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Biochemistry

Évaluation de la fonction mitochondriale dans le nerf sciatique par respirométrie à haute résolution

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63690
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

Summary

La respirométrie à haute résolution couplée à des capteurs de fluorescence détermine la consommation mitochondriale d’oxygène et la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Le présent protocole décrit une technique pour évaluer la fréquence respiratoire mitochondriale et la production de ROS dans le nerf sciatique perméabilisé.

Abstract

Le dysfonctionnement mitochondrial dans les nerfs périphériques accompagne plusieurs maladies associées à la neuropathie périphérique, qui peuvent être déclenchées par de multiples causes, notamment les maladies auto-immunes, le diabète, les infections, les troubles héréditaires et les tumeurs. L’évaluation de la fonction mitochondriale dans les nerfs périphériques de la souris peut être difficile en raison de la petite taille de l’échantillon, d’un nombre limité de mitochondries présentes dans le tissu et de la présence d’une gaine de myéline. La technique décrite dans ce travail minimise ces défis en utilisant un protocole de perméabilisation unique adapté de celui utilisé pour les fibres musculaires, pour évaluer la fonction mitochondriale du nerf sciatique au lieu d’isoler les mitochondries du tissu. En mesurant la production d’espèces réactives fluorimétriques avec Amplex Red/Peroxyidase et en comparant différents substrats mitochondriaux et inhibiteurs dans les nerfs perméabilisés par la saponine, il a été possible de détecter simultanément les états respiratoires mitochondriaux, les espèces réactives de l’oxygène (ROS) et l’activité des complexes mitochondriaux. Par conséquent, la méthode présentée ici offre des avantages par rapport à l’évaluation de la fonction mitochondriale par d’autres techniques.

Introduction

Les mitochondries sont essentielles au maintien de la viabilité cellulaire et remplissent de nombreuses fonctions cellulaires telles que le métabolisme énergétique (voies de métabolisme du glucose, des acides aminés, des lipides et des nucléotides). En tant que site principal de production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), les mitochondries sont au centre de plusieurs processus de signalisation cellulaire tels que l’apoptose et participent à la synthèse des amas fer-soufre (Fe-S), à l’importation et à la maturation des protéines mitochondriales et au maintien de leur génome et de leurs ribosomes 1,2,3. Le réseau de dynamique de la membrane mitochondriale est contrôlé par des processus de fusion et de fission, et ils ont également des machines pour le contrôle de la qualité et la mitophagie 4,5,6.

Le dysfonctionnement mitochondrial est associé à l’apparition de plusieurs conditions pathologiques telles que le cancer, le diabète et l’obésité7. Des perturbations de la fonction mitochondriale sont détectées dans les troubles neurodégénératifs qui affectent le système nerveux central, comme dans la maladie d’Alzheimer 8,9, la maladie de Parkinson 10,11, la sclérose latérale amyotrophique 12,13 et la maladie de Huntington 14,15 . Dans le système nerveux périphérique, une perte de la fonction mitochondriale dans les axones est observée dans les neuropathies immunitaires, telles que le syndrome de Guillain-Barré16,17, et en association avec une production élevée de ROS mitochondrial dans les axones, ces événements conduisent à l’activation de la MAP Kinase dans les cellules de Schwann18. Cela démontre que la physiologie mitochondriale peut être essentielle non seulement pour une cellule spécifique au site, mais pour un tissu entier. Dans la polyneuropathie sensorielle distale associée au VIH (HIV-DSP), les mitochondries jouent un rôle dans le mécanisme par lequel la protéine trans-activateur de transcription (HIV-TAT) permet au VIH de se répliquer efficacement, ainsi que plusieurs autres rôles dans la pathogenèse de l’infection par le VIH19,20.

L’évaluation de la physiologie mitochondriale du nerf sciatique est devenue une cible essentielle pour étudier la neuropathie 7,21,22. Dans la neuropathie diabétique, les analyses protéomiques et métabolomiques suggèrent que la plupart des altérations moléculaires du diabète affectent la phosphorylation oxydative mitochondriale du nerf sciatique et le métabolisme des lipides7. Ces altérations semblent également être des signes précoces de diabète induit par l’obésité21. Dans un modèle murin de neuropathie douloureuse induite par la chimiothérapie, une altération mitochondriale du nerf sciatique est détectée comme une diminution de la phosphorylation oxydative22 et une réduction des activités des complexes mitochondriaux, du potentiel membranaire et de la teneur en ATP23. Cependant, bien que plusieurs groupes aient cité le dysfonctionnement mitochondrial dans les neuropathies, ces études se limitent aux mesures de l’activité dans les complexes mitochondriaux sans préservation des membranes mitochondriales, sans évaluation de l’intégrité mitochondriale ou mesures de la teneur en ATP comme paramètre de la production mitochondriale d’ATP. En général, une évaluation correcte de la consommation mitochondriale d’oxygène et de la production de ROS nécessite l’isolement des mitochondries par centrifugation différentielle dans un gradient percoll/saccharose. L’isolement des mitochondries peut également être un facteur limitant pour le tissu nerveux sciatique en raison de la grande quantité de tissu nécessaire et de la perte et de la perturbation des mitochondries.

La présente étude vise à fournir un protocole pour mesurer la physiologie mitochondriale comme la consommation d’oxygène mitochondrial et la production de ROS dans le nerf sciatique, en préservant les membranes mitochondriales et sans qu’il soit nécessaire d’isoler les mitochondries. Ce protocole est adapté des mesures de consommation d’oxygène dans les fibres musculaires perméabilisées24 par respirométrie à haute résolution (HRR). Les avantages de cette procédure sont la possibilité d’évaluer les mitochondries dans de petites quantités de tissus tels que le nerf sciatique et d’évaluer les paramètres mitochondriaux in situ, préservant ainsi l’environnement mitochondrial, la structure et le profil bioénergétique, pour obtenir un résultat physiologiquement fiable. Les états respiratoires mitochondriaux ont été déterminés avec des substrats et des inhibiteurs après la perméabilisation du nerf sciatique afin d’évaluer correctement la bioénergétique mitochondriale et le coefficient cytochrome c pour l’intégrité de la membrane mitochondriale, fournissant un guide pour les étapes de l’évaluation du système de transport d’électrons mitochondrial (ETS) et le calcul des paramètres essentiels. Cette étude peut fournir des outils pour répondre aux questions sur les mécanismes physiopathologiques dans lesquels le métabolisme du nerf sciatique est impliqué, tels que les neuropathies périphériques.

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Protocol

Le présent protocole est approuvé par le Comité d’éthique sur l’utilisation des animaux dans la recherche, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) et les lignes directrices des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le nerf sciatique est isolé de souris mâles C57BL/6 âgées de quatre mois, euthanasiées par luxation cervicale conformément aux directives institutionnelles. Les étapes du protocole sont optimisées pour éviter la détérioration mitochondriale. Par conséquent, dans ce protocole, l’étalonnage des capteurs d’oxygène polarographiques a été effectué avant la dissection et la perméabilisation du tissu nerveux sciatique de souris.

1. Préparation des réactifs

  1. Préparez le tampon de préservation tissulaire (tampon TP).
    1. Préparer les réactifs suivants dans une solution d’eau ultrapure : 10 mM de tampon Ca-EGTA avec 0,1 μM de calcium libre, 20 mM d’imidazole, 20 mM de taurine, 50 mM de K-MES, 0,5 mM de TNT, 6,56 mM deMgCl2, 5,77 mM d’ATP, 15 mM de phosphocréatine (voir tableau des matériaux), pH 7,1. Conserver à -20°C.
  2. Préparez le tampon respiratoire des mitochondries (tampon MR).
    1. Préparer les réactifs suivants dans une solution d’eau ultrapure : 0,5 mM deK2EGTA, 3 mM de MgCl2, 60 mM de MES, 20 mM de taurine, 10 mM de KH2PO4, 20 mM de HEPES, 110 mM de D-saccharose, 1 mg/mL de BSA (sans acide gras) (voir tableau des matériaux), pH 7,4. Conserver à -20 °C.
  3. Préparer la solution mère de saponine en dissolvant 5 mg de saponine (voir tableau des matériaux) dans 1 mL de tampon TP (étape 1.1) et la conserver sur la glace. La saponine est préparée fraîchement.
  4. Préparer Amplex Red en remettant la poudre en suspension (voir tableau des matériaux) avec du DMSO pour obtenir une concentration en stock de 2 mM et conserver à -20 °C dans un flacon à l’abri de la lumière.
    REMARQUE: Pour éviter d’user la sonde par congélation et décongélation, faites de petites aliquotes pour le stockage pas plus de 6 mois25.

2. Étalonnage des capteurs d’oxygène polarographiques pour la respirométrie à haute résolution (HRR)

  1. Nettoyez les chambres HRR de l’instrument et des seringues (voir tableau des matériaux).
    1. Ouvrez les chambres HRR, remplissez d’eau distillée jusqu’au sommet et remuez pendant 5 min 3x. Répétez avec de l’éthanol, puis à nouveau avec de l’eau. Lavez les bouchons et les seringues avec de l’eau / éthanol / eau 3x chacun.
  2. Appliquez les paramètres d’étalonnage suivants dans le logiciel HRR (voir Tableau des matériaux).
    1. Dans le contrôle logiciel HRR, ajoutez la température expérimentale (37 °C), les paramètres du capteur d’oxygène (gain, 2; tension de polarisation, 800 mV) et du capteur ampérométrique (gain, 1000; tension de polarisation, 100 mV).
  3. Calibrez les capteurs d’oxygène.
    1. Pipette 2,1 mL de tampon MR (étape 1.2) dans chaque chambre. Fermez avec les bouchons et aspirez l’air dans la chambre jusqu’à ce qu’une bulle se forme. Remuer à 37 °C pendant 1 h en mode étalonnage jusqu’à ce que le flux d’oxygène par masse soit stable.
    2. Effectuer un étalonnage de l’air des capteurs d’oxygène polarographiques dans le logiciel selon le protocole24 du fabricant.
      REMARQUE: L’étape d’étalonnage n’est effectuée qu’une seule fois avant une expérience. Des expériences supplémentaires dans le même milieu respiratoire et à la même température peuvent être effectuées après un simple lavage des chambres (étape 2.1).

3. Dissection et perméabilisation du nerf sciatique

  1. Retirez le nerf sciatique en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Euthanasier l’animal par luxation cervicale après l’avoir retiré de sa cage et doucement retenu pour se reposer sur le banc.
    2. Chez l’animal euthanasié, faites une incision avec des ciseaux dans le bas du dos, en commençant près de la colonne vertébrale et en descendant la cuisse vers le pied. Enlevez la peau et les muscles attachés au nerf, puis coupez et retirez tout le nerf sciatique.
    3. Peser immédiatement le tissu et le placer dans un flacon rempli de tampon TB froid (4 °C). Effectuez les étapes 3.2 à 3.3 sur la glace.
      REMARQUE: Le poids des tissus humides est utilisé pour normaliser la consommation d’oxygène et le flux de production de ROS dans les étapes suivantes. Si le tissu ne peut pas être pesé immédiatement, conservez-le dans un tampon TB froid. La procédure est effectuée dans des tissus frais et ne doit pas être congelée pour éviter des dommages mitochondriaux.
  2. Pour la préparation des tissus, placez le nerf sciatique dans une boîte de Petri avec suffisamment de tampon TP pour le couvrir. Tenez une extrémité du nerf avec une pince, et avec une autre paire de pinces, retirez les faisceaux nerveux horizontalement.
    REMARQUE: Cette procédure doit être effectuée en moins de 10 minutes pour éviter la détérioration des tissus. Le tissu sera prêt lorsqu’il pourra être visualisé sous forme de couches brumeuses transparentes, en face du tissu opaque blanc précédent (Figure 1).
  3. Tout d’abord, transférez le tissu expansé dans un petit plat contenant 1 mL de tampon TP pour la perméabilisation des tissus. Pour commencer la perméabilisation, transférer le tissu avec une pince dans une boîte contenant 1 mL de tampon TP et 10 μL de saponine (à partir de la solution mère, étape 1.3).
    1. Agiter doucement dans un agitateur à microplaques pendant 30 min, puis transférer le tissu avec une pince dans un plat frais contenant du tampon MR (1 mL) et agiter doucement pendant 10 min. Transférer le tissu avec une pince dans une chambre HRR calibrée.

4. Détermination de la consommation d’oxygène et de la production de ROS

  1. Remplissez les chambres HRR avec 2,1 mL de tampon MR, ajoutez Amplex Red (étape 1.4) à une concentration finale de 5 μM et de peroxydase à 2 U/mL, et ajoutez le nerf sciatique perméabilisé (étape 3).
    1. Fixez les capteurs de fluorescence de l’instrument, éteignez les lumières dans la section de commande du logiciel et appuyez sur Connecter à l’oxygraphe. Dans « modifier les protocoles » dans le logiciel, insérez le poids tissulaire mesuré à l’étape 3.1.3.
  2. Allez dans « mise en page », choisissez l’option « flux spécifique par unité d’échantillon » et sélectionnez Tracés pour accéder simultanément à la lecture de la consommation d’oxygène et, si vous le souhaitez, à la production H2O2 . Attendez ~10 min.
    REMARQUE: Ce temps est nécessaire pour stabiliser le flux basal de la consommation d’oxygène sans substrat ajouté (basal). Avant d’autres injections, assurez-vous que le flux d’oxygène est stabilisé.
  3. Injecter deux impulsions deH2O2, chacune à une concentration finale de 260 μM, pour un étalonnage ultérieur dans la chambre.
  4. Injecter 20 μL de succinate (voir Tableau des matériaux), un substrat du complexe mitochondrial II, pour activer le système de transport d’électrons mitochondriaux.
    REMARQUE: Différents substrats mitochondriaux peuvent être ajoutés à ce stade pour évaluer la fonction mitochondriale par différents complexes. Des résultats représentatifs avec des substrats variables pour les complexes mitochondriaux I et II sont présentés à la figure 2 et à la figure 3. À ce stade, une augmentation de la consommation d’O2et de laproduction de H2 O 2, simultanément, est observée à la figure 3.
  5. Ajouter 20 μL d’adénosine diphosphate (ADP) pour activer la synthèse de l’adénosine triphosphate (ATP).
    REMARQUE: ADP stimule la synthèse de l’ATP et réduit le potentiel membranaire. Une augmentation de la consommation d’O2 et une diminution de la production deH2 O2 devraient être observées26,27.
  6. Dans l’ordre, ajouter 5 μL de cytochrome c (voir Tableau des matériaux) comme indicateur de l’intégrité de la membrane.
    REMARQUE: Si le tissu est bien préparé et perméabilisé, le cytochrome c ne devrait pas augmenter la consommation d’oxygène de plus de 15%. Si cela se produit, consultez la section de dépannage pour obtenir des recommandations.
  7. Titrer avec des aliquotes de 0,2 μg/mL d’oligomycine (voir tableau des matériaux) jusqu’à ce qu’aucune autre diminution de la consommation d’O2 ne soit observée.
    REMARQUE: L’oligomycine agit en inhibant la synthèse de l’ATP conduisant à une diminutiondu débit d’O2 et à une amélioration de la formation deH2 O 2 favorisée par le potentiel membranaire élevé26,27.
  8. Titrer avec des aliquotes de 0,5 μmol/L de cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone (FCCP) (voir tableau des matériaux), le découpleur mitochondrial, jusqu’à ce qu’il soit possible de ne plus observer d’augmentation de la consommation d’O2 . Pour terminer l’expérience, injectez 2 μl d’antimycine A à une concentration finale de 5 μM et attendez la stabilisation du débit.
    REMARQUE: Une diminution de la production de H2O2 est observée en raison de la dissipation du potentiel membranaire après l’injection de FCCP. L’antimycine A inhibe le complexe III, empêchant ainsi le flux d’électrons. Par conséquent, la consommation d’O2 dépendant des mitochondries est altérée, diminuant le flux d’oxygène par masse et stimulant les fuites d’électrons, augmentantla production de H2O2 26,27.
  9. Allez dans la barre de commandes, recherchez « multisensoriel » dans le logiciel, cliquez sur Contrôler > Enregistrer le fichier et Déconnecter.
    REMARQUE: L’ajout d’autres substrats et inhibiteurs peut être effectué en fonction de la question à l’étude. Un exemple est décrit dans les résultats représentatifs. L’étalonnage H2O2 est effectué après la fin de l’expérience, conformément au protocole28 du fabricant.
  10. Ouvrez le fichier enregistré et sélectionnez la trace « Flux d’oxygène par masse » pour obtenir les résultats expérimentaux de la consommation d’oxygène. Sélectionnez manuellement la fenêtre entre les injections en appuyant sur Maj + bouton gauche de la souris.
    1. Allez à Marks > Statistics pour visualiser les résultats de chaque injection de substrat/inhibiteurs/protocole découplé. Pour la production H2O2 , effectuez la même procédure avec la trace « Amp-Slope ».
      REMARQUE: Lors de la sélection de la fenêtre, évitez les artefacts d’injections de volume en choisissant une fenêtre où l’oxygène (ou H2O2) est plus stable et constant. Des exemples de fenêtres sélectionnées sont représentés par des accolades noires dans les résultats représentatifs (Figure 2 et Figure 3).

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Representative Results

La consommation mitochondriale d’oxygène par le nerf sciatique perméabilisé est représentée à la figure 2. La trace rouge représente le fluxd’O2 par unité de masse en pmol/s.mg. Après avoir enregistré une consommation basale d’oxygène avec des substrats endogènes (respiration de routine), du succinate (SUCC) est injecté pour enregistrer la respiration entraînée par le complexe II (succinate déshydrogénase), ce qui entraîne une augmentation du taux de consommation d’oxygène. En séquence, une concentration saturante d’ADP est ajoutée, activant l’ATP synthase et entraînant une phosphorylation oxydative. Il en résulte un état phosphorylatif de la respiration mitochondriale. La respiration à l’état phosphorylatif signifie que l’ATP synthase peut produire de l’ATP à partir d’ADP + Pi (phosphate inorganique) en utilisant le potentiel membranaire formé par le gradient protonique comme force proton-motrice pour générer de l’ATP26. Avec la diminution du potentiel membranaire favorisée par l’activité de l’ATP synthase, la consommation d’oxygène est accélérée et une augmentation du débit d’oxygène est observée. L’ajout de cytochrome c exogène (CYTC) n’a favorisé qu’une stimulation minimale de la respiration, certifiant l’intégrité de la membrane externe mitochondriale pour cette préparation. La perméabilisation des tissus peut endommager l’intégrité de la membrane et la perte du cytochrome c. Une augmentation des taux de respiration de plus de 10% à 15% indique des mitochondries endommagées et une préparation inadéquatedes tissus 28,29. Dans ce résultat représentatif, il y a une augmentation de 8,7% de la respiration, ce qui indique une bonne qualité de la préparation tissulaire (tableau 1). Le titrage à l’oligomycine (OLIGO) doit être effectué avec des doses minimales pour éviter d’atteindre une concentration d’OLIGO pouvant interférer dans l’évaluation de la capacité maximale30. L’inhibition de l’ATP synthase par OLIGO - ou la respiration de l’état 4 par l’oligomycine26 - a entraîné une diminution du flux de consommation d’oxygène. Le titrage avec FCCP, un réactif de découpleur mitochondrial, dissipe le potentiel de la membrane mitochondriale, stimulant le flux respiratoire et affichant la capacité maximale de transfert d’électrons (capacité maximale ETS). À la fin de l’expérience, l’antimycine A (AA), un inhibiteur du complexe III, est injectée pour inhiber la respiration mitochondriale et pour enregistrer la consommation d’oxygène non mitochondriale (respiration résiduelle) (Figure 2). Les débits absolus d’oxygène enregistrés dans cette expérience représentative sont calculés dans le tableau 1.

La possibilité d’analyser la consommation mitochondriale d’oxygène simultanément avec la production réactive d’oxygène (ROS) - déterminée par la détection du peroxyde d’hydrogène (H2O2) par Amplex Red avec des capteurs de fluorescence - est un grand avantage pour déterminer un profil bioénergétique et un outil standard pour la détection du dysfonctionnement mitochondrial dans diverses pathologies. L’ajout de différents substrats pour différents complexes pour alimenter l’ETS mitochondrial peut également fournir plus d’informations sur les sites spécifiques du dysfonctionnement mitochondrial. La figure 3 est illustrée avec la mesure simultanée de la consommation d’oxygène (figure 3A) et de la production de ROS (figure 3B) en présence de différents substrats fournissant du carburant pour l’ETS. Après avoir enregistré la respiration basale, le pyruvate + malate (PM) est ajouté à la chambre comme substrat pour le complexe mitochondrial I, augmentant ainsi le flux de consommation d’oxygène. L’ajout de SUCC, le substrat du complexe II, augmente également la respiration, mais l’ajout supplémentaire de palmitoyl-carnitine (PC) n’augmente pas le flux d’oxygène par rapport aux ajouts de substrat antérieurs, ce qui suggère que pm et SUCC peuvent déjà avoir saturé le site mitochondrial de l’ubiquinone ou un manque d’oxydation des acides gras. Comme prévu, la production de ROS augmente également après l’ajout de substrats, ce qui représente la fuite d’oxygène qui s’échappe de l’ETS et forme des ROS (Figure 3B, trace verte). L’ajout d’ADP en concentration saturante augmente la consommation d’oxygène, entraînant la formation d’ATP (trace rouge sur la figure 3A) et diminuant la production de ROS (figure 3B, trace verte). L’ajout de CYTC n’augmente le débit d’oxygène que de 6,8%, confirmant l’intégrité de la membrane mitochondriale. Le titrage avec OLIGO diminue le débit de consommation d’oxygène (trace rouge sur la figure 3A) et augmente la production de ROS (trace verte sur la figure 3B). Les effets ADP et OLIGO suggèrent que le nerf sciatique perméabilisé dans ce protocole peut reproduire la relation standard en physiologie mitochondriale, dans laquelle une augmentation de la consommation d’oxygène entraîne une diminution du potentiel membranaire et empêche la production de ROS31,32.

L’ajout de FCCP, comme prévu pour un découpleur, augmente la consommation d’oxygène à son taux maximal et, en raison de la dissipation du potentiel membranaire, la production de ROS est réduite. L’ajout de roténone, un inhibiteur des complexes I et AA, réduit la consommation d’oxygène et augmente la formation de ROS (Figure 3A, B), confirmant que la physiologie mitochondriale et le profil bioénergétique dans le nerf sciatique perméabilisé sont préservés. Les valeurs absolues des débits d’oxygène enregistrés dans cette expérience sont calculées dans le tableau 2.

Figure 1
Figure 1 : Préparation du nerf sciatique pour la perméabilisation des mitochondries. Toutes les procédures doivent être effectuées sur la glace. (A) Le nerf sciatique est extrait d’une souris euthanasiée et placé dans une boîte de Petri contenant un tampon de préservation des tissus à 4 °C. (B) Séparation des faisceaux nerveux sciatiques avec des pinces. (C,D) Le tissu est prêt lorsqu’il est disséqué en touffes translucides, plutôt qu’en la structure tubulaire opaque blanche d’origine (A). Barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour agrandir cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Résultat représentatif de la consommation mitochondriale d’oxygène dans le nerf sciatique perméabilisé de la souris. L’expérience est une trace représentative d’un extrait de nerf sciatique d’une souris euthanasiée. Le nerf sciatique a été perméabilisé auparavant, comme décrit dans la section du protocole. Les injections sont indiquées sous forme de flèches à des moments précis. SUCC: succinate; ADP: adénosine diphosphate; Cyt c: cytochrome c; OLIGO: oligomycine; FCCP : cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone; AA: antimycine A. La concentration en oxygène en temps réel sous forme de [nmol /mL] (trace bleue) et le taux de consommation d’oxygène sous forme de flux par unité de masse [pmol / (s.mg)] (trace rouge) sont indiqués. Les broches noires représentent les fenêtres des taux de consommation d’oxygène sélectionnés pour les résultats après chaque injection. Basal fait référence à la respiration sans substrats. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Résultat de la consommation mitochondriale d’oxygène couplée à la production de ROS dans le nerf sciatique perméabilisé de la souris. Une trace représentative d’un extrait de nerf sciatique d’une souris euthanasiée est montrée. Le nerf sciatique a été perméabilisé auparavant, comme décrit dans la section du protocole. Les injections sont indiquées sous forme de flèches à des moments précis. H2O2 : peroxyde d’hydrogène ; PM: pyruvate/malate; SUCC: succinate; PC: palmitoyl-carnitine; ADP: adénosine diphosphate; Cyt c: cytochrome c; OLIGO: oligomycine; FCCP : cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone; ROT: roténone; AA: antimycine A. (A) La concentration en oxygène en temps réel comme [nmol / mL] (trace bleue) et le taux de consommation d’oxygène comme flux par unité de masse [O2 pmol / (s.mg)] (trace rouge) sont indiqués. (B) La production de ROS est démontrée par fluorescenceH2 O2 (trace violette) et pente de production H2O2 [pmol/(s.mg)] (trace verte), après étalonnage. Les broches noires représentent les fenêtres des taux de consommation d’oxygène sélectionnés pour les résultats après chaque injection. Basal fait référence à la respiration sans substrats. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Substrats Ajouts Taux de consommation d’oxygène
Flux par masse (pmol/[s.mg])
Basal (pas d’ajout) aucun 5.9
Succinate (SUCC) Un ajout de 10 mM 16.9
ADP Une addition de 1 μM 28.5
Cytochrome c (CYTC) Un ajout de 10 μM 31
Oligomycine A (OLIGO) Titrage avec des additions de 0,2 μg/mL 21.9
Le Titrage avec des ajouts de 0,5 μM 31.1
Antimycine A (AA) Un ajout de 5 μM 11.3

Tableau 1 : Protocole substrats/découpleur/inhibiteurs/titrage (SUIT) et résultats des taux de consommation d’oxygène dans le nerf sciatique perméabilisé de souris. La consommation d’oxygène est représentée en [O2pmol/(s.mg)], après chaque ajout du protocole SUIT. Les résultats sont obtenus par la moyenne des fenêtres sélectionnées marquées à la figure 2.

Substrats Ajouts Consommation d’oxygène (O2 pmol/[s.mg]) Production de ROS (H2O2 pmol/[s.mg])
Basal (pas d’ajout) aucun 5.77 0.53
Pyruvate + Malate (PM) Une impulsion de 5 mM + 2,5 mM 7.17 0.58
Succinate (SUCC) Un ajout de 10 mM 14.06 0.75
Palmitoyl carnitine (PC) Deux impulsions de 25 μM 14.68 0.79
ADP Une addition de 1 μM 22.9 0.25
Cytochrome c (CYTC) Un ajout de 10 μM 24.36 0.09
Oligomycine A (OLIGO) Titrage avec des additions de 0,2 μg/mL 17.03 0.5
Le Titrage avec des ajouts de 0,5 μM 23.98 0.16
Roténone (ROT) Un ajout de 1μM 19.75 0.48
Antimycine A (AA) Un ajout de 5 μM 4.08 0.53

Tableau 2 : Protocole substrats/découpleur/inhibiteurs/titrage (SUIT) et résultats de la production de ROS couplés aux taux de consommation d’oxygène du nerf sciatique perméabilisé par la souris. La consommation d’oxygène est représentée en [O2 pmol/(s.mg)] et en production de ROS par [H2O2 pmol/(s.mg)] après chaque ajout du protocole SUIT. Les résultats sont obtenus par la moyenne des fenêtres sélectionnées marquées à la figure 3.

Paramètres de la fonction mitochondriale Calculs à partir des taux de consommation d’oxygène
Respiration basale Respiration basale (flux sans ajout de substrats)28
Consommation résiduelle d’oxygène (ROX) [Flux après ajout de AA] 28 ans
Complexe I fuite respiration [Flux après addition de PM] – [ROX]28,37
Respiration de fuite complexe II [Flux après ajout de SUCC] – [ROX]28,37
État phosphorylatif (capacité Oxphos) [Flux après ajout d’ADP] – [ROX]28,43
État non phosphorylatif (fuite respiratoire) [Flux après addition d’oligomycine] – [ROX]28
Rapport de contrôle respiratoire [État phosphorylatif / Non phosphorylatif] 28,43
Capacité du SEQE [Flux après ajout de FCCP] – [ROX]28,37

Tableau 3 : Calcul des paramètres pour l’évaluation de la fonction mitochondriale dans le nerf sciatique perméabilisé de souris. Paramètres pour la formule d’évaluation de la physiologie mitochondriale par les taux de consommation d’oxygène.

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Discussion

Plusieurs maladies ou affections accompagnant les neuropathies ont un dysfonctionnement mitochondrial comme facteur de risque. L’évaluation de la fonction mitochondriale dans les nerfs périphériques est essentielle pour élucider comment les mitochondries agissent dans ces conditions neurodégénératives. L’évaluation de la fonction mitochondriale est laborieuse en raison de la difficulté de la méthode d’isolement et de la rareté du matériel. Ainsi, le développement de techniques de perméabilisation tissulaire qui ne nécessitent pas l’isolement des mitochondries est essentiel.

Pour évaluer la fonction mitochondriale dans les tissus perméabilisés, il est essentiel de choisir un produit chimique capable de perméabiliser la membrane plasmique cellulaire sans interférer avec la respiration cellulaire. Dans les nerfs périphériques tels que le nerf sciatique, la composition en myéline est d’environ 70% lipidique, dont la plupart sont du cholestérol33,34. Le choix d’agents perméabilisants tels que la saponine et la digitonine qui interagissent avec les molécules de cholestérol donne des pores qui permettent au substrat d’accéder à la machinerie mitochondriale sans interférer avec d’autres compartiments cellulaires35,36. Dans ce protocole, la méthode bien établie de perméabilisation des fibres musculaires par la saponine décrite par Pesta et Gnaiger24 est adaptée aux nerfs sciatiques. La procédure de perméabilisation comprend une autre étape critique concernant la séparation des tissus pour permettre l’accès aux substrats nécessaires à l’enregistrement des paramètres mitochondriaux d’intérêt. Le présent travail décrit les étapes, et les illustrations sont fournies pour une séparation tissulaire satisfaisante dans la figure 1.

Les enregistrements de la fréquence respiratoire mitochondriale sont essentiels pour établir des différences concernant le dysfonctionnement des complexes mitochondriaux, la perturbation de la phosphorylation oxydative ou les mitochondries perturbées. Les affections respiratoires et les paramètres mitochondriaux sont définis par Chance et Williams26. Dans cet article, la respiration de routine est définie comme la respiration basale lorsque la consommation mitochondriale d’oxygène est enregistrée sans ajout de substrats exogènes; capacité des complexes - lorsque des substrats pour les complexes I ou II sont ajoutés pour alimenter la consommation d’oxygène mitochondrial, également appelé respiration par fuite; état phosphorylatif - lorsque l’ADP est ajouté dans la séquence de substrats complexes et entraîne la synthèse de l’ATP; état non phosphorylatif - lorsque tout ADP est formé en ATP ou avec l’ajout d’un inhibiteur de l’ATP synthase, l’oligomycine (ou l’état 4); Capacité maximale ETS - lorsque le découpleur mitochondrial FCCP est ajouté et; consommation résiduelle d’oxygène (ROX) après addition de roténone et d’antimycine A - lorsque la consommation d’oxygène n’est pas liée aux mitochondries. La technique décrite dans ce travail pour l’évaluation de la fonction mitochondriale dans le tissu nerveux sciatique par HRR permet de déterminer de nombreux états respiratoires et de calculer la fonction mitochondriale intrinsèque dans le même échantillon. Les résultats d’un test de protocole substrat/non couplé/inhibiteurs peuvent être utilisés pour dériver des paramètres de la fonction mitochondriale à partir desquels les rapports/facteurs de contrôle respiratoire peuvent être calculés37, comme le montre le tableau 3. L’évaluation de ces paramètres combine des taux de fuite absolus, couplés à une respiration mitochondriale maximale, et augmente les données pour une valeur diagnostique 24,35,36,37,38,39.

Bien que le dysfonctionnement mitochondrial dans les nerfs périphériques soit cité dans la littérature, il existe des limites dans la démonstration de ces paramètres. Dans un modèle de neuropathie induite par la chimiothérapie, une diminution du potentiel de la membrane mitochondriale dans le traitement avec l’agent chimiothérapeutique, l’oxaliplatine, et une réduction de l’activité in vitro des complexes I, II et III sont observées dans les axones sensoriels du nerf périphérique (nerf saphène)40,41. Cependant, il y a un manque d’informations sur le contrôle exercé par le potentiel membranaire sur les activités des complexes et la formation d’ATP par phosphorylation oxydative, un paramètre essentiel dans l’évaluation de la fonction mitochondriale. En outre, dans les nerfs sciatiques dissociés de rats Sprague-Dawley perméabilisés à la digitonine, l’enregistrement de la consommation d’oxygène n’est démontré que pour l’état phosphorylé, mais n’est pas comparé à la consommation d’oxygène en présence d’un inhibiteur de l’ATPase ou d’un découpleur22. Dans la présente méthode, il est possible de calculer le rapport de contrôle respiratoire dans le nerf perméabilisé (tableau 3) par rapport au rapport de contrôle respiratoire des mitochondries isolées, généralement calculé à partir de l’état3/état4 (ou des états phosphorylatifs/non phosphorylatifs). Avec la méthode fournie dans ce travail, il est possible d’évaluer les capacités complexes I, II - maintenir l’intégrité de la membrane mitochondriale - et les rapports de contrôle du flux, et d’atteindre une capacité maximale de respiration et de consommation d’oxygène résiduel.

Différentes méthodes de perméabilisation du nerf sciatique pour l’évaluation de la consommation mitochondriale d’oxygène sont décrites dans la littérature. Une technique de perméabilisation du nerf sciatique est démontrée dans un protocole avec traitement à la saponine et perméabilisation par impulsion vortex; cependant, seuls l’état phosphorylatif et la capacité maximale ont été démontrés41. De plus, en comparant les valeurs présentées ici pour les mêmes paramètres, le flux d’oxygène observé par Cooper et al.41 est inférieur de 70%, démontrant qu’il y a des dommages à la membrane mitochondriale liés à la méthode d’agitation. Dans le présent protocole, la séparation tissulaire préserve l’intégrité de la membrane mitochondriale, confirmée par la faible augmentation du flux d’oxygène après l’ajout du cytochrome c. Il s’agit d’une caractéristique qui permet d’enregistrer tous les paramètres mitochondriaux, fournissant un enregistrement complet de la phosphorylation oxydative mitochondriale et de la fonction. Même si dans une méthode de perméabilisation du nerf sciatique avec la collagénase, les valeurs de flux d’oxygène sont comparables à celles présentées ici, une augmentation de près de 20% est observée après l’ajout du cytochrome c, suggérant un certain niveau de lésions de la membrane mitochondriale21. Avec le protocole décrit dans cet article, une augmentation de seulement 6,3% à 8,7% du flux d’oxygène après addition de cytochrome c a été observée, confirmant l’avantage de la méthode actuelle dans la préservation de l’intégrité de la membrane mitochondriale et l’optimisation de l’enregistrement de la consommation d’oxygène.

Les mitochondries sont le principal site de génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) associées à divers processus de signalisation dans le tissu nerveux sciatique et aux mécanismes liés à la physiopathologie dans les neuropathies42,43. Ce protocole a permis d’accéder à la génération de peroxyde d’hydrogène avec un capteur de fluorescence simultanément à la consommation d’oxygène. Comme on l’observe à la figure 3, la production de ROS est sensible aux altérations des états respiratoires mitochondriaux, confirmant l’état d’intégrité mitochondriale et optimisant l’enregistrement de la fonction mitochondriale.

D’autres méthodes telles que l’analyseur de flux extracellulaire (EFA), basé sur des capteurs de fluorescence pour enregistrer la consommation d’oxygène, peuvent évaluer la fonction mitochondriale du nerf périphérique dans les cellules cultivées - telles que les cellules de Schwann ou les axones - dans un dispositif de criblage automatisé à haut débit. Cependant, l’utilisation de capteurs polarographiques tels que HRR présente certains avantages, notamment la possibilité de suivre l’expérience en temps réel, pour effectuer de multiples injections de substrats/inhibiteurs ; ainsi, cela permet d’évaluer un plus grand nombre de fonctions complexes dans les mitochondries dans une expérience, et le coût inférieur des consommables 24,35,38,39. Un inconvénient de l’utilisation de HRR par rapport à l’EFA est l’absence d’un capteur pour l’acidification des milieux (pour l’analyse du flux glycolytique) et la capacité de flux de travail limitée, qui permet l’utilisation de seulement deux échantillons à la fois.

Les limites des techniques de perméabilisation tissulaire requises pour le HRR sont bien connues. Ils comprennent l’incapacité d’évaluer les mitochondries lorsque l’ADP est limitant et une fréquence respiratoire non couplée réduite par rapport aux mitochondries isolées. Cependant, le protocole de perméabilisation du nerf saponine-sciatique décrit ici - comme une adaptation du protocole de perméabilisation des fibres musculaires par Pesta et Gnaiger24 - permet l’évaluation des états respiratoires mitochondriaux et des paramètres mitochondriaux sans endommager l’intégrité mitochondriale. Il permet également d’enregistrer simultanément la consommation d’oxygène et la production de ROS dans le nerf sciatique, un tissu dont les limites sont notoires pour isoler les mitochondries. Ainsi, ce protocole permet une meilleure évaluation de la fonction mitochondriale dans les nerfs périphériques et peut fournir des avantages aux chercheurs dans l’étude des rôles mitochondriaux dans les conditions physiopathologiques affectant les nerfs périphériques.

Dépannage
S’il y a une augmentation de la consommation d’O2 après l’ajout du cytochrome c à plus de 15% du flux de consommation d’oxygène, cela indique que la procédure de perméabilisation était très forte et a causé des dommages à la structure mitochondriale. Si tel est le cas, jetez et relançez la dissection avec une séparation nerveuse plus douce et répétez les étapes. Si certains réactifs injectés ne démontrent pas l’effet attendu sur la consommation d’oxygène des mitochondries ou la production deH2O2 , c’est probablement dû à une contamination de la chambre par des inhibiteurs mitochondriaux. Dans ce cas, deux actions peuvent être prises: (1) recommencer l’expérience après avoir lavé les chambres et les seringues (étape 2.1) ou (2) ajouter un échantillon de mitochondries ou d’homogénéat isolés des tissus avant d’effectuer l’étape 2.1. Les ajouts de ces échantillons absorberont les inhibiteurs mitochondriaux et amélioreront l’étape de nettoyage.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par l’Instituto Serrapilheira, la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), le Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) et le Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Nous sommes reconnaissants au Dr Antonio Galina Filho, au Dr Monica Montero Lomeli et au Dr Claudio Masuda pour le soutien apporté aux installations de laboratoire, ainsi qu’au Dr Martha Sorenson pour leurs commentaires aimables et précieux dans l’amélioration de l’article.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate Sigma-Aldrich A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Amplex Red Reagent Thermo Fisher scientific A12222 Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.) Sigma-Aldrich A8674
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030 heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c Sigma-Aldrich C7752 (from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91 OROBOROS INSTRUMENTS, Austria Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V Thermo Fisher scientific 88882005
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
EGTA sodium salt Sigma-Aldrich E8145
Hamilton syringe Sigma-Aldrich HAM80075 10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W Merck H1009
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
Micro-dissecting forceps, curved Sigma-Aldrich F4142
Micro-dissecting forceps, straight Sigma-Aldrich F4017
O2K - Filter set Amplex Red OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44321-01 Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44210-01
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k OROBOROS INSTRUMENTS, Austria http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) Sigma-Aldrich P4509
Peroxidase from horseradish Sigma-Aldrich P8375
Petri dishes, polystyrene MERCK P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic Sigma-Aldrich PHR1330
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saponin Sigma-Aldrich SAE0073
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Taurine Sigma-Aldrich T0625

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