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Biochemistry

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63690
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

Summary

Hochauflösende Respirometrie, gekoppelt mit Fluoreszenzsensoren, bestimmt den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung der mitochondrialen Atemfrequenzen und der ROS-Produktion im permeabilisierten Ischiasnerv.

Abstract

Mitochondriale Dysfunktion in peripheren Nerven begleitet mehrere Krankheiten, die mit peripherer Neuropathie verbunden sind, die durch mehrere Ursachen ausgelöst werden können, einschließlich Autoimmunerkrankungen, Diabetes, Infektionen, Erbkrankheiten und Tumoren. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion in peripheren Nerven der Maus kann aufgrund der geringen Probengröße, einer begrenzten Anzahl von Mitochondrien im Gewebe und des Vorhandenseins einer Myelinscheide eine Herausforderung darstellen. Die in dieser Arbeit beschriebene Technik minimiert diese Herausforderungen, indem sie ein einzigartiges Permeabilisierungsprotokoll verwendet, das an das für Muskelfasern verwendete Protokoll angepasst ist, um die mitochondriale Funktion des Ischiasnervs zu beurteilen, anstatt die Mitochondrien vom Gewebe zu isolieren. Durch die Messung der fluorimetrischen reaktiven Speziesproduktion mit Amplex Red/Peroxidase und den Vergleich verschiedener mitochondrialer Substrate und Inhibitoren in saponin-permeabilisierten Nerven war es möglich, mitochondriale Atmungszustände, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und die Aktivität von mitochondrialen Komplexen gleichzeitig nachzuweisen. Daher bietet die hier vorgestellte Methode Vorteile gegenüber der Beurteilung der mitochondrialen Funktion durch andere Techniken.

Introduction

Mitochondrien sind essentiell für die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit und erfüllen zahlreiche Zellfunktionen wie den Energiestoffwechsel (Glukose-, Aminosäure-, Lipid- und Nukleotidstoffwechselwege). Als primärer Ort der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sind Mitochondrien in mehreren Zellsignalprozessen wie Apoptose von zentraler Bedeutung und beteiligen sich an der Synthese von Eisen-Schwefel (Fe-S) -Clustern, dem Import und der Reifung von mitochondrialen Proteinen sowie der Aufrechterhaltung ihres Genoms und ihrer Ribosomen 1,2,3. Das mitochondriale Membrandynamiknetzwerk wird durch Fusions- und Spaltungsprozesse gesteuert, und sie verfügen auch über Maschinen zur Qualitätskontrolle und Mitophagie 4,5,6.

Mitochondriale Dysfunktion ist mit dem Auftreten mehrerer pathologischer Zustände wie Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit verbunden7. Störungen der mitochondrialen Funktion werden bei neurodegenerativen Erkrankungen festgestellt, die das zentrale Nervensystem betreffen, wie bei der Alzheimer-Krankheit 8,9, der Parkinson-Krankheit 10,11, der amyotrophen Lateralsklerose 12,13 und der Huntington-Krankheit 14,15 . Im peripheren Nervensystem wird ein Verlust der mitochondrialen Funktion in Axonen bei Immunneuropathien wie dem Guillain-Barré-Syndrom 16,17 beobachtet, und in Verbindung mit einer hohen mitochondrialen ROS-Produktion in Axonen führen diese Ereignisse zu einer MAP-Kinase-Aktivierung in Schwann-Zellen18. Dies zeigt, dass die mitochondriale Physiologie nicht nur für eine ortsspezifische Zelle, sondern für ein ganzes Gewebe unerlässlich sein kann. Bei der HIV-assoziierten distalen sensorischen Polyneuropathie (HIV-DSP) spielen Mitochondrien eine Rolle in dem Mechanismus, durch den das HIV-TAT-Protein (Transaktivator of Transkription) es HIV ermöglicht, sich effizient zu replizieren, sowie mehrere andere Rollen bei der HIV-Infektionspathogenese19, 20.

Die Beurteilung der mitochondrialen Physiologie des Ischiasnervs hat sich als wesentliches Ziel für die Untersuchung der Neuropathieherausgestellt 7,21,22. Bei der diabetischen Neuropathie deuten proteomische und metabolomische Analysen darauf hin, dass die meisten molekularen Veränderungen bei Diabetes die mitochondriale oxidative Phosphorylierung des Ischiasnervs und den Fettstoffwechselbeeinflussen 7. Diese Veränderungen scheinen auch frühe Anzeichen für einen durch Fettleibigkeit verursachten Diabeteszu sein 21. In einem Mausmodell der chemotherapieinduzierten schmerzhaften Neuropathie wird eine mitochondriale Beeinträchtigung des Ischiasnervs als Abnahme der oxidativen Phosphorylierung22 und eine Verringerung der Aktivitäten der mitochondrialen Komplexe, des Membranpotentials und des ATP-Gehalts23 nachgewiesen. Obwohl mehrere Gruppen mitochondriale Dysfunktion bei Neuropathien zitiert haben, beschränken sich diese Studien auf die Messungen der Aktivität in mitochondrialen Komplexen ohne Erhaltung der mitochondrialen Membranen, fehlende Bewertung der mitochondrialen Integrität oder Messungen des ATP-Gehalts als Parameter für die mitochondriale ATP-Produktion. Im Allgemeinen erfordert eine ordnungsgemäße Beurteilung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs und der ROS-Produktion die Isolierung von Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation in einem Percoll/Saccharose-Gradienten. Die Isolierung von Mitochondrien kann aufgrund der großen Menge an benötigtem Gewebe und des Verlusts und der Störung der Mitochondrien auch ein limitierender Faktor für Ischiasnervengewebe sein.

Die vorliegende Studie zielt darauf ab, ein Protokoll zur Messung der mitochondrialen Physiologie wie des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs und der ROS-Produktion im Ischiasnerv bereitzustellen, wobei die mitochondrialen Membranen erhalten bleiben und keine Mitochondrien isoliert werden müssen. Dieses Protokoll wird aus Sauerstoffverbrauchsmessungen in permeabilisierten Muskelfasern24 durch hochauflösende Respirometrie (HRR) angepasst. Die Vorteile dieses Verfahrens sind die Möglichkeit, Mitochondrien in kleinen Gewebemengen wie dem Ischiasnerv zu bewerten und mitochondriale Parameter in situ zu bewerten, wodurch die mitochondriale Umgebung, Struktur und das bioenergetische Profil erhalten bleiben, um ein physiologisch vertrauenswürdiges Ergebnis zu erhalten. Die mitochondrialen Atmungszustände wurden mit Substraten und Inhibitoren nach der Permeabilisierung des Ischiasnervs bestimmt, um die mitochondriale Bioenergetik und den Cytochrom-c-Koeffizienten für die Integrität der mitochondrialen Membran richtig zu beurteilen und einen Leitfaden für Schritte der Bewertung des mitochondrialen Elektronentransportsystems (ETS) und der Berechnung wesentlicher Parameter zu geben. Diese Studie kann Werkzeuge zur Beantwortung von Fragen in pathophysiologischen Mechanismen liefern, an denen der Ischiasnervenstoffwechsel beteiligt ist, wie z.B. periphere Neuropathien.

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Protocol

Das vorliegende Protokoll wird von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren in der Forschung, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) und den Richtlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren genehmigt. Der Ischiasnerv wird aus vier Monate alten männlichen C57BL / 6-Mäusen isoliert, die gemäß den institutionellen Richtlinien durch Zervixdislokation eingeschläfert werden. Die Protokollschritte sind optimiert, um eine Verschlechterung der Mitochondrien zu vermeiden. Daher wurde in diesem Protokoll die Kalibrierung von polarographischen Sauerstoffsensoren vor der Dissektion und Permeabilisierung des Ischiasnervengewebes der Maus durchgeführt.

1. Herstellung von Reagenzien

  1. Bereiten Sie den Gewebekonservierungspuffer (TP-Puffer) vor.
    1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien in Reinstwasserlösung vor: 10 mM Ca-EGTA-Puffer mit 0,1 μM freiem Kalzium, 20 mM Imidazol, 20 mM Taurin, 50 mM K-MES, 0,5 mM DTT, 6,56 mM MgCl2, 5,77 mM ATP, 15 mM Phosphokreatin (siehe Materialtabelle), pH 7,1. Bei -20°C lagern.
  2. Bereiten Sie den Mitochondrien-Atmungspuffer (MR-Puffer) vor.
    1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien in Reinstwasserlösung vor: 0,5 mMK2EGTA, 3 mM MgCl 2, 60 mM MES, 20 mM Taurin, 10 mM KH2 PO 4, 20 mM HEPES, 110 mM D-Saccharose, 1 mg/ml BSA (fettsäurefrei) (siehe Materialtabelle), pH7,4. Bei -20 °C lagern.
  3. Bereiten Sie die Sapolin-Stammlösung vor, indem Sie 5 mg Saponin (siehe Materialtabelle) in 1 ml TP-Puffer (Schritt 1.1) auflösen und auf Eis halten. Saponin wird frisch zubereitet.
  4. Bereiten Sie Amplex Red vor, indem Sie das Pulver (siehe Materialtabelle) mit DMSO resuspendieren, um eine Lagerkonzentration von 2 mM zu erhalten, und lagern Sie es bei -20 °C in einer vor Licht geschützten Durchstechflasche.
    HINWEIS: Um zu vermeiden, dass die Sonde durch Einfrieren und Auftauen abgenutzt wird, machen Sie kleine Aliquots für die Lagerung nicht länger als 6 Monate25.

2. Kalibrierung von polarographischen Sauerstoffsensoren für die hochauflösende Respirometrie (HRR)

  1. Reinigen Sie die HRR-Kammern des Instruments und der Spritzen (siehe Materialtabelle).
    1. HRR-Kammern öffnen, mit destilliertem Wasser bis zur Oberseite füllen und 5 min 3x umrühren. Wiederholen Sie mit Ethanol und dann noch einmal mit Wasser. Waschstopfen und Spritzen mit Wasser/Ethanol/Wasser je 3x.
  2. Wenden Sie die folgenden Kalibrierungseinstellungen in der HRR-Software an (siehe Materialverzeichnis).
    1. Addieren Sie in der HRR-Softwaresteuerung die experimentelle Temperatur (37 °C), die Parameter für den Sauerstoffsensor (Verstärkung, 2; Polarisationsspannung, 800 mV) und für den amperometrischen Sensor (Verstärkung, 1000; Polarisationsspannung, 100 mV).
  3. Kalibrieren Sie die Sauerstoffsensoren.
    1. Pipette 2,1 ml MR-Puffer (Schritt 1.2) in jede Kammer. Schließen Sie mit den Stoppern und saugen Sie Luft in die Kammer, bis sich eine Blase bildet. Im Kalibriermodus 1 h bei 37 °C umrühren, bis der Sauerstofffluss pro Masse stabil ist.
    2. Führen Sie eine Luftkalibrierung der polarographischen Sauerstoffsensoren in der Software gemäß dem Protokoll24 des Herstellers durch.
      HINWEIS: Der Kalibrierungsschritt wird vor einem Experiment nur einmal durchgeführt. Zusätzliche Experimente in gleichem Atmungsmedium und gleicher Temperatur können nach dem bloßen Waschen von Kammern durchgeführt werden (Schritt 2.1).

3. Dissektion und Permeabilisierung des Ischiasnervs

  1. Entfernen Sie den Ischiasnerv mit den folgenden Schritten.
    1. Euthanasieren Sie das Tier durch Zervixdislokation, nachdem Sie es aus seinem Käfig entfernt und sanft auf der Bank ruhen lassen.
    2. Machen Sie bei dem eingeschläferten Tier einen Schnitt mit einer Schere im unteren Rückenbereich, beginnend in der Nähe der Wirbelsäule und den Oberschenkel hinunter zum Fuß. Entfernen Sie Haut und Muskeln, die am Nerv befestigt sind, und schneiden und entfernen Sie dann den gesamten Ischiasnerv.
    3. Wiegen Sie das Gewebe sofort und legen Sie es in eine Durchstechflasche, die mit kaltem TB-Puffer (4 °C) gefüllt ist. Führen Sie die Schritte 3.2-3.3 auf dem Eis aus.
      HINWEIS: Das Nassgewebegewicht wird verwendet, um den Sauerstoffverbrauch und den ROS-Produktionsfluss in den folgenden Schritten zu normalisieren. Wenn das Gewebe nicht sofort gewogen werden kann, bewahren Sie es in einem kalten TB-Puffer auf. Das Verfahren wird in frischem Gewebe durchgeführt und darf nicht eingefroren werden, um mitochondriale Schäden zu vermeiden.
  2. Für die Gewebepräparation legen Sie den Ischiasnerv in eine Petrischale mit genügend TP-Puffer, um ihn zu bedecken. Halten Sie ein Ende des Nervs mit einer Pinzette und ziehen Sie mit einer anderen Pinzette die Nervenbündel horizontal heraus.
    HINWEIS: Dieses Verfahren muss in weniger als 10 Minuten durchgeführt werden, um eine Verschlechterung des Gewebes zu vermeiden. Das Gewebe ist bereit, wenn es als transparente neblige Schichten gegenüber dem vorherigen weißen undurchsichtigen Gewebe sichtbar gemacht werden kann (Abbildung 1).
  3. Übertragen Sie zuerst das gespreizte Gewebe in eine kleine Schale, die 1 ml TP-Puffer für die Gewebepermeabilisierung enthält. Um mit der Permeabilisierung zu beginnen, wird das Gewebe mit einer Pinzette in eine Schale überführt, die 1 ml TP-Puffer und 10 μL Saponin enthält (aus Stammlösung, Schritt 1.3).
    1. In einem Mikroplatten-Shaker vorsichtig für 30 min schütteln, dann das Gewebe mit einer Pinzette in eine frische Schale mit MR-Puffer (1 ml) geben und vorsichtig für 10 min schütteln. Überführen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in eine kalibrierte HRR-Kammer.

4. Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs und der ROS-Produktion

  1. Füllen Sie die HRR-Kammern mit 2,1 ml MR-Puffer, fügen Sie Amplex Red (Schritt 1.4) zu einer Endkonzentration von 5 μM und Peroxidase zu 2 E/ml hinzu und fügen Sie den permeabilisierten Ischiasnerv hinzu (Schritt 3).
    1. Schließen Sie die Fluoreszenzsensoren des Instruments an, schalten Sie die Lichter im Steuerungsbereich der Software aus und drücken Sie Mit Oxygraph verbinden. Geben Sie unter "Protokolle bearbeiten" in der Software das in Schritt 3.1.3 gemessene Gewebegewicht ein.
  2. Gehen Sie zu "Layout", wählen Sie die Option "Spezifischer Fluss pro Probeneinheit" und wählen Sie Plots aus, um gleichzeitig auf die Sauerstoffverbrauchsanzeige und, falls gewünscht, auf dieH2O2-Produktionzuzugreifen. Warten Sie ~ 10 min.
    HINWEIS: Diese Zeit ist erforderlich, um den basalen Fluss des Sauerstoffverbrauchs ohne zusätzliches Substrat (basal) zu stabilisieren. Stellen Sie vor weiteren Injektionen sicher, dass der Sauerstofffluss stabilisiert wird.
  3. Injizieren Sie zwei H2O2-Impulse mit jeweils einer Endkonzentration von 260 μM, um sie später in der Kammer zu kalibrieren.
  4. Injizieren Sie 20 μL Succinat (siehe Materialtabelle), ein substrat des mitochondrialen Komplexes II, um das mitochondriale Elektronentransportsystem zu aktivieren.
    HINWEIS: Verschiedene mitochondriale Substrate können an dieser Stelle hinzugefügt werden, um die mitochondriale Funktion durch verschiedene Komplexe zu bewerten. Repräsentative Ergebnisse mit unterschiedlichen Substraten für die mitochondrialen Komplexe I und II sind in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt. An dieser Stelle ist in Abbildung 3 ein gleichzeitiger Anstieg des O2-Verbrauchs und der H2O2-Produktion zu beobachten.
  5. Fügen Sie 20 μL Adenosindiphosphat (ADP) hinzu, um die Adenosintriphosphat (ATP) -Synthese zu aktivieren.
    HINWEIS: ADP stimuliert die ATP-Synthese und reduziert das Membranpotential. Es wird erwartet, dass ein Anstieg desO2-Verbrauchs und ein Rückgang der Produktion vonH2O2beobachtet werden26,27.
  6. Fügen Sie nacheinander 5 μL Cytochrom c (siehe Materialtabelle) als Indikator für die Membranintegrität hinzu.
    HINWEIS: Wenn das Gewebe gut vorbereitet und permeabilisiert ist, sollte Cytochrom c den Sauerstoffverbrauch nicht um mehr als 15% erhöhen. Wenn dies der Fall ist, suchen Sie im Abschnitt zur Fehlerbehebung nach Empfehlungen.
  7. Titrieren Sie mit Aliquots von 0,2 μg/ml Oligomycin (siehe Materialtabelle), bis kein weiterer Rückgang desO2-Verbrauchs beobachtet wird.
    HINWEIS: Oligomycin wirkt, indem es die ATP-Synthese hemmt, was zu einer Abnahme des O2-Flusses und einer Verbesserung derH2O2-Bildungführt, die durch das hohe Membranpotential 26,27 begünstigt wird.
  8. Titrieren Sie mit Aliquots von 0,5 μmol/L Carbonylcyanid 4-(Trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP) (siehe Materialtabelle), dem mitochondrialen Entkoppler, bis kein weiterer Anstieg desO2-Verbrauchs mehr beobachtet werden kann. Um das Experiment zu beenden, injizieren Sie 2 μl Antimycin A auf eine Endkonzentration von 5 μM und warten Sie auf die Stabilisierung des Flusses.
    HINWEIS: Eine Abnahme derH2O2-Produktionwird aufgrund der Membranpotentialdissipation nach der Injektion von FCCP beobachtet. Antimycin A hemmt den Komplex III und verhindert so den Elektronenfluss. Daher ist der mitochondrienabhängige O2-Verbrauch beeinträchtigt, was den Sauerstofffluss pro Masse verringert und den Elektronenverlust stimuliert, wodurch dieH2O2-Produktionum 26,27 erhöht wird.
  9. Gehen Sie in die Befehlsleiste, suchen Sie in der Software nach "multisensorisch", klicken Sie auf Control > Save file und Disconnect.
    HINWEIS: Die Zugabe anderer Substrate und Inhibitoren kann entsprechend der untersuchten Frage durchgeführt werden. Ein Beispiel ist in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben. DieH2O2-Kalibrierungwird nach Beendigung des Experiments gemäß dem Protokoll28 des Herstellers durchgeführt.
  10. Öffnen Sie die gespeicherte Datei und wählen Sie die Spur "Sauerstofffluss pro Masse", um die experimentellen Sauerstoffverbrauchsergebnisse zu erhalten. Wählen Sie das Fenster zwischen den Injektionen manuell aus, indem Sie Umschalttaste + Linke Maustaste drücken.
    1. Gehen Sie zu Marks > Statistics, um die Ergebnisse für jede Injektion von Substrat / Inhibitoren / entkoppeltem Protokoll zu visualisieren. Führen Sie fürdie H 2O 2-Produktion den gleichen Vorgang mit der Spur "Amp-Slope" durch.
      HINWEIS: Vermeiden Sie bei der Auswahl des Fensters Artefakte von Volumeninjektionen, indem Sie ein Fenster wählen, in dem Sauerstoff (oderH2O2)stabiler und konstanter ist. Beispiele für ausgewählte Fenster werden in den repräsentativen Ergebnissen durch schwarze geschweifte Klammern dargestellt (Abbildung 2 und Abbildung 3).

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Representative Results

Der mitochondriale Sauerstoffverbrauch durch den permeabilisierten Ischiasnerv ist in Abbildung 2 dargestellt. Die rote Spur stellt denO2-Fluss pro Masseneinheit in pmol/s.mg dar. Nach der Erfassung eines basalen Sauerstoffverbrauchs mit endogenen Substraten (Routineatmung) wird Succinat (SUCC) injiziert, um die durch Komplex II (Succinat-Dehydrogenase) angetriebene Atmung aufzuzeichnen, was zu einer Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs führt. In der Folge wird eine sättigende Konzentration von ADP hinzugefügt, die die ATP-Synthase aktiviert und die oxidative Phosphorylierung antreibt. Dies führt zu einem phosphorylativen Zustand der mitochondrialen Atmung. Phosphorylative Zustandsatmung bedeutet, dass die ATP-Synthase ATP aus ADP + Pi (anorganisches Phosphat) erzeugen kann, wobei das Membranpotential, das durch den Protonengradienten gebildet wird, als protonengetriebene Kraft verwendet wird, um ATP26 zu erzeugen. Mit der Abnahme des Membranpotentials, die durch die ATP-Synthase-Aktivität gefördert wird, wird der Sauerstoffverbrauch beschleunigt und ein Anstieg des Sauerstoffflusses beobachtet. Die Zugabe von exogenem Cytochrom c (CYTC) förderte nur eine minimale Stimulation der Atmung und bescheinigte die Integrität der mitochondrialen äußeren Membran für dieses Präparat. Permeabilisierung von Geweben kann die Membranintegrität und den Verlust von Cytochrom c schädigen. Erhöhte Atemfrequenzen von mehr als 10%-15% deuten auf beschädigte Mitochondrien und unzureichende Gewebepräparationhin 28,29. In diesem repräsentativen Ergebnis gibt es einen Anstieg der Atmung um 8,7%, was auf eine gute Qualität der Gewebepräparation hinweist (Tabelle 1). Die Titration mit Oligomycin (OLIGO) muss mit minimalen Dosen durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass eine Konzentration von OLIGO erreicht wird, die die Bewertung der maximalen Kapazitätbeeinträchtigen kann 30. Die Hemmung der ATP-Synthase durch OLIGO - oder die Atmung im Zustand 4 durch Oligomycin 26 - führte zu einem verringertenSauerstoffverbrauchsfluss. Die Titration mit FCCP, einem mitochondrialen Entkopplerreagenz, löst das mitochondriale Membranpotential auf, stimuliert den Atmungsfluss und zeigt die maximale Kapazität für den Elektronentransfer (ETS-Maximalkapazität) an. Am Ende des Experiments wird Antimycin A (AA), ein Inhibitor des Komplexes III, injiziert, um die mitochondriale Atmung zu hemmen und den nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch (Restatmung) aufzuzeichnen (Abbildung 2). Die absoluten Sauerstoffströme, die in diesem repräsentativen Experiment aufgezeichnet wurden, sind in Tabelle 1 berechnet.

Die Möglichkeit, den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch gleichzeitig mit der reaktiven Sauerstoffproduktion (ROS) zu analysieren - bestimmt durch Nachweis von Wasserstoffperoxid (H2O2)durch Amplex Red mit Fluoreszenzsensoren - ist ein großer Vorteil zur Bestimmung eines bioenergetischen Profils und ein Standardwerkzeug zur Erkennung von mitochondrialen Dysfunktionen in verschiedenen Pathologien. Die Zugabe verschiedener Substrate für verschiedene Komplexe zur Befeuerung des mitochondrialen ETS kann auch mehr Informationen über die spezifischen Stellen für mitochondriale Dysfunktion liefern. Abbildung 3 zeigt die gleichzeitige Messung des Sauerstoffverbrauchs (Abbildung 3A) und der ROS-Produktion (Abbildung 3B) in Gegenwart verschiedener Substrate, die Brennstoff für das ETS liefern. Nach der Erfassung der Basalatmung wird der Kammer Pyruvat + Malat (PM) als Substrat für den mitochondrialen Komplex I zugesetzt, wodurch der Sauerstoffverbrauchsfluss erhöht wird. Die Zugabe von SUCC, dem Substrat des Komplexes II, erhöht auch die Atmung, aber eine weitere Zugabe von Palmitoyl-Carnitin (PC) erhöht den Sauerstofffluss im Vergleich zu den früheren Substratzusätzen nicht, was darauf hindeutet, dass PM und SUCC möglicherweise bereits die mitochondriale Ubichinonstelle gesättigt haben oder einen Mangel an Fettsäureoxidation aufweisen. Wie erwartet, steigt die ROS-Produktion auch nach der Zugabe von Substraten, was das Austreten von Sauerstoff darstellt, der aus ETS austritt und ROS bildet (Abbildung 3B, grüne Spur). Die Zugabe von ADP in der Sättigungskonzentration erhöht den Sauerstoffverbrauch, treibt die ATP-Bildung (rote Spur in Abbildung 3A) und die ROS-Produktion ab (Abbildung 3B, grüne Spur). Die Zugabe von CYTC erhöht den Sauerstofffluss nur um 6,8%, was die Integrität der mitochondrialen Membran bestätigt. Die Titration mit OLIGO verringert den Sauerstoffverbrauchsfluss (rote Spur in Abbildung 3A) und erhöht die ROS-Produktion (grüne Spur in Abbildung 3B). ADP- und OLIGO-Effekte deuten darauf hin, dass der permeabilisierte Ischiasnerv in diesem Protokoll die Standardrelation in der mitochondrialen Physiologie replizieren kann, in der ein Anstieg des Sauerstoffverbrauchs zu einer Abnahme des Membranpotentials führt und die ROS-Produktionverhindert 31,32.

Die Zugabe von FCCP, wie für einen Entkoppler erwartet, erhöht den Sauerstoffverbrauch auf seine maximale Rate, und als Folge der Membranpotentialdissipation wird die ROS-Produktion verringert. Die Zugabe von Rotenon, einem Inhibitor der Komplexe I und AA, reduziert den Sauerstoffverbrauch und erhöht die ROS-Bildung (Abbildung 3A, B), was bestätigt, dass die mitochondriale Physiologie und das bioenergetische Profil im permeabilisierten Ischiasnerv erhalten bleiben. Die absoluten Werte für die in diesem Experiment aufgezeichneten Sauerstoffströme sind in Tabelle 2 berechnet.

Figure 1
Abbildung 1: Vorbereitung des Ischiasnervs zur Permeabilisierung der Mitochondrien. Alle Verfahren müssen auf Eis durchgeführt werden. (A) Der Ischiasnerv wird einer eingeschläferten Maus entnommen und bei 4 °C in eine Petrischale gegeben, die Gewebeerhaltungspuffer enthält. (B) Trennung von Ischiasnervenbündeln mit Pinzetten. (C,D) Das Gewebe ist bereit, wenn es in durchscheinende Büschel und nicht in die ursprüngliche weiße, undurchsichtige röhrenförmige Struktur (A) zerlegt wird. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentatives Ergebnis des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs im permeabilisierten Ischiasnerv der Maus. Das Experiment ist eine repräsentative Spur eines Ischiasnervenextrakts aus einer eingeschläferten Maus. Der Ischiasnerv war zuvor durchmeabilisiert, wie im Protokollabschnitt beschrieben. Injektionen werden zu bestimmten Zeiten als Pfeile angezeigt. SUKK: prägnant; ADP: Adenosindiphosphat; Cyt c: Cytochrom c; OLIGO: Oligomycin; FCCP: Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon; AA: Antimycin A. Echtzeit-Sauerstoffkonzentration als [nmol/ml] (blaue Spur) und Sauerstoffverbrauchsrate als Fluss pro Masseneinheit [pmol/(s.mg)] (rote Spur) sind dargestellt. Schwarze Zahnspangen stellen Fenster mit Sauerstoffverbrauchsraten dar, die für die Ergebnisse nach jeder Injektion ausgewählt wurden. Basal bezieht sich auf die Atmung ohne Substrate. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Das Ergebnis des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in Verbindung mit der ROS-Produktion im permeabilisierten Ischiasnerv der Maus. Eine repräsentative Spur eines Ischiasnervenextrakts von einer eingeschläferten Maus wird gezeigt. Der Ischiasnerv war zuvor durchmeabilisiert, wie im Protokollabschnitt beschrieben. Injektionen werden zu bestimmten Zeiten als Pfeile angezeigt. H2O2: Wasserstoffperoxid; PM: Pyruvat/Malat; SUKK: prägnant; PC: Palmitoyl-Carnitin; ADP: Adenosindiphosphat; Cyt c: Cytochrom c; OLIGO: Oligomycin; FCCP: Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon; ROT: Rotenon; AA: Antimycin A. (A) Echtzeit-Sauerstoffkonzentration als [nmol/ml] (blaue Spur) und Sauerstoffverbrauchsrate als Fluss pro Masseneinheit [O2 pmol/(s.mg)] (rote Spur) sind dargestellt. (B) Die ROS-Produktion wird nach Kalibrierung als H2O2-Fluoreszenz (violette Spur) undH2O2-Produktionssteigung[pmol/(s.mg)] (grüne Spur) nachgewiesen. Schwarze Zahnspangen stellen Fenster mit Sauerstoffverbrauchsraten dar, die für die Ergebnisse nach jeder Injektion ausgewählt wurden. Basal bezieht sich auf die Atmung ohne Substrate. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Substrate Ergänzungen Sauerstoffverbrauch Rate
Flussmittel pro Masse (pmol/[s.mg])
Basal (ohne Zusatz) nichts 5.9
Succinat (SUCC) Eine Addition von 10 mM 16.9
Adp Eine Zugabe von 1 μM 28.5
Cytochrom c (CYTC) Eine Zugabe von 10 μM 31
Oligomycin A (OLIGO) Titration mit Zugaben von 0,2 μg/ml 21.9
FCCP Titration mit Zugaben von 0,5 μM 31.1
Antimycin A (AA) Eine Zugabe von 5 μM 11.3

Tabelle 1: SUIT-Protokoll (Substrate/Unkoppler/Inhibitoren/Titration) und Ergebnisse der Sauerstoffverbrauchsraten im permeabilisierten Ischiasnerv der Maus. Der Sauerstoffverbrauch wird in [O2pmol/(s.mg)] nach jeder Zugabe des SUIT-Protokolls dargestellt. Die Ergebnisse werden durch den Durchschnitt der in Abbildung 2 markierten ausgewählten Fenster ermittelt.

Substrate Ergänzungen Sauerstoffverbrauch (O2 pmol/[s.mg]) ROS-Produktion (H2O2pmol/[s.mg])
Basal (ohne Zusatz) nichts 5.77 0.53
Pyruvat + Malat (PM) Ein Puls von 5 mM + 2,5 mM 7.17 0.58
Succinat (SUCC) Eine Addition von 10 mM 14.06 0.75
Palmitoylcarnitin (PC) Zwei Impulse von 25 μM 14.68 0.79
Adp Eine Zugabe von 1 μM 22.9 0.25
Cytochrom c (CYTC) Eine Zugabe von 10 μM 24.36 0.09
Oligomycin A (OLIGO) Titration mit Zugaben von 0,2 μg/ml 17.03 0.5
FCCP Titration mit Zugaben von 0,5 μM 23.98 0.16
Rotenon (ROT) Eine Zugabe von 1μM 19.75 0.48
Antimycin A (AA) Eine Zugabe von 5 μM 4.08 0.53

Tabelle 2: Protokoll über Substrate/Entkoppler/Inhibitoren/Titration (SUIT) und Ergebnisse der ROS-Produktion gekoppelt an die Sauerstoffverbrauchsraten des permeabilisierten Ischiasnervs der Maus. Der Sauerstoffverbrauch wird in [O2 pmol/(s.mg)] und die ROS-Produktion durch [H2O2pmol/(s.mg)] nach jeder Zugabe des SUIT-Protokolls dargestellt. Die Ergebnisse werden durch den Durchschnitt der in Abbildung 3 markierten ausgewählten Fenster ermittelt.

Parameter für die mitochondriale Funktion Berechnungen aus dem Sauerstoffverbrauch
Basale Atmung Basale Atmung (Flussmittel ohne Zugabe von Substraten)28
Restsauerstoffverbrauch (ROX) [Flussmittel nach Zugabe von AA] 28
Komplex I leckt Atmung [Flussfluss nach Zugabe von PM] – [ROX]28,37
Komplex II Leckatmung [Flussmittel nach Zugabe von SUCC] – [ROX]28,37
Phosphorylativer Zustand (Oxphos-Kapazität) [Flussfluss nach Zugabe von ADP] – [ROX]28,43
Nicht-phosphorylativer Zustand (Leckrespiration) [Flussmittel nach Zugabe von Oligomycin] – [ROX]28
Atemkontrollverhältnis [Phosphorylativer Zustand / Nicht-phosphorylativ] 28,43
ETS-Kapazität [Flussfluss nach Zugabe von FCCP] – [ROX]28,37

Tabelle 3: Parameterberechnung zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion im permeabilisierten Ischiasnerv der Maus. Parameter für die mitochondriale physiologische Bewertungsformel durch Sauerstoffverbrauchsraten.

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Discussion

Mehrere Krankheiten oder Zustände, die Neuropathien begleiten, haben eine mitochondriale Dysfunktion als Risikofaktor. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion in peripheren Nerven ist unerlässlich, um aufzuklären, wie sich die Mitochondrien bei diesen neurodegenerativen Zuständen verhalten. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion ist aufgrund der Schwierigkeit der Isolationsmethode und der Materialknappheit mühsam. Daher ist die Entwicklung von Gewebepermeabilisierungstechniken, die keine Isolierung der Mitochondrien erfordern, unerlässlich.

Um die mitochondriale Funktion in permeabilisierten Geweben zu bewerten, ist die Wahl einer Chemikalie, die die Zellplasmamembran durchbluten kann, ohne die Zellatmung zu beeinträchtigen, von entscheidender Bedeutung. In peripheren Nerven wie dem Ischiasnerv besteht die Myelinzusammensetzung zu etwa 70% aus Lipid, von denen die meisten Cholesterin33,34 sind. Die Wahl von Permeabilisierungsmitteln wie Saponin und Digitonin, die mit Cholesterinmolekülen interagieren, führt zu Poren, die dem Substrat den Zugang zu mitochondrialen Maschinen ermöglichen, ohne andere zelluläre Kompartimente zu stören35,36. In diesem Protokoll ist die von Pesta und Gnaiger24 beschriebene bewährte Methode zur Muskelfaserpermeabilisierung durch Saponin für die Ischiasnerven geeignet. Das Permeabilisierungsverfahren umfasst einen weiteren kritischen Schritt in Bezug auf die Gewebetrennung, um den Zugang zu Substraten zu ermöglichen, die für die Aufzeichnung von mitochondrialen Parametern von Interesse erforderlich sind. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Schritte, und die Abbildungen sind für eine zufriedenstellende Gewebetrennung in Abbildung 1 vorgesehen.

Mitochondriale Atemfrequenzaufzeichnungen sind wichtig, um Unterschiede in Bezug auf Mitochondrienkomplexe, Fehlfunktionen, oxidative Phosphorylierungsstörungen oder gestörte Mitochondrien festzustellen. Atemwegserkrankungen und mitochondriale Parameter werden von Chance und Williams26 definiert. In diesem Artikel wird die Routineatmung als basale Atmung definiert, wenn der mitochondriale Sauerstoffverbrauch ohne Zusatz von exogenen Substraten aufgezeichnet wird; Komplexkapazität - wenn Substrate für Komplex I oder II zum mitochondrialen Sauerstoffverbrauch des Brennstoffs hinzugefügt werden, der auch als Leckatmung bezeichnet wird; phosphorylativer Zustand - wenn ADP in der Sequenz von komplexen Substraten hinzugefügt wird und die ATP-Synthese antreibt; nicht-phosphorylativer Zustand - wenn alle ADP in ATP oder unter Zugabe von ATP-Synthase-Inhibitor, Oligomycin (oder Zustand 4) gebildet werden; ETS maximale Kapazität - wenn der mitochondriale Entkoppler FCCP hinzugefügt wird und; Restsauerstoffverbrauch (ROX) nach Zugabe von Rotenon und Antimycin A - wenn der Sauerstoffverbrauch nicht mit den Mitochondrien zusammenhängt. Die in dieser Arbeit beschriebene Technik zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnervengewebe durch HRR ermöglicht die Bestimmung zahlreicher Atmungszustände und die Berechnung der intrinsischen mitochondrialen Funktion innerhalb derselben Probe. Die Testergebnisse eines Substrat-/Entkopplungs-/Inhibitorprotokolls können verwendet werden, um Parameter der mitochondrialen Funktion abzuleiten, aus denen Atemkontrollverhältnisse/-faktoren berechnet werdenkönnen 37, wie in Tabelle 3 gezeigt. Die Auswertung dieser Parameter kombiniert absolute Leckraten, gekoppelt mit maximaler mitochondrialer Atmung, und erhöht die Daten für einen Diagnosewert 24,35,36,37,38,39.

Obwohl in der Literatur eine mitochondriale Dysfunktion in peripheren Nerven zitiert wird, gibt es Einschränkungen beim Nachweis dieser Parameter. In einem chemotherapieinduzierten Neuropathie-Modell wird eine Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials bei Behandlung mit dem Chemotherapeutikum Oxaliplatin und eine Verringerung der In-vitro-Aktivität der Komplexe I, II und III in sensorischen Axonen des peripheren Nervs (Nervus saphenus)40,41 beobachtet. Es fehlen jedoch Informationen über die Kontrolle, die das Membranpotential auf die Aktivitäten der Komplexe und die Bildung von ATP durch oxidative Phosphorylierung ausübt, ein wesentlicher Parameter bei der Bewertung der mitochondrialen Funktionen. Auch bei dissoziierten Ischiasnerven von Sprague-Dawley-Ratten, die mit Digitonin permeabilisiert sind, wird die Aufzeichnung des Sauerstoffverbrauchs nur für den phosphorylierten Zustand nachgewiesen, aber nicht mit dem Sauerstoffverbrauch in Gegenwart eines ATPase-Inhibitors oder eines Entkopplers22 verglichen. Bei der vorliegenden Methode ist es möglich, das Atemkontrollverhältnis im permeabilisierten Nerv (Tabelle 3) im Vergleich zum Atemkontrollverhältnis isolierter Mitochondrien zu berechnen, das üblicherweise aus dem Zustand3/Zustand4 (oder phosphorylativen/nicht-phosphorylativen Zuständen) berechnet wird. Mit der in dieser Arbeit bereitgestellten Methode ist es möglich, komplexe I-, II-Kapazitäten - unter Beibehaltung der Integrität der mitochondrialen Membran - und Flusskontrollverhältnisse zu bewerten und maximale Kapazität der Atmung und des Restsauerstoffverbrauchs zu erreichen.

Verschiedene Methoden zur Permeabilisierung des Ischiasnervs zur Beurteilung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs werden in der Literatur beschrieben. Eine Technik zur Permeabilisierung des Ischiasnervs wird in einem Protokoll mit Saponinbehandlung und Permeabilisierung durch Wirbelpuls demonstriert; Es wurden jedoch nur der phosphorylative Zustand und die maximale Kapazitätgezeigt 41. Darüber hinaus ist der von Cooper et al.41 beobachtete Sauerstofffluss, der die hier dargestellten Werte für die gleichen Parameter vergleicht, um 70% niedriger, was zeigt, dass die mitochondriale Membran im Zusammenhang mit der Rührmethode geschädigt ist. Im vorliegenden Protokoll bewahrt die Gewebetrennung die Integrität der mitochondrialen Membran, die durch den geringen Anstieg des Sauerstoffflusses nach der Zugabe von Cytochrom c bestätigt wird. Dies ist eine Funktion, mit der alle mitochondrialen Parameter aufgezeichnet werden können, wodurch eine vollständige Aufzeichnung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung und Funktion bereitgestellt wird. Obwohl bei einer Ischiasnerv-Permeabilisierungsmethode mit Kollagenase die Sauerstoffflusswerte mit denen hier dargestellten vergleichbar sind, wird nach Zugabe von Cytochrom c ein Anstieg von fast 20% beobachtet, was auf ein gewisses Maß an Mitochondrienmembranschädenhindeutet 21. Mit dem in diesem Artikel beschriebenen Protokoll wurde eine Erhöhung des Sauerstoffflusses um nur 6,3%-8,7% nach Cytochrom-c-Zugabe beobachtet, was den Vorteil der vorliegenden Methode bei der Erhaltung der Integrität der mitochondrialen Membran und der Optimierung der Sauerstoffverbrauchserfassung bestätigt.

Mitochondrien sind der primäre Ort der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die mit verschiedenen Signalprozessen im Ischiasnervengewebe und Mechanismen im Zusammenhang mit der Pathophysiologie bei Neuropathienverbunden sind 42,43. Dieses Protokoll ermöglichte es, mit einem Fluoreszenzsensor gleichzeitig mit dem Sauerstoffverbrauch auf die Wasserstoffperoxiderzeugung zuzugreifen. Wie in Abbildung 3 beobachtet, reagiert die ROS-Produktion empfindlich auf Veränderungen der mitochondrialen Atmungszustände, was den mitochondrialen Integritätsstatus bestätigt und die mitochondriale Funktionsaufzeichnung optimiert.

Andere Methoden wie der extrazelluläre Flussanalysator (EFA), der auf Fluoreszenzsensoren zur Aufzeichnung des Sauerstoffverbrauchs basiert, können die mitochondriale Funktion des peripheren Nervs in kultivierten Zellen - wie Schwann-Zellen oder Axonen - in einem automatisierten Hochdurchsatz-Screening-Gerät bewerten. Es gibt jedoch einige Vorteile bei der Verwendung von polarographischen Sensoren wie HRR, einschließlich insbesondere der Fähigkeit, das Experiment in Echtzeit zu verfolgen, um mehrere Injektionen von Substraten / Inhibitoren durchzuführen; Dadurch ermöglicht dies die Bewertung einer größeren Anzahl komplexer Funktionen in Mitochondrien in einem Experiment und der niedrigeren Kosten von Verbrauchsmaterialien 24,35,38,39. Ein Nachteil der Verwendung von HRR im Vergleich zu EFA ist das Fehlen eines Sensors für die Medienversauerung (zur Analyse des glykolytischen Flusses) und die begrenzte Workflow-Fähigkeit, die die Verwendung von nur zwei Proben gleichzeitig ermöglicht.

Die Einschränkungen der für die HRR erforderlichen Gewebepermeabilisierungstechniken sind bekannt. Dazu gehören die Unfähigkeit, Mitochondrien zu bewerten, wenn ADP einschränkend ist, und eine reduzierte entkoppelte Atemfrequenz im Vergleich zu isolierten Mitochondrien. Das hier beschriebene Saponin-Ischiasnerv-Permeabilisierungsprotokoll - als Anpassung des Muskelfaser-Permeabilisierungsprotokolls durch Pesta und Gnaiger24 - ermöglicht jedoch die Beurteilung mitochondrialer Atmungszustände und mitochondrialer Parameter, ohne die mitochondriale Integrität zu schädigen. Es ermöglicht auch die gleichzeitige Aufzeichnung des Sauerstoffverbrauchs und der ROS-Produktion im Ischiasnerv, einem Gewebe mit berüchtigten Einschränkungen zur Isolierung von Mitochondrien. Somit ermöglicht dieses Protokoll eine bessere Beurteilung der mitochondrialen Funktion in peripheren Nerven und kann Forschern Vorteile bei der Untersuchung der mitochondrialen Rollen bei pathophysiologischen Zuständen bieten, die periphere Nerven betreffen.

Fehlerbehebung
Wenn derO2-Verbrauch nach Zugabe von Cytochrom c zu mehr als 15% des Sauerstoffverbrauchsflusses ansteigt, deutet dies darauf hin, dass das Permeabilisierungsverfahren sehr stark war und die mitochondriale Struktur schädigte. Wenn dies der Fall ist, verwerfen und beginnen Sie die Dissektion mit einer sanfteren Nerventrennung erneut und wiederholen Sie die Schritte. Wenn einige injizierte Reagenzien nicht die erwartete Wirkung beim Sauerstoffverbrauch der Mitochondrien oder bei derH2O2-Produktionzeigen, ist dies wahrscheinlich auf eine Kammerkontamination mit mitochondrialen Inhibitoren zurückzuführen. In diesem Fall können zwei Maßnahmen ergriffen werden: (1) Starten Sie das Experiment nach dem Waschen der Kammern und Spritzen neu (Schritt 2.1) oder (2) fügen Sie eine Probe von gewebeisolierten Mitochondrien oder Homogenaten hinzu, bevor Sie Schritt 2.1 ausführen. Die Zugabe dieser Proben absorbiert mitochondriale Inhibitoren und verbessert den Reinigungsschritt.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Studie wurde finanziert vom Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) und Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Wir danken Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli und Dr. Claudio Masuda für die Unterstützung mit Laboreinrichtungen und Dr. Martha Sorenson für die freundlichen und wertvollen Kommentare zur Verbesserung des Artikels.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate Sigma-Aldrich A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Amplex Red Reagent Thermo Fisher scientific A12222 Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.) Sigma-Aldrich A8674
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030 heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c Sigma-Aldrich C7752 (from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91 OROBOROS INSTRUMENTS, Austria Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V Thermo Fisher scientific 88882005
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
EGTA sodium salt Sigma-Aldrich E8145
Hamilton syringe Sigma-Aldrich HAM80075 10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W Merck H1009
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
Micro-dissecting forceps, curved Sigma-Aldrich F4142
Micro-dissecting forceps, straight Sigma-Aldrich F4017
O2K - Filter set Amplex Red OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44321-01 Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - module component Fluorscence-Sensor Green OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44210-01
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k OROBOROS INSTRUMENTS, Austria http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) Sigma-Aldrich P4509
Peroxidase from horseradish Sigma-Aldrich P8375
Petri dishes, polystyrene MERCK P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic Sigma-Aldrich PHR1330
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saponin Sigma-Aldrich SAE0073
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Taurine Sigma-Aldrich T0625

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Biochemie Ausgabe 183
Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie
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Formiga-Jr, M. A., Camacho-Pereira, J. Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (183), e63690, doi:10.3791/63690 (2022).

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