Summary
이 프로토콜은 인간 곰팡이 병원균 칸 디다 알비칸스에서 뉴클레아제(CUT&RUN)를 사용하여 표적 하에서의 절단 및 방출을 위한 실험 방법 및 데이터 분석 워크플로우를 기술한다.
Abstract
조절 전사 인자는 세포 분화, 환경 혼란 및 스트레스에 대한 반응, 숙주 - 병원체 상호 작용을 포함한 많은 중요한 생물학적 과정을 제어합니다. DNA에 대한 조절 전사 인자의 게놈 전체 결합을 결정하는 것은 이러한 종종 복잡한 생물학적 과정에서 전사 인자의 기능을 이해하는 데 필수적이다. 뉴클레아제 (CUT&RUN)를 이용한 표적 및 방출 하에서의 절단은 시퀀싱 (ChIP-seq) 방법에 이어 전통적이고 널리 사용되는 크로마틴 면역침전에 대한 매력적인 대안인 생체내 단백질-DNA 결합 상호작용의 게놈 전체 매핑을 위한 현대적인 방법이다. CUT&RUN은 더 높은 처리량의 실험 설정을 적용할 수 있으며 ChIP-seq보다 샘플당 시퀀싱 비용이 낮고 동적 범위가 상당히 높습니다. 여기에서는 인간 진균 병원균 칸 디다 알비칸 스에서 전사 인자-DNA 결합 상호작용의 게놈 전체 분석을 위해 맞춤화된 포괄적인 CUT&RUN 프로토콜 및 수반되는 데이터 분석 워크플로우가 설명된다. 이 상세한 프로토콜은 전사 인자-코딩 유전자의 에피토프 태깅으로부터 시퀀싱을 위한 라이브러리 준비에 이르기까지 필요한 모든 실험 절차를 포함한다; 또한 CUT&RUN 데이터 분석을 위한 맞춤형 계산 워크플로우가 포함되어 있습니다.
Introduction
칸디다 알비칸스는 임상적으로 관련성이 있는, 다형성 인간 진균 병원체로서, 플랑크톤(free-floating) 성장 모드 및 세포외 매트릭스에 의해 보호되는 단단히 부착된 세포의 군집으로서 1,2,3의 생물막 성장 모드로 알려져 있다. 다른 발달 및 세포 과정과 유사하게, 생물막 개발은 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 조절 전사 인자 (TFs)에 의해 전사 수준에서 조절되는 것으로 알려진 중요한 C. 알비칸 독성 특성이다4. 최근에, 크로마틴 조절제 및 히스톤 개질제는 또한 DNA 접근성을 매개함으로써 C. 알비칸 생물막 형성5 및 형태형성6의 중요한 조절제로서 등장하였다. 이 중요한 곰팡이 병원체의 복잡한 생물학을 이해하기 위해, 뚜렷한 발달 및 세포 과정 동안 특정 TF의 게놈 전체 국소화를 결정하는 효과적인 방법이 중요합니다.
크로마틴 면역침전에 이어 시퀀싱(ChIP-seq)은 C. 알비칸5,6에서 단백질-DNA 상호작용을 조사하기 위해 널리 사용되는 방법이며, 마이크로어레이(ChIP-chip)9 방법에 이어 보다 고전적인 크로마틴 면역침전을 대체하고 있다. 그러나 ChIP-seq 및 ChIP-chip 방법 둘 다 많은 수의 입력 세포(10)를 필요로 하며, 이는 환자 또는 감염의 동물 모델로부터 수집된 생물막과 같은 특정 샘플 및 성장 모드의 맥락에서 TF를 조사할 때 복잡한 인자가 될 수 있다. 또한, 크로마틴 면역침전 (ChIP) 분석은 종종 게놈 전체에 걸쳐 상당한 양의 배경 신호를 산출하며, 관심있는 표적에 대해 높은 수준의 농축이 필요하여 신호를 노이즈로부터 충분히 분리한다. ChIP-chip 분석은 오늘날 대부분 구식이지만, ChIP-seq 에 필요한 시퀀싱 깊이는 많은 연구자, 특히 여러 TF 및 / 또는 크로마틴 관련 단백질을 연구하는 연구자에게이 분석을 엄청나게 비싸게 만듭니다.
표적 하에서의 절단 및 뉴클레아제 (CUT&RUN)를 이용한 방출은 ChIP-seq에 대한 매력적인 대안이다. 2017년 Henikoff 연구실에서 ChIP-seq 및 크로마틴 내인성 절단의 한계를 우회한 후 ChEC-seq 11,12를 시퀀싱하여 게놈 전체 수준에서 단백질-DNA 상호작용을 확인하는 또 다른 방법인 TF 및 크로마틴 관련 단백질의 고분해능, 게놈 전체 매핑을 제공하기 위해 개발되었다(13) . CUT&RUN은 테더링된 미세구균 핵을 사용하여 투과된 핵 내에서 크로마틴의 표적 소화에 의존하고, 이어서 소화된 DNA 단편 9,10의 시퀀싱에 의존한다. DNA 단편은 ChIP 분석에서와 같이 무작위 단편화를 통해 게놈 전체에 걸쳐 생성되기보다는 관심있는 단백질에 의해 결합되는 유전자좌에서 특이적으로 생성되기 때문에 CUT&RUN 접근법은 배경 신호를 크게 감소시키고, 따라서 ChIP-서열 11,13에 비해 시퀀싱 깊이의1/10 번째를 필요로 하며, 14. 이러한 개선은 궁극적으로 시퀀싱 비용을 크게 줄이고 각 샘플의 출발 물질로 필요한 총 입력 셀 수를 줄입니다.
여기에서, 생물막 및 플랑크톤 배양물로부터 분리된 C. 알비칸 세포에서 TFs의 게놈 전체 국소화를 결정하기 위해 적응되고 최적화된 강력한 CUT&RUN 프로토콜이 기술된다. 철저한 데이터 분석 파이프 라인도 제공되어 결과 시퀀스 데이터를 처리 및 분석 할 수 있으며 사용자는 코딩 또는 생물 정보학에 대한 최소한의 전문 지식을 필요로합니다. 간략하게, 이 프로토콜은 TF 코딩 유전자의 에피토프 태깅, 생물막 및 플랑크톤 세포의 수확, 무손상 투과화된 핵의 단리, 관심있는 특정 단백질 또는 에피토프 태깅된 단백질에 대한 일차 항체와의 인큐베이션, 키메라 A/G-마이크로코카셀 뉴클레아제(pAG-MNase) 융합 단백질을 일차 항체에 테더링, 염색질 소화 후 게놈 DNA 회수, 시퀀싱을 위한 게놈 DNA 라이브러리의 제조를 기술한다.
실험적 CUT&RUN 프로토콜은 FASTQ 형식으로 원시 DNA 시퀀싱 판독을 취하고 필요한 모든 처리 단계를 구현하여 관심 TF에 의해 결합된 상당히 풍부한 유전자좌의 전체 목록을 제공하는 특수 목적의 데이터 분석 파이프라인이 뒤따릅니다(기본 항체에 의해 표적화됨). 설명된 라이브러리 준비 프로토콜의 여러 단계는 TF의 CUT&RUN 분석을 위해 특별히 조정되고 최적화되었습니다(뉴클레오솜과는 반대). 이 원고에 제시된 데이터는 상용 CUT&RUN 키트의 TF 특이적 적응을 사용하여 생성되었지만, 이러한 프로토콜은 개별적으로 공급되는 성분(즉, pAG-MNase 효소 및 자기 DNA 정제 비드)과 사내에서 제조된 완충액을 사용하여 검증되었으며, 이는 실험 비용을 상당히 절감할 수 있다. 포괄적인 실험 및 데이터 분석 프로토콜은 아래에 단계별 형식으로 자세히 설명되어 있습니다. 버퍼 및 미디어 레시피뿐만 아니라 모든 시약 및 중요 장비는 각각 재료 표 및 보충 파일 1에 나열되어 있습니다.
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Protocol
1. C. 알비칸 균주의 에피토프 태깅
- 1kb 상류 및 하류 플랭킹 서열과 함께 관심있는 유전자를 칸디다 게놈 데이터베이스에서 프라이머 설계 도구로 업로드하십시오 ( 자료 표 참조). 정지 코돈으로부터 50 bp 상류 및 하류를 강조하여 가이드 RNA (gRNA)를 설계하고, 오른쪽의 gRNA 선택 도구를 클릭하십시오. 안내선 설계 및 분석을 선택합니다. 가이드 파라미터에 대해 Ca22(칸디다 알비칸스 SC5314 어셈블리 22(디플로이드)) 게놈 및 NGG(SpCas9, 3'측) 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 사용하고 마침을 클릭하십시오. 도 1은 관심있는 C. 알비칸 유전자를 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)로 태깅하기 위한 에피토프 워크플로우를 기술한다.
- 다음 페이지에서 gRNA 설계의 대상 영역을 확인하고 녹색 버튼을 누릅니다. gRNA를 온-타겟 점수로 정렬합니다.
참고: 프라이머 설계 도구는 gRNA의 특이성을 정량화하기 위해 온타겟 및 오프타겟 점수를 계산합니다. 이상적인 가이드는 >60의 온 타겟 점수, ~ 33의 오프 타겟 점수를 가지며 정지 코돈과 겹칩니다. 이는 GFP 통합 후 gRNA 표적화를 절제하는 동안 높은 gRNA 특이성을 가능하게 한다. ∼50의 오프 타겟 스코어를 갖는 gRNA는 대립유전자 변이를 나타내고; 따라서, 오직 하나의 대립유전자만이 gRNA에 의해 인식될 것이다. - 20 bp gRNA 표적 서열의 서열 (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') 및 (5'-GTTTTAGAGCTAGAATAGC-3')을 각각 5' 및 3' 말단에 추가하여, 60 bp 프라이머/올리고뉴클레오티드를 생성한다. 대안적으로, 20 bp 서열을 Nguyen et al.15에 의해 제공된 gRNA 계산기에 복사한다. 60 bp 맞춤형 gRNA 올리고뉴클레오티드를 주문한다.
- 단계 1.1.2로부터의 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCC-3') 및 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') 및 "고유 B 단편"을 1.1.2로부터의 맞춤형 60 bp gRNA 올리고뉴클레오티드 (100 mM)로 "유니버셜 A 단편"으로 증폭시킨다. 및 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGTTTAAACACCG-3')을 주형 DNA로서 pADH110 (플라스미드 저장소 ID# 90982) 및 pADH139 (플라스미드 저장소 ID# 90987)를 각각 사용한다. 표 1에 제공된 PCR 반응 및 사이클링 조건을 사용한다.
참고: pADH139는 이종성 칸디다 말토사 LEU2 마커를 운반하는 균주에 특이적이다. C. 알비칸 LEU2 유전자의 단일 카피를 갖는 균주를 사용하는 경우, pADH139 대신에 pADH119 (플라스미드 저장소 ID#90985)를 대체한다. - 1% 아가로스 겔 상에서 5 μL의 PCR을 확인함으로써 성공적인 증폭을 확인하였다. ~ 1kb A 및 B 단편 앰플리콘을 찾으십시오.
- 각각의 A 및 B 단편 1 μL를 혼합하고 표 2 에 제공된 PCR 반응 및 사이클링 조건을 사용하여 이들을 함께 스티치하여 전장 C 단편을 생성한다.
- 0.5 μL의 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') 및 0.5 μL의 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3')을 각각의 PCR 반응에 첨가하고, 피펫팅에 의해 잘 혼합하고, 표 3에 열거된 사이클링 조건을 완료하였다.
참고: pADH139 대신 pADH119를 사용하는 경우 AHO1453 대신 AHO1238(5'-TGTATTTTTTTTTTAAAATTTTAGTGTGACTGTTTC-3')을 대체하십시오. - 1% 아가로스 겔 상에서 PCR의 5 μL를 확인하여 C 단편의 적절한 스티칭 및 증폭을 확인하였다. ~2kb 앰플리콘을 찾으십시오. C 단편을 사용 준비가 될 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
참고: 스티칭 및 증폭으로 인해 여러 개의 비특이적 밴드가 발생하거나 번지는 경우 A 및 B 단편의 PCR 정리를 수행하고 1.1.5 단계부터 반복하십시오.
- 다음 페이지에서 gRNA 설계의 대상 영역을 확인하고 녹색 버튼을 누릅니다. gRNA를 온-타겟 점수로 정렬합니다.
- 프라이머 설계 도구를 사용하여 관심 유전자의 정지 코돈의 바로 상류에 링커 서열 (RIPLING)16 (pCE1, 플라스미드 저장소 ID# 174434)을 갖는 전체 CTG 최적화된 단량체성 eGFP를 추가하여, C 말단 번역 융합체를 생성한다. 이 구축물을 사용하여 pCE1로부터 공여체 DNA(dDNA)를 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 설계한다.
- 링커 서열에 대해 18-22 bp 상동성을 갖는 정방향 올리고뉴클레오티드를 설계하고, 오픈 리딩 프레임(ORF)의 3' 말단에 >50 bp 상동성을 설계한다.
참고: 18-22bp 상동성은 55°C와 58°C 사이의 증폭을 위한 어닐링 온도를 생성한다. 전장 올리고뉴클레오티드가 프라이머 이량체를 형성하는 경우, 그에 따라 링커 서열/GFP 또는 게놈에 대한 상동성을 조정한다. - 태그될 ORF의 하류 비코딩 서열에 대해 GFP의 3' 말단과 >50 bp 상동성을 갖는 역방향 올리고뉴클레오티드를 생성한다.
- 이들 올리고뉴클레오티드를 주문하고, 표 4에 제공된 터치다운 PCR 사이클링 조건을 사용하여 dDNA를 증폭시킨다.
- 링커 서열에 대해 18-22 bp 상동성을 갖는 정방향 올리고뉴클레오티드를 설계하고, 오픈 리딩 프레임(ORF)의 3' 말단에 >50 bp 상동성을 설계한다.
- 플랭킹 통합 부위를 가로질러 증폭함으로써 GFP의 통합을 확인하기 위한 콜로니 PCR(cPCR) 올리고뉴클레오티드의 두 세트를 설계한다. 먼저 프라이머 설계 도구를 사용하여 정방향 dDNA 올리고뉴클레오티드를 선택하고 오른쪽의 프라이머 버튼을 클릭하십시오.
- 프라이머 만들기 |를 클릭합니다. 마법사 | Tm Param과 알고리즘이 SantaLucia 1998로 설정되어 있는지 확인합니다. 선택 사용을 클릭하여 1.2.1에서 설계된 정방향 올리고뉴클레오티드의 좌표를 표적 서열로 입력합니다.
- 최적 프라이머 온도를 55°C로, 최대 앰플리콘 크기를 900bp로 설정하고 오른쪽 상단 의 프라이머 생성 버튼을 클릭합니다.
- 가장 낮은 페널티 스코어를 갖는 올리고뉴클레오티드 쌍을 선택하고 프라이머가 5' 통합 부위에 걸쳐 증폭되는지 확인한다. 정방향 cPCR 프라이머가 정방향 dDNA 프라이머 서열과 역방향 cPCR 프라이머가 eGFP 태그 또는 링커 서열 내에 완전히 상류에 있는지 확인하십시오.
- 1.3-1.3.3단계를 반복합니다. 역방향 dDNA와 함께 올리고뉴클레오티드와 함께 3' 통합 부위를 가로질러 증폭되는 cPCR 올리고뉴클레오티드의 두 번째 세트를 생성한다. 정방향 cPCR 프라이머가 역방향 dDNA 프라이머 서열의 eGFP 태그 또는 링커 서열과 역방향 cPCR 프라이머 하류에 전적으로 놓여 있는지 확인하십시오.
- 이러한 올리고뉴클레오티드를 주문하십시오.
- 2,500 ng의 pADH140을 소화하고, 여기에는 Cas9 (플라스미드 저장소 ID# 90988)가 포함되어 있으며, GFP 태그가 지정되는 각 유전자에 대한 제한 효소가 포함되어 있습니다. 각 소화의 총 부피를 15 μL로 설정하고; pADH140 플라스미드 농도에 기초하여 물의 부피를 그에 따라 조정한다. 표 5에 명시된 소화 조건을 사용하십시오. 소화된 플라스미드를 사용 준비가 될 때까지 -20°C에 보관한다.
참고: 균주를 C. 알비칸 LEU2 유전자의 단일 카피로 형질전환시키는 경우, 이종성 C. 말토사 LEU2 마커 대신에, pADH140 대신에 pADH137(플라스미드 저장소 ID# 90986)을 대체한다. - GFP 태그가 붙을 각 유전자에 대해 10mg/mL 연어 정자 DNA 12μL를 99°C에서 10분 동안 변성시키고 ≤4°C로 급속히 냉각시킨다. 사용 준비가 될 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
- C. 알비칸 LEU2 반접합성 누어스에리신 민감성 균주를 효모 펩톤 덱스트로스(YPD) 플레이트 상에 스트레킹하고 이틀 동안 30°C에서 인큐베이션한다.
- 단일 콜로니를 선택하고 4 mL의 액체 YPD로 옮깁니다. 250 rpm에서 진탕하면서 30°C에서 12-16시간 동안 인큐베이션한다.
- 일회용 큐벳 (1 mL, 1 cm 경로 길이)을 사용하여 분광 광도계에서 밤새 (12-16 h) 배양된 배양의600 nm (OD600)에서의 광학 밀도를 측정하였다.
- 하룻밤 동안 배양물을 삼각 플라스크에 희석하여 YPD 중의0.1의 OD600 으로 희석한다. 반응 당 5 mL를 차지하고, 추후OD600 을 검사하기 위한 추가의 5 mL를 포함한다.
참고 : 배양의 양은 변형 반응의 수에 따라 다릅니다. - 희석된 하룻밤 배양물을 0.5-0.8의 OD600에 도달할 때까지 250 rpm으로 진탕하면서30 °C의 진탕 배양기에서 인큐베이션한다.
- 실온에서 5분 동안 4,000 × g 의 원심분리; 상층액을 제거하고 버립니다.
- 세포 펠릿을 필터 팁과 혼합된 부드러운 피펫을 통해 멸균수 1 mL에 재현탁시키고 멸균된 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브로 옮긴다.
- 세포를 실온에서 4,000 × g 에서 1분 동안 원심분리하여 펠릿화하는 단계; 상층액을 제거하고 버립니다. 멸균수 1mL에 재현탁하고 총 두 번의 세척을 반복하십시오.
- 펠렛을 단계 1.10에서 사용된 부피의 1/100번째 단계에서 재현탁시킨다. 예를 들어, 15 mL가 사용된 경우, 펠렛을 150 μL의 멸균수에 재현탁시킨다.
- 각 형질전환 반응을 위한 별도의 튜브에서, 50 μL의 C 단편, 50 μL의 dDNA, 2,500 ng의 제한 효소 소화된 pADH140 및 10 μL의 변성 연어 정자 DNA를 혼합한다.
- 단계 1.14로부터 세포 슬러리 50 μL를 첨가하고, 피펫팅에 의해 혼합한다.
- n + 1 변환에 대한 플레이트 믹스 (보충 파일 1)의 재고를 만드십시오.
- 플레이트 믹스 1 mL를 세포 / DNA 혼합물에 넣고 5 번 뒤집어서 혼합하십시오.
참고: 튜브의 바닥을 탭하면서 뒤집어서 남아 있는 액체를 빼냅니다. - 혼합물을 진탕 없이 밤새도록(12-16 h) 30°C의 인큐베이터에 놓는다.
- 세포를 수조에서 44°C에서 15분 동안 열충격시켰다.
- 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브를 실온에서 5,000 × g 에서 2분 동안 원심분리한다.
- 멸균 피펫 팁을 사용하여 진공 흡인에 의해 PLATE 믹스를 제거하고, 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의한다.
- 세포 펠릿을 1 mL의 YPD에 재현탁시키고, 실온에서 4,000 × g 에서 1분 동안 원심분리하여 펠렛을 제거하고, 상청액을 제거한다. 두 번째 세척을 반복하고, 세포 펠릿을 1 mL의 YPD에 재현탁하고, 현탁액을 추가로 1 mL의 YPD(최종 부피 2 mL)를 함유하는 10 mL 둥근바닥, 일회용 배양 튜브로 옮긴다. 세포를 30°C에서 5시간 동안 250 rpm으로 진탕하면서 회수하였다.
- 튜브를 실온에서 4,000 × g 에서 5분 동안 원심분리하는 단계; 상층액을 제거하고 버립니다.
- 세포 펠렛을 100μL의 멸균수 및 플레이트에 재현탁시키고 200 μg/mL 누세오트리신(NAT200)으로 보충된 YPD 상에 재현탁시킨다. 30°C에서 2-3일 동안 인큐베이션한다.
- 100 μL의 20 mM NaOH를 96-웰 PCR 플레이트의 웰에 분취하고, 각 웰은 NAT200 플레이트 상에서 성장한 개별 콜로니에 대응한다. 멸균 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 개별 형질전환 콜로니를 골라 새로운 NAT200 플레이트에 패치하고 나머지 세포를 20mM NaOH로 웰로 소용돌이친다. cPCR 반응을 위한 DNA 주형으로 사용되는 세포 용해물을 만들기 위해 나머지 콜로니에 대해 반복한다.
- PCR 플레이트를 밀봉하고, 가열된 뚜껑이 있는 열순환기에서 99°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- 단계 1.3-1.3.5에서 설계된 올리고뉴클레오티드로 두 개의 cPCR 반응을 설정한다. 필요에 따라 반응 수를 늘립니다. 표 6으로부터 단계 1.26에서 제조된 세포 파쇄물을 사이클링 조건 및 PCR 반응 혼합물로 PCR 반응을 수행한다. 각 웰로부터 10-20 μL를 1% 아가로스 겔 상에서 실행한다. 적절하게 통합된 GFP dDNA를 나타내는 두 개의 cPCR 프라이머 세트의 증폭과 함께 콜로니를 찾는다.
- 류신이 결여된 합성 완전한(SC) 배지 상에 GFP를 혼입시킨 콜로니를 재연한다. 30°C 인큐베이터에서 2-3일 동안 인큐베이션한다. 개별 콜로니를 선택하고 400 μg/mL 누세오트리신(NAT400) 플레이트로 보충된 YPD 및 YPD에 패치하십시오. 24시간 후에 NAT400 플레이트에서 성장하지 못하는 콜로니를 CRISPR 성분을 성공적으로 잃어버린 콜로니로 식별하십시오.
- GFP 태그가 YPD 패치 플레이트로부터의 셀을 사용하여 단계 1.25-1.28을 반복함으로써 유지되는지 확인한다. 정확한 밴드가 존재하는 경우, 4 mL의 YPD에 접종하고 단계 1.7에 기재된 바와 같이 밤새 (12-16 h) 성장시킨다.
- 밤새 배양된 새로운 GFP 태깅된 균주를 필터-멸균된 50% 글리세롤과 멸균된 동결튜브 내에서 1:1 비율로 혼합한다. -80°C에서 보관하고 필요에 따라 YPD 플레이트 상에 재연한다.
참고: 형광 현미경을 통해 태그가 지정된 TF의 핵 국소화를 확인하고 적절한 표현형 분석에서 야생형 표현형을 확인함으로써 GFP 태그 균주를 검증하는 것이 좋습니다.
2. 생물막 배양물의 시료 준비
- 줄무늬 C. 알비칸스 GFP-태깅된 균주(들)를 YPD 한천 플레이트 상에 놓고 2-3일 동안 30°C에서 인큐베이션한다. 한천 플레이트로부터 단리된 단일 콜로니를 사용하여, 4 mL의 YPD 액체 배지에 접종한다. 30°C에서 밤새 진탕하면서 인큐베이션한다(12-16 h). 밤새 배양물(들)의OD600 을 결정한다.
참고: CUT&RUN 실험을 위해 샘플당 세 번의 생물학적 반복실험을 사용하는 것이 좋습니다. - 멸균된 12-웰 처리되지 않은 세포 배양 플레이트를 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI)-1640 배지에서 0.5(2 × 107 세포/mL에 해당)의 최종OD600에 접종하여 최종 부피 2 mL로 접종한다. 250 rpm에서 진탕하면서 마이크로플레이트 인큐베이터에서 37°C에서 90분 동안 인큐베이션한다.
참고: 균주 당 하나의 12-웰 세포 배양 플레이트를 배지 단독 오염 대조군으로 접종하지 않은 하나의 웰과 함께 사용하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 하나의 12-웰 세포 배양 플레이트 웰 (또는 최소 5 백만 세포)의 1/10번째 를 사용하여 성공적으로 적용되었습니다. 더 많은 수의 세포를 사용하면 총 DNA 수율이 증가하며, 이는 일반적으로 고품질 시퀀싱 라이브러리를 생성합니다. - 진공 트랩 장치에 유연한 플라스틱 튜브를 통해 부착 된 멸균 피펫 팁을 사용하여 흡인으로 부착되지 않은 세포를 제거하십시오. 부착된 세포를 2 mL의 멸균 1x 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 1회 세척한다. 신선한 RPMI-1640 배지 2 mL를 웰에 첨가하고, 250 rpm에서 진탕하면서 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 다른 균주 및/또는 조건의 웰 사이에서 피펫 팁을 변경하십시오. 흡인하는 동안 팁으로 우물 바닥을 긁지 마십시오. - 24시간 인큐베이션이 끝날 때, 11개의 접종된 웰 각각으로부터 액체 및 생물막 물질을 수집하여 단일의 멸균 50 mL 코니컬 튜브에 풀링한다. 둘 이상의 균주 또는 성장 조건을 동시에 처리하는 경우 독립 풀에서 필요에 따라 반복하십시오.
참고: 피펫 필터 팁으로 각 웰의 바닥과 가장자리를 긁어 표면에 부착된 셀을 제거합니다. 피펫을 사용하여 생물막을 균질화하십시오. - 펠릿 샘플을 실온에서 5분 동안 4,000 × g 에서 원심분리하였다. 상청액을 가능한 한 많이 데칸트하여 펠릿의 파괴를 최소화하기 위해주의를 기울이십시오. 펠렛을 액체 질소에 스냅-동결시키고 수집 직후 -80°C에서 저장하거나 단계 4(핵의 단리)로 직접 계속한다.
3. 플랑크톤 배양물의 시료 준비
- 줄무늬 C. 알비칸스 GFP-태깅된 균주(들)를 YPD 한천 플레이트 상에 놓고 2-3일 동안 30°C에서 인큐베이션한다. 한천 플레이트로부터 단리된 단일 콜로니를 사용하여, 4 mL의 YPD 액체 배지에 접종한다. 30°C에서 밤새 진탕하면서 인큐베이션한다(12-16 h). 밤새 배양물(들)의OD600 을 결정한다.
- 백-RPMI-1640 액체 배지 중 0.1의 OD600으로 밤새 희석하고, OD600이 0.5와0.8 사이가 될 때까지 2-5 h 동안 225 rpm에서 진탕하면서 30°C에서 인큐베이션한다.
참고 : 세포는 수확되기 전에 적어도 두 배의 배수를 거쳐야합니다. 플랑크톤 배양에 사용되는 조건은 필요에 따라 조절할 수 있다. - 샘플을 실온에서 5분 동안 4,000 × g 에서 원심분리하여 펠릿화한다. 상청액을 가능한 한 많이 데칸트하여 펠릿의 파괴를 최소화하기 위해주의를 기울이십시오. 펠렛을 액체 질소에 스냅-동결시키고 수집 직후 -80°C에서 저장하거나 단계 4(핵의 단리)로 직접 계속한다.
4. 핵의 분리
참고: 실험 당일, 신선한 Ficoll 버퍼를 준비하고, 재현탁 버퍼의 분취량에 2-메르캅토에탄올 및 프로테아제 억제제를 추가하고, SPC 버퍼의 분취량에 프로테아제 억제제를 추가합니다( 보충 파일 1 참조). 펠렛을 재현탁시키려면, 200 μL 또는 1 mL 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 피펫하여 세포 또는 핵의 손상을 방지한다. 핵 분리를 시작하기 전에 열 블록을 켜서 30 °C로 예열하십시오. 이 프로토콜의 나머지 부분에 대한 모든 피펫 팁과 튜브는 인증된 DNA/RNA 및 DNase/RNase가 없어야 하며, 이후의 모든 피펫팅 단계에는 필터 팁을 사용하는 것이 좋습니다.
- 펠렛(들)을 1 mL의 실온 재현탁 완충액에 재현탁시키고 멸균된 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브로 옮긴다. 펠렛을 2,000 × g 의 실온에서 2분 동안 탁상 원심분리기에서 상청액을 제거하였다.
참고: 200 μL 또는 1 mL 피펫 팁을 사용하여 상층액을 제거하고 펠렛의 파괴를 최소화하기 위해 주의하십시오. - 펠렛(들)을 200 μL의 실온 재현탁 완충액에 재현탁시킨다. 재현탁된 펠렛으로부터, 5 μL 분취량을 새로운 PCR 튜브 내로 옮기고, 나중에 사용하기 위해 이를 4°C에 보관한다.
참고: 이 분취량은 분리된 핵의 품질을 평가하기 위한 후속 품질 관리 단계 동안 대조군으로 사용될 것입니다. - 펠렛을 2,000 × g 에서 2분 동안 피펫을 이용하여 상층액을 제거하고 폐기한다. 200 μL의 재현탁 완충액을 사용하여 세척 단계를 두 번 반복하십시오.
- 실온에서 2,000 × g 에서 2분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 재현탁 버퍼 300μL와 라이티케이스 용액 10μL를 추가합니다(50mg/mL, 물자 표 참조). 열 블록에서 30°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
참고: 또는 열 블록 대신 30°C로 가열된 수조를 사용할 수도 있습니다. 여기에 사용 된 스페로 플라스탕스 조건은 C. 알비칸의 효모 및 히팔 세포 모두에 효과적이도록 최적화되었습니다. 이 프로토콜을 세포벽 완전성 또는 다른 세포 형태학에 영향을 미치는 돌연변이를 가진 C. albicans 세포에 적용 할 때 스페로플라스팅 조건을 최적화하는 것이 좋습니다. 이 30분 인큐베이션 단계 동안, 사용자는 시간을 절약하기 위해 미리 5단계(콘카나발린 A 비드 활성화)를 완료할 수 있는 옵션을 갖는다.- 임계 단계: 30분 인큐베이션 단계 후, 5 μL 분취량을 새로운 PCR 튜브 내로 옮긴다. 단계 4.2로부터 4°C에서 보관된 5 μL의 단리된 핵 및 5 μL의 무손상 세포 분취량에, 1 μL의 칼코플루오화 백색 (형광 세포벽 염료) 및 1 μL의 SYTO 13 (핵산 염색)을 첨가한다. 어둠 속에서 30°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 형광 현미경을 사용하여 분리된 핵의 완전성과 순도를 육안으로 검사한다. 손상되지 않은 핵(488-509nm 여기 필터 사용)이 눈에 띄게 염색된 것을 보여주는 분리된 핵을 찾고 칼코플루오르 백색 염료(390-420nm 여기 필터 사용)에 의한 세포벽 염색이 없는지 확인합니다. 무손상 대조군 세포에서, 칼코플루오르 백색 염료 (390-420 nm 여기 필터 사용) 및 무손상 핵 염색 (488-509 nm 여기 필터 사용)에 의한 현저한 세포벽 염색을 찾으십시오.
- 4°C에서 2,000 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 펠렛을 1mL 필터 팁을 사용하여 500μL의 빙냉 재현탁 버퍼에 재현탁하여 5회 부드럽게 위아래로 피펫팅합니다. 4°C에서 2,000 × g 에서 5분 동안 원심분리하고, 1 mL 피펫을 이용하여 상층액을 제거하였다. 펠렛을 갓 만든 얼음처럼 차가운 Ficoll 버퍼 1mL로 재현탁하십시오.
참고 :이 시점부터 얼음 위에 샘플과 버퍼를 보관하십시오. - 샘플을 4°C에서 5,000 × g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 펠렛을 500 μL의 빙냉 SPC 완충액에 재현탁시킨다.
참고 :이 시점부터는 핵이 손상되지 않도록 매우 부드럽게 다루십시오. - 샘플을 4°C에서 5,000 × g 에서 10분 동안 원심분리하고, 펠렛을 파괴하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 제거하였다. 펠릿화된 핵이 들어있는 튜브를 얼음 위에 놓고 단계 5로 진행한다. 단계 5가 단계 4.4에서 이미 미리 완료된 경우, 단계 6으로 진행하거나 펠렛을 액체 질소에서 스냅-냉동하고 수집 직후 -80°C에 보관한다.
5. 콘카나발린 A 비드 활성화
참고: 이 단계는 매우 중요한 단계입니다. 이 시점부터 사용자는 상업적으로 이용 가능한 CUT&RUN 키트 또는 소스 키 구성 요소를 개별적으로 사용하여 프로토콜을 계속 사용하고 사내에서 버퍼를 준비 할 수 있습니다. 상업용 키트를 사용하는 경우, 달리 언급되지 않는 한 아래에 사용된 모든 완충제 및 시약이 키트에 포함된다. 시약을 독립적으로 소싱하기 위한 개별 카탈로그 번호도 재료 표에 제공됩니다. 사용하기 전에 얼음 위의 모든 버퍼를 식히십시오. 5단계가 완료되면 즉시 6단계로 진행하는 것이 좋습니다. 격리 된 핵의 여러 동결 해동은 DNA 손상을 증가시키는 것으로 알려져 있으며 품질이 좋지 않은 결과를 초래할 수 있으므로 피하십시오.
- 피펫을 사용하여 콘카나발린 A(ConA) 비드를 부드럽게 재현탁시킨다. 샘플 당 22 μL의 ConA 비드 현탁액을 단일 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에서 처리하도록 이송한다. 비드 슬러리가 맑아질 때까지 튜브를 마그네틱 랙 위에 놓으십시오. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 버립니다.
참고: 총 10개의 샘플에 대해 CUT&RUN을 수행할 때, 예를 들어, 220μL의 ConA 비드 현탁액을 1.5mL 마이크로퍼지 튜브로 옮깁니다. - 마그네틱 랙에서 ConA 비드가 들어있는 튜브를 제거하고 즉시 200μL의 빙냉 비드 활성화 버퍼를 추가하고 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합합니다. 비드 슬러리가 맑아질 때까지 튜브를 마그네틱 랙 위에 놓으십시오. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 버립니다. 총 두 번의 세척에 대해 이 단계를 반복합니다.
- 비드를 처리될 핵의 샘플 당 22 μL의 빙냉 비드 활성화 완충액에 재현탁시킨다. 필요할 때까지 구슬을 얼음 위에 보관하십시오.
주: 후속 단계의 처리량은 사용 가능한 마그네틱 튜브 랙의 수와 용량에 따라 다릅니다. 두 개의 16웰 튜브 랙에서 32개의 샘플을 처리하는 것은 이 프로토콜의 대부분의 사용자에게 관리 가능한 숫자입니다. 그러나 숙련 된 사용자 또는 로봇 액체 처리 시스템을 사용할 수있는 경우 더 높은 처리량이 가능합니다.
6. 활성화된 비드에 결합 핵
참고: 사용하기 전에 얼음 위의 모든 버퍼를 식히십시오. 프로테아제 억제제로 보충된 모든 완충제는 실험 당일에 신선하게 제조되어야 한다. 후속 단계에서 0.2 mL 스트립 튜브를 사용하는 것이 좋습니다.
- 단계 4로부터 펠렛된 핵을 빙냉 SPC 버퍼 100 μL에 재현탁시키고 새로운 8-튜브 0.2 mL 스트립으로 옮긴다. 20 μL의 활성화된 비드를 각 샘플에 첨가하고 부드럽게 피펫을 혼합한다. 교반 없이 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- 슬러리가 맑을 때까지 자석 랙에 튜브를 놓으십시오. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 버립니다. 마그네틱 랙에서 튜브를 분리하고 200μL의 빙냉 세척 버퍼를 각 샘플에 추가합니다. 5 번 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 비드를 재현탁하십시오. 각 샘플의 100 μL 분취량을 새로운 8-튜브 0.2 mL 스트립으로 옮깁니다.
- 중요 단계: 각 CUT&RUN 샘플을 두 개의 개별 분취량으로 나눕니다. 음성 대조군 항체 (예를 들어, IgG 음성 대조군 항체)에 대한 분취량 중 하나를 사용하고 다른 하나는 관심있는 단백질 (예를 들어, 항-GFP 항체)에 대한 표적 항체에 대해 사용한다.
참고: 두 샘플 모두 계산 파이프라인이 관심 TF와 관련된 농축 신호를 정확하게 식별하기 위해 필요합니다. 태그되지 않은 균주를 갖는 항-GFP 항체를 사용하는 추가의 조절이 또한 수행될 수 있다. 이러한 대조군은 GFP 태깅된 균주에서 IgG 항체의 사용과 유사한 결과를 보여주었다. 따라서, 단순화를 위해, 모든 실험에 대해 표준 IgG 대조군을 사용하는 것이 좋다.
- 중요 단계: 각 CUT&RUN 샘플을 두 개의 개별 분취량으로 나눕니다. 음성 대조군 항체 (예를 들어, IgG 음성 대조군 항체)에 대한 분취량 중 하나를 사용하고 다른 하나는 관심있는 단백질 (예를 들어, 항-GFP 항체)에 대한 표적 항체에 대해 사용한다.
7. 일차 항체 결합
참고: pAG-MNase 융합 단백질은 토끼, 염소, 당나귀, 기니피그 및 마우스 IgG 항체17에 잘 결합합니다. 일반적으로, 대부분의 상업적 ChIP-seq-인증 상용 항체는 CUT&RUN 절차와 양립가능하다. 사용된 일차 항체의 양은 항체의 효율에 의존하며, 관심있는 항체가 ChIP 또는 CUT&RUN 실험에서 이전에 시험되지 않은 경우 항체의 적정 (예를 들어, 1:50, 1:100, 1:200 및 1:400 최종 희석)이 필요할 수 있다. 사용하기 전에 얼음 위의 모든 버퍼를 식히십시오. 항체 결합 단계에 사용되는 모든 완충제는 실험 당일에 신선하게 제조되어야 한다.
- 마그네틱 랙에 튜브를 놓고 슬러리가 완전히 깨끗해질 때까지 기다리십시오. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 버립니다. 50 μL의 항체 버퍼를 첨가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하십시오.
- 3 μL의 항-GFP 폴리클로날 항체 (또는 시험되지 않은 항체를 사용하는 경우 0.5 μg)를 첨가한다. 튜브를 4°C에서 2시간 동안 너트 믹서 상에서 인큐베이션한다.
참고: 일부 CUT&RUN 프로토콜은 pAG-MNase첨가 14 이전에 이차 항체를 첨가함으로써 수율 증가를 보고합니다. 그러나 이 추가 단계를 사용하여 유의한 개선이 관찰되지 않았으므로 이 프로토콜에는 포함되지 않습니다. - 튜브를 실온에서 100 × g에서 5 초 동안 간단히 원심분리하고, 튜브를 마그네틱 랙 위에 놓고, 슬러리가 맑아지면 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 버립니다. 비드가 들어있는 튜브가 여전히 마그네틱 랙에 있는 동안, 200μL의 얼음처럼 차가운 세포 투과 버퍼를 비드에 직접 첨가하십시오. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 버립니다. 얼음처럼 차가운 세포 투과 버퍼로 총 두 번의 세척을 반복하십시오.
- 50μL의 빙냉 세포 투과 버퍼를 각 튜브에 넣고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.
참고: 비드는 종종 이 시점에서 응집되지만 200μL 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합하면 쉽게 분산될 수 있습니다.
8. 항체에 대한 pAG-MNase의 결합
- 2.5 μL의 pAG-Mnase (20x 스톡)를 각 샘플에 첨가하고, 피펫팅에 의해 부드럽게 혼합한다. 샘플을 (~ 45 ° 각도로 약간 상승 된) 4 °C의 너트 레이터 위에 놓습니다. 너트 에이터를 켜고 샘플을 1 시간 동안 인큐베이션하십시오.
- 스트립 튜브를 실온에서 100 ×g에서 5 초 동안 간단히 원심분리하고, 튜브를 마그네틱 랙 위에 놓고, 슬러리가 맑아지면 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 버립니다.
참고: 이 단계는 매우 중요합니다. 이 단계 후에 튜브의 캡 또는 측면에 남아있는 이월 항체는 배경 신호의 양을 상당히 증가시킬 것이다. - 비드가 들어있는 튜브가 여전히 마그네틱 랙에 있는 동안 200μL의 얼음처럼 차가운 세포 투과화 버퍼를 첨가하고, 슬러리를 맑게 하고, 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 버립니다. 세포 투과 버퍼를 사용한 총 두 번의 세척에 대해 이 단계를 반복합니다.
- 얼음처럼 차가운 세포 투과 완충액 100μL를 시료에 넣고 5회 위아래로 부드럽게 피펫을 한다.
9. 표적 크로마틴 소화 및 방출
- 샘플(들)을 함유하는 튜브를 5분 동안 습윤 얼음 욕조에서 인큐베이션한다. 3 μL의 100 mMCaCl2 를 다채널 피펫을 사용하여 각 샘플에 첨가한다. 부드럽게 피펫을 5 번 위아래로 피펫하고, 즉시 튜브를 젖은 얼음 욕조로 되돌리고 30 분 동안 배양하십시오.
- 66 μL의 스톱 버퍼를 각 샘플에 첨가하고 부드럽게 와동시켜 혼합한다. 샘플을 건조 욕조에서 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
참고: 스톱 버퍼의 샘플당 1.5pg의 이종성 대장균 스파이크인 DNA를 추가하는 것이 좋습니다. 1.5 pg의 대장균 스파이크-인 DNA의 첨가는 1,000-10,000개의 매핑된 스파이크-인 판독에 대해 1-10백만 개의 매핑된 실험 판독을 초래한다14. 스파이크 인 DNA는 시퀀싱 깊이를 교정하는 데 사용되며 일련의 샘플을 비교하는 데 특히 중요합니다. 스파이크 인 대장균 의 첨가는 매우 권장되지만 필수적이지는 않습니다. 상용 CUT&RUN 키트에는 대장균 스파이크 인 DNA가 포함되어 있지만 별도로 구입할 수도 있습니다. - 튜브를 마그네틱 랙 위에 놓고 160 μL의 상청액을 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브로 옮깁니다. 샘플 80 μL를 새로운 2 mL 마이크로퍼지 튜브로 옮기고 백업 샘플이 필요한 경우 -20°C에서 보관한다. 80 μL 샘플로 단계 10을 진행한다.
10. 수집된 DNA 샘플의 정리
참고: 사용 전에 DNA 정제 비드를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하십시오. 얼음 위에 100 % 이소 프로판올을 미리 식히십시오. 샘플을 혼합 할 때 피펫을 10 번 위아래로 피펫하십시오.
- 소용돌이 DNA 정제 비드는 비드 현탁액을 균질화한다. 재현탁된 비드의 50 μL (∼0.6x 샘플 부피)를 각 샘플에 첨가한다. 피펫-믹스 샘플을 실온에서 5분 동안 너트레이터 상에서 인큐베이션한다.
참고: 사용된 샘플에 대한 DNA 정제 비드의 비율은 매우 중요합니다. 샘플에 비해 0.6x 부피의 DNA 정제 비드 용액을 사용하면 자성 비드가 손상된 핵에서 방출되는 큰 DNA 단편에 결합 할 수 있습니다. CUT&RUN-농축된 DNA 단편은 이들 큰 DNA 단편보다 훨씬 작으며, 따라서 이 단계에서 상청액에 유지된다. - 튜브를 자기 랙 상에 놓고 DNA를 함유하는 상청액 130 μL를 0.2 mL 8-튜브 스트립으로 옮긴다. 추가로 30 μL의 DNA 정제 비드를 샘플(들)에 첨가한다(총 부피는 160 μL이다).
- 얼음처럼 차가운 100% 이소프로판올 170μL(~1x 시료 부피)를 첨가하고, 10회 위아래로 피펫팅하여 잘 섞은 다음, 얼음 위에서 10분 동안 배양한다.
참고: DNA 정제 비드가 CUT&RUN이 농축된 작은 단편을 효율적으로 포획하기 위해 이 단계에 100% 얼음처럼 차가운 이소프로판올을 사용하는 것이 중요합니다. - 마그네틱 랙에 튜브를 놓고 슬러리가 제거되면 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다.
- 튜브가 마그네틱 랙 위에 있는 동안 갓 준비한 실온 80% 에탄올 200μL를 튜브에 넣고 실온에서 30초 동안 배양합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다. 80 % 에탄올로 총 두 번 세척 할 때이 단계를 반복하십시오.
- 튜브를 100 × g으로 빠르게 회전시키고 튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓고 슬러리가 제거 된 후 피펫을 사용하여 잔류 에탄올을 제거하십시오. 튜브가 뚜껑을 연 상태에서 마그네틱 랙에 남아있는 동안 비드를 5 분 동안 공기 건조시킵니다.
참고: 최종 DNA 수율을 크게 감소시킬 수 있으므로 건조 시간을 5분을 초과하지 마십시오. - 마그네틱 랙으로부터 튜브를 분리하고, pH 8에서 0.1x Tris-EDTA(TE) 17 μL를 첨가하여 비드로부터 DNA를 용출시켰다. 잘 섞어서 튜브를 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 슬러리가 깨끗해질 때까지 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다. 슬러리가 제거되면, 15 μL의 상청액을 멸균된 0.2 mL PCR 튜브로 조심스럽게 옮긴다.
- 수집된 DNA의 농도를 제조자의 프로토콜에 따라 형광계를 사용하여 측정한다.
참고 : 일반적으로 수집 된 DNA의 농도는 ~ 1 ng / μL입니다. 때때로, 수집된 DNA의 농도가 너무 낮아서 형광계를 사용하여 정량할 수 없다. 이것은 실패한 실험의 지표가 아닙니다. 수집된 DNA의 농도에 관계없이 라이브러리 준비를 진행한다. - 단계 11로 진행하거나 준비가 될 때까지 샘플을 -20°C에서 저장한다.
11. 시퀀싱을 위한 도서관 준비
참고: 다음 단계에서는 시중에서 판매되는 라이브러리 준비 키트를 사용합니다. 라이게이션 마스터 믹스를 사용하여 단계를 수행할 때는 튜브에 닿지 않는 것을 최소화하고 항상 얼음 위에 보관하십시오.
- pH 8에서 0.1x TE를 사용하여 CUT&RUN DNA의 총 부피를 50μL로 올립니다. 시료당 3μL의 End Prep Enzyme Mix와 7μL의 End Prep Reaction Buffer의 마스터 믹스를 만듭니다. 10μL의 마스터 믹스를 CUT&RUN DNA에 넣고 5회 위아래로 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
- 100 ×g에서 빠른 회전을 수행하여 튜브의 측면에서 모든 액체를 수집하십시오. 튜브를 ≥75°C로 설정된 가열된 뚜껑을 가진 열순환기에 놓고 표 7의 사이클링 조건을 실행한다.
주: 단계 10으로부터 수집된 입력 DNA 농도에 따라, 표 8로부터 필요한 어댑터 희석을 따른다. - 샘플당 2.5μL의 어댑터를 넣고 10회 위아래로 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
주: 어댑터를 샘플에 추가하고 라이게이션 마스터 믹스를 추가하기 전에 완전히 혼합하는 것이 중요합니다. - 30μL의 라이게이션 마스터 믹스와 1μL의 라이게이션 인핸서의 마스터 믹스를 만드십시오. 31 μL의 마스터 믹스를 샘플에 첨가한다. 10 번 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합하십시오.
- 가열된 뚜껑을 떼어낸 상태에서 열순환기에서 15분 동안 20°C에서 인큐베이션한다.
참고: 샘플을 얼음 위에 보관하고 열순환기가 20°C에 도달한 후에만 열순환기로 옮기는 것이 중요합니다. - 100 ×g에서 빠른 스핀을 수행하여 튜브의 측면으로부터 모든 액체를 수집하고, 3 μL의 Uracil 절제 효소를 첨가하고, ≥47°C로 설정된 가열된 뚜껑을 사용하여 37°C에서 15분 동안 열순환기에서 튜브를 인큐베이션한다.
참고: 이 지점은 안전한 정지 지점입니다. 샘플을 -20°C에서 저장하거나 단계 11.7로 직접 계속한다. 단계 11.7로 직접 계속하는 경우, 사용 전에 30분 동안 실온에서 DNA 정제 비드를 인큐베이션한다. - 11.6단계로부터의 어댑터 라이게이션 반응에 DNA 정제 비드의 154.4 μL(∼1.6x 샘플 부피)를 첨가한다. 피펫-믹스 샘플을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 슬러리가 제거되면 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다.
- 갓 준비한 실온 80% 에탄올 200μL를 튜브에 첨가하고 실온에서 30초 동안 인큐베이션한다. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 버리고 80 % 에탄올로 총 두 번 세척 할 때이 단계를 반복하십시오.
- 튜브를 100 × g에서 잠깐 회전시킵니다. 튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓고 피펫을 사용하여 잔류 에탄올을 제거하십시오. 튜브가 뚜껑을 연 상태에서 마그네틱 랙에 남아있는 동안 구슬을 5 분 동안 공기가 건조시킵니다.
참고: 최종 DNA 수율을 크게 감소시킬 수 있으므로 건조 시간을 5분을 초과하지 마십시오. - 마그네틱 랙으로부터 튜브를 제거하고, pH 8에서 0.1x TE의 17 μL를 첨가하여 비드로부터 DNA를 용출시킨다. 잘 섞어서 실온에서 5분 동안 배양한다.
- 슬러리가 깨끗해질 때까지 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다. 슬러리가 제거되면, 15 μL의 상청액을 멸균된 0.2 mL PCR 튜브로 조심스럽게 옮긴다.
- 샘플 당 25 μL의 DNA 중합효소 마스터 믹스와 5 μL의 유니버설 포워드 라이브러리 증폭 프라이머 (10 μM)의 마스터 믹스를 만드십시오.
참고: 피펫팅 손실을 고려하기 위해 마스터 믹스의 추가 샘플 하나를 준비하십시오. - 30 μL의 마스터 믹스를 15 μL의 어댑터 라이게이션된 DNA 샘플에 첨가한다. 5 μL의 역고유 인덱싱된 라이브러리 증폭 프라이머 (10 μM)를 각 샘플에 첨가하여 최종 부피를 총 50 μL로 가져온다. 표 9에서 PCR 사이클링 조건을 수행한다.
참고: DNA 정제 비드를 사용하기 전에 실온에서 30분 동안 인큐베이션하십시오. - DNA 정제 비드를 소용돌이 치며 재현탁시킨다. 재현탁된 비드의 35 μL (∼0.7x 샘플 부피)를 PCR 증폭된 DNA 샘플에 첨가한다. 샘플을 실온에서 5분 동안 너트레이터 상에서 혼합하고 인큐베이션한다.
- 튜브를 마그네틱 랙 위에 놓고 슬러리가 맑아지면 DNA가 들어있는 상청액을 새로운 0.2 mL 8-웰 PCR 스트립 튜브로 옮깁니다.
- 119 μL (~1.4x 샘플 부피)의 비드를 샘플에 첨가하고, 5 회 위아래로 피펫팅하여 혼합한다. 샘플을 실온에서 5분 동안 너트레이터 상에서 인큐베이션한다.
- 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 슬러리가 제거되면 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다.
- 갓 준비한 실온 80% 에탄올 200μL를 튜브에 첨가하고 실온에서 30초 동안 인큐베이션한다. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 버리십시오. 80 % 에탄올로 총 두 번 세척하는 단계를 반복하십시오.
- 튜브를 100 × g에서 잠깐 회전시킵니다. 튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓고 피펫을 사용하여 잔류 에탄올을 제거하십시오. 튜브가 뚜껑을 연 상태에서 마그네틱 랙에 남아있는 동안 비드를 5 분 동안 공기 건조시킵니다.
참고: 최종 DNA 수율을 크게 감소시킬 수 있으므로 건조 시간을 5분을 초과하지 마십시오. - 마그네틱 랙으로부터 튜브를 제거하고, pH 8에서 0.1x TE의 14 μL를 첨가하여 비드로부터 DNA를 용출시켰다. 잘 섞어서 실온에서 5분 동안 배양한다.
- 슬러리가 깨끗해질 때까지 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다. 슬러리가 제거되면, 상청액 13 μL를 멸균된 0.2 mL PCR 튜브로 조심스럽게 옮긴다.
- 신선한 1x 트리스-보레이트-EDTA (TBE)를 준비하고 미리 만들어진 상용 10% 아크릴아미드 TBE 겔을 1x TBE로 채워진 겔 전기영동 장치에 삽입한다.
- 첫 번째 웰에 2μL의 저범위 DNA 사다리를 첨가한다. 3 μL의 6x 로딩 염료를 단계 11.22로부터 미리 수집된 샘플 13 μL와 혼합한다. 조심스럽게 15 μL를 겔의 각 웰에 첨가한다. 젤을 70V에서 90 분 동안 실행하십시오.
참고: 각 시료 사이의 젤에 웰 하나를 비워 두는 것이 좋습니다, 이것은 샘플 교차 오염의 가능성을 줄이기 때문입니다. 숙련 된 사용자는 특히 많은 수의 샘플을 처리 할 때 교차 오염을 신중하게 피하면서 모든 웰을 사용하는 것이 적절하다는 것을 알 수 있습니다. - 젤 상자에서 캐스트된 젤을 제거합니다. 제조업체의 지침에 따라 젤 캐스트를 열고 젤 캐스트에서 젤을 부드럽게 제거한 다음 100mL의 1x TBE가 들어있는 젤 유지 트레이 안에 넣으십시오.
참고 : 젤이 얇고 깨지기 쉽기 때문에 젤이 찢어지지 않도록 젤 캐스트에서 젤을 부드럽게 제거하십시오. 젤을 취급 할 때마다 장갑과 젤을 1x TBE로 미리 젖는 것이 중요합니다. 젤 홀딩 트레이는 젤의 크기보다 약간 커야합니다 (양쪽에 약 0.5 "). 96웰 PCR 튜브 보관 박스와 함께 제공되는 플라스틱 뚜껑은 표준 미니 젤 크기를 위한 편리한 고정 트레이입니다. - 핵산 겔 염색 10 μL를 트레이에 첨가하고 부드럽게 소용돌이친다. 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 덮고 실온에서 10 분 동안 정적으로 배양하십시오.
- 탈이온수 100mL로 젤을 두 번 헹구십시오. 호박색 필터 커버를 사용하여 청색광 조명 아래에서 젤을 이미지화합니다(그림 2).
참고: 성공적인 라이브러리는 100 ~ 500bp 사이의 번짐을 보여줍니다. 또한 눈에 띄는 ~ 125 어댑터 이량체 밴드가있을 것입니다. 어댑터 이량체의 존재는 불량한 라이브러리 품질을 나타내는 지표가 아닙니다. 이러한 양의 어댑터 이량체는 저풍부 TF에서 수행되는 CUT&RUN 실험에서는 피할 수 없으며 이러한 라이브러리를 준비하는 데 사용되는 입력 재료의 양이 적기 때문에 발생합니다. DNA를 손상시킬 수있는 자외선을 사용하지 마십시오. - 그림 2에 도시된 바와 같이, 각 라이브러리에 대해, 겔을 ∼125 bp 두드러진 어댑터 이량체 밴드(어댑터 이량체 밴드에 닿지 않도록 주의)보다 약간 위에, 그리고 400 bp 사다리 마크 아래로 절단한다.
참고: ~125 어댑터 이량체 밴드를 피하는 것이 중요합니다. 소량의 어댑터 이량체조차도 라이브러리 품질을 크게 떨어 뜨립니다. - 22 G 바늘을 사용하여 0.65 mL 튜브의 바닥을 천공하고 천공된 튜브를 멸균된 2 mL 마이크로퍼지 튜브 내부에 넣는다. 겔 슬라이스를 2 mL 마이크로퍼지 튜브 내부의 뚫린 튜브로 옮긴다.
- 0.65 mL 천공된 튜브와 샘플을 담은 2 mL 마이크로퍼지 튜브를 실온에서 10,000 × g 에서 2분 동안 원심분리하여 2 mL 마이크로퍼지 튜브 내부에 겔 슬러리를 수집한다.
참고: 구멍이 뚫린 튜브는 이제 비어 있어야 하며 폐기할 수 있습니다. 뚫린 튜브 내부에 여전히 겔이 남아 있는 경우, 뚫린 튜브를 다시 2 mL 마이크로퍼지 튜브 내부에 넣고 실온에서 10,000 × g 에서 다시 원심분리하여 추가 2분 동안 원심분리한다. - 겔 슬러리를 2 mL 마이크로퍼지 튜브 내부에 첨가하고, 300 μL의 빙냉 겔 용출 완충액을 첨가하고, 실온에서 최소 3시간 또는 밤새도록 (12-16 h) 동안 너트레이터 상에서 혼합한다.
- 모든 액체 및 겔 슬러리를 0.22 μm 필터 컬럼으로 옮긴다. 실온에서 10,000 × g 에서 1분 동안 원심분리; 수집 된 부피는 ~ 300 μL이어야합니다.
- 450 μL (~1.5x 샘플 부피)의 DNA 정제 비드를 첨가하고, 너트 레이터 상에서 실온에서 5 분 동안 인큐베이션한 다음, 슬러리가 맑아질 때까지 샘플을 마그네틱 랙 상에 놓는다.
참고: DNA 정제 비드를 사용하기 전에 실온에서 30분 동안 인큐베이션하십시오. - 500 μL의 상청액을 제거하고 버리고, 비드를 파괴하지 않도록 한다.
- 마그네틱 랙에서 샘플을 제거하고 5 번 위아래로 피펫팅하여 비드를 혼합하십시오. 200 μL의 샘플을 새로운 PCR 스트립 튜브로 옮긴다.
- 스트립 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 슬러리가 제거되면 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다.
- 갓 준비한 실온 80% 에탄올 200μL를 튜브에 첨가하고 실온에서 30초 동안 인큐베이션한다. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 버리십시오. 80 % 에탄올로 총 두 번 세척 할 때이 단계를 반복하십시오.
- 튜브를 100 × g에서 잠깐 회전시킵니다. 튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓고 피펫을 사용하여 잔류 에탄올을 제거하십시오. 튜브가 뚜껑을 연 상태에서 마그네틱 랙에 남아 있는 동안 비드를 최대 5분 동안 공기 건조시킵니다.
참고: 최종 DNA 수율을 크게 감소시킬 수 있으므로 건조 시간을 5분을 초과하지 마십시오. - 마그네틱 랙으로부터 튜브를 제거하고, pH 8에서 0.1x TE의 17 μL를 첨가하여 비드로부터 DNA를 용출시킨다. 잘 섞어서 튜브를 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 슬러리가 깨끗해질 때까지 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다. 슬러리가 제거되면, 15 μL의 상청액을 멸균된 0.2 mL PCR 튜브로 조심스럽게 옮긴다.
- 형광계를 이용하여 최종 라이브러리 수량을 측정하는 단계; 이 최종 라이브러리를 시퀀싱에 사용하십시오.
참고: 최소 3억 40bp 이상의 쌍 끝 읽기를 제공하는 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 최대 48개의 라이브러리를 단일 레인에서 풀링하고 시퀀싱할 수 있습니다.
12. CUT&RUN 시퀀스 분석
참고: 이 섹션에서는 CUT&RUN 시퀀스 데이터를 분석하는 데 사용되는 계산 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 계산 가상 환경을 설정하는 것으로 시작하여 사용자가 로컬 컴퓨터에서 명령을 실행하는 과정을 안내합니다. 이 프로토콜은 로컬 머신, 가상 클라우드 서버 및 고성능 컴퓨팅 클러스터와 같은 모든 컴퓨팅 리소스에서 작동합니다. 이 논문에 제시된 모든 CUT&RUN 데이터는 NCBI GEO에서 수탁 번호 GSE193803으로 액세스할 수 있습니다.
- https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis 에서 CUT&RUN 분석의 소스 코드를 다운로드합니다.
참고: 워크플로는 MacOS 또는 Linux OS 시스템에서 가장 잘 작동합니다. Windows 사용자는 GitBash를 사용하여 워크플로를 실행할 수 있습니다(자료 표 참조).- GitHub 페이지에서 녹색 코드 버튼을 클릭하여 코드를 직접 다운로드| ZIP 옵션을 다운로드 하십시오. 폴더의 압축을 로컬 컴퓨터의 관련 위치에 풉니다.
- Conda 환경( 자료표 참조)을 설치하고 한 번만 실행합니다.
참고: 이 워크플로는 Conda 명령줄 도구 환경을 사용하여 필요한 모든 소프트웨어 및 도구를 설치합니다. - Conda가 설치되면(한 번만 실행) 다음 명령과 함께 제공된 보충 파일 2 를 사용하여 가상 환경을 만듭니다.
conda create --name--file Supplementary_File_2.txt - 다음을 사용하여 이 워크플로를 실행할 때마다 가상 환경을 활성화합니다.
conda 활성화 - 입력 원시 FASTQ 파일을 단일 폴더, 이상적으로는 CUT&RUN 실험당 하나의 폴더로 구성합니다.
13. 정렬을 위한 게놈 파일의 생성
- 정렬을 위해 게놈 파일을 생성합니다 (각 게놈 파일에 대해 한 번만 실행). 다음과 같은 모든 C. albicans 게놈 파일을 저장할 폴더를 만듭니다.
mkdir ca_genome_files
14. C. 알비칸 게놈 어셈블리 다운로드 21
- wget 또는 curl 도구를 사용하여 Candida Genome Database에서 C. albicans 게놈 어셈블리 21을 다운로드하십시오 (자료 표 참조)18.
참고: C. 알비칸 어셈블리(21)는 여기서 CUT&RUN 결과를 어셈블리(21)에 정렬된 이전에 공개된 ChIP-칩 결과와 비교하기 위해 사용되었다. 사용자는 다른 어셈블리 버전을 다운로드하고 유사한 명령을 실행하여 정렬 요구에 맞는 관련 게놈 파일을 생성할 수 있습니다.
15. Bowtie 2 인덱스 데이터베이스 생성(데이터베이스 이름: ca21)
- 다음을 사용합니다.
bowtie2-build C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
bowtie2-inspect -s ca21
16. CUT&RUN 분석 파이프라인 실행
- 도움말 섹션을 읽고 파이프라인의 매개 변수에 익숙해지십시오.
배쉬 cut_n_run_pipeline.sh -h
17. 관련 매개 변수로 cut_n_run_pipeline.sh 파일을 실행하십시오.
- 스크립트를 실행합니다.
bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y y > /path/to/output.log 2>&1
참고: 코드의 19-36행에 대한 자세한 설명과 함께 관련 매개 변수는 GitHub 페이지 https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh 에 설명되어 있습니다.
18. 출력 파일 구성
- BedTools 병합 함수19를 사용하여 /path/to/input/folder/peakcalling/macs2에 있는 MACS2에 의해 호출된 모든 반복실험으로부터의 중요한 피크를 병합한다.
고양이 / 경로 / 입력 / 폴더 / 피크 콜링 / macs2 / all_replicate_files 정렬 -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o last, mean, first, mean, mean, mean > /path/to/merged_output.bed
참고: 복제 샘플에서 겹치는 피크를 평가하는 방법에 대한 추가 정보 및 모범 사례는 Landt et al.20 및 Boyd et al.21을 참조하십시오.
19. BedTools 빼기 기능을 사용하여 차단된 게놈 영역에 대한 일치 항목 제거
- 다음을 사용하십시오 : 빼기 침대 -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/ Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
참고: C. albicans 게놈의 차단 목록에 있는 영역은 보충 파일 3에서 .bed 파일로 제공됩니다. 이 목록은 주로 C. albicans CUT&RUN, ChIP-seq 및 ChIP-chip 데이터 세트에서 일반적으로 위양성 결과를 생성하는 텔로머 반복 및 중심과 같은 매우 반복적인 시퀀스 요소 및 영역으로 구성됩니다. 따라서 차단 된 영역을 제거하는 것이 좋습니다. 그러나, 특정 단백질 표적에 대해, 이들 유전자좌를 배제하는 것이 부적절하거나 바람직하지 않을 수 있다. 사용자는 이 단계를 건너뛰어 이러한 차단 목록 영역 내에 포함된 신호를 유지하거나 자체 차단 목록 영역을 만들 수 있습니다.
20. UCSC bigWigMerge 함수22를 사용하여 복제물에서 BigWig 파일 병합
- 다음을 사용하십시오 : bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
- UCSC bedGraphToBigWig 기능을 사용하여 bigWigMerge의 BedGraph 출력을 BigWigg로 변환하십시오.
bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file
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Representative Results
이 강력한 CUT&RUN 프로토콜은 C. 알비칸 생물막 및 플랑크톤 배양물에서 특정 TF의 게놈 전체 국소화를 조사하기 위해 채택되고 최적화되었습니다(실험 접근법에 대한 개요는 그림 2 참조). 결과 CUT&RUN 시퀀싱 데이터의 분석을 용이하게 하기 위해 철저한 데이터 분석 파이프라인도 포함되어 있으며 사용자는 코딩 또는 생물정보학에 대한 최소한의 전문 지식을 보유해야 합니다(분석 파이프라인의 개요는 그림 3 참조). ChIP-칩 및 ChIP-seq 방법과 달리, CUT&RUN은 포름알데히드 가교결합 없이 상당히 감소된 수의 입력 세포로부터 제조된 무손상의 투과화 핵을 사용하여 수행된다. C. albicans spheroplasts에서 손상되지 않은 핵을 분리하는 것은 프로토콜의 중요한 단계입니다. 용해물을 사용하는 C. 알비칸 세포벽의 소화를 통한 효율적인 스페로플라스팅은 효소적 소화 반응 조건이 각 세포 유형에 최적화되어야 하기 때문에 어려울 수 있다. 따라서 고품질 시퀀싱 결과를 통한 성공적인 CUT&RUN 실험을 보장하기 위해 초기 품질 관리 단계가 포함되며 표준 형광 현미경을 사용하여 무손상 핵의 존재를 검증합니다.
세포벽 소화 및 핵 완전성은 대조군 무손상 세포와 형광 세포벽 및 핵산 염색으로 염색된 단리된 핵 모두를 시각화함으로써 정기적으로 평가된다. 세포벽 염색이 관찰되지 않는 단리된 무손상 핵과는 달리, 핵 및 세포벽 둘 모두는 무손상 대조군 세포에서 형광 표지된다(도 4A). 마지막으로, 시퀀싱 전에, CUT&RUN 라이브러리의 단편 크기 분포는 모세관 전기영동 장비를 사용하여 평가된다. 이 품질 관리 단계는 CUT&RUN 라이브러리의 품질을 평가할 때 신뢰할 수 있는 척도입니다. 도 4B의 상부 패널에 있는 전기영동 추적에서 볼 수 있듯이, TF를 조사하는 실험을 위해 생성된 성공적인 라이브러리는 280bp보다 작은 단편에 대해 높은 농축성을 보여준다. 도 4B 의 하단 패널에 있는 전기영동 트레이스는 실패한 CUT&RUN 실험의 결과를 나타낸다.
여기서, ∼2,000 bp에서의 피크는 주로 CUT&RUN 실험 동안 광범위하게 손상되거나 부러진 핵으로부터 방출된 소화되지 않은 DNA로부터 발생하였다. 최종 풀링된 라이브러리의 프래그먼트 크기 분포를 평가하는 것도 오염 어댑터 이량체의 완전한 제거를 확인하는 데 권장됩니다(그림 4C). 일반적으로 라이브러리당 5-10백만 개의 쌍 끝 읽기(~40개의 기본 읽기 길이)는 C. Albicans의 대부분의 TF CUT&RUN 실험에 충분한 시퀀싱 깊이를 제공합니다. 쌍 끝 또는 단일 끝의 대체 시퀀싱 읽기 길이를 사용하여 CUT&RUN 라이브러리를 시퀀스할 수 있습니다. 예를 들어, 25bp에서 150bp 사이의 쌍 끝 판독 길이는 결과의 품질에 영향을 주지 않아야 합니다. 150bp보다 크거나 같은 단일 엔드 읽기는 TF CUT&RUN 실험에서도 작동해야 합니다. 그러나 함께 제공되는 데이터 분석 파이프라인은 단일 엔드 읽기를 수용하도록 수정해야 합니다.
이 CUT&RUN 프로토콜과 함께 제공되는 데이터 분석 파이프라인은 C. 알비칸 생물막 형성을 제어하는 두 개의 TF, Ndt80 및 Efg1을 조사하여 검증되었습니다. 도 4D에 도시된 바와 같이, Ndt80은 EFG1 ORF의 상류의 인터제닉 영역(상당히 농축된 Ndt80 ChIP-칩 유전자좌를 나타내는 검정 막대에 의해 강조됨)에 결합한다. EFG1 의 상류에 있는 이러한 인터제닉 영역은 이전에 ChIP-칩4에 의한 생물막 형성 동안 Ndt80 결합에 대해 고도로 농축되는 것으로 나타났다. 그러나 CUT&RUN 실험은 ChIP 칩 실험보다 이 영역 내에서 훨씬 더 많은 피크를 확인했다(10개의 피크 대 4개의 피크). Ndt80 DNA 결합 모티프는 CUT&RUN에 의해 확인된 모든 Ndt80 결합 유전자좌에 걸쳐 풍부하며(보충 그림 1), 이는 이 방법론에 의해 확인된 추가적인 피크가 선의의 Ndt80 결합 부위일 가능성이 있음을 나타낸다. 체계적인 비교 분석은 제시된 CUT&RUN 프로토콜이 생물막 형성4 동안 Ndt80 및 Efg1에 대해 이전에 알려진 결합 사건의 대부분을 성공적으로 확인했음을 나타냈다(도 5).
또한 이전에 발표된 ChIP-칩 실험에서 캡처되지 않은 많은 새로운 TF 결합 이벤트가 CUT&RUN을 사용하여 확인되었습니다(그림 5). 전반적으로, Ndt80 및 Efg1 둘 다 이전에 공개된 ChIP 칩 데이터와 겹치는 유전자좌에 바인딩되고 CUT&RUN 방법을 통해서만 식별된 유전자좌에 바인딩된다(이러한 CUT&RUN 데이터와 Ndt80 및 Efg1에 대한 이전에 공개된 ChIP-칩 데이터 사이의 중첩은 그림 5의 Venn 다이어그램에 요약되어 있다). 더욱이, 유의하게 불리는 피크 (FRiP 스코어) 내의 판독의 분획은 그들의 대조군 IgG 샘플에서보다 GFP 태깅된 샘플에서 일관되게 더 높았다 ( 보충 도 2 참조). 요약하면, 이러한 결과는 여기에 설명 된 CUT & RUN 프로토콜이 저농축 샘플에서 C. albicans TF-DNA 결합 상호 작용을 조사하기 위해 최적화 된 강력한 방법임을 보여줍니다.
그림 1: C. 알비칸 TFs의 에피토프 태깅. (A) 관심있는 TF 유전자 (이 경우 NDT80 )를 확인하고 ORF의 3' 말단에서 Cas9 (오렌지색 모양으로 표시)의 절단을 표적으로 할 gRNA를 선택합니다. (b) 칸디다 클래드-최적화된 eGFP와 >50 bp 상동성 절단 부위로부터의 상류 및 하류는 DSB를 복구하는 dDNA를 제공할 것이다. (c) 콜로니 PCR을 사용하여 의도된 통합을 확인하기 위해 개별 콜로니를 스크리닝한다. 프라이머는 빨간색 화살표로 표시되고 앰플리콘은 파선 상자로 표시됩니다. 이 그림은 BioRender.com 를 사용하여 작성되었습니다. 약어: TF = 전사 인자; gRNA = 가이드 RNA; ORF = 오픈 판독 프레임; eGFP = 강화된 녹색 형광 단백질; DSB = 이중 가닥 파단; 미국 = 업스트림; DS = 다운스트림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: CUT&RUN 실험 프로토콜의 개략적인 개요. C. 생물막 또는 플랑크톤 배양 조건으로부터 수집된 알비칸 세포는 무손상 핵을 분리하기 위해 투과된다. ConA 비드가 활성화되고, 그 후 무손상 핵이 활성화된 ConA 비드에 결합된다. 관심있는 항체를 비드에 결합된 핵에 첨가하고 4°C에서 인큐베이션한다. 다음에, pAG-MNase를 첨가하고, 표적 항체에 결합하도록 허용한다. CaCl2의 첨가 후, pAG-MNase가 활성화되고, 킬레이트화 시약이 첨가되어 pAG-MNase를 불활성화시킬 때까지 표적화된 크로마틴 소화가 진행된다. pAG-MNase-결합된 항체 복합체는 투과된 핵 밖으로 확산되도록 허용되고, 생성된 DNA는 추출되고 세척된다. 시퀀싱 라이브러리는 CUT&RUN이 풍부해진 DNA 단편으로부터 준비되고, 생성된 라이브러리는 10% PAGE 겔에서 실행되어 시퀀싱 전에 오염된 어댑터 이량체를 분리하고 제거합니다. 이 그림은 BioRender.com 를 사용하여 작성되었습니다. 약어: CUT&RUN = 뉴클레아제를 사용하여 표적 및 방출 하에서의 절단; ConA = 콘카나발린 A; PAGE = 폴리아크릴아미드 겔 전기영동. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: CUT&RUN 데이터 분석 파이프라인의 개략적인 개요. 워크플로우는 FastQC를 사용하여 원시 FASTQ 파일에 대한 품질 검사를 수행한 다음, 트리밍하여 시퀀싱 어댑터를 제거하는 것으로 시작합니다. 트리밍된 판독은 이어서 기준 게놈에 정렬되고, 정렬된 판독들은 TF 크기 결합 신호(20bp ≤ 정렬된 판독 ≤ 120bp)를 위해 그들의 크기에 기초하여 필터링된다. 그런 다음 크기 선택 판독이 스파이크인 에스케리치아 콜리 판독에 대해 보정되고, 보정된 판독값은 MACS2를 사용하여 피크를 호출하는 데 사용됩니다. <> 기호는 C. 알비칸 판독 카운트가 각 샘플에 대한 대장균 판독 카운트를 사용하여 보정되었음을 나타내는 시각적 표현입니다. 약어: CUT&RUN = 뉴클레아제를 사용하여 표적 및 방출 하에서의 절단; TF = 전사 인자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 성공적인 CUT&RUN 실험에 중요한 품질 관리 단계 . (A) 세포는 핵 분리 전후의 형광 세포벽(파란색) 및 핵산(녹색) 염색으로 염색되고 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다. (B) CUT&RUN TF 라이브러리는 모세관 전기영동 장비를 사용하여 분석된다. 성공적인 CUT&RUN TF 라이브러리(녹색 체크 표시로 표시됨)는 200bp보다 작은 짧은 조각에 대해 보강됩니다. 차선책의 CUT&RUN TF 라이브러리(빨간색 "X"로 표시됨)는 큰 DNA 단편에 대한 농축을 보여줍니다. (C) 48개의 CUT&RUN 라이브러리를 함께 풀링하고 모세관 전기영동 장비를 사용하여 분석한다. 고품질의 풀링된 라이브러리(녹색 체크 표시로 표시됨)에는 어댑터 이량체(레인 1)가 없는 반면, 저품질 풀링된 라이브러리(빨간색 "X"로 표시됨)는 소량의 어댑터 이량체(레인 2)를 유지합니다. (d) EFG1 ORF(Orf19.610)의 상류의 인터제닉 영역에서 Ndt80 결합(상부 트랙)에 대한 유의한 농축을 보여주는 CUT&RUN 데이터세트(Ndt80 IgG 대조군, 하단 트랙 포함)로부터의 대표적인 IGV 트랙. 검정 막대는 이전에 공개된 ChIP-칩 실험4에 의해 확인된 유의하게 농축된 Ndt80 결합 피크를 나타낸다. 파란색 막대는 여기에 제시된 CUT&RUN 실험에서 확인된 상당히 풍부한 Ndt80 결합 피크를 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm (A). 약어: CUT&RUN = 뉴클레아제를 사용하여 표적 및 방출 하에서의 절단; TF = 전사 인자; GFP = 녹색 형광 단백질; ORF = 읽기 프레임을 엽니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 칸 디다 알비칸스 생물막에서 제시된 CUT&RUN 프로토콜 및 데이터 분석 파이프라인을 사용하여 확인된 Ndt80 및 Efg1 농축 피크의 평가. 맨 위 행의 Venn 다이어그램은 이전에 게시된 ChIP 칩 데이터(4)와 CUT&RUN을 통해 식별된 Ndt80 및 Efg1 결합 사이트 간의 겹침 정도를 보여줍니다. Ndt80 및 Efg1에 대한 모든 결합 이벤트에 대한 CUT&RUN 신호는 하단 행에 컬러 히트맵으로 표시됩니다(빨간색 = 높은 피크 신호, 파란색 = 낮음/없음 피크 신호, 컬러 막대는 GFP 신호에서 뺀 IgG 신호를 나타냄). 업스트림(-1.0kb) 및 다운스트림(+1.0kb)의 1,000bp 영역이 히트맵에 표시됩니다. 프로파일 플롯으로서의 신호 강도(즉, 농축)가 히트맵 위에 도시되어 있다. Ndt80 및 Efg1에 대한 세 가지 생물학적 반복실험이 CUT&RUN 농축을 시각화하기 위해 평가되었다. 약어: ChIP = 크로마틴 면역침전; CUT&RUN = 표적 하에서 절단하고 뉴클레아제를 사용하여 방출; GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 범용 A 및 독특한 B 단편을 증폭하기 위한 PCR 반응 혼합 및 PCR 사이클링 조건. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: PCR 반응 믹스 및 PCR 사이클링 조건을 통해 A 및 B 단편을 스티치하여 전장 C 단편을 생성한다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 전장 C 단편을 PCR 증폭하기 위한 PCR 사이클링 조건. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: PCR 반응 믹스 및 PCR 사이클링 조건은 공여체 DNA GFP 태그를 증폭시킨다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 5: 플라스미드 소화 반응을 위한 플라스미드 소화 반응 혼합 및 반응 조건. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 6: 콜로니 PCR을 위한 PCR 반응 혼합 및 PCR 사이클링 조건. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 7: 시퀀싱을 위한 준비에서 라이브러리의 최종 복구 단계를 위한 PCR 사이클링 조건. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 8: 시퀀싱 라이브러리를 준비하기 위한 입력 DNA에 대한 어댑터 희석 권장 사항. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 9: 어댑터 라이게이션된 DNA를 PCR 증폭하기 위한 PCR 사이클링 조건. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: Ndt80 DNA 결합 서열 모티프 농축. 생물막 ChIP-칩 데이터(진한 파란색 점선) 또는 CUT&RUN 데이터(연한 파란색 점선)에서 확인된 Ndt80 결합 유전자좌에 대한 누적 Ndt80 모티프 농축 점수는 무작위 인터제닉 유전자좌(적색 점선)와 비교하였다. 왼쪽 Y축은 X축에 해당하는 누적 모티프 점수를 포함하는 각 데이터 세트에 대한 총 유전자좌의 백분율을 나타냅니다. 파선은 무작위 인터제닉 대조군 유전자좌에 대하여 X축의 각 지점에서 모티프 점수 농축(-log10 P-값, 오른손 Y축)의 유의성을 나타낸다. 누적 모티프 점수 및 P-값은 MochiView23 을 사용하여 결정하였다( 표 자료 참조). 모든 Ndt80-결합 유전자좌는 ChIP-칩 및 CUT&RUN 데이터세트 내의 Ndt80 결합의 각 피크 아래에 중심을 둔 500 bp 윈도우로서 샘플링되었고, 길이의 차이를 제어하기 위해 무작위로 선택된 500 bp 인터제닉 유전자좌와 비교하였다. 약어: ChIP = 크로마틴 면역침전; ChIP-칩 = 크로마틴 면역침전에 이어 마이크로어레이; CUT&RUN = 표적 하에서 절단하고 뉴클레아제를 사용하여 방출한다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 샘플당 피크 점수 내의 판독 분율. 각 반복실험에 대한 FRiP 점수를 나타내는 막대 그림입니다. FRiP 점수는 피크 내의 매핑된 판독 수를 CUT&RUN 샘플에서 매핑된 판독의 총 수로 나눈 값으로 계산됩니다. 서로 다른 막대 색상은 X축을 따라 표시된 개별 생물학적 복제 샘플을 나타냅니다. 예상한 바와 같이, 양성 GFP 샘플의 FRiP 스코어는 음성 IgG 샘플에 대한 것보다 일관되게 더 높다. 모든 샘플은 Landt et al.20에 의해 설정된 권장 사항에 따라 허용 가능한 FRiP 역치 (>1 %)를 보여줍니다. 약어: FRiP = 피크 내의 판독의 분율; CUT&RUN = 표적 하에서 절단하고 뉴클레아제를 사용하여 방출한다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : 사용 된 모든 버퍼 및 솔루션에 대한 조리법. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 데이터 분석 파이프라인에 필요한 생물 정보학 도구. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3 : C. albicans 게놈에서 권장되는 차단 된 영역. 이 차단 된 유전자좌 목록은 주로 이전의 게놈 전체 결합 실험에서 역사적으로 위양성 결과를 산출 한 텔로머 반복 및 중심과 같은 매우 반복적 인 서열 요소 및 영역을 포함합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 C. albicans에서 규제 TF의 게놈 전체 현지화를위한 포괄적 인 실험 및 계산 파이프 라인을 제공합니다. 표준 미생물학 및 분자 생물학 교육을받은 모든 사람이 쉽게 접근 할 수 있도록 설계되었습니다. CUT&RUN 분석의 높은 동적 범위와 낮은 시료 입력 요구 사항을 활용하고 C. 알비칸 생물막 및 플랑크톤 배양에서 TF-DNA 결합 상호작용의 국산화를 위한 최적화를 포함함으로써, 이 프로토콜은 전통적인 ChIP-seq 접근법에 대한 강력하고 저렴한 대안을 제시합니다. ChIP-seq에 비해 CUT&RUN은 바운드 피크에 매핑된 시퀀싱 판독의 비율이 높고, 높은 처리량에 더 적합하며, 실질적으로 더 낮은 입력 셀 수를 요구하고, 독성 가교제를 사용할 필요가 없으며, 고품질 결과를 생성하기 위해 샘플당 10배 더 적은 시퀀싱 판독을 필요로 하는 상당히 높은 감도를 산출합니다13,14,17, 23,24년. 이 프로토콜의 샘플 당 비용을 더욱 줄이기 위해 버퍼 및 미디어 레시피가 상세한 시약 목록과 함께 포함되어있어 필요한 모든 버퍼 및 배지의 사내 준비뿐만 아니라 필수 시약의 대량 소싱을 용이하게합니다. C. 알비칸 생물막 형성, 표현형 스위칭, 공생은 모두 복잡한 엮인 전사 네트워크(26)에 의해 조절되기 때문에, 이 견고하고 용이하며 비용 효율적인 CUT&RUN 프로토콜은 이 중요한 인간 진균 병원체에서 이들 및 다른 많은 세포 과정을 이해하기 위한 강력한 새로운 도구를 제공한다.
TF는 히스톤 또는 다른 크로마틴 관련 단백질만큼 풍부하지 않으므로 CUT&RUN을 통해 TF-DNA 결합 상호 작용을 조사하는 데 있어 고유한 과제를 야기합니다. 이러한 과제를 해결하기 위해 표준 CUT&RUN 실험 프로토콜13에 대한 중요한 조정 및 최적화가 이루어졌습니다. TF를 표적으로 하는 대부분의 성공적인 CUT&RUN 실험은 정량화하기에는 너무 희석된 소량의 DNA를 산출하고 종종 150 bp 13,23보다 작은 단편에 대해 농축되기 때문에, 라이브러리 준비 반응 조건은 또한 이들 더 작은 단편(27)을 선호하도록 최적화되었다. 이 최적화 단계에도 불구하고, 생성된 PCR 증폭 라이브러리는 상당한 비율의 어댑터 이량체를 포함하는데, 이는 마그네틱 비드 기반 DNA 크기 선택 방법을 사용하여 완전히 제거되지 않는다. 이 문제를 해결하기 위해 어댑터 이량체가 거의 없는 최종 시퀀싱 준비 라이브러리를 생성하기 위해 PAGE 젤 크기 선택 단계가 포함되었습니다. 이는 더 작은 TF 파생 CUT&RUN 조각을 유지하면서 어댑터 이량체를 제거하는 것이 고품질 결과를 얻는 데 필수적이기 때문에 프로토콜의 중요한 단계입니다.
또한 상세한 계산 파이프라인은 시퀀싱 데이터를 필터링하여 CUT&RUN 분석에서 TF-DNA 결합 상호 작용에서 파생된 더 작은 판독에 초점을 맞춥니다. 이러한 TF 특이적 조정으로 인해, 이 프로토콜은 뉴클레오솜과 같은 대형 크로마틴 관련 복합체를 프로파일링하는 데 권장되지 않는다. 이론적으로 상용화된 라이브러리 준비 키트에 포함된 표준 라이브러리 준비 프로토콜을 따름으로써 이러한 목적을 위해 프로토콜을 조정할 수 있지만, 사용자는 계산 파이프라인에 포함된 포스트 시퀀싱 크기 선택을 조정해야 할 것이다. 특히, 코드 파일 cut_n_run_pipeline.sh의 크기-필터링 섹션에서, 사용자는 분석 파이프라인이 다른 유형의 크로마틴-DNA 결합 상호작용에 대해 생성된 시퀀싱 결과를 분석할 수 있도록 "14400"(120bp*120bp)의 현재 값을 원하는 단편 길이의 제곱으로 대체해야 할 것이다.
성공적인 CUT&RUN 실험의 또 다른 핵심 단계는 최적의 사후 시퀀싱 데이터 분석 파라미터를 선택하는 것입니다. 대부분의 전산 파이프라인은 표준화되고 C. albicans에 관심이 있는 규제 TF의 연구에 적용할 수 있도록 설계되었지만, 파이프라인을 실행하는 동안 사용자가 평가해야 하는 두 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 첫 번째 고려 사항은 바인딩된 대상 사이트를 식별하기 전에 시퀀싱 데이터에서 중복 판독을 포함할지 또는 제거할지입니다. 저풍부 TF는 일반적으로 라이브러리 증폭 단계 동안 PCR 복제에서 파생되는 판독의 상당 부분을 포함하는 시퀀싱 데이터를 산출하므로 PCR 중복을 제거하면 결과에 상당히 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 그러나, 고도로 풍부한 TF 또는 크로마틴 관련 단백질의 경우, PCR 중복은 전형적으로 총 판독 수의 더 작은 부분을 나타내며, 종종 데이터의 배경 잡음을 억제하기 위해 제거된다. 궁극적으로, PCR 중복을 유지하거나 제거하기 위한 이러한 결정은 관심 TF 및 획득된 시퀀싱 데이터의 깊이에 의존한다. 따라서 파이프라인은 PCR 중복 판독 유무에 관계없이 파생된 데이터에 대해 독립적인 출력 파일을 자동으로 생성하므로 사용자는 각 실험에 가장 적합한 결과를 산출하는 출력 파일을 결정할 수 있습니다.
두 번째 고려 사항은 실험 (관심있는 단백질에 대한 항체) 및 음성 대조군 (IgG) 샘플 모두에서 유의하지만 매우 가변적 인 농축을 산출하는 문제가있는 유전자좌를 확인하고 제거할지 여부입니다. 피크 호출 알고리즘은 MACS2를 사용하여 실험 샘플과 대조군 샘플 모두에서 상당히 풍부한 유전자좌를 식별하고 둘 다에 나타나는 유전자좌를 제외합니다. 이 접근법은 일반적으로 가장 문제가되는 유전자좌를 제거하지만, 이전 경험이 TF 농축의 진정한 양성 부위가 될 가능성이 낮다는 것을 나타 냈음에도 불구하고 일부는 때때로 특정 실험에서 중요한 피크로 나타납니다. 따라서, "차단된" 유전자좌로 지칭되는 이러한 문제가되는 유전자좌를 제거하기 위한 선택적인 필터링 단계가 제공된다. 차단된 유전자좌의 목록은 주로 이전의 게놈 전체 결합 분석에서 역사적으로 위양성 결과를 산출한 텔로미릭 반복 및 중심과 같은 매우 반복적인 서열 요소 및 영역을 포함한다. 이것은 높은 자신감으로 문제가있는 것으로 할당 된 유전자좌의 매우 보수적 인 목록입니다. 그러나 각 사용자는 이 필터가 사례별로 실험에 적합한지 여부를 평가해야 합니다. IgG 음성 대조군에 대한 잠재적인 대안은 DNA에 결합하지 않는 핵국소화된 단백질에 대해 CUT&RUN을 수행하는 것이다. 이 접근법은 ChIP 실험28에 이상적인 제어인 것으로 밝혀졌으며, 유사한 접근법이 CUT&RUN에 대해 고려할만한 가치가 있다.
CUT&RUN은 더 높은 진핵생물과 모델 효모 사카로마이세스 세레비시아에서 단백질-DNA 상호작용을 조사하는 데 널리 사용되는 선택이 되었습니다. 여기에서, 임상적으로 관련된 진균 병원체 C. 알비칸에서 게놈 전체 TF-DNA 결합 상호작용을 조사하기 위해 성공적으로 적응되었다. 이 프로토콜은 에피토프 태그가 지정된 TF를 발현하는 균주의 엔지니어링부터 결과 CUT&RUN 시퀀싱 데이터의 계산 분석에 이르기까지 필요한 모든 실험 및 계산 절차에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 전반적으로, 이 프로토콜 및 수반되는 데이터 분석 파이프라인은 저풍부 생물막 샘플로부터 분리된 세포의 복잡한 다형성 집단을 사용하는 경우에도 강력한 TF-DNA 결합 프로파일을 생성하며, ChIP-seq 방법론보다 낮은 전체 비용으로 우수한 데이터 품질을 제공한다.
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Disclosures
Clarissa J. Nobile은 생물막 감염에 대한 진단 및 치료제를 개발하는 회사인 BioSynesis, Inc.의 공동 설립자입니다.
Acknowledgments
원고에 대한 피드백에 대해 Nobile 및 Hernday 연구소의 과거와 현재의 모든 회원들에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (NIH) 국립 일반 의료 과학 연구소 (NIGMS) 상 번호 R35GM124594와 C.J.N.에 부여 된 의자의 형태로 Kamangar 가족에 의해 지원되었습니다. 이 연구는 또한 NIH 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (NIAID) 상 번호 R15AI137975 A.D.H.L.E.에 의해 지원되었.C NIH 국립 치과 및 두개골 안면 연구 연구소 (NIDCR) 펠로우십 번호 F31DE028488에 의해 지원되었습니다. 내용은 저자의 전적인 책임이며 자금 제공자의 견해를 대표하지 않습니다. 기금 제공자는 연구 설계에 아무런 역할을하지 못했습니다. 데이터의 수집, 분석 또는 해석에서; 원고의 쓰기에; 또는 결과를 게시하기로 결정했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
| 0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
| 1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
| 1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
| 12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| 2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| 5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
| Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
| Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
| Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
| Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
| Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
| Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
| curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
| DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
| DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
| E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
| ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
| End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
| FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
| FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
| Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
| Fluorescence microscope | User-dependent | ||
| Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
| GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
| GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
| GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
| HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
| High-speed centrifuge | User-dependent | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | |
| Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
| Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
| MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
| Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
| Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
| MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| NaCl | VWR | 470302-522 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
| NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
| NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
| NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
| Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
| Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
| Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
| pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
| pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
| pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
| pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
| pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
| pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
| pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
| Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
| Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
| Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
| Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
| Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
| SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
| Thermocycler | User-dependent | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
| Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
| Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
| UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
| USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
| Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
| wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| Yeast extract | Criterion | C7341 | |
| Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |
References
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