Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63690
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

Summary

נשימה ברזולוציה גבוהה המוצמדת לחיישנים פלואורסצנטיים קובעת את צריכת החמצן המיטוכונדריה ואת ייצור מיני החמצן הריאקטיבי (ROS). הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה להערכת שיעורי הנשימה המיטוכונדריאליים וייצור ROS בעצב הסיאטי החודר.

Abstract

תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בעצבים היקפיים מלווה מספר מחלות הקשורות לנוירופתיה היקפית, אשר יכולות להיות מופעלות על ידי גורמים מרובים, כולל מחלות אוטואימוניות, סוכרת, זיהומים, הפרעות תורשתיות וגידולים. הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצבים ההיקפיים של העכבר יכולה להיות מאתגרת בשל גודל המדגם הקטן, מספר מוגבל של מיטוכונדריה הנמצאת ברקמה, ונוכחותו של נדן מיאלין. הטכניקה המתוארת בעבודה זו ממזערת את האתגרים הללו על ידי שימוש בפרוטוקול חדירה ייחודי המותאם מאחד המשמש לסיבי שריר, כדי להעריך את תפקוד המיטוכונדריה העצבית הסיאטית במקום לבודד את המיטוכונדריה מהרקמה. על ידי מדידת ייצור מינים תגובתיים פלואורימטריים עם Amplex Red/Peroxidase והשוואת מצעים ומעכבים מיטוכונדריאליים שונים בעצבים מחלחלים של סאפונין, ניתן היה לזהות מצבי נשימה מיטוכונדריאליים, מיני חמצן תגובתי (ROS) ופעילות של קומפלקסים מיטוכונדריאליים בו זמנית. לכן, השיטה המוצגת כאן מציעה יתרונות בהשוואה להערכת תפקוד המיטוכונדריה על ידי טכניקות אחרות.

Introduction

המיטוכונדריה חיונית לשמירה על כדאיות התאים ומבצעת תפקודים תאיים רבים כגון חילוף חומרים של אנרגיה (גלוקוז, חומצת אמינו, שומנים ומסלולי חילוף חומרים של נוקלאוטידים). כאתר העיקרי לייצור מיני חמצן תגובתי (ROS), המיטוכונדריה היא מרכזית במספר תהליכי איתות תאיים כגון אפופטוזיס ומשתתפת בסינתזה של צבירי ברזל-גופרית (Fe-S), ייבוא והבשלה של חלבונים מיטוכונדריאליים, ושמירה על הגנום והריבוזומים שלהם 1,2,3. רשת הדינמיקה של הממברנות המיטוכונדריה נשלטת על ידי תהליכי היתוך וביקוע, ויש להם גם מכונות לבקרת איכותומיטופגיה 4,5,6.

תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור להופעתם של מספר מצבים פתולוגיים כגון סרטן, סוכרת והשמנת יתר7. הפרעות בתפקוד המיטוכונדריה מזוהות בהפרעות נוירודגנרטיביות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית, כמו במחלת אלצהיימר 8,9, מחלת פרקינסון10,11, טרשת אמיוטרופית צידית12,13, ומחלת הנטינגטון14,15 . במערכת העצבים ההיקפית, אובדן תפקוד המיטוכונדריה באקסונים נצפה בנוירופתיה חיסונית, כגון תסמונת Guillain-Barré16,17, ובשילוב עם ייצור ROS מיטוכונדריאלי גבוה באקסונים, אירועים אלה מובילים להפעלת MAP Kinase בתאי שוואן18. זה מדגים כי פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית עשויה להיות חיונית לא רק עבור תא ספציפי לאתר, אלא עבור רקמה שלמה. בפולינוירופתיה חושית דיסטלית הקשורה ל- HIV (HIV-DSP), למיטוכונדריה יש תפקיד במנגנון שבאמצעותו הגורם הטרנס-מפעיל של חלבון שעתוק (HIV-TAT) מאפשר ל- HIV להשתכפל ביעילות, כמו גם מספר תפקידים אחרים בפתוגנזה של הידבקות ב- HIV19,20.

הערכה של פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית של עצבים סיאטיים התגלתה כמטרה חיונית לחקר נוירופתיה 7,21,22. בנוירופתיה סוכרתית, ניתוחים פרוטאומיים ומטבולומיים מצביעים על כך שרוב השינויים המולקולריים בסוכרת משפיעים על זרחון חמצון מיטוכונדריאלי של עצבים סיאטיים ועל חילוף החומרים של השומנים7. נראה כי שינויים אלה הם גם סימנים מוקדמים לסוכרת הנגרמת על ידי השמנת יתר21. במודל עכברי של נוירופתיה כואבת הנגרמת על ידי כימותרפיה, פגיעה מיטוכונדריאלית בעצב הסיאטי מזוהה כירידה בזרחון החמצוני22, והפחתה של פעילויות קומפלקסים מיטוכונדריאליים, פוטנציאל ממברנה ותכולת ATP23. עם זאת, למרות שכמה קבוצות ציינו תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בנוירופתיה, מחקרים אלה מוגבלים למדידות של פעילות בקומפלקסים מיטוכונדריאליים ללא שימור של הממברנות המיטוכונדריה, ללא הערכה של שלמות המיטוכונדריה או מדידות של תוכן ATP כפרמטר לייצור ATP מיטוכונדריאלי. באופן כללי, הערכה נכונה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי וייצור ROS דורשת בידוד של מיטוכונדריה על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית בשיפוע פרקול/סוכרוז. בידוד המיטוכונדריה יכול גם להיות גורם מגביל לרקמת עצב סיאטית בגלל הכמות הגדולה של הרקמה הדרושה ואובדן מיטוכונדריה והפרעה.

המחקר הנוכחי נועד לספק פרוטוקול למדידת הפיזיולוגיה המיטוכונדרית כצריכה חמצן מיטוכונדריאלית וייצור ROS בעצב הסיאטי, תוך שמירה על ממברנות מיטוכונדריאליות וללא צורך בבידוד המיטוכונדריה. פרוטוקול זה מותאם ממדידות צריכת חמצן בסיבי שריר חודרניים24 על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה (HRR). היתרונות של הליך זה הם האפשרות להעריך את המיטוכונדריה בכמויות קטנות של רקמות כגון העצב הסיאטי ולהעריך פרמטרים מיטוכונדריאליים באתרם, ובכך לשמר את הסביבה המיטוכונדרית, המבנה והפרופיל הביו-אנרגטי, כדי להשיג תוצאה אמינה מבחינה פיזיולוגית. מצבי הנשימה המיטוכונדריים נקבעו עם מצעים ומעכבים לאחר חדירת עצבים סיאטיים כדי להעריך כראוי ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית ומקדם ציטוכרום c לשלמות הממברנה המיטוכונדרית, וסיפקו מדריך לצעדים של הערכת מערכת הובלת האלקטרונים המיטוכונדרית (ETS) וחישוב פרמטרים חיוניים. מחקר זה יכול לספק כלים למענה על שאלות במנגנונים פתופיזיולוגיים שבהם מעורב חילוף החומרים העצבי הסיאטי, כגון נוירופתיות היקפיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי אושר על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים במחקר, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) והנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות ניסוי ושימוש בהן. העצב הסיאטי מבודד מעכברי C57BL/6 זכרים בני ארבעה חודשים, המתים על ידי נקע צוואר הרחם בהתאם להנחיות המוסדיות. שלבי הפרוטוקול ממוטבים כדי למנוע הידרדרות מיטוכונדריאלית. לכן, בפרוטוקול זה, כיול של חיישני חמצן פולארוגרפיים בוצע לפני כריתה וחדירה של רקמת עצבים סיאטית של עכבר.

1. הכנת ריאגנטים

  1. הכן את מאגר שימור הרקמות (חיץ TP).
    1. הכן את הריאגנטים הבאים בתמיסת מים אולטרה-אפורה: 10 mM של חיץ Ca-EGTA עם 0.1 μM של סידן חופשי, 20 mM של אימידזול, 20 mM של טאורין, 50 mM של K-MES, 0.5 mM של DTT, 6.56 mM של MgCl2, 5.77 mM של ATP, 15 mM של phosphocreatine (ראה טבלת חומרים), pH 7.1. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  2. הכן את מאגר הנשימה של המיטוכונדריה (MR Buffer).
    1. הכן את הריאגנטים הבאים בתמיסת מים אולטרה-אפורה: 0.5 mM של K2EGTA, 3 mM של MgCl2, 60 mM של MES, 20 mM של טאורין, 10 mM של KH2PO4, 20 mM של HEPES, 110 mM של D-סוכרוז, 1 מ"ג / מ"ל של BSA (ללא חומצות שומן) (ראה טבלת חומרים), pH 7.4. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  3. הכינו את תמיסת מלאי הספונין על ידי המסת 5 מ"ג של ספונין (ראו טבלת חומרים) ב-1 מ"ל של מאגר TP (שלב 1.1) ושמרו אותו על קרח. ספונין מוכן טרי.
  4. הכן את Amplex Red על ידי שימוש חוזר באבקה (ראה טבלת חומרים) עם DMSO כדי להשיג ריכוז מלאי של 2 mM ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בבקבוקון המוגן מפני אור.
    הערה: כדי להימנע מלשחוק את הגשושית על ידי הקפאה והפשרה, הכינו עליפוטים קטנים לאחסון לא יותר מ-6 חודשיםו-25 חודשים.

2. כיול חיישני חמצן פולארוגרפיים לנשימה ברזולוציה גבוהה (HRR)

  1. נקו את תאי ה-HRR של המכשיר והמזרקים (ראו טבלת חומרים).
    1. פתחו תאי HRR, התמלאו במים מזוקקים עד למעלה וערבבו במשך 5 דקות 3x. חוזרים על הפעולה עם אתנול ואז שוב עם מים. יש לשטוף פקקים ומזרקים במים/אתנול/מים פי 3 כל אחד.
  2. החל את הגדרות הכיול הבאות בתוכנת HRR (ראה טבלת חומרים).
    1. בבקרת תוכנת HRR, הוסף את הטמפרטורה הניסיונית (37 °C), את הפרמטרים עבור חיישן חמצן (רווח, 2; מתח קיטוב, 800 mV), ועבור חיישן אמפרומטרי (רווח, 1000; מתח קיטוב, 100 mV).
  3. כייל את חיישני החמצן.
    1. פיפטה 2.1 מ"ל של MR Buffer (שלב 1.2) לתוך כל תא. סגור עם הפקקים ושאב אוויר לתוך החדר עד שנוצרת בועה. מערבבים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת במצב כיול עד ששטף החמצן למסה יציב.
    2. בצע כיול אוויר של חיישני החמצן הפולבוגרפיים בתוכנה על פי פרוטוקול היצרן24.
      הערה: שלב הכיול מבוצע רק פעם אחת לפני ניסוי. ניסויים נוספים באותו אמצעי נשימה וטמפרטורה יכולים להתבצע לאחר שטיפת תאים בלבד (שלב 2.1).

3. כריתה וחדירה של העצב הסיאטי

  1. הסר את העצב הסיאטי בעקבות השלבים הבאים.
    1. להרדים את החיה על ידי נקע צוואר הרחם לאחר הוצאתה מהכלוב שלה וריסון בעדינות למנוחה על הספסל.
    2. בחיה המתת חסדת, לבצע חתך עם מספריים בגב התחתון, להתחיל ליד עמוד השדרה ולהמשיך במורד הירך לכיוון כף הרגל. הסר את העור והשריר המחוברים לעצב, ולאחר מכן חתך והסר את כל העצב הסיאטי.
    3. שקלו את הרקמה באופן מיידי והניחו אותה בבקבוקון מלא ב-TB Buffer קר (4 מעלות צלזיוס). בצע שלבים 3.2-3.3 על קרח.
      הערה: משקל הרקמה הרטובה משמש לנרמול צריכת החמצן וזרימת ייצור ה- ROS בשלבים הבאים. אם לא ניתן לשקול את הרקמה באופן מיידי, שמרו אותה ב-TB Buffer קר. ההליך מבוצע ברקמה טרייה ואין להקפיא אותו כדי למנוע נזק מיטוכונדריאלי.
  2. להכנת הרקמה, מניחים את העצב הסיאטי בצלחת פטרי עם מספיק TP Buffer כדי לכסות אותו. החזק קצה אחד של העצב עם מלקחיים, ועם זוג מלקחיים נוסף, שלף את צרורות העצבים אופקית.
    הערה: הליך זה צריך להיעשות תוך פחות מ -10 דקות כדי למנוע הידרדרות רקמות. הרקמה תהיה מוכנה כאשר ניתן יהיה לדמיין אותה כשכבות ערפיליות שקופות, מול הרקמה הלבנה האטומה הקודמת (איור 1).
  3. ראשית, העבירו את הרקמה המשוחקת לתוך צלחת קטנה המכילה 1 מ"ל של TP Buffer לצורך חדירת רקמות. כדי להתחיל permeabilization, להעביר את הרקמה עם מלקחיים לצלחת המכילה 1 מ"ל של TP Buffer ו 10 μL של saponin (מתוך תמיסת מלאי, שלב 1.3).
    1. יש לנער בעדינות שייקר של מיקרו-פלטה למשך 30 דקות, ואז מעבירים את הרקמה עם המלקחיים למנה טרייה המכילה MR Buffer (1 מ"ל) ומנערים בעדינות במשך 10 דקות. העבר את הרקמה עם מלקחיים לתא HRR מכויל.

4. צריכת חמצן וקביעת ייצור ROS

  1. מלאו את תאי ה-HRR ב-2.1 מ"ל של MR Buffer, הוסיפו את Amplex Red (שלב 1.4) לריכוז סופי של 5 μM ופרוקסידאז ל-2 U/mL, והוסיפו את העצב הסיאטי החודר (שלב 3).
    1. חברו את חיישני הפלואורסצנציה של המכשיר, כבו את האורות בחלק הבקרה של התוכנה ולחצו על Connect to oxygraph. ב"פרוטוקולי עריכה" בתוכנה, הכנס את משקל הרקמה שנמדד בשלב 3.1.3.
  2. עבור אל "פריסה", בחר באפשרות "שטף ספציפי ליחידת דגימה", ובחר Plots כדי לגשת בו זמנית לקריאת צריכת החמצן, ואם תרצה, את ייצור H2O2 . המתן ~ 10 דקות.
    הערה: זמן זה נדרש כדי לייצב את הזרימה הבסיסית של צריכת החמצן ללא תוספת מצע (בסיסית). לפני זריקות נוספות, ודא שזרימת החמצן מתייצבת.
  3. הזריקו שני פולסים של H2O2, כל אחד מהם לריכוז סופי של 260 מיקרומטר, לכיול מאוחר יותר בתא.
  4. הזריקו 20 μL של סוקסינט (ראו טבלת חומרים), מצע קומפלקס מיטוכונדריאלי II, כדי להפעיל את מערכת הובלת האלקטרונים המיטוכונדרית.
    הערה: ניתן להוסיף מצעים מיטוכונדריאליים שונים בנקודה זו כדי להעריך את תפקוד המיטוכונדריה על ידי קומפלקסים שונים. תוצאות מייצגות עם מצעים משתנים עבור קומפלקסים מיטוכונדריאליים I ו-II מוצגות באיור 2 ובאיור 3. בשלב זה, עלייה בצריכת O2 ובייצור H2O2 , בו זמנית, נצפית באיור 3.
  5. הוסף 20 μL של אדנוזין דיפוספט (ADP) כדי להפעיל סינתזת אדנוזין טריפוספט (ATP).
    הערה: ADP מגרה סינתזת ATP ומפחית את פוטנציאל הממברנה. עלייה בצריכת O2 וירידה בייצור של H2O2 צפויים להיות נצפים26,27.
  6. ברצף, הוסף 5 μL של ציטוכרום c (ראה טבלת חומרים) כאינדיקטור לשלמות הממברנה.
    הערה: אם הרקמה מוכנה היטב וחודרת, ציטוכרום c לא אמור להגדיל את צריכת החמצן ביותר מ -15%. אם היא מתרחשת, עיין בסעיף פתרון בעיות לקבלת המלצות.
  7. טיטרט עם אליקוטים של 0.2 מיקרוגרם/מ"ל של אוליגומיצין (ראו טבלת חומרים) עד שלא נצפתה ירידה נוספת בצריכת O2 .
    הערה: אוליגומיצין פועל על ידי עיכוב סינתזת ATP המובילה לירידה בזרימת O2 ולשיפור בהיווצרות H2O2 המועדף על ידי פוטנציאל הממברנה הגבוה26,27.
  8. טיטרט עם אליקוטים של 0.5 מיקרומול/ליטר של קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומתוקסי)פניל-הידרזון (FCCP) (ראה טבלת חומרים), הלא-קופלר המיטוכונדרי, עד שלא ניתן להבחין בעלייה נוספת בצריכת O2 . כדי לסיים את הניסוי, הזריקו 2 μl של אנטימיצין A לריכוז סופי של 5 μM והמתינו לייצוב זרימה.
    הערה: נצפתה ירידה בייצור H2O2 עקב פיזור פוטנציאל הממברנה לאחר הזרקת FCCP. אנטימיצין A מעכב את קומפלקס III, ובכך מונע את זרימת האלקטרונים. לכן, צריכת O2 התלויה במיטוכונדריה נפגעת, מפחיתה את שטף החמצן למסה ומעוררת דליפת אלקטרונים, מה שמגדיל את ייצור H2O2 26,27.
  9. עבור אל סרגל הפקודות, חפש "רב-חושי" בתוכנה, לחץ על שליטה > שמור קובץ והתנתק.
    הערה: תוספת של מצעים ומעכבים אחרים יכולה להתבצע על פי השאלה הנחקרת. דוגמה מתוארת בתוצאות הייצוגיות. כיול H2O2 מבוצע לאחר סיום הניסוי, על פי פרוטוקול היצרן28.
  10. פתח את הקובץ שנשמר ובחר את המעקב "שטף חמצן למסה" כדי לקבל את תוצאות צריכת החמצן הניסיונית. בחר ידנית את החלון בין הזרקות על-ידי לחיצה על לחצן Shift + Left mouse.
    1. עבור אל Marks > סטטיסטיקה כדי לדמיין את התוצאות עבור כל זריקה של מצע / מעכבים / פרוטוקול לא משותף. עבור ייצור H2O2 , בצע את אותו הליך עם עקבות "Amp-Slope".
      הערה: בעת בחירת החלון, הימנע מממצאים של זריקות נפח על-ידי בחירת חלון שבו חמצן (או H2O2) יציב וקבוע יותר. דוגמאות לחלונות שנבחרו מיוצגות על-ידי סוגריים מסולסלים שחורים בתוצאות המייצגות (איור 2 ואיור 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

צריכת החמצן המיטוכונדריאלית על ידי העצב הסיאטי המחלחל מיוצגת באיור 2. העקבה האדומה מייצגת את שטף O2 ליחידת מסה ב-pmol/s.mg. לאחר רישום צריכת חמצן בסיסית עם מצעים אנדוגניים (נשימה שגרתית), מוזרק סוקינט (SUCC) לנשימה מונעת קומפלקס II (סוקסינט דהידרוגנאז), וכתוצאה מכך לעלייה בקצב צריכת החמצן. ברצף, מתווסף ריכוז רווי של ADP, המפעיל ATP סינתאז ומניע זרחון חמצוני. התוצאה היא מצב פוספורילטיבי של נשימה מיטוכונדריאלית. נשימת מצב זרחני פירושה ש-ATP synthase יכול לייצר ATP מ-ADP + Pi (פוספט אנאורגני) באמצעות פוטנציאל הממברנה שנוצר על ידי גרדיאנט הפרוטונים ככוח מניע פרוטון ליצירת ATP26. עם הירידה בפוטנציאל הממברנה המקודמת על ידי פעילות ATP סינתאז, צריכת החמצן מואצת, ונצפתה עלייה בזרימת החמצן. התוספת של ציטוכרום c אקסוגני (CYTC) קידמה רק גירוי מינימלי של נשימה, ואישרה את שלמות הממברנה החיצונית המיטוכונדרית להכנה זו. חדירה של רקמות עלולה לפגוע בשלמות הממברנה ובאובדן ציטוכרום c. שיעורי נשימה מוגברים של יותר מ -10%-15% מצביעים על מיטוכונדריה פגומה והכנת רקמות לקויה28,29. בתוצאה מייצגת זו, יש עלייה של 8.7% בנשימה, מה שמעיד על איכות טובה של הכנת הרקמה (טבלה 1). את הטיטרציה עם אוליגומיצין (OLIGO) צריך לעשות עם מינונים מינימליים כדי למנוע הגעה לריכוז של OLIGO שיכול להפריע בהערכת יכולת מקסימלית30. עיכוב של ATP סינתאז על ידי OLIGO - או מצב 4 נשימה על ידי אוליגומיצין26 - הביא לירידה בזרימת צריכת החמצן. טיטרציה עם FCCP, ריאגנט מיטוכונדריאלי ללא קירור, מפזרת את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדרית, מגרה את שטף הנשימה ומציגה את היכולת המקסימלית להעברת אלקטרונים (קיבולת מקסימלית של ETS). בסוף הניסוי מוזרק אנטימיצין A (AA), מעכב של קומפלקס III, כדי לעכב את הנשימה המיטוכונדרית ולתעד צריכת חמצן לא מיטוכונדריאלית (נשימה שיורית) (איור 2). זרמי החמצן המוחלטים שנרשמו בניסוי מייצג זה מחושבים בטבלה 1.

האפשרות לנתח צריכת חמצן מיטוכונדריאלית בו זמנית עם ייצור חמצן תגובתי (ROS) - שנקבעה על ידי גילוי מי חמצן (H2O2) על ידי Amplex Red עם חיישנים פלואורסצנטיים - היא יתרון גדול לקביעת פרופיל ביו-אנרגטי וכלי סטנדרטי לזיהוי תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בפתולוגיות מגוונות. הוספת מצעים שונים עבור קומפלקסים שונים כדי לתדלק ETS מיטוכונדריאלי יכולה גם להניב מידע נוסף על האתרים הספציפיים לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה. איור 3 מוצג עם מדידה סימולטנית של צריכת חמצן (איור 3A) וייצור ROS (איור 3B) בנוכחות מצעים שונים המספקים דלק ל-ETS. לאחר רישום הנשימה הבסיסית, פירובט + מלאט (PM) מתווסף לתא כמצע לקומפלקס המיטוכונדריה I, מה שמגדיל את שטף צריכת החמצן. התוספת של SUCC, המצע של קומפלקס II, מגבירה גם היא את הנשימה, אך תוספת נוספת של פלמיטואיל-קרניטין (PC) אינה מגבירה את זרימת החמצן בהשוואה לתוספות המצע המוקדמות יותר, מה שמרמז על כך שייתכן ש- PM ו- SUCC כבר רוויים את אתר יוביקינון המיטוכונדרי או חוסר בחמצון חומצות שומן. כצפוי, ייצור ה-ROS גדל גם לאחר הוספת מצעים, המייצגים דליפת חמצן שבורחת מ-ETS ויוצרת ROS (איור 3B, עקבות ירוקים). התוספת של ADP בריכוז הרוויה מגדילה את צריכת החמצן, מניעה את היווצרות ה-ATP (עקבות אדומים באיור 3A) ומפחיתה את ייצור ה-ROS (איור 3B, עקבות ירוקים). התוספת של CYTC רק מגבירה את זרימת החמצן ב -6.8%, ומאשרת את שלמות הממברנה המיטוכונדרית. טיטרציה עם OLIGO מפחיתה את זרימת צריכת החמצן (עקבות אדומים באיור 3A) ומגבירה את ייצור ה-ROS (עקבות ירוקים באיור 3B). השפעות ADP ו- OLIGO מצביעות על כך שעצב sciatic חדיר בפרוטוקול זה יכול לשכפל את הקשר הסטנדרטי בפיזיולוגיה המיטוכונדרית, שבה עלייה בצריכת החמצן מובילה לירידה בפוטנציאל הממברנה ומונעת ייצור ROS31,32.

התוספת של FCCP, כצפוי עבור uncoupler, מגדילה את צריכת החמצן לקצב המקסימלי שלה, וכתוצאה מפיזור פוטנציאל הממברנה, ייצור ROS יורד. התוספת של רוטנון, מעכב של קומפלקס I ו-AA, מפחיתה את צריכת החמצן ומגבירה את היווצרות ה-ROS (איור 3A,B), מה שמאשר כי פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית ופרופיל ביו-אנרגטי בעצב הסיאטי החודר נשמרים. ערכים מוחלטים עבור זרימות חמצן שנרשמו בניסוי זה מחושבים בטבלה 2.

Figure 1
איור 1: הכנה עצבית סיאטית לחדירה של המיטוכונדריה. כל ההליכים צריכים להתבצע על הקרח. (A) העצב הסיאטי מופק מעכבר מורדם ומונח בצלחת פטרי המכילה חיץ שימור רקמות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס( B) הפרדת צרורות עצבים סיאטיים עם מלקחיים. (ג,ד) הרקמה מוכנה כאשר היא נחתכת לתוך ניבים שקופים, ולא למבנה הצינורי הלבן האטום המקורי (A). סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תוצאה מייצגת של צריכת חמצן מיטוכונדריאלית בעצב הסיאטי המחלחל של העכבר. הניסוי הוא עקבות מייצגים של תמצית עצב סיאטית אחת מעכבר שהורדם. העצב הסיאטי היה מחלחל לפני כן, כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול. הזרקות מסומנות כחצים בזמנים מסוימים. SUCC: סוקסינט; ADP: אדנוזין דיפוספט; Cyt c: ציטוכרום c; אוליגו: אוליגומיצין; FCCP: קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומתוקסי)פניל הידרזון; AA: אנטימיצין A. ריכוז חמצן בזמן אמת כמו [nmol/mL] (עקבות כחולים) וקצב צריכת חמצן כשטף ליחידת מסה [pmol/(s.mg)] (עקבות אדומים) מוצגים. הפלטה השחורה מייצגת חלונות של קצבי צריכת חמצן שנבחרו לתוצאות לאחר כל זריקה. בזלת מתייחסת לנשימה ללא מצעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: התוצאה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלית מצומדת לייצור ROS בעצב הסיאטי של העכבר החודר. עקבות מייצגים של תמצית עצבים סיאטית אחת מעכבר מורדם מוצגים. העצב הסיאטי היה מחלחל לפני כן, כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול. הזרקות מסומנות כחצים בזמנים מסוימים. H2O2: מי חמצן; PM: פירובט/מלאט; SUCC: סוקסינט; PC: פלמיטואיל-קרניטין; ADP: אדנוזין דיפוספט; Cyt c: ציטוכרום c; אוליגו: אוליגומיצין; FCCP: קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומתוקסי)פניל הידרזון; ROT: רוטנון; AA: אנטימיצין A. (A) ריכוז חמצן בזמן אמת כמו [nmol/mL] (עקבות כחולים) וקצב צריכת חמצן כמו שטף ליחידת מסה [O2 pmol/(s.mg)] (עקבות אדומים) מוצגים. (B) ייצור ROS מודגם כ-H2O2 פלואורסצנציה (עקבות סגולים) ו-H2O2 שיפוע ייצור [pmol/(s.mg)] (עקבות ירוקים), לאחר הכיול. הפלטה השחורה מייצגת חלונות של קצבי צריכת חמצן שנבחרו לתוצאות לאחר כל זריקה. בזלת מתייחסת לנשימה ללא מצעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מצעים תוספות קצב צריכת חמצן
שטף למסה (pmol/[s.mg])
בזאלי (ללא תוספת) ללא 5.9
סוקסינט (SUCC) תוספת אחת של 10 mM 16.9
ADP תוספת אחת של 1 μM 28.5
ציטוכרום c (CYTC) תוספת אחת של 10 מיקרומטר 31
אוליגומיצין A (OLIGO) טיטרציה עם תוספות של 0.2 מיקרוגרם/מ"ל 21.9
FCCP טיטרציה עם תוספות של 0.5 מיקרומטר 31.1
אנטימיצין A (AA) תוספת אחת של 5 מיקרומטר 11.3

טבלה 1: פרוטוקול מצעים/Uncoupler/מעכבים/טיטרציה (SUIT) ותוצאות של שיעורי צריכת חמצן בעצב סיאטי מחלחל לעכבר. צריכת חמצן מיוצגת ב-[O2pmol/(s.mg)], לאחר כל תוספת של פרוטוקול SUIT. התוצאות מתקבלות על ידי ממוצע החלונות שנבחרו המסומנים באיור 2.

מצעים תוספות צריכת חמצן (O2 pmol/[s.mg]) ייצור ROS (H2O2 pmol/[s.mg])
בזאלי (ללא תוספת) ללא 5.77 0.53
פירובט + מלאט (PM) פולס אחד של 5 mM + 2.5 mM 7.17 0.58
סוקסינט (SUCC) תוספת אחת של 10 mM 14.06 0.75
פלמיטואיל קרניטין (PC) שני פולסים של 25 מיקרומטר 14.68 0.79
ADP תוספת אחת של 1 μM 22.9 0.25
ציטוכרום c (CYTC) תוספת אחת של 10 מיקרומטר 24.36 0.09
אוליגומיצין A (OLIGO) טיטרציה עם תוספות של 0.2 מיקרוגרם/מ"ל 17.03 0.5
FCCP טיטרציה עם תוספות של 0.5 מיקרומטר 23.98 0.16
רוטנונה (ROT) תוספת אחת של 1μM 19.75 0.48
אנטימיצין A (AA) תוספת אחת של 5 מיקרומטר 4.08 0.53

טבלה 2: פרוטוקול מצעים/Uncoupler/מעכבים/טיטרציה (SUIT) ותוצאות ייצור ROS המצומדות לשיעורי צריכת החמצן של העצב הסיאטי המחלחל של העכבר. צריכת חמצן מיוצגת ב[O2 pmol/(s.mg)] ובייצור ROS על ידי [H2O2 pmol/(s.mg)] לאחר כל הוספה של פרוטוקול SUIT. התוצאות מתקבלות על-ידי ממוצע החלונות שנבחרו המסומנים באיור 3.

פרמטרים עבור פונקציה מיטוכונדריאלית חישובים משיעורי צריכת חמצן
נשימה בזלתית נשימה בסיסית (שטף ללא תוספת של מצעים)28
צריכת חמצן שיורית (ROX) [שטף לאחר הוספת AA] 28
נשימה מורכבת אני דולף [שטף לאחר הוספת PM] – [ROX]28,37
נשימת דליפה מורכבת II [שטף לאחר הוספת SUCC] – [ROX]28,37
מצב פוספורילטיבי ( יכולת אוקספוס) [שטף לאחר הוספת ADP] – [ROX]28,43
לא - מצב פוספורילטיבי (נשימת דליפה) [שטף לאחר הוספת אוליגומיצין] – [ROX]28
יחס בקרה נשימתית [מצב פוספורילטיבי / לא -פוספורילטיבי] 28,43
קיבולת ETS [שטף לאחר הוספת FCCP] – [ROX]28,37

טבלה 3: חישוב פרמטרים להערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי המחלחל של העכבר. פרמטרים לנוסחת הערכה של פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית לפי שיעורי צריכת חמצן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מספר מחלות או מצבים המלווים נוירופתיות סובלים מתפקוד לקוי של המיטוכונדריה כגורם סיכון. ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה בעצבים היקפיים חיונית כדי להבהיר כיצד המיטוכונדריה פועלת במצבים נוירודגנרטיביים אלה. ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה היא מייגעת בשל הקושי של שיטת הבידוד והמחסור בחומר. לפיכך, התפתחות של טכניקות חדירת רקמות שאינן דורשות בידוד של מיטוכונדריה היא חיונית.

כדי להעריך את תפקוד המיטוכונדריה ברקמות מחלחלות, בחירת כימיקל שיכול לחלחל לקרום הפלזמה של התא מבלי להפריע לנשימה של התא היא קריטית. בעצבים היקפיים כגון העצב הסיאטי, הרכב המיאלין הוא כ -70% שומנים, רובם כולסטרול33,34. הבחירה בחומרים מחלחלים כגון סאפונין ודיג'יטונין המקיימים אינטראקציה עם מולקולות כולסטרול גורמת לנקבוביות המאפשרות למצע גישה למכונות מיטוכונדריאליות מבלי להפריע לתאים תאיים אחרים35,36. בפרוטוקול זה, השיטה המבוססת היטב עבור חדירת סיבי שריר על ידי saponin המתוארת על ידי Pesta ו Gnaiger24 מותאם עבור העצבים sciatic. הליך החדירה כולל שלב קריטי נוסף בנוגע להפרדת רקמות כדי לאפשר גישה למצעים כנדרש לרישום פרמטרים מיטוכונדריאליים בעלי עניין. העבודה הנוכחית מתארת את השלבים, והאיורים ניתנים להפרדת רקמות משביעת רצון באיור 1.

רישומי קצבי הנשימה המיטוכונדריה חיוניים כדי לקבוע הבדלים בנוגע לתקלה בקומפלקסים של המיטוכונדריה, הפרעה לזרחון חמצוני או שיבוש המיטוכונדריה. מצבים נשימתיים ופרמטרים מיטוכונדריאליים מוגדרים על ידי צ'אנס וויליאמס26. במאמר זה, הנשימה השגרתית מוגדרת כנשימה בסיסית כאשר צריכת חמצן מיטוכונדריאלית נרשמת ללא תוספת של מצעים אקסוגניים; קיבולת קומפלקסים - כאשר מצעים עבור I או II מורכבים מתווספים לצריכת חמצן מיטוכונדריאלית של דלק, הנקראים גם כנשימת דליפה; מצב זרחני - כאשר ADP מתווסף ברצף של מצעים מורכבים ומניע סינתזת ATP; מצב לא פוספורילטיבי - כאשר כל ADP נוצר לתוך ATP או עם תוספת של מעכב ATP synthase, oligomycin (או מצב 4); קיבולת מקסימלית של ETS - כאשר מוסיפים את ה- FCCP הלא-מיטוכונדריאלי ו; צריכת חמצן שיורית (ROX) לאחר תוספת של רוטנון ואנטימיצין A - כאשר צריכת החמצן אינה קשורה למיטוכונדריה. הטכניקה המתוארת בעבודה זו להערכת תפקוד המיטוכונדריה ברקמת עצב סיאטית על ידי HRR מאפשרת קביעת מצבים נשימתיים רבים וחישוב תפקוד מיטוכונדריאלי פנימי בתוך אותה מדגם. ניתן להשתמש בתוצאות בדיקה של פרוטוקול מצע/לא מעכבים/מעכבים כדי לגזור פרמטרים של תפקוד המיטוכונדריה שמהם ניתן לחשב יחסי/גורמים לבקרה נשימתית37, כפי שמודגם בטבלה 3. הערכה של פרמטרים אלה משלבת שיעורי דליפה מוחלטים, יחד עם נשימה מיטוכונדריאלית מקסימלית, ומעלה נתונים עבור ערך אבחון 24,35,36,37,38,39.

למרות תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בעצבים היקפיים מצוטט בספרות, ישנן מגבלות בהדגמת פרמטרים אלה. במודל נוירופתיה המושרה על ידי כימותרפיה, נצפתה ירידה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדרית בטיפול בחומר הכימותרפי, אוקסליפלטין, והפחתת הפעילות החוץ גופית של קומפלקסים I, II ו- III באקסונים חושיים של העצב ההיקפי (עצב ספנוס)40,41. עם זאת, קיים מחסור במידע על הבקרה המופעלת על ידי פוטנציאל הממברנה על פעילות הקומפלקסים והיווצרות ATP על ידי זרחון חמצוני, פרמטר חיוני בהערכת תפקוד המיטוכונדריה. כמו כן, בעצבים סיאטיים מנותקים מחולדות ספראג-דאולי המחלחלות עם דיגיטונין, הרישום של צריכת החמצן מודגם רק עבור המצב הזרחוני, אך אינו מושווה לצריכת חמצן בנוכחות מעכב ATPase או uncoupler22. בשיטה הנוכחית, ניתן לחשב את יחס הבקרה הנשימתית בעצב החודר (טבלה 3) בהשוואה ליחס הבקרה הנשימתית של מיטוכונדריה מבודדת, המחושבת בדרך כלל ממצב 3/state4 (או מצבים זרחניים/לא זרחניים). עם השיטה המסופקת בעבודה זו, ניתן להעריך יכולות מורכבות I, II - שמירה על שלמות הממברנה המיטוכונדרית - ויחסי בקרת שטף, ולהשיג נשימה קיבולת מקסימלית וצריכת חמצן שיורית.

שיטות שונות לחדירת עצבים סיאטיים להערכת צריכת חמצן מיטוכונדריאלי מתוארות בספרות. טכניקה לחדירת עצבים סיאטיים מודגמת בפרוטוקול עם טיפול בספונין וחדירה על ידי דופק מערבולת; עם זאת, רק מצב פוספורילטיבי ויכולת מקסימלית הודגמו41. בנוסף, בהשוואת הערכים המוצגים כאן עבור אותם פרמטרים, שטף החמצן שנצפה על ידי Cooper et al.41 נמוך ב -70%, ומדגים כי יש נזק לממברנה המיטוכונדרית הקשורה לשיטת התסיסה. בפרוטוקול הנוכחי, הפרדת הרקמה שומרת על שלמות הממברנה המיטוכונדרית, שאושרה על ידי העלייה הקטנה בשטף החמצן לאחר הוספת ציטוכרום c. זוהי תכונה המאפשרת לרשום את כל הפרמטרים המיטוכונדריים, ומספקת תיעוד מלא של זרחון ותפקוד חמצוני מיטוכונדריאלי. אף על פי שבשיטת חדירה עצבית סיאטית עם קולגן, ערכי שטף החמצן דומים לאלה המוצגים כאן, נצפתה עלייה של כמעט 20% לאחר הוספת ציטוכרום c, מה שמרמז על רמה מסוימת של נזק לממברנה המיטוכונדרית21. עם הפרוטוקול המתואר במאמר זה, נצפתה עלייה של 6.3%-8.7% בלבד של שטף החמצן לאחר הוספת ציטוכרום c, המאשרת את היתרון של השיטה הנוכחית בשמירה על שלמות הממברנה המיטוכונדרית ובאופטימיזציה של רישום צריכת החמצן.

מיטוכונדריה היא האתר העיקרי ליצירת מיני חמצן תגובתי (ROS) הקשורים לתהליכי איתות מגוונים ברקמת עצב סיאטית ומנגנונים הקשורים לפתופיזיולוגיה בנוירופתיה42,43. פרוטוקול זה איפשר לגשת לייצור מי חמצן באמצעות חיישן פלואורסצנטי בו זמנית עם צריכת חמצן. כפי שנצפה באיור 3, ייצור ROS רגיש לשינויים במצבי נשימה מיטוכונדריאליים, המאשר את מצב השלמות המיטוכונדרית ומייעל את רישום התפקוד המיטוכונדריאלי.

שיטות אחרות כגון מנתח שטף חוץ-תאי (EFA), המבוסס על חיישנים פלואורסצנטיים לתיעוד צריכת חמצן, יכולות להעריך את תפקוד המיטוכונדריה של העצב ההיקפי בתאים בתרבית - כגון תאי שוואן או אקסונים - במכשיר סינון אוטומטי בעל תפוקה גבוהה. עם זאת, ישנם כמה יתרונות בשימוש בחיישנים פולארוגרפיים כגון HRR, כולל במיוחד היכולת לעקוב אחר הניסוי בזמן אמת, כדי לבצע זריקות מרובות של מצעים / מעכבים; לפיכך, הדבר מאפשר הערכה של מספר רב יותר של פונקציות מורכבות במיטוכונדריה בניסוי אחד, והעלות הנמוכה יותר של חומרים מתכלים 24,35,38,39. חיסרון בשימוש ב- HRR בהשוואה ל- EFA הוא היעדר חיישן להחמצת מדיה (לניתוח שטף גליקוליטי) ויכולת זרימת העבודה המוגבלת, המאפשרת שימוש בשתי דגימות בלבד בכל פעם.

המגבלות של טכניקות חדירת רקמות הנדרשות עבור HRR ידועות היטב. הם כוללים את חוסר היכולת להעריך מיטוכונדריה כאשר ADP מגבילה ושיעור נשימה לא מתואם מופחת בהשוואה למיטוכונדריה מבודדת. עם זאת, פרוטוקול חדירת העצב הספונין-sciatic המתואר כאן - כהתאמת פרוטוקול חדירת סיבי השריר על ידי Pesta ו- Gnaiger24 - מאפשר הערכה של מצבי נשימה מיטוכונדריאליים ופרמטרים מיטוכונדריאליים ללא פגיעה בשלמות המיטוכונדריה. זה גם מאפשר הקלטה בו זמנית של צריכת חמצן וייצור ROS בעצב הסיאטי, רקמה עם מגבלות ידועות לשמצה לבידוד המיטוכונדריה. לפיכך, פרוטוקול זה מאפשר הערכה טובה יותר של תפקוד המיטוכונדריה בעצבים היקפיים ויכול לספק יתרונות לחוקרים בחקירת תפקידים מיטוכונדריאליים במצבים פתופיזיולוגיים הפוגעים בעצבים היקפיים.

פתרון בעיות
אם יש עלייה בצריכת O2 לאחר הוספת ציטוכרום c ליותר מ -15% משטף צריכת החמצן, זה מצביע על כך שהליך החדירה היה חזק מאוד וגרם נזק למבנה המיטוכונדריה. אם זה המקרה, השליכו והזינו מחדש את הנתיחה עם הפרדת עצבים עדינה יותר וחזור על השלבים. אם חלק מהריאגנטים המוזרקים אינם מדגימים את ההשפעה הצפויה בצריכת חמצן מיטוכונדריה או בייצור H2O2 , זה כנראה בגלל זיהום תאי עם מעכבי מיטוכונדריאליים. במקרה זה, ניתן לנקוט שתי פעולות: (1) להפעיל מחדש את הניסוי לאחר שטיפת התאים והמזרקים (שלב 2.1) או (2) להוסיף דגימה של כל מיטוכונדריה מבודדת רקמה או הומוגנט לפני ביצוע שלב 2.1. התוספות של דגימות אלה יספגו מעכבים מיטוכונדריאליים וישפרו את שלב הניקוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי מכון סראפילהירה, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) ו-Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). אנו מודים לד"ר אנטוניו גלינה פילו, לד"ר מוניקה מונטרו לומלי ולד"ר קלאודיו מסודה על התמיכה במתקני המעבדה, ולד"ר מרתה סורנסון על הערות טובות ובעלות ערך בשיפור המאמר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate Sigma-Aldrich A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Amplex Red Reagent Thermo Fisher scientific A12222 Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.) Sigma-Aldrich A8674
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030 heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c Sigma-Aldrich C7752 (from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91 OROBOROS INSTRUMENTS, Austria Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V Thermo Fisher scientific 88882005
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
EGTA sodium salt Sigma-Aldrich E8145
Hamilton syringe Sigma-Aldrich HAM80075 10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W Merck H1009
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
Micro-dissecting forceps, curved Sigma-Aldrich F4142
Micro-dissecting forceps, straight Sigma-Aldrich F4017
O2K - Filter set Amplex Red OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44321-01 Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44210-01
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k OROBOROS INSTRUMENTS, Austria http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) Sigma-Aldrich P4509
Peroxidase from horseradish Sigma-Aldrich P8375
Petri dishes, polystyrene MERCK P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic Sigma-Aldrich PHR1330
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saponin Sigma-Aldrich SAE0073
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Taurine Sigma-Aldrich T0625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
  3. Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
  4. Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
  5. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
  6. Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  7. Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
  8. Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
  9. Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
  10. Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson's disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
  11. Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
  12. Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
  13. Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
  14. Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
  15. Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
  16. Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and 'plugging' of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
  17. Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
  18. Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
  19. Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
  20. Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, Elsevier Inc. (2019).
  21. Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
  22. Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
  23. Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
  24. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  25. Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
  26. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
  27. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
  28. Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. 80 (2014).
  29. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
  30. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
  31. Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
  32. Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
  33. Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
  34. Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
  35. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
  36. Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
  37. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  38. Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
  39. Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
  40. Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
  41. Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
  42. Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
  43. Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).

Tags

ביוכימיה גיליון 183
הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Formiga-Jr, M. A., Camacho-Pereira,… More

Formiga-Jr, M. A., Camacho-Pereira, J. Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (183), e63690, doi:10.3791/63690 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter