjælp af den supplerende fil 2 , der følger med følgende kommando:
   conda create --name --file Supplementary_File_2.txt
4. Aktivér det virtuelle miljø, hver gang denne arbejdsproces skal udføres ved hjælp af:
   conda activate
5. Organiser input raw FASTQ-filer i en enkelt mappe, ideelt set en mappe pr. CUT & RUN-eksperiment.

13. Generering af genomfilen til justering

1. Generer genomfilen til justering (kør kun én gang for hver genomfil). Opret en mappe for at gemme alle C. albicans genomfiler, såsom:
   mkdir ca_genome_files

14. Download af C. albicans genomsamling 21

1. Download C. albicans genomsamling 21 fra Candida Genome Database ved hjælp af enten wget- eller curl-værktøjer (se materialetabellen)¹⁸.
   BEMÆRK: C. albicans samling 21 blev brugt her til at sammenligne CUT&RUN resultater med tidligere offentliggjorte ChIP-chip resultater, som var tilpasset Assembly 21. Brugere kan downloade andre samlingsversioner og køre lignende kommandoer for at generere relevante genomfiler til deres justeringsbehov.

15. Generer en Bowtie 2-indeksdatabase (databasenavn: ca21)

1. Brug følgende:
   bowtie2-build C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
   bowtie2-inspect -s ca21

16. Kør CUT&RUN-analysepipelinen

1. Læs hjælpeafsnittet for at blive fortrolig med parametrene for rørledningen.
   bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. Udfør cut_n_run_pipeline.sh fil med relevante parametre

1. Udfør scriptet:
   bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y y > /path/to/output.log 2>&1
   BEMÆRK: De relevante parametre med detaljerede beskrivelser på linje 19-36 i koden er beskrevet på GitHub-siden https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh.

18. Organiser outputfiler

1. Flet betydelige toppe fra alle replikater kaldet af MACS2 placeret i / path / to / input / folder / peakcalling / macs2 ved hjælp af BedTools-fletningsfunktionen¹⁹.
   cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files sorter -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o last,mean,first,mean,mean,mean > /path/to/merged_output.bed
   BEMÆRK: For yderligere oplysninger og bedste praksis for vurdering af overlappende toppe i replikatprøver henvises til Landt et ^al.20 og Boyd et ^al.21.

19. Fjern tændstikker til blokerede genomiske regioner ved hjælp af BedTools-trækfunktionen

1. Brug følgende: træk FratrukketBed -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
   BEMÆRK: De blokerede regioner i C. albicans-genomet leveres som en .bed-fil i supplerende fil 3. Listen består primært af meget gentagne sekvenselementer og regioner såsom telomeriske gentagelser og centromerer, der almindeligvis giver falsk-positive resultater i C. albicans CUT&RUN, ChIP-seq og ChIP-chip datasæt. Derfor anbefales det at fjerne de blokerede regioner. For visse proteinmål kan det imidlertid være uhensigtsmæssigt eller uønsket at udelukke disse loci. Brugere kan springe dette trin over for at bevare signaler indeholdt i disse blokerede regioner eller oprette deres egne blokerede regioner.

20. Flet BigWig-filer fra replikater ved hjælp af UCSC bigWigMerge-funktionen²²

1. Brug følgende: bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
2. Konverter BedGraph-output fra bigWigMerge til BigWig ved hjælp af UCSC bedGraphToBigWig-funktionen.
   bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

Representative Results

Denne robuste CUT&RUN-protokol blev tilpasset og optimeret til at undersøge den genomdækkende lokalisering af specifikke TF'er i C. albicans biofilm og planktoniske kulturer (se figur 2 for en oversigt over den eksperimentelle tilgang). En grundig dataanalysepipeline er også inkluderet for at lette analysen af de resulterende CUT&RUN-sekventeringsdata og kræver, at brugerne har minimal ekspertise inden for kodning eller bioinformatik (se figur 3 for en oversigt over analysepipelinen). I modsætning til ChIP-chip- og ChIP-seq-metoderne udføres CUT&RUN ved anvendelse af intakte, permeabiliserede kerner fremstillet af et signifikant reduceret antal inputceller uden formaldehydtværbinding. Isolering af intakte kerner fra C. albicans spheroplasts er et kritisk trin i protokollen. Effektiv spheroplasting via fordøjelsen af C. albicans cellevæggen ved hjælp af lyticase kan være udfordrende, da de enzymatiske fordøjelsesreaktionsbetingelser skal optimeres for hver celletype. For at sikre et vellykket CUT&RUN-eksperiment med sekventeringsresultater af høj kvalitet er der således inkluderet et tidligt kvalitetskontroltrin, og tilstedeværelsen af intakte kerner verificeres ved hjælp af et standard fluorescensmikroskop.

Cellevægsfordøjelse og nuklear integritet vurderes regelmæssigt ved at visualisere både kontrol intakte celler og isolerede kerner farvet med fluorescerende cellevæg og nukleinsyrepletter. I modsætning til de isolerede intakte kerner, hvor cellevægsfarvning ikke observeres, er både kerner og cellevæggene fluorescerende mærket i de intakte kontrolceller (figur 4A). Endelig evalueres fragmentstørrelsesfordelingen af CUT&RUN-biblioteker inden sekventering ved hjælp af et kapillærelektroforeseinstrument. Dette kvalitetskontroltrin er et pålideligt mål til vurdering af kvaliteten af CUT&RUN-biblioteker. Som det ses i elektroforesesporet på toppanelet i figur 4B, viser vellykkede biblioteker genereret til eksperimenter, der undersøger TF'er, høj berigelse for fragmenter mindre end 280 bp. Elektroforesesporet i bundpanelet i figur 4B repræsenterer resultater fra et mislykket CUT&RUN-eksperiment.

Her opstod toppen på ~ 2.000 bp hovedsageligt fra ufordøjet DNA frigivet fra kerner, der var omfattende beskadiget eller brudt under CUT & RUN-eksperimentet. Det anbefales også at vurdere fragmentstørrelsesfordelingen af de endelige puljebiblioteker for at bekræfte fuldstændig fjernelse af kontaminerende adapterdimerer (figur 4C). Typisk giver 5-10 millioner parrede endelæsninger (~ 40 basislæsningslængde) pr. Bibliotek tilstrækkelig sekventeringsdybde til de fleste TF CUT & RUN-eksperimenter i C. albicans. Alternative sekventeringslæselængder, enten parret-ende eller single-end, kan bruges til at sekvensere CUT&RUN-biblioteker. For eksempel bør parrede læselængder mellem 25 og 150 bp ikke påvirke kvaliteten af resultaterne. Single-end læsninger større end eller lig med 150 bp bør også fungere for TF CUT & RUN eksperimenter. Den ledsagende dataanalysepipeline skal dog ændres for at imødekomme single-end-læsninger.

Denne CUT&RUN-protokol og den ledsagende dataanalysepipeline blev valideret ved at undersøge to TF'er, Ndt80 og Efg1, som kontrollerer C. albicans biofilmdannelse. Som vist i figur 4D er Ndt80 bundet i intergene områder (fremhævet af de sorte bjælker, der indikerer signifikant berigede Ndt80 ChIP-chip loci) opstrøms for EFG1 ORF. Denne intergene region opstrøms for EFG1 viste sig tidligere at være stærkt beriget til Ndt80-binding under biofilmdannelse af ChIP-chip⁴. CUT&RUN-eksperimenter identificerede imidlertid signifikant flere toppe inden for denne region end ChIP-chip-eksperimenter (10 toppe vs 4 toppe). Ndt80 DNA-bindingsmotiver er beriget på tværs af alle de Ndt80-bundne loci, der er identificeret af CUT&RUN (supplerende figur 1), hvilket indikerer, at de yderligere toppe, der er identificeret ved denne metode, sandsynligvis er bona fide Ndt80-bundne steder. En systematisk komparativ analyse viste, at denne præsenterede CUT&RUN-protokol med succes identificerede størstedelen af de tidligere kendte bindingshændelser for Ndt80 og Efg1 under biofilmdannelse⁴ (figur 5).

Desuden blev mange nye TF-bindingshændelser, der ikke blev fanget i de tidligere offentliggjorte ChIP-chip-eksperimenter, identificeret ved hjælp af CUT&RUN (figur 5). Samlet set er både Ndt80 og Efg1 bundet til loci overlappende med tidligere offentliggjorte ChIP-chipdata og til loci identificeret kun ved hjælp af CUT&RUN-metoden (overlapninger mellem disse CUT&RUN-data og tidligere offentliggjorte ChIP-chipdata for Ndt80 og Efg1 er opsummeret i Venn-diagrammerne i figur 5). Desuden var brøkdelen af læsninger inden for signifikant kaldte toppe (FRiP-score) konsekvent højere i GFP-mærkede prøver end i deres kontrol-IgG-prøver (se supplerende figur 2). Sammenfattende viser disse resultater, at CUT&RUN-protokollen, der er beskrevet her, er en robust metode, der er optimeret til at undersøge C. albicans TF-DNA-bindende interaktioner fra prøver med lav overflod.

Figur 1: Epitopmærkning af C. albicans TF'er . (A) Identificer et TF-gen af interesse (NDT80 i dette tilfælde) og vælg et gRNA til at målrette skæringen af Cas9 (repræsenteret ved den orange form) i 3' enden af ORF. (B) Candida clade-optimeret eGFP med >50 bp homologi opstrøms og nedstrøms fra det afskårne sted vil give dDNA til reparation af DSB. (C) Brug koloni PCR til at screene individuelle kolonier for at bekræfte den påtænkte integration. Primere er angivet med røde pile, og amplikoner betegnes med stiplede kasser. Denne figur blev oprettet ved hjælp af BioRender.com. Forkortelser: TF = transkriptionsfaktor; gRNA = guide RNA; ORF = åben læseramme; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; DSB = dobbeltstrenget pause; USA = opstrøms; DS = nedstrøms. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Skematisk oversigt over CUT&RUN eksperimentel protokol. C. albicans celler indsamlet fra biofilm eller planktoniske dyrkningsbetingelser permeabiliseres for at isolere intakte kerner. ConA-perler aktiveres, og de intakte kerner bindes derefter til de aktiverede ConA-perler. Det interessante antistof tilsættes de perlebundne kerner og inkuberes ved 4 °C. Dernæst tilsættes pAG-MNase og får lov til at binde til målantistoffet. Efter tilsætning af CaCl₂ aktiveres pAG-MNase, og målrettet kromatinfordøjelse fortsætter indtil tilsætning af chelaterende reagens for at inaktivere pAG-MNase. Det pAG-MNase-bundne antistofkompleks får lov til at diffundere ud af de permeabiliserede kerner, og det resulterende DNA ekstraheres og rengøres. Sekventeringsbiblioteker fremstilles ud fra cut&run-berigede DNA-fragmenter, og de resulterende biblioteker køres derefter på en 10% PAGE-gel for at adskille og fjerne forurenende adapterdimerer inden sekventering. Denne figur blev oprettet ved hjælp af BioRender.com. Forkortelser: CUT&RUN = spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease; ConA = concanavalin A; PAGE = polyacrylamidgelelektroforese. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Skematisk oversigt over CUT&RUN-dataanalysepipelinen. Arbejdsprocessen starter med at udføre kvalitetskontrol af de rå FASTQ-filer ved hjælp af FastQC, efterfulgt af trimning for at fjerne sekventeringsadaptere. De trimmede læsninger justeres derefter til referencegenomet, og de justerede læsninger filtreres baseret på deres størrelse for at berige for bindingssignaler i TF-størrelse (20 bp ≤ justeret læsning ≤ 120 bp). Størrelsesvalgte læsninger kalibreres derefter mod spike-in Escherichia coli-læsninger , og kalibrerede læsninger bruges til at kalde toppe ved hjælp af MACS2. Symbolet <> er en visuel repræsentation for at indikere, at C. albicans læsetællinger blev kalibreret ved hjælp af E. coli-læsetællinger for hver prøve. Forkortelser: CUT&RUN = spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease; TF = transkriptionsfaktor. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Kvalitetskontroltrin, der er kritiske for vellykkede CUT & RUN-eksperimenter. (A) Celler farves med fluorescerende cellevæg (blå) og nukleinsyre (grøn) pletter før og efter kerneisolering og visualiseres ved hjælp af et fluorescensmikroskop. (B) CUT &RUN TF-biblioteker analyseres ved hjælp af et kapillærelektroforeseinstrument. Succesfulde CUT&RUN TF-biblioteker (angivet med det grønne flueben) er beriget til korte fragmenter, der er mindre end 200 bp. Suboptimale CUT&RUN TF-biblioteker (angivet med det røde "X") viser berigelse for store DNA-fragmenter. (C) 48 CUT &RUN-biblioteker samles sammen og analyseres ved hjælp af et kapillærelektroforeseinstrument. Poolede biblioteker af høj kvalitet (angivet med det grønne flueben) er fri for adapterdimerer (bane 1), mens poolede biblioteker af lav kvalitet (angivet med det røde "X") bevarer små mængder adapterdimere (bane 2). D) Repræsentative IGV-spor fra CUT&RUN-datasæt (herunder Ndt80 IgG-kontrollen, bundsporet), der viser en betydelig berigelse for Ndt80-binding (topspor) i det intergene område opstrøms for EFG1 ORF (Orf19.610). De sorte bjælker repræsenterer signifikant berigede Ndt80-bindingstoppe identificeret ved tidligere offentliggjorte ChIP-chip-eksperimenter⁴. De blå søjler repræsenterer signifikant berigede Ndt80-bindingstoppe, der er identificeret i CUT&RUN-eksperimenterne, der præsenteres her. Skalastænger = 50 μm (A). Forkortelser: CUT&RUN = spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease; TF = transkriptionsfaktor; GFP = grønt fluorescerende protein; ORF = åben læseramme. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Evaluering af Ndt80 og Efg1 berigede toppe identificeret ved hjælp af den præsenterede CUT&RUN protokol og dataanalyse pipeline på Candida albicans biofilm. Venn-diagrammerne i øverste række illustrerer graden af overlapning mellem Ndt80- og Efg1-bindingssteder identificeret via CUT&RUN med tidligere offentliggjorte ChIP-chipdata⁴. CUT&RUN-signalerne for alle bindingshændelser for Ndt80 og Efg1 vises i nederste række som farvede heatmaps (rød = højt spidssignal; blå = lavt/intet spidssignal; farvet bjælke angiver IgG-signal trukket fra GFP-signal); 1.000 bp-områder opstrøms (-1,0 kb) og nedstrøms (+1,0 kb) vises i heatmaps. Signalintensiteten (dvs. berigelse) som profilplot er vist over heatmaps. Tre biologiske replikater for Ndt80 og Efg1 blev evalueret for at visualisere CUT&RUN-berigelsen. Forkortelser: ChIP = kromatinimmunfældning; CUT&RUN = spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: PCR-reaktionsblanding og PCR-cykelforhold for at forstærke universelle A- og unikke B-fragmenter. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: PCR-reaktionsblanding og PCR-cyklusbetingelser for at sy A- og B-fragmenter for at skabe C-fragmentet i fuld længde. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: PCR-cykelforhold til PCR forstærker C-fragmentet i fuld længde. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: PCR-reaktionsblanding og PCR-cykelbetingelser for at forstærke donor-DNA GFP-mærket. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 5: Plasmidfordøjelsesreaktionsblanding og reaktionsbetingelser for plasmidfordøjelsesreaktionerne. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 6: PCR-reaktionsblanding og PCR-cykelforhold for koloni-PCR. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 7: PCR-cykelforhold for bibliotekets slutreparationstrin som forberedelse til sekventering. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 8: Adapterfortyndingsanbefalinger til input-DNA'et til forberedelse af sekventeringsbiblioteker. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 9: PCR-cykelforhold for at PCR forstærker det adapter-ligerede DNA. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende figur 1: Ndt80 DNA-bindende sekvensmotivberigelse. Kumulative Ndt80-motivberigelsesscorer for Ndt80-bundne loci identificeret i biofilm ChIP-chip-data (mørkeblå prikket linje) eller CUT&RUN-data (lyseblå prikket linje) sammenlignet med tilfældige intergene loci (rød prikket linje). Den venstre Y-akse angiver procentdelen af det samlede loci for hvert datasæt, der indeholder en tilsvarende kumulativ motivscore på X-aksen. Stiplede linjer angiver betydningen af motivscoreberigelsen (-log10 P-værdi, højre Y-akse) på hvert punkt på X-aksen i forhold til det tilfældige intergene kontrollodi. Kumulative motivscorer og P-værdier blev bestemt ved hjælp af MochiView²³ (se Tabel over materialer). Alle Ndt80-bundne loci blev samplet som 500 bp vinduer centreret under hver top af Ndt80 binding inden for ChIP-chip og CUT & RUN datasæt og sammenlignet med tilfældigt udvalgte 500 bp intergene loci for at kontrollere for forskelle i længden. Forkortelser: ChIP = kromatinimmunfældning; ChIP-chip = kromatinimmunfældning efterfulgt af mikroarray; CUT&RUN = spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Brøkdel af læsninger inden for en topscore pr. Prøve. Stregplot, der viser FRiP-scoren for hver replikat. FRiP-scorer beregnes som antallet af kortlagte læsninger inden for en top divideret med det samlede antal kortlagte læsninger i en CUT&RUN-prøve. De forskellige stregfarver repræsenterer individuelle biologiske replikatprøver, som angivet langs X-aksen. Som forventet er FRiP-score af positive GFP-prøver konsekvent højere end for negative IgG-prøver. Alle prøver viser acceptable FRiP-tærskler (>1 %) i henhold til anbefalingerne fra Landt et ^al.20. Forkortelser: FRiP = brøkdel af læsninger inden for en top; CUT&RUN = spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Opskrifter til alle anvendte buffere og opløsninger. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Bioinformatiske værktøjer, der kræves til dataanalysepipelinen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: Anbefalede blokerede regioner i C. albicans genomet. Denne liste over blokerede loci indeholder primært meget gentagne sekvenselementer og regioner såsom telomeriske gentagelser og centromerer, der historisk har givet falsk-positive resultater i tidligere genom-brede bindingsforsøg. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Denne protokol præsenterer en omfattende eksperimentel og beregningsmæssig pipeline til genom-wide lokalisering af regulatoriske TF'er i C. albicans. Det er designet til at være meget tilgængeligt for alle med standard mikrobiologi og molekylærbiologi uddannelse. Ved at udnytte det høje dynamiske område og de lave prøveinputkrav i CUT&RUN-analysen og inkludere optimeringer til lokalisering af TF-DNA-bindingsinteraktioner i C. albicans biofilm og planktoniske kulturer præsenterer denne protokol et kraftfuldt og billigt alternativ til traditionelle ChIP-seq-tilgange. Sammenlignet med ChIP-seq giver CUT&RUN betydeligt højere følsomhed, med en højere andel af sekventeringslæsninger kortlagt til bundne toppe, er mere modtagelig for høj gennemstrømning, kræver væsentligt lavere inputcellenumre, kræver ikke brug af giftige tværbindingsmidler og kræver ti gange færre sekventeringslæsninger pr. prøve for at producere resultater af høj kvalitet 13,14,17^{, 23,24}. For yderligere at reducere omkostningerne pr. prøve ved denne protokol medtages buffer- og medieopskrifter sammen med en detaljeret reagensliste for at lette den interne forberedelse af alle nødvendige buffere og medier samt bulktilvejebringelse af essentielle reagenser. Da C. albicans biofilmdannelse, fænotypisk kobling og kommensalisme alle reguleres af komplekse sammenvævede transkriptionsnetværk²⁶, giver denne robuste, lette og omkostningseffektive CUT & RUN-protokol et kraftfuldt nyt værktøj til at forstå disse og mange andre cellulære processer i dette vigtige humane svampepatogen.

TF'er er ikke så rigelige som histoner eller andre kromatin-associerede proteiner, hvilket skaber en unik udfordring for at undersøge TF-DNA-bindende interaktioner via CUT&RUN. For at løse denne udfordring blev der foretaget kritiske justeringer og optimeringer af standard CUT&RUN eksperimentel protokol¹³. Da de fleste vellykkede CUT&RUN-eksperimenter rettet mod TF'er giver en lille mængde DNA, der er for fortyndet til at kvantificere og ofte beriges for fragmenter mindre end 150 bp^13,23, blev bibliotekets forberedelsesreaktionsbetingelser også optimeret til at favorisere disse mindre fragmenter²⁷. Selv med dette optimeringstrin indeholder de resulterende PCR-amplificerede biblioteker en betydelig andel af adapterdimerer, som ikke fjernes fuldstændigt ved hjælp af magnetiske perlebaserede DNA-størrelsesudvælgelsesmetoder. For at løse dette problem blev der inkluderet et PAGE gelstørrelsesvalgstrin for at generere endelige sekventeringsklare biblioteker, der stort set er blottet for adapterdimerer. Dette er et kritisk trin i protokollen, da fjernelse af adapterdimerer, samtidig med at de mindre TF-afledte CUT&RUN-fragmenter bevares, er afgørende for at opnå resultater af høj kvalitet.

Desuden filtrerer den detaljerede beregningsrørledning sekventeringsdataene for at fokusere på de mindre læsninger, der stammer fra TF-DNA-bindingsinteraktioner i CUT&RUN-analysen. På grund af disse TF-specifikke justeringer anbefales denne protokol ikke til profilering af store kromatin-associerede komplekser såsom nukleosomer. Selvom det teoretisk er muligt at tilpasse protokollen til dette formål ved at følge standardprotokollen til forberedelse af biblioteket, der følger med det kommercielt tilgængelige biblioteksforberedelsessæt, skal brugeren justere det valg af postsekventeringsstørrelse, der er inkluderet i beregningspipelinen. Specifikt skal brugerne i størrelsesfiltreringsafsnittet i kodefilen cut_n_run_pipeline.sh erstatte den aktuelle værdi af "14400" (120 bp * 120 bp) med kvadratet af den ønskede fragmentlængde for at gøre det muligt for analyserørledningen at analysere de sekventeringsresultater, der genereres for andre typer kromatin-DNA-bindingsinteraktioner.

Et andet vigtigt skridt i et vellykket CUT&RUN-eksperiment inkluderer valg af optimale dataanalyseparametre efter sekventering. Mens det meste af beregningsrørledningen er designet til at være standardiseret og anvendelig til undersøgelse af enhver lovgivningsmæssig TF af interesse for C. albicans, er der to vigtige overvejelser, som brugeren skal evaluere, mens han kører rørledningen. Den første overvejelse er, om du skal medtage eller fjerne duplikatlæsninger fra sekventeringsdataene inden identifikationen af bundne målsteder. Da TF'er med lav overflod typisk vil give sekventeringsdata, der indeholder en betydelig procentdel af læsninger, der er afledt af PCR-duplikering under biblioteksforstærkningstrinnet, kan fjernelse af PCR-duplikater have en betydelig negativ indvirkning på resultaterne. Men med meget rigelige TF'er eller kromatin-associerede proteiner repræsenterer PCR-duplikater typisk en mindre del af det samlede antal læsninger og fjernes ofte for at undertrykke baggrundsstøj i dataene. I sidste ende afhænger denne beslutning om at beholde eller fjerne PCR-dubletter af den interessetilfattede tf og dybden af de opnåede sekventeringsdata. Således genererer pipelinen automatisk uafhængige outputfiler til data, der er afledt med eller uden PCR-duplikatlæsninger, så brugeren kan beslutte, hvilke outputfiler der giver de bedste resultater for hvert eksperiment.

Den anden overvejelse er, om man skal identificere og fjerne problematiske loci, der giver signifikant, men alligevel meget variabel berigelse i både eksperimentelle (antistof mod proteinet af interesse) og negativ kontrol (IgG) prøver. Peak-calling-algoritmen bruger MACS2 til at identificere signifikant berigede loci i både eksperimentelle og kontrolprøver og udelukker dem, der vises i begge. Selv om denne tilgang typisk eliminerer de mest problematiske loci, forekommer nogle lejlighedsvis som signifikante toppe i visse eksperimenter, selvom tidligere erfaringer viser, at de sandsynligvis ikke er sande positive steder for TF-berigelse. Således tilvejebringes et valgfrit filtreringstrin for at fjerne disse problematiske loci, kaldet "blokerede" loci. Listen over blokerede loci indeholder primært meget gentagne sekvenselementer og regioner såsom telomeriske gentagelser og centromerer, der historisk har givet falsk-positive resultater i tidligere genom-brede bindingsassays. Dette er en meget konservativ liste over loci tildelt som problematisk med stor tillid. Hver bruger bør dog vurdere, om dette filter er egnet til deres eksperiment(er) fra sag til sag. Et potentielt alternativ til IgG negativ kontrol ville være at udføre CUT& RUN mod et nukleart lokaliseret protein, der ikke binder DNA. Denne tilgang har vist sig at være en ideel kontrol for ChIP-eksperimenter²⁸, og en lignende tilgang er værd at overveje for CUT&RUN.

CUT&RUN er blevet et populært valg til at undersøge protein-DNA-interaktioner i højere eukaryoter og modelgæren Saccharomyces cerevisiae. Her er det lykkedes at tilpasse det til at undersøge genom-dækkende TF-DNA-bindende interaktioner i det klinisk relevante svampepatogen C. albicans. Denne protokol giver detaljerede metoder til alle nødvendige eksperimentelle og beregningsmæssige procedurer, fra konstruktion af stammer, der udtrykker epitopmærkede TF'er, til beregningsanalysen af de resulterende CUT& RUN-sekventeringsdata. Samlet set producerer denne protokol og den ledsagende dataanalysepipeline robuste TF-DNA-bindingsprofiler, selv ved anvendelse af komplekse multimorfe populationer af celler isoleret fra biofilmprøver med lav overflod og giver overlegen datakvalitet til en lavere samlet pris end ChIP-seq-metoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore Sigma	SLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubes	VWR	490003-190
1 M CaCl2	Fisher Scientific	50-152-341
1 M PIPES	Fisher Scientific	AAJ61224AK
12-well untreated cell culture plates	Corning	351143
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	60-24-2
2% Digitonin	Fisher Scientific	CHR103MI
50 mL conical tubes	VWR	89039-658
5x phusion HF buffer	Fisher Scientific	F530S	Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
Agar	Criterion	C5001
Agencourt AMPure XP magnetic beads	Beckman Coulter	A63880
Agilent Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific	VWR	89133-910
Bacto peptone	BD Biosciences	211677
Benchling primer design tool	Benchling		https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
Betaine	Fisher Scientific	AAJ77507AB
Calcofluor white stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
Candida Genome Database			http://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads	Polysciences	86057-3
Conda software			https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit	Epicypher	14-1048	Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)	New England Biolabs	N0447S
Dextrose (D-glucose)	Fisher Scientific	D163
Difco D-mannitol	BD Biosciences	217020
Disposable cuvettes	Fisher Scientific	14-955-127
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x)	Fisher Scientific	R0611
DreamTaq green DNA polymerase	Fisher Scientific	EP0713	Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase buffer	Fisher Scientific	EP0713	Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNA	Epicypher	18-1401
ELMI Microplate incubator	ELMI	TRMS-04	Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction Buffer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proof	VWR	89125-170
FastDigest MssI	Fisher Scientific	FD1344	Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI Buffer	Fisher Scientific	FD1344	Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400	Fisher BioReagents	BP525-25
Fluorescence microscope			User-dependent
Gel electrophoresis apparatus			User-dependent
GeneRuler low range DNA ladder	Fisher Scientific	FERSM1192
GitBash workflow			https://gitforwindows.org/
GitHub source code			https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5	Boston BioProducts	BBH-75-K
High-speed centrifuge			User-dependent
Isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1830-4
Lens paper	VWR	52846-001
Ligation Enhancer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrate	MP Biomedicals	215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody	Takara	632592	User-dependent
MACS2			https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes	Epicypher	10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes	Fisher Scientific	MR02
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometer	BioTek	EPOCH2TC	Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiView			http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
NaCl	VWR	470302-522
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
NCBI GEO			https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)	New England Biolabs	E7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit	New England Biolabs	E7645S	Referred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT)	Goldbio	N-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 well	Fisher Scientific	EC62755BOX
Nutating mixer	VWR	82007-202
Nutrient broth	Criterion	C6471
pADH110	Addgene	90982	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119	Addgene	90985	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137	Addgene	90986	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139	Addgene	90987	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140	Addgene	90988	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNase	Epicypher	15-1016 or 15-1116	50 rxn or 250 rxn
pCE1	Addgene	174434	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lid	Fisher Scientific	FB0875712
Phusion high fidelity DNA polymerase	Fisher Scientific	F530S	Referred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350	VWR	10791-816
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q33230
Qubit fluorometer	Life Technologies	Q33216	Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibody	Epicypher	13-0042
RNase A	Sigma-Aldrich	10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets	Sigma-Aldrich	5056489001
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R6504
Shaking incubator	Eppendorf	M12820004	User-dependent
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G
Spin-X centrifuge tube filters	Fisher Scientific	07-200-385
Sterile inoculating loops	VWR	30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Fisher Scientific	S11494
SYTO 13 nucleic acid stain	Fisher Scientific	S7575	Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
Thermocycler			User-dependent
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethane	Sigma-Aldrich	252859-100G
Ultra II Ligation Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solution	Invitrogen	15632011
USER Enzyme			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixer	VWR	10153-834
wget tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
Yeast extract	Criterion	C7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)	Fisher Scientific	NC0439194