Summary
Респирометрия высокого разрешения в сочетании с флуоресцентными датчиками определяет потребление митохондриального кислорода и генерацию активных форм кислорода (АФК). Настоящий протокол описывает метод оценки скорости дыхания митохондрий и продукции АФК в пермеабилизированном седалищном нерве.
Abstract
Митохондриальная дисфункция в периферических нервах сопровождает несколько заболеваний, связанных с периферической невропатией, которые могут быть вызваны несколькими причинами, включая аутоиммунные заболевания, диабет, инфекции, наследственные расстройства и опухоли. Оценка митохондриальной функции в периферических нервах мыши может быть сложной задачей из-за небольшого размера выборки, ограниченного количества митохондрий, присутствующих в ткани, и наличия миелиновой оболочки. Метод, описанный в этой работе, минимизирует эти проблемы, используя уникальный протокол пермеабилизации, адаптированный из того, который используется для мышечных волокон, для оценки митохондриальной функции седалищного нерва вместо выделения митохондрий из ткани. Измеряя продукцию флуориметрических реактивных видов с помощью Amplex Red/Peroxidase и сравнивая различные митохондриальные субстраты и ингибиторы в сапонин-пермеабилизированных нервах, можно было одновременно обнаружить митохондриальные респираторные состояния, активные формы кислорода (АФК) и активность митохондриальных комплексов. Таким образом, метод, представленный здесь, предлагает преимущества по сравнению с оценкой митохондриальной функции другими методами.
Introduction
Митохондрии необходимы для поддержания жизнеспособности клеток и выполняют многочисленные клеточные функции, такие как энергетический метаболизм (пути метаболизма глюкозы, аминокислот, липидов и нуклеотидов). Как основной участок производства активных форм кислорода (АФК), митохондрии занимают центральное место в нескольких клеточных сигнальных процессах, таких как апоптоз, и участвуют в синтезе железо-серных (Fe-S) кластеров, импорте и созревании митохондриального белка и поддержании их генома и рибосом 1,2,3. Сеть динамики митохондриальных мембран контролируется процессами слияния и деления, а также имеет механизм контроля качества и митофагии 4,5,6.
Митохондриальная дисфункция связана с появлением нескольких патологических состояний, таких как рак, диабет и ожирение7. Нарушения митохондриальной функции выявляются при нейродегенеративных расстройствах, влияющих на центральную нервную систему, таких как болезнь Альцгеймера 8,9, болезнь Паркинсона10,11, боковой амиотрофический склероз12,13 и болезнь Хантингтона14,15 . В периферической нервной системе потеря митохондриальной функции в аксонах наблюдается при иммунных невропатиях, таких как синдром Гийена-Барре16,17, и в связи с высокой митохондриальной продукцией АФК в аксонах эти события приводят к активации MAP киназы в шванновских клетках18. Это демонстрирует, что митохондриальная физиология может быть необходима не только для клетки, специфичной для сайта, но и для всей ткани. При ВИЧ-ассоциированной дистальной сенсорной полинейропатии (ВИЧ-ДСП) митохондрии играют роль в механизме, с помощью которого трансактиватор транскрипционного белка (ВИЧ-ТАТ) позволяет ВИЧ эффективно реплицироваться, а также ряд других ролей в патогенезе ВИЧ-инфекции19,20.
Оценка физиологии митохондрий седалищного нерва стала важной целью для исследования нейропатии 7,21,22. При диабетической нейропатии протеомный и метаболомный анализы показывают, что большинство молекулярных изменений при диабете влияют на митохондриальное окислительное фосфорилирование седалищного нерва и липидный обмен7. Эти изменения также, по-видимому, являются ранними признаками диабета21, вызванного ожирением. В мышиной модели вызванной химиотерапией болезненной нейропатии митохондриальные нарушения в седалищном нерве обнаруживаются как снижение окислительного фосфорилирования22 и снижение активности митохондриальных комплексов, мембранного потенциала и содержания АТФ23. Однако, хотя несколько групп ссылались на митохондриальную дисфункцию при невропатиях, эти исследования ограничены измерениями активности в митохондриальных комплексах без сохранения митохондриальных мембран, без оценки целостности митохондрий или измерений содержания АТФ в качестве параметра для митохондриальной продукции АТФ. В целом, правильная оценка потребления митохондриального кислорода и производства АФК требует выделения митохондрий путем дифференциального центрифугирования в градиенте перколл/сахарозы. Выделение митохондрий также может быть ограничивающим фактором для ткани седалищного нерва из-за большого количества необходимой ткани и потери и разрушения митохондрий.
Настоящее исследование направлено на обеспечение протокола для измерения митохондриальной физиологии как потребления митохондриального кислорода и производства АФК в седалищном нерве, сохраняя митохондриальные мембраны и без необходимости выделения митохондрий. Этот протокол адаптирован из измерений потребления кислорода в пермеабилизированных мышечных волокнах24 с помощью респирометрии высокого разрешения (HRR). Преимуществами этой процедуры являются возможность оценки митохондрий в небольших количествах ткани, таких как седалищный нерв, и оценка митохондриальных параметров in situ, тем самым сохраняя митохондриальную среду, структуру и биоэнергетический профиль, для получения физиологически достоверного результата. Митохондриальные респираторные состояния определяли с помощью субстратов и ингибиторов после пермеабилизации седалищного нерва для правильной оценки митохондриальной биоэнергетики и коэффициента цитохрома C для целостности митохондриальной мембраны, обеспечивая руководство для этапов оценки митохондриальной электронной транспортной системы (ETS) и расчета существенных параметров. Это исследование может предоставить инструменты для ответа на вопросы в патофизиологических механизмах, в которых участвует метаболизм седалищного нерва, таких как периферические невропатии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Настоящий протокол одобрен Комитетом по этике использования животных в исследованиях, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) и руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения по уходу за экспериментальными животными и их использованию. Седалищный нерв изолирован от четырехмесячных самцов мышей C57BL/6, усыпленных вывихом шейки матки в соответствии с институциональными руководящими принципами. Этапы протокола оптимизированы, чтобы избежать ухудшения митохондрий. Поэтому в этом протоколе калибровка полярографических датчиков кислорода выполнялась до рассечения и пермеабилизации ткани седалищного нерва мыши.
1. Подготовка реагентов
- Подготовьте буфер сохранения тканей (TP Buffer).
- В сверхчистом водном растворе готовят следующие реагенты: 10 мМ буфера Ca-EGTA с 0,1 мкМ свободного кальция, 20 мМ имидазола, 20 мМ таурина, 50 мМ K-MES, 0,5 мМ DTT, 6,56 мМ MgCl2, 5,77 мМ АТФ, 15 мМ фосфокреатина (см. Таблицу материалов), рН 7,1. Хранить при температуре -20°C.
- Подготовьте буфер дыхания митохондрий (MR Buffer).
- В сверхчистом водном растворе готовят следующие реагенты: 0,5 мМ K2EGTA, 3 мМ MgCl2, 60 мМ MES, 20 мМ таурина, 10 мМ KH2PO4, 20 мМ HEPES, 110 мМ D-сахарозы, 1 мг/мл BSA (без жирных кислот) (см. Таблицу материалов), рН 7,4. Хранить при -20 °C.
- Готовят раствор сапонина, растворяя 5 мг сапонина (см. Таблицу материалов) в 1 мл буфера ТП (этап 1.1) и держат его на льду. Сапонин готовят свежим способом.
- Готовят Amplex Red путем повторного использования порошка (см. Таблицу материалов) с ДМСО для получения концентрации запаса 2 мМ и хранят при -20 °C во флаконе, защищенном от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать износа зонда путем замораживания и оттаивания, сделайте небольшие аликвоты для хранения не дольше 6 месяцев25.
2. Калибровка полярографических датчиков кислорода для респирометрии высокого разрешения (HRR)
- Очистите камеры HRR инструмента и шприцев (см. Таблицу материалов).
- Откройте камеры HRR, залейте дистиллированной водой до самого верха и перемешайте в течение 5 мин 3x. Повторить с этанолом, а затем снова с водой. Промывные пробки и шприцы водой/этанолом/водой по 3 раза каждая.
- Примените следующие параметры калибровки в программном обеспечении HRR (см. Таблицу материалов).
- В программном управлении HRR добавьте экспериментальную температуру (37 °C), параметры для датчика кислорода (усиление, 2; поляризационное напряжение, 800 мВ) и для амперометрического датчика (усиление, 1000; поляризационное напряжение, 100 мВ).
- Калибровка датчиков кислорода.
- Пипетка 2,1 мл MR Buffer (шаг 1.2) в каждую камеру. Закройте пробками и втягивайте воздух в камеру, пока не образуется пузырь. Перемешивайте при 37 °C в течение 1 ч в режиме калибровки до тех пор, пока поток кислорода на массу не станет стабильным.
- Выполнить воздушную калибровку полярографических датчиков кислорода в программном обеспечении в соответствии с протоколомпроизводителя 24.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этап калибровки выполняется только один раз перед экспериментом. Дополнительные эксперименты в той же среде дыхания и температуре могут быть выполнены после простой промывки камер (этап 2.1).
3. Рассечение и пермеабилизация седалищного нерва
- Удалите седалищный нерв, следуя приведенным ниже шагам.
- Усыпить животное путем вывиха шейки матки после извлечения из его клетки и осторожно удерживаемого для отдыха на скамейке.
- У усыпленного животного сделайте разрез ножницами в пояснице, начиная с позвоночника и продолжая вниз по бедру к стопе. Удалите кожу и мышцы, прикрепленные к нерву, а затем отрежьте и удалите весь седалищный нерв.
- Немедленно взвесьте ткань и поместите ее во флакон, наполненный холодным TB Buffer (4 °C). Выполните шаги 3.2-3.3 на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Масса влажных тканей используется для нормализации потребления кислорода и производственного потока АФК на следующих этапах. Если ткань не может быть взвешена немедленно, сохраните ее в холодном туберкулезном буфере. Процедура проводится в свежих тканях и не должна быть заморожена, чтобы избежать повреждения митохондрий.
- Для приготовления ткани поместите седалищный нерв в чашку Петри с достаточным количеством буфера TP, чтобы покрыть его. Удерживайте один конец нерва щипцами, а другой парой щипцов вытягивайте нервные пучки горизонтально.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура должна быть выполнена менее чем за 10 минут, чтобы избежать ухудшения состояния тканей. Ткань будет готова, когда ее можно будет визуализировать в виде прозрачных туманных слоев, противоположных предыдущей белой непрозрачной ткани (рисунок 1). - Во-первых, переложите очищенную ткань в небольшую посуду, содержащую 1 мл TP Buffer для пермеабилизации тканей. Чтобы начать пермеабилизацию, переложите ткань щипцами в посуду, содержащую 1 мл TP Buffer и 10 мкл сапонина (из исходного раствора, стадия 1.3).
- Аккуратно встряхните в микропластинчатом шейкере в течение 30 мин, затем переложите ткань щипцами в свежую посуду, содержащую MR Buffer (1 мл) и аккуратно встряхните в течение 10 мин. Перенесите ткань щипцами в калиброванную камеру HRR.
4. Потребление кислорода и определение производства АФК
- Заполните камеры HRR 2,1 мл буфера MR, добавьте Amplex Red (шаг 1,4) к конечной концентрации 5 мкМ и пероксидазу до 2 Ед/мл и добавьте пермеабилизированный седалищный нерв (шаг 3).
- Подключите флуоресцентные датчики прибора, выключите свет в разделе управления программного обеспечения и нажмите Connect to oxygraph. В поле "Протоколы редактирования" в программном обеспечении вставьте вес ткани, измеренный на этапе 3.1.3.
- Перейдите в раздел «Макет», выберите опцию «Удельный поток на единицу образца» и выберите Графики, чтобы одновременно получить доступ к показаниям потребления кислорода и, при необходимости, к производству H2O2 . Подождите ~10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это время требуется для стабилизации базального потока потребления кислорода без добавления субстрата (базального). Перед дальнейшими инъекциями убедитесь, что поток кислорода стабилизирован. - Вводят два импульса H2O2, каждый до конечной концентрации 260 мкМ, для последующей калибровки в камере.
- Введите 20 мкл сукцината (см. Таблицу материалов), субстрата митохондриального комплекса II, чтобы активировать митохондриальную систему переноса электронов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные митохондриальные субстраты могут быть добавлены на этом этапе для оценки митохондриальной функции различными комплексами. Репрезентативные результаты с различными субстратами для митохондриальных комплексов I и II показаны на рисунках 2 и 3. В этот момент одновременно наблюдается увеличение потребленияO2 и производстваH2 O2 одновременно на рисунке 3. - Добавьте 20 мкл аденозиндифосфата (АДФ) для активации синтеза аденозинтрифосфата (АТФ).
ПРИМЕЧАНИЕ: АДФ стимулирует синтез АТФ и снижает мембранный потенциал. Ожидается рост потребленияО2 и снижение производстваН2О2 ожидается26,27. - В последовательности добавляют 5 мкл цитохрома c (см. Таблицу материалов) в качестве индикатора целостности мембраны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань хорошо подготовлена и пермеабилизирована, цитохром c не должен увеличивать потребление кислорода более чем на 15%. Если это произойдет, обратитесь к разделу устранения неполадок для получения рекомендаций. - Титруйте с аликвотами 0,2 мкг/мл олигомицина (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока не наблюдается дальнейшего снижения потребленияО2 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Олигомицин действует путем ингибирования синтеза АТФ, что приводит к уменьшению потокаО2 и усилению образованияН2О2, чему способствует высокий мембранный потенциал26,27. - Титруйте с аликвотами 0,5 мкмоль/л карбонилцианида 4-(трифторметокси)фенилгидразона (FCCP) (см. Таблицу материалов), митохондриального разъединителя, до тех пор, пока не удастся наблюдать дальнейшего увеличения потребленияО2 . Чтобы закончить эксперимент, вводят 2 мкл антимицина А до конечной концентрации 5 мкМ и ждут стабилизации потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение продукцииH2O2 наблюдается из-за диссипации мембранного потенциала после инъекции FCCP. Антимицин А ингибирует комплекс III, тем самым предотвращая поток электронов. Таким образом, митохондриально-зависимое потребление O2 нарушается, уменьшая поток кислорода на массу и стимулируя утечку электронов, увеличивая выработкуH2 O2 26,27. - Перейдите в панель команд, найдите «мультисенсорный» в программном обеспечении, нажмите «Управление > «Сохранить файл» и «Отключить».
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление других субстратов и ингибиторов может быть выполнено в соответствии с исследуемым вопросом. Пример описан в репрезентативных результатах. КалибровкаH2 O 2 выполняется после завершения эксперимента, согласно протоколупроизводителя 28. - Откройте сохраненный файл и выберите трассировку «Поток кислорода на массу», чтобы получить результаты экспериментального потребления кислорода. Вручную выберите окно между инъекциями, нажав Shift + Левая кнопка мыши.
- Перейдите в Marks > Statistics , чтобы визуализировать результаты для каждой инъекции субстрата/ингибиторов/несвязанного протокола. Для производства H2O2 выполните ту же процедуру со следом «Amp-Slope».
ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе окна избегайте артефактов объемных инъекций, выбрав окно, в котором кислород (или H2O2) более стабилен и постоянен. Примеры выбранных окон представлены черными фигурными скобками в репрезентативных результатах (рисунок 2 и рисунок 3).
- Перейдите в Marks > Statistics , чтобы визуализировать результаты для каждой инъекции субстрата/ингибиторов/несвязанного протокола. Для производства H2O2 выполните ту же процедуру со следом «Amp-Slope».
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Потребление митохондриального кислорода пермеабилизированным седалищным нервом представлено на рисунке 2. Красный след представляет собой поток O2 на единицу массы в pmol/s.mg. После регистрации базального потребления кислорода эндогенными субстратами (рутинное дыхание) вводится сукцинат (SUCC) для записи дыхания, управляемого комплексом II (сукцинатдегидрогеназа), что приводит к увеличению скорости потребления кислорода. Последовательно добавляется насыщенная концентрация АДФ, активирующая АТФ-синтазу и приводящая к окислительному фосфорилированию. Это приводит к фосфорилативному состоянию митохондриального дыхания. Фосфорилативное дыхание означает, что АТФ-синтаза может продуцировать АТФ из АДФ + Пи (неорганический фосфат), используя мембранный потенциал, образованный протонным градиентом, в качестве протонно-движущей силы для генерации АТФ26. При снижении мембранного потенциала, стимулируемого активностью АТФ-синтазы, ускоряется потребление кислорода, наблюдается увеличение потока кислорода. Добавление экзогенного цитохрома c (CYTC) способствовало лишь минимальной стимуляции дыхания, удостоверяя целостность наружной мембраны митохондрий для этого препарата. Пермеабилизация тканей может повредить целостность мембраны и потерять цитохром с. Повышенные показатели дыхания более чем на 10%-15% свидетельствуют о повреждении митохондрий и недостаточной подготовке тканей28,29. В этом репрезентативном результате наблюдается увеличение дыхания на 8,7%, что свидетельствует о хорошем качестве тканевого препарата (табл. 1). Титрование олигомицином (ОЛИГО) необходимо проводить с минимальными дозами, чтобы избежать достижения концентрации ОЛИГО, которая может помешать максимальной оценке емкости30. Ингибирование АТФ-синтазы OLIGO - или дыхание состояния 4 олигомицином26 - приводило к снижению потока потребления кислорода. Титрование с помощью FCCP, реагента митохондриального разъединителя, рассеивает митохондриальный мембранный потенциал, стимулируя поток дыхания и отображая максимальную емкость для переноса электронов (максимальная емкость ETS). В конце эксперимента вводится антимицин А (АА), ингибитор комплекса III, для ингибирования митохондриального дыхания и регистрации немитохондриального потребления кислорода (остаточное дыхание) (рисунок 2). Абсолютные потоки кислорода, зарегистрированные в этом репрезентативном эксперименте, рассчитываются в таблице 1.
Возможность анализа потребления митохондриального кислорода одновременно с продукцией реакционноспособного кислорода (АФК) – определяемая путем обнаружения перекиси водорода (Н2О2) компанией Amplex Red с помощью флуоресцентных датчиков – является большим преимуществом для определения биоэнергетического профиля и стандартным инструментом для выявления митохондриальной дисфункции при различных патологиях. Добавление различных субстратов для различных комплексов для подпитки митохондриальной ЭТ также может дать больше информации о конкретных участках митохондриальной дисфункции. Фиг.3 показана с одновременным измерением расхода кислорода (Фиг.3А) и производства АФК (Фиг.3В) в присутствии различных подложек, обеспечивающих топливо для ЭТС. После регистрации базального дыхания пируват + малат (ПМ) добавляют в камеру в качестве субстрата для митохондриального комплекса I, увеличивая поток потребления кислорода. Добавление SUCC, субстрата комплекса II, также увеличивает дыхание, но дальнейшее добавление пальмитоил-карнитина (PC) не увеличивает поток кислорода по сравнению с более ранними добавлениями субстрата, предполагая, что PM и SUCC, возможно, уже насытили сайт митохондриального убихинона или отсутствие окисления жирных кислот. Как и ожидалось, производство АФК также увеличивается после добавления субстратов, представляющих собой утечку кислорода, который выходит из ETS и образует ROS (рисунок 3B, зеленый след). Добавление АДФ в насыщенную концентрацию увеличивает потребление кислорода, стимулируя образование АТФ (красный след на рисунке 3А) и уменьшая выработку АФК (рисунок 3В, зеленый след). Добавление CYTC только увеличивает поток кислорода на 6,8%, подтверждая целостность митохондриальной мембраны. Титрование с помощью OLIGO уменьшает поток потребления кислорода (красный след на рисунке 3A) и увеличивает производство АФК (зеленый след на рисунке 3B). Эффекты АДФ и ОЛИГО свидетельствуют о том, что пермеабилизированный седалищный нерв в этом протоколе может воспроизводить стандартное соотношение в митохондриальной физиологии, при котором увеличение потребления кислорода приводит к снижению мембранного потенциала и предотвращает выработку АФК31,32.
Добавление FCCP, как и ожидалось для разъединителя, увеличивает потребление кислорода до максимальной скорости, и в результате рассеивания мембранного потенциала снижается выработка АФК. Добавление ротенона, ингибитора комплекса I и АА, снижает потребление кислорода и увеличивает образование АФК (рисунок 3А,В), подтверждая, что митохондриальная физиология и биоэнергетический профиль в пермеабилизированном седалищном нерве сохраняются. Абсолютные значения потоков кислорода, зафиксированные в данном эксперименте, рассчитываются в таблице 2.
Рисунок 1: Подготовка седалищного нерва к пермеабилизации митохондрий. Все процедуры нужно выполнять на льду. (А) Седалищный нерв извлекают из усыпленной мыши и помещают в чашку Петри, содержащую буфер сохранения тканей при 4 °C. (B) Разделение пучков седалищного нерва щипцами. (С,Г) Ткань готова, когда она рассечена на полупрозрачные пучки, а не на исходную белую непрозрачную трубчатую структуру (А). Шкала = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативный результат потребления митохондриального кислорода в пермеабилизированном седалищном нерве мыши. Эксперимент представляет собой репрезентативный след одного экстракта седалищного нерва от усыпленной мыши. Седалищный нерв был проницаем ранее, как описано в разделе протокола. Инъекции обозначаются стрелками в определенное время. SUCC: сукцинат; АДФ: аденозиндифосфат; Цит c: цитохром c; ОЛИГО: олигомицин; FCCP: карбонилцианид 4-(трифторметокси)фенилгидразон; АА: антимицин А. Показана концентрация кислорода в реальном времени в виде [нмоль/мл] (синий след) и норма потребления кислорода в виде потока на единицу массы [пмоль/(s.mg)] (красный след). Черные брекеты представляют собой окна норм потребления кислорода, выбранные для результатов после каждой инъекции. Базальный относится к дыханию без субстратов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Результат потребления митохондриального кислорода в сочетании с производством АФК в пермеабилизированном седалищном нерве мыши. Показан репрезентативный след одного экстракта седалищного нерва от усыпленной мыши. Седалищный нерв был проницаем ранее, как описано в разделе протокола. Инъекции обозначаются стрелками в определенное время. H2O2: перекись водорода; ТЧ: пируват/малат; SUCC: сукцинат; ПК: пальмитоил-карнитин; АДФ: аденозиндифосфат; Цит c: цитохром c; ОЛИГО: олигомицин; FCCP: карбонилцианид 4-(трифторметокси)фенилгидразон; РОТ: ротенон; АА: антимицин А. (А) Показана концентрация кислорода в реальном времени в виде [нмоль/мл] (синий след) и норма потребления кислорода в виде потока на единицу массы [O2 пмоль/(s.mg)] (красный след). (B) Производство АФК демонстрируется в видефлуоресценцииH2 O 2 (фиолетовый след) и производственногоуклонаH2 O 2 [pmol/(s.mg)] (зеленый след) после калибровки. Черные брекеты представляют собой окна норм потребления кислорода, выбранные для результатов после каждой инъекции. Базальный относится к дыханию без субстратов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Субстратов | Дополнения | Норма потребления кислорода |
| Поток на массу (pmol/[s.mg]) | ||
| Базальный (без добавления) | никакой | 5.9 |
| Сукцинат (SUCC) | Одно дополнение 10 мМ | 16.9 |
| АДП | Одно добавление 1 мкМ | 28.5 |
| Цитохром c (CYTC) | Одно добавление 10 мкМ | 31 |
| Олигомицин А (ОЛИГО) | Титрование с добавлением 0,2 мкг/мл | 21.9 |
| ФКИП | Титрование с добавками 0,5 мкМ | 31.1 |
| Антимицин А (АА) | Одно добавление 5 мкМ | 11.3 |
Таблица 1: Протокол субстратов/разъединителей/ингибиторов/титрования (SUIT) и результаты норм потребления кислорода у пермеабилизированного седалищного нерва мышей. Потребление кислорода представлено в [O2pmol/(s.mg)], после каждого добавления протокола SUIT. Результаты получаются по среднему значению выбранных окон, отмеченных на рисунке 2.
| Субстратов | Дополнения | Потребление кислорода (O2 пмоль/[s.mg]) | Производство ROS (H2O2 pmol/[s.mg]) |
| Базальный (без добавления) | никакой | 5.77 | 0.53 |
| Пируват + Малат (PM) | Один импульс 5 мМ + 2,5 мМ | 7.17 | 0.58 |
| Сукцинат (SUCC) | Одно дополнение 10 мМ | 14.06 | 0.75 |
| Пальмитоилкарнитин (PC) | Два импульса по 25 мкМ | 14.68 | 0.79 |
| АДП | Одно добавление 1 мкМ | 22.9 | 0.25 |
| Цитохром c (CYTC) | Одно добавление 10 мкМ | 24.36 | 0.09 |
| Олигомицин А (ОЛИГО) | Титрование с добавлением 0,2 мкг/мл | 17.03 | 0.5 |
| ФКИП | Титрование с добавками 0,5 мкМ | 23.98 | 0.16 |
| Ротенон (ROT) | Одно добавление 1 мкМ | 19.75 | 0.48 |
| Антимицин А (АА) | Одно добавление 5 мкМ | 4.08 | 0.53 |
Таблица 2: Протокол субстратов/разъединителей/ингибиторов/титрования (SUIT) и результаты производства АФК в сочетании с показателями потребления кислорода у мышей, пермеабилизированных седалищным нервом. Потребление кислорода представлено в [O2 pmol/(s.mg)] и производстве ROS [H2O2 pmol/(s.mg)] после каждого добавления протокола SUIT. Результаты получаются по среднему значению выбранных окон, отмеченных на рисунке 3.
| Параметры митохондриальной функции | Расчеты по нормам потребления кислорода |
| Базальное дыхание | Базальное дыхание (флюс без добавления субстратов)28 |
| Остаточный расход кислорода (ROX) | [Поток после добавления АА] 28 См. |
| Комплекс I утечки дыхания | [Поток после добавления ТЧ] – [ROX]28,37 |
| Комплекс II утечек дыхания | [Поток после добавления SUCC] – [ROX]28,37 |
| Фосфорилативное состояние (емкость Oxphos) | [Поток после добавления ADP] – [ROX]28,43 |
| Нефосфорилативное состояние (утечечное дыхание) | [Флюс после добавления олигомицина] – [ROX]28 |
| Коэффициент контроля дыхания | [Фосфорилативное состояние / Нефосфорилирование] 28,43 руб. |
| Емкость ETS | [Поток после добавления FCCP] – [ROX]28,37 |
Таблица 3: Расчет параметров для оценки митохондриальной функции у пермеабилизированного седалищного нерва мыши. Параметры формулы оценки физиологии митохондрий по нормам потребления кислорода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Некоторые заболевания или состояния, сопровождающие невропатии, имеют митохондриальную дисфункцию в качестве фактора риска. Оценка функции митохондрий в периферических нервах имеет важное значение для выяснения того, как митохондрии действуют в этих нейродегенеративных состояниях. Оценка митохондриальной функции является трудоемкой из-за сложности метода изоляции и дефицита материала. Таким образом, разработка методов пермеабилизации тканей, которые не требуют выделения митохондрий, имеет важное значение.
Чтобы оценить функцию митохондрий в пермеабилизированных тканях, выбор химического вещества, которое может пронизывать клеточную плазматическую мембрану, не вмешиваясь в клеточное дыхание, имеет решающее значение. В периферических нервах, таких как седалищный нерв, состав миелина составляет около 70% липидов, большинство из которых составляют холестерин33,34. Выбор пермеабилизирующих агентов, таких как сапонин и дигитонин, которые взаимодействуют с молекулами холестерина, приводит к появлению пор, которые обеспечивают субстрату доступ к митохондриальному механизму, не вмешиваясь в другие клеточные компартменты35,36. В этом протоколе хорошо зарекомендовавший себя способ пермеабилизации мышечных волокон сапонином, описанный Пестой и Гнайгером24, адаптирован для седалищных нервов. Процедура пермеабилизации включает в себя еще один критический этап, касающийся разделения тканей, чтобы обеспечить доступ к субстратам, необходимым для записи интересующих митохондриальных параметров. Настоящая работа описывает этапы, а иллюстрации приведены для удовлетворительного разделения тканей на рисунке 1.
Записи о скорости дыхания митохондрий необходимы для установления различий в отношении неисправности комплексов митохондрий, нарушения окислительного фосфорилирования или нарушенных митохондрий. Респираторные заболевания и митохондриальные параметры определяются Chance и Williams26. В этой статье рутинное дыхание определяется как базальное дыхание, когда потребление митохондриального кислорода регистрируется без добавления экзогенных субстратов; емкость комплексов - когда субстраты для комплекса I или II добавляются к топливному расходу митохондриального кислорода, также называемому утечкой дыхания; фосфорилативное состояние - когда АДФ добавляется в последовательность комплексов субстратов и управляет синтезом АТФ; нефосфорилативное состояние – когда весь АДФ образуется в АТФ или с добавлением ингибитора АТФ-синтазы, олигомицина (или состояния 4); Максимальная емкость ETS - при добавлении митохондриального разъединителя FCCP; остаточное потребление кислорода (ROX) после добавления ротенона и антимицина А - когда потребление кислорода не связано с митохондриями. Описанная в данной работе методика оценки митохондриальной функции в седалищной нервной ткани методом HRR позволяет определить многочисленные дыхательные состояния и рассчитать внутреннюю митохондриальную функцию в пределах одного образца. Результаты испытаний протокола субстрата/несвязанных/ингибиторов могут быть использованы для получения параметров митохондриальной функции, из которых могут быть рассчитаны коэффициенты/факторы дыхательного контроля37, как показано в таблице 3. Оценка этих параметров сочетает в себе абсолютные показатели утечки в сочетании с максимальным митохондриальным дыханием и поднимает данные для диагностического значения 24,35,36,37,38,39.
Хотя митохондриальная дисфункция периферических нервов упоминается в литературе, существуют ограничения в демонстрации этих параметров. В модели нейропатии, индуцированной химиотерапией, снижение потенциала митохондриальной мембраны при лечении химиотерапевтическим агентом оксалиплатином и снижение активности in vitro комплексов I, II и III наблюдается в сенсорных аксонах периферического нерва (подкожного нерва)40,41. Однако отсутствует информация о контроле мембранного потенциала активности комплексов и образовании АТФ путем окислительного фосфорилирования, что является существенным параметром оценки митохондриальной функции. Кроме того, у диссоциированных седалищных нервов крыс Sprague-Dawley, проницаемых дигитонином, регистрация потребления кислорода демонстрируется только для фосфорилированного состояния, но не сравнивается с потреблением кислорода в присутствии ингибитора АТФазы или разъединителя22. В настоящем способе можно рассчитать коэффициент контроля дыхания в пермеабилизированном нерве (таблица 3) по сравнению с коэффициентом контроля дыхания изолированных митохондрий, обычно рассчитываемым из состояния3/состояния4 (или фосфорилативных/нефосфорилирующих состояний). С помощью метода, представленного в данной работе, можно оценить комплекс I, II емкости - поддержание целостности митохондриальной мембраны - и коэффициенты управления потоком, а также достичь максимальной емкости дыхания и остаточного потребления кислорода.
В литературе описаны различные методы пермеабилизации седалищного нерва для оценки потребления кислорода митохондриями. Методика пермеабилизации седалищного нерва продемонстрирована в протоколе с лечением сапонином и пермеабилизацией вихревым импульсом; однако было продемонстрировано только фосфорилативное состояние и максимальная емкость41. Кроме того, сравнивая представленные здесь значения для тех же параметров, поток кислорода, наблюдаемый Cooper et al.41 , на 70% ниже, демонстрируя, что существует повреждение митохондриальной мембраны, связанное с методом перемешивания. В настоящем протоколе разделение тканей сохраняет целостность митохондриальной мембраны, что подтверждается небольшим увеличением потока кислорода после добавления цитохрома c. Это особенность, которая позволяет регистрировать все митохондриальные параметры, обеспечивая полную запись митохондриального окислительного фосфорилирования и функции. Несмотря на то, что в методе пермеабилизации седалищного нерва коллагеназой значения потока кислорода сопоставимы с представленными здесь, увеличение почти на 20% наблюдается после добавления цитохрома c, что предполагает некоторый уровень повреждения митохондриальной мембраны21. При протоколе, описанном в данной статье, наблюдалось увеличение только на 6,3%-8,7% потока кислорода после добавления цитохрома с, что подтверждает преимущество настоящего способа в сохранении целостности митохондриальной мембраны и оптимизации регистрации потребления кислорода.
Митохондрии являются основным местом генерации активных форм кислорода (АФК), связанных с различными сигнальными процессами в седалищной нервной ткани и механизмами, связанными с патофизиологией при невропатиях42,43. Этот протокол позволил получить доступ к генерации перекиси водорода с помощью флуоресцентного датчика одновременно с потреблением кислорода. Как показано на рисунке 3, производство АФК чувствительно к изменениям митохондриальных респираторных состояний, подтверждая состояние целостности митохондрий и оптимизируя запись митохондриальной функции.
Другие методы, такие как внеклеточный анализатор потока (EFA), основанный на флуоресцентных датчиках для регистрации потребления кислорода, могут оценивать митохондриальную функцию периферических нервов в культивируемых клетках, таких как шванновские клетки или аксоны, в автоматизированном высокопроизводительном скрининговом устройстве. Однако есть некоторые преимущества в использовании полярографических датчиков, таких как HRR, включая, в частности, возможность следить за экспериментом в режиме реального времени, делать множественные инъекции субстратов/ингибиторов; таким образом, это позволяет оценить большее количество сложных функций в митохондриях в одном эксперименте и меньшую стоимость расходных материалов 24,35,38,39. Недостатком использования HRR по сравнению с EFA является отсутствие датчика подкисления сред (для анализа гликолитического потока) и ограниченные возможности рабочего процесса, что позволяет использовать только два образца одновременно.
Ограничения методов пермеабилизации тканей, необходимых для HRR, хорошо известны. Они включают в себя неспособность оценить митохондрии, когда АДФ ограничивает, и снижение частоты дыхания без связи по сравнению с изолированными митохондриями. Тем не менее, протокол пермеабилизации сапонин-седалищного нерва, описанный здесь - как адаптация протокола пермеабилизации мышечного волокна Pesta и Gnaiger24 - позволяет оценивать митохондриальные респираторные состояния и митохондриальные параметры без повреждения целостности митохондрий. Он также позволяет одновременно регистрировать потребление кислорода и выработку АФК в седалищном нерве, ткани с печально известными ограничениями для выделения митохондрий. Таким образом, этот протокол позволяет лучше оценить функцию митохондрий в периферических нервах и может предоставить преимущества исследователям в исследовании роли митохондрий в патофизиологических условиях, поражающих периферические нервы.
Устранение неполадок
Если наблюдается увеличение потребленияО2 после добавления цитохрома с к более чем 15% потока потребления кислорода, это указывает на то, что процедура пермеабилизации была очень сильной и вызвала повреждение митохондриальной структуры. Если это так, отбросьте и повторно запустите рассечение с более мягким разделением нервов и повторите шаги. Если некоторые введенные реагенты не демонстрируют ожидаемого эффекта в потреблении кислорода митохондриями или производствеH2O2, это, вероятно, связано с загрязнением камеры митохондриальными ингибиторами. В этом случае можно предпринять два действия: (1) возобновить эксперимент после промывки камер и шприцев (этап 2.1) или (2) добавить образец любого изолированного тканью митохондрия или гомогената перед выполнением шага 2.1. Добавление этих образцов будет поглощать митохондриальные ингибиторы и улучшать стадию очистки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Институтом Серрапилхейры, Фондом организации ампаро в Пескисе по вопросам развития Рио-де-Жанейро (ФАПЕРЖ), Национальным советом по научным вопросам и технологиям (CNPq) и Координационным советом по вопросам образования в Нижнем Бразилии (CAPES). Мы благодарны д-ру Антонио Галине Фильо, д-ру Монике Монтеро Ломели и д-ру Клаудио Масуде за поддержку с лабораторным оборудованием, а также доктору Марте Соренсон за добрые и ценные комментарии по улучшению статьи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K - Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G.
- Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
- Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
- Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
- Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
- Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson's disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
- Winklhofer, K. F., Haass, C.
- Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
- Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
- Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
- Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
- Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and 'plugging' of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
- Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
- Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
- Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
- Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, Elsevier Inc. (2019).
- Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
- Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
- Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
- Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. 80 (2014).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
- Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
- Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
- Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
- Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
- Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P.
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
- Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
- Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
- Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
- Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
- Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
- Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).
