Summary
İnsektisitlerin kahve meyvesi delicisine (CBB) karşı toksisitesini test etmek için yeşil kahve meyvelerini (GF'ler) kullanan bir yöntem geliştirilmiştir. İnsektisitler veya toksik maddeler, CBB istilasından önce veya sonra dezenfekte edilmiş GF'lere uygulandı. Böcek mortalitesi, iticilik ve üreme kapasitesi, diğer parametrelere ek olarak değerlendirildi.
Abstract
Kahve meyvesi delici (CBB) Hypothenemus hampei'yi tedavi etmek için böcek öldürücüleri önermeden önce, bu böcek öldürücülerin yetişkin böceklere karşı mortalitesini ve kovuculuğunu veya üreme çıktısı üzerindeki etkilerini bilmek değerlidir. Bununla birlikte, şu anda mevcut yöntemler sadece yetişkin mortalitesini değerlendirmekte ve yeni insektisitlerin seçimini farklı bir etki şekli ile sınırlandırmaktadır. Bu çalışmada, laboratuvar koşullarında CBB üzerindeki çeşitli etkileri tanımlamak için farklı deneysel yöntemler incelenmiştir. Bunun için yeşil kahve meyveleri (GF'ler) toplandı ve sodyum hipoklorit çözeltisine daldırılarak ve ardından UV ışık ışınlaması ile dezenfekte edildi. Paralel olarak, bir koloniden CBB yetişkinleri, sodyum hipoklorit çözeltisine daldırılarak dezenfekte edildi. Meyve korumasını (ön istila) değerlendirmek için meyveler plastik kutulara yerleştirildi ve böcek öldürücüler uygulandı. Daha sonra, CBB yetişkinleri GF başına iki CBB oranında serbest bırakıldı. GF'ler, CBB istilasını ve 1, 7, 15 ve 21 gün sonra sağkalımı değerlendirmek için kontrollü koşullar altında bırakıldı. CBB istilasından (postinfestasyon) sonra insektisit etkinliğini değerlendirmek için, CBB yetişkinleri GF'lere 21 ° C'de 3 saat boyunca 2: 1 oranında salındı. CBB yetişkinlerini karınları kısmen açıkta bırakmış olarak gösteren istila edilmiş meyveler seçildi ve 96 kuyucuklu raflara yerleştirildi ve meyvelere sıkılan CBB'ler doğrudan tedavi edildi. 20 gün sonra, meyveler disseke edildi ve her meyvenin içindeki CBB biyolojik aşamaları kaydedildi. GF'ler, CBB'ye karşı toksik, kimyasal ve biyolojik böcek öldürücüleri değerlendirmek için doğal koşulları taklit eden substratlar olarak görev yaptı.
Introduction
Kahve meyvesi delici (CBB), Hypothenemus hampei, ilk olarak 1988'de Kolombiya'da tespit edildi ve o zamandan beri kahve mahsulünün en önemli haşere türü haline geldi. CBB dişileri, doğum meyvesini zaten döllenmiş olarak bırakır ve 1,2 yaydıkları uçucu kimyasallar tarafından yönlendirilen yeni meyveler ararlar. Tam bir döngü 23 gün içinde3 25 ° C sıcaklıkta yerine getirilir. Döngü, kurucu dişinin tohuma nüfuz etmesi ve meyve endospermine yumurta bırakması ile başlar. Kapalı larvalar tohumu yer. Meyveler bu noktada disseke edilirse, hem kurucu dişi hem de yavrularını gözlemlemek mümkün olacaktır. 14 gün sonra, larvalar genellikle pupa haline gelir, pupa aşaması 5 gün sürer. Yetişkin aşamasında, dişiler kardeşleriyle çiftleşir ve yeni döllenmiş dişiler, yeni bir döngü4'e başlamak için yeni kahve meyveleri arayan hasarlı meyvelerden uzaklaşırlar.
Hem penetrasyon süreci hem de larva beslemenin sonucu kahve tohumuna zarar verir, kahve içeceğinin kalitesini düşürür ve geliri önemli ölçüde azaltır; kahve tarlalarında% 5'ten fazla istila genellikle ekonomik eşik olarak kabul edilir.
CBB kontrolü, kültürel kontrol ve agronomik uygulamalar, doğal biyolojik ajanlar ve güvenlik koşulları ve zamanında uygulama gerektiren kimyasal böcek öldürücülerin kullanımı dahil olmak üzere entegre bir haşere yönetimi (IPM) stratejisine dayanmaktadır4.
CBB'nin kontrolü için yeni insektisitleri değerlendirmek için, hızlı sonuçların elde edilmesini sağlayan düşük maliyetli metodolojilere ihtiyaç vardır. İnsektisitlerin 5,6 dahil edildiği kahve içeren yapay diyetler veya böcek öldürücülerin kuru parşömen kahvesi 7,8,9 üzerine püskürtülmesi de dahil olmak üzere hem laboratuvar hem de saha prosedürleri şu anda kullanılmaktadır. Ayrıca entomolojik kollarla kaplı kahve ağacı dalları kullanılarak sahada yapılan deneyler10,11; ancak bu yöntemler yoğun emek ve uzun değerlendirme süreleri gerektirir.
Doğal alan koşullarına benzeyen, aynı zamanda hızlı ve ucuz olan bir durum, yeşil veya olgun kahve meyvelerinin kullanılmasıdır. Bununla birlikte, bu meyveler CBB'yi geliştirmek için uygun koşullar altında muhafaza edilmeli, kalitelerini ve özelliklerini korumak için mikroorganizmalar tarafından yapılan değişikliklerden ve kirleticilerden kaçınılmalıdır. Bu amaçla, farklı dezenfektanların yanı sıra ısıve radyasyon içeren prosedürler 7,9,12,13,14,15,16 kullanılmıştır.
Ek olarak, CBB'ye karşı insektisit değerlendirme yöntemleri, meyve aramak için uçan veya bu meyvelere nüfuz eden yetişkin dişilerin simülasyonlarını gerektirir17,18. Bunun için 8,11,19 tarlasında yapay meyve istilaları gerçekleştirilmiştir, ancak bu işlem emek yoğun ve çevresel koşullara bağlıdır.
Burada, saha koşullarına benzeyen kontrollü çevresel koşullar altında CBB üzerinde farklı etkileri olabilecek ürünlerin değerlendirilmesi için standartlaştırılmış bir metodoloji açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol, laboratuvar koşullarında CBB üzerindeki farklı etkileri tanımlamak için farklı yöntemleri ele almaktadır.
1. Meyve toplama
- Sabahın erken saatlerinde bir kahve plantasyonunda ağaçlardan çiçek açtıktan sonra ~ 120-150 gün gelişim yaşına sahip GF'leri seçin.
2. Meyve dezenfeksiyonu20
- Laboratuvara yaklaşık 300 GF getirin. Düzgün boyutlu ve sağlıklı GF'leri seçin ve pedinkülleri geri çekin.
- GF'leri bir sabun çözeltisine daldırın (998 mL musluk suyunda 2 mL sıvı bulaşık deterjanı), ardından GF'leri yıkamak için ovalayın. Ardından, meyveleri suyla durulayın, suyu üç kez değiştirin.
- GF'leri% 0.5 sodyum hipoklorit çözeltisine (900 mL musluk suyunda 100 mL) batırın ve 15 dakika boyunca 110 rpm'de bir çalkalayıcıda karıştırın. Daha sonra, GF'leri bir çalkalayıcıda karıştırarak ve suyu her 10 dakikada bir üç kez değiştirerek suyla durulayın.
- GF'leri steril kağıt havlularla kurulayın.
- GF'leri tepsilere (33 cm x 25 cm x 2 cm) yerleştirin ve UV özellikli yatay laminer akış istasyonunun içine UV kaynağından 55 cm mesafeye yerleştirerek 15 dakika boyunca ışınlayın.
- 15 dakikalık süre boyunca, her 5 dakikada bir, tüm meyvenin ışınlanmasını sağlamak için GF'leri hareket ettirin.
3. Böcek dezenfeksiyonu21
- Biyotahlilleri kurmak için yeni ortaya çıkan (aynı gün) CBB böceklerini kullanın.
- CBB'leri% 0.5 sodyum hipoklorit çözeltisine batırın, 10 dakika boyunca bir fırçayla yavaşça çalkalayın.
- CBB'leri müslin bir bezden süzün ve steril damıtılmış suyla üç kez yıkayın.
- Fazla suyu steril kağıt havlularla temizleyin.
4. Meyveler üzerinde koruyucu etkisi olan bir ürünün değerlendirilmesi (preinfestasyon) (Şekil 1)
- Deneysel birim başına bir grup GF kullanın. Genel olarak, deney birimi başına 30 GF'lik bir grup kullanılır.
- GF'leri plastik kutulara (deney ünitesi) yerleştirin.
- Değerlendirme için test ürününü farklı konsantrasyonlarda uygulayın. Uygulamayı portatif bir püskürtücü ünite ile gerçekleştirin. Burada %5 ve %6'lık bir alkaloid emülsiyon test edildi.
- Kontrol olarak, bir grup GF'yi suyla püskürtün.
- Tedavi başına en az üç tekrar (deney ünitesi) kullanın, birbiri ardına püskürtün.
- Steril bir başlıkta, GF başına iki CBB yetişkinini serbest bırakın (plastik kutulara toplam 60 CBB verilir). 30 dakika sonra kutuları örtün.
- Plastik kutuları istila edilmiş GF'lerle birlikte kontrollü koşullar altında (karanlık, 25 ± 2 °C ve bağıl nem% 71 ±% 5) bir odada veya inkübatörde bırakın.
- 1, 7, 15 ve 21 gün sonra, her kutudaki meyvelerin dışındaki daha delici meyvelerin ve canlı ve ölü böceklerin sayısını sayın.
- Enfestasyon sonrası 20 günde, her GF'yi bir stereomikroskop altında disseke edin, büyütme 10x.
- Her meyvedeki böcekler tarafından zarar görmüş sağlıklı tohumların veya tohumların sayısını sayın.
- Gözlemlenen farklı CBB biyolojik aşamalarını22 sayın ve deney birimi başına böcek ölümünü belirlemek için her tohumdaki ölü böceklerin sayısını sayın.
5. CBB istilasından sonra (postinfestasyon) bir ürünün etkisinin değerlendirilmesi (Şekil 3)
- Tedavi başına 200 meyve grupları kullanın.
- Asteril başlıkta, CBB yetişkinlerini (CBB yetişkinlerinin GF'lere 2: 1 oranı) daha önce dezenfekte edilmiş GF'lere bırakın ve istilanın 21 ° C'de 3 saat boyunca ilerlemesine izin verin.
- GF'leri inceleyin. 3 saat sonra, çoğu CBB'lerin karnı hala açıkta kalacak şekilde (pozisyon A20), Şekil 2'de gösterildiği gibi istila edilmelidir.
- 46 istila edilmiş GF'yi (A pozisyonu) seçin ve bunları 96 delikli plastik raflara (deney ünitesi) yerleştirin. Meyveler bu pozisyonda kalmalıdır, böylece işlem doğrudan meyveyi delen CBB'ye püskürtülebilir.
- Tedavi başına en az üç kez (üç raf) püskürtün, birbiri ardına 30 dakika sonra rafları kaplayın.
- Rafları istila edilmiş GF'lerle birlikte kontrollü koşullar altında (karanlık, 25 ± 2 °C ve bağıl nem% 71 ±% 5) bir odada veya inkübatörde bırakın.
- 20 gün sonra, GF'leri 10x büyütmede bir stereomikroskop altında inceleyin.
- Her meyvedeki böcekler tarafından zarar görmüş sağlıklı tohumların veya tohumların sayısını sayın.
- Deney birimi başına böcek ölümlerini belirlemek için farklı CBB biyolojik aşamaları22'yi ve her tohumdaki ölü böceklerin sayısını sayın.
6. CBB üzerinde caydırıcı etkisi olan bir ürünün değerlendirilmesi
- Meyveler üzerinde koruyucu etkisi olan bir ürünü değerlendirmek için belirtilen 4.1-4.6 adımlarını izleyin.
- CBB yetişkinlerini plastik kutulara bıraktıktan sonra, kutulardan uzaklaşan CBB'lerin sayısını ve GF'leri enfekte eden sayıyı sayın. Ardından, 4.7-4.11 arasındaki adımları izleyin.
- CBB istilasından sonra ürünü değerlendirmek için özetlenen 5.1-5.5 adımlarını izleyin.
- Her tedaviyi A pozisyonundaki böceklere püskürttükten sonra, GF'den çıkan ve / veya GF'den uzaklaşan CBB'lerin sayısını sayın. Ardından, 5.6-5.9 arasındaki adımları izleyin.
7. İstatistiksel analiz
NOT: Yanıt değişkenleri, zaman içindeki ölüm yüzdeleri ve sağlıklı istila edilmemiş kahve tohumlarının yüzdesidir.
- Her tedavi için her yanıt değişkeninin ortalama ve standart sapmasını tahmin edin.
- Tamamen rastgele bir tasarım için bir modelle her yanıt değişkeni için varyans analizi gerçekleştirin.
NOT: Dunnett'in% 5'lik karşılaştırma testi, tedavileri mutlak kontrol (su kontrolü) ile karşılaştırmak için gerçekleştirilir. - Tedaviler mutlak kontrolden önemli ölçüde farklı olduğunda, tedavileri karşılaştırmak için% 5 en az anlamlı fark (LSD) testi kullanın.
- Testin gücünü değerlendirmek; % 85'ten büyükse, varyansların normalliği ve homojenliği varsayımları karşılanır.
Şekil 1: İnsektisitlerin CBB üzerindeki preinfestasyon etkilerinin değerlendirilmesi için prosedür. İnsektisitlerin yeşil meyveler (GF'ler) kullanılarak Hypothenemus hampei (CBB) üzerindeki preenfestasyon etkilerini değerlendirme adımları. (A) Meyve seçimi. (B) İnsektisitlerin kahve meyvelerine püskürtülmesi. (C) GF başına 2: 1 CBB oranında kahve meyvelerinin CBB istilası. (D) İstilacı meyveler. (E) Meyvelerin kontrollü koşullar altında kuluçkalanması. (F) Meyve diseksiyonu. (G) Tohumların içindeki CBB popülasyonunu saymak. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kahve meyvelerinin CBB istilasını işleyin. İstilacı meyveler, karınları kısmen açıkta olan CBB yetişkinlerini içerir (pozisyon A). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İnsektisitlerin CBB üzerindeki pozinfestasyon etkilerinin değerlendirilmesi için prosedür. GF'leri kullanarak insektisitlerin CBB üzerindeki istila sonrası etkilerini değerlendirme adımları. (A) Meyve seçimi. (B) Meyvelerin CBB ile GF başına 2:1 CBB oranında istila edilmesi. (C) İstilacı meyvelerin seçimi. (D) İnsektisitin meyvelere püskürtülmesi. (E) Meyvelerin kuluçkalanması. (F) Meyve diseksiyonu. (G) CBB popülasyonunun sayılması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonuçlar, CBB dişilerinin meyveleri tanıdığını ve meyve yüzeyinin özelliklerine ve yayılan kokulara bağlı olarak, CBB dişilerinin meyvelere 21 ° C'de 3 saat içinde nüfuz etmeye veya sıkmaya başladığını göstermiştir.
Bir insektisitin kahve meyvelerine uygulandığında CBB üzerindeki etkisi (preinfestasyon prosedürü) 24 saat sonra ve zamanla Şekil 4'te gösterilmiştir. LSD testine göre, iki insektisit (% 5 ve% 6'da alkaloid emülsiyonu) 20. Günde yüksek böcek mortalitesine neden oldu (Tablo 1) ve su mutlak kontrolüne (P < 0.001) kıyasla önemli farklılıklar gösterdi. İnfüze edilmemiş sağlıklı tohumların yüzdeleri ile ilgili olarak (Tablo 1), Dunnett'in testine göre% 5 (P < 0.001) kontrol ve insektisit grupları arasında da farklılıklar vardı. Kontrol grubunda, tohumların% 37'si istila edilmemiş, böcek ilacı uygulaması tohumları korurken, insektisit 2 kullanıldığında tohumların% 94'ü ve insektisit 1 ile% 89'u sağlıklı kalmıştır.
Şekil 4: İnsektisitlerin kontroldeki preenfestasyon etkilerine karşı iki insektisit grubu. İnsektisitlerin preenfestasyon etkileri. Yetişkin H. hampei'nin yüzde mortalitesi, istiladan sonra 1, 7, 15 ve 21. günlerde değerlendirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Muamele | Deney ünitesi | Mortalite (%) | Sağlıklı tohum (%) | ||||
| Ortalama | Sd | Ortalama | Sd | ||||
| Kontrol (su) | 5 | 12.4 | 8.3 | 37 | 6.3 | ||
| İnsektisit 1 | 5 | 83.9 | *b | 3.9 | 89 | *b | 6 |
| Böcek ilacı 2 | 5 | 94.2 | *a | 3.2 | 94.2 | *a | 3.7 |
| * Her değişken için, Dunnett'in testine göre% 5'lik kontrol (su) ile ilgili farklılıklar. | |||||||
Tablo 1: Preinfestasyon tedavisinin CBB üzerine etkisi. Yüzde ölüm oranı ve yüzde20 gün sonra sağlıklı tohumlar. * Her değişken için, Dunnett'in testine göre% 5'lik kontrol (su) ile ilgili farklılıklar.
21 gün sonra preinfestasyon sonuçları Tablo 1'de gösterilmiştir ve zaman içindeki sonuçlar Şekil 4'e karşılık gelmektedir. Bu durumda, kahve meyveleri böcek ölümlerine neden olan toksik bir madde ile kaplanmıştır. Böcekler, meyvelerin üzerinde yürüdüklerinde, meyveleri palplarıyla tattıklarında veya meyvelerin epidermisini çiğnemeye başladıklarında emprenye olurlar. Ek olarak, meyve yüzeyine uygulanan maddeler meyvenin doğal kokusunu değiştirebilir veya değiştirebilir, bu nedenle CBB bireyleri istila sürecini durdurabilir, ya uçup gidebilir ya da meyveye dokunmadan veya istila etmeden ayrılmayı tercih edebilir. Ürünün etki süresine bağlı olarak, böcek ölümleri veya istila davranışından kaçınma 24 saat veya daha uzun süre devam edebilir.
Öte yandan, eğer ürünler böcekler meyveleri sıkmaya başladıktan sonra (postinfestasyon) uygulanırsa, ürünler böcek kütikülüne nüfuz ederek böcek ölümlerine neden olabilir (Tablo 2 ve Şekil 5). En yüksek mortalite insektisit 2 ile meydana geldi (P < 0.01). Ölüm oranı hızla meydana gelirse, böcek tohuma girmeden önce ölecek ve tohumların içinde yumurta veya böcek popülasyonu bulunmayacaktır.
Şekil 5: İnsektisitlerin istila sonrası etkileri. Yetişkin H. hampei'nin yüzde mortalitesi, istiladan sonra 1, 7, 15 ve 21. günlerde değerlendirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Muamele | Deney ünitesi | Mortalite (%) | Sağlıklı tohum (%) | ||||
| Ortalama | Sd | Ortalama | Sd | ||||
| Kontrol (su) | 5 | 11.1 | 3.0 | 57.3 | 3. 9 | ||
| İnsektisit 1 | 5 | 46.8 | *b | 6.6 | 79.2 | *b | 8.6 |
| Böcek ilacı 2 | 5 | 77.8 | *a | 3.7 | 90.0 | *a | 2.9 |
| * Her değişken için, Dunnett'in testine göre% 5'lik kontrol (su) ile ilgili farklılıklar. | |||||||
Tablo 2: Postenfestasyon tedavisinin CBB üzerine etkileri. 20 gün sonra yüzde ölüm oranı ve yüzde sağlıklı tohumlar. * Her değişken için, Dunnett'in testine göre% 5'lik kontrol (su) ile ilgili farklılıklar. Her değişken için farklı harfler LSD'ye göre %5 farklılık gösterir.
İnsektisitlerin etkileri, değerlendirmenin 20. gününde sağlıklı istila edilmemiş tohumların yüzdesi olarak yansıtılmaktadır (Tablo 2). Yüksek böcek ölümleri nedeniyle, böcek kahve tohumlarına nüfuz etmedi ve onlara zarar vermedi. Kahve tohumlarının %79-%90'ı arasında korunan ürünlerin uygulanması, tohumların %57'sinin sağlıklı olduğu kontrol açısından farklılıklar göstererek (P < 0.01). İki insektisit arasında da anlamlı farklılıklar gözlenmiştir (P < 0.01).
Bazı durumlarda, böcekler tohuma zarar vermeden önce bile çok hızlı bir şekilde öldüler. Bununla birlikte, böceğin ölümü daha uzun sürerse, böcek tohuma ulaşabilir ve bazı yumurtalar biriktirebilir ve daha sonra yetişkin ölecektir. Bu durumda, kahve çekirdeğinin içinde, su püskürtülen kontrol grubunda bulunan böcek popülasyonuna kıyasla azalmış bir böcek popülasyonu bulunmuştur (Tablo 3).
| Tedavi | Toplam Ortalama Böcek Popülasyonu / Tohumu | * Duncan gruplandırma (alfa= 00.05) |
| Kontrol | 5 | a |
| Entomopatojen | 2.5 | b |
| İtici madde | 3.27 | b |
| Entomopatojen + Kovucu | 1.5 | c |
| Her değişken için farklı harfler LSD'ye göre %5 farklılık gösterir. | ||
Tablo 3: Entomopatojen bir mantar ve itici bir madde ile tedaviden sonra istila sonrası etkiler. Tohumların içindeki böcek popülasyonu. GF'ler 15 günde diseke edildi. * Her değişken için, Dunnett'in testine göre% 5'lik kontrol (su) ile ilgili farklılıklar. Her değişken için farklı harfler LSD'ye göre %5 farklılık gösterir.
Şekil 6 , istila sonrası etkileri, bir entomopatojen ve itici bir maddenin etkisi olan bir ürünün etkisini ve bunların kombine etkilerini göstermektedir.
Şekil 6: Entomopatojen bir mantarın ve itici bir maddenin istila sonrası etkileri. Yetişkin H. hampei ve tohum hasarının yüzde ölüm oranı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu metodolojiler, toksik ürünlerin CBB üzerindeki farklı etkilerinin hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde meyvelerin yanı sıra böceklerin dezenfeksiyonu da kritik adımlardır. Tarladan elde edilen meyveler laboratuvarda kullanıldığında, epidermistemikroorganizmalar ve akarlar bulunduğundan sıklıkla yüksek kontaminasyon ve dehidrasyon gösterirler 7,15,16. Bu nedenle, dezenfekte edilmemiş meyve veya böceklerin kullanılması, bakteri veya mantar gibi mikroorganizmaların neden olduğu kontaminasyon nedeniyle böcek ölümüne neden olacak ve böylece biyotahlil sonuçlarına müdahale edecektir. Daha önce, Tapias ve ark.20, karbendazim ve benzalkonyum klorür gibi meyve dezenfeksiyonu için diğer antimikrobiyal ajanları değerlendirdi; Bununla birlikte, meyve dezenfeksiyonu iyi olmasına rağmen, bu bileşikler CBB veya çevre için oldukça toksiktir.
% 0.5 sodyum hipoklorit kullanımı, meyveleri çözeltiye 30 dakika ve 15 dakika batırarak değerlendirildi. Her iki uzunluktan sonra, mikroorganizmalar etkilendi, ancak CBB, çözeltinin oksitleyici gücü nedeniyle 30 dakikalık daldırmadan sonra da etkilendi23. UV ışığı, mikroorganizmaların DNA'sına zarar verir24, kontaminasyonu azaltır. Bununla birlikte, daha yüksek dozlarda (daha uzun maruz kalma süresi), nekroz ve tohum dehidrasyonuna neden olan meyve hasarı meydana gelir. Bu prosedürde 15 dakika boyunca% 0.5 sodyum hipoklorit ile dezenfeksiyonun ardından 15 dakika boyunca UV ışığına maruz kalmanın optimal olduğu bulunmuştur.
İkinci husus böcek kalitesidir. Bu çalışma için böcekler BIOCAFE25 (http://avispitas.blogspot.com/p/biocafe.html) adı verilen bir böcek yetiştirme ünitesi tarafından sağlanmıştır. Zayıf böcek kolonilerinden zayıf veya yetiştirilmiş böcekler, toksik bir ürünün sonuçlarını abartacaktır. Dahası, laboratuvar davranışı, bu durumda, yüksek uygunluğa sahip vahşi tip böceklerin saha gözlemlerine karşılık gelmeyecektir. Ek olarak, bu tür böcekler biyotahlil ile etkileşime girebilecek çok sayıda mikroorganizma içerebilir. Bu nedenle, dezenfeksiyon21 , metodolojinin başarısını sağlamak için önemli bir adımdır.
İstila ile ilgili olarak (bir meyveye iki böcek), daha önce daha fazla miktarda böcek kullanılmasının, birden fazla böcek delinmesi olan kahve meyvelerinin sayısını artıracağı ve analizi daha zor hale getireceği belirlenmişti20. Ek olarak, deneylerin yapıldığı sıcaklık, A pozisyonunda böceklerle meyve elde etmek veya meyveler püskürtüldüğünde normal bir böcek penetrasyonu elde etmek için önemlidir. 3 saat boyunca 21 ° C'lik bir sıcaklık kullanmak, meyvelerin% 70'inden fazlasının istila edilmesine izin verdi. Sıcaklık 25-27 ° C arasına yükseldiğinde, böceklerin çoğu 21 ° C'den daha kısa bir sürede B konumuna ulaştı. CBB'nin meyveye daha hızlı nüfuz etmesi, böceğin sıcaklık artışı nedeniyle daha büyük aktivitesinin bir sonucudur26. Bu nedenle, daha uzun süre 25 ° C'lik bir sıcaklık kullanmanın rahatsızlığı, birçok meyvenin birden fazla delikli ve hem A hem de B pozisyonlarında böceklerle bulunmasıdır.
Bu yöntemin geliştirilmesinden önce, maddeyi diyetin içine veya üzerine dahil ederek toksik maddelerin etkilerini değerlendirmek için öğütülmüş kahve içeren yapay böcek diyetleri kullanılmıştır 5,6; ancak, bu diyetler özel bileşenleri nedeniyle pahalıdır27,28. Parşömen kahvesi, kahve çekirdeklerinin değerlendirilecek maddeye serpiştirildiği veya daldırıldığı insektisit değerlendirmesi için de kullanılmıştır. Parşömenin yapısı ve bileşimi meyvenin perikarpınınkinden farklı olduğundan, böcek ilacı ve kahve arasındaki etkileşimin farklı olması beklenir. Parşömen kahvesi ile, insektisit molekülü kolayca emilebilir, böylece doğal koşullar altında gözlenenden daha fazla ölüm oranı üretir. Ek olarak, parşömen kahvesi nispeten daha pahalıdır, çünkü meyve özünden çıkarılması ve daha sonra kurutulması gerekir. Dahası, böcek büyümesi için doğal substrat değildir.
Sonuç olarak, gerçek yeşil kahvenin böcek büyümesi için yeterli besinlerle kullanılması, bileşiklerin simüle edilmiş doğal koşullar altında böceklere toksisitesini değerlendirmenin en uygun yoludur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbirinin beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Kolombiya Ulusal Kahve Yetiştiricileri Federasyonu'na, Entomoloji Bölümü asistanlarına (Diana Marcela Giraldo, Gloria Patricia Naranjo), Deney İstasyonu Naranjal'a ve Jhon Félix Trejos'a teşekkürlerini sunarlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker with spout, low form 500 mL | BRAND PP | BR87826 | |
| Benchtop Shaker | New Brunswick Scientific Innova 4000 Incubator Shaker | ||
| Dishwashing liquid soap-AXION | Colgate-Palmolive | AXION | |
| Hood; Horizontal Laminar Flow Station | Terra Universal | Powder-Coated Steel, 1930 mm W x 1118 mm D x 1619 mm H, 120 V (https://www.terrauniversal.com/hood-horizontal-laminar-flow-station-9620-64a.html) | |
| Insects CBB | BIOCAFE | (http://avispitas.blogspot.com/p/biocafe.html). | |
| Multi Fold White paper towels | Familia | 73551 | |
| Preval Spray unit | Preval Merck | Z365556-1KT | https://www.sigmaaldrich.com/CO/es/product/sigma/z365556?gclid=Cj0KCQiAweaNBhDEARIsAJ 5hwbfZOy1TWGj6huatFtRQt AzOyHe5-oBiKnOUK2T1exuuk WwJLdvxkvsaAjoYEALw_wcB |
| Reversible Racks 96-Well | heathrowscientific | HEA2345A | https://www.heathrowscientific.com/reversible-racks-96-well-i-hea2345a |
| Scalpel blades N 11 | Merck | S2771-100EA | |
| Scalpel handles N3 | Merck | S2896-1EA | |
| Sodium Hypochloride | The clorox company | Clorox | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi 508 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-508.html |
References
- Mendesil, E., et al. Semiochemicals used in host location by the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Journal of Chemical Ecology. 35 (8), 944-950 (2009).
- Jaramillo, J., et al. Coffee berry borer joins bark beetles in coffee klatch. PLoS ONE. 8 (9), 74277 (2013).
- Giraldo-Jaramillo, M., Garcia, A. G., Parra, J. R. Biology, thermal requirements, and estimation of the number of generations of Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) (Coleoptera: Curculionidae) in the state of São Paulo, Brazil. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2192-2200 (2018).
- Benavides, P., Góngora, C., Bustillo, A. IPM Program to Control Coffee Berry Borer Hypothenemus hampei, with Emphasis on Highly Pathogenic Mixed Strains of Beauveria bassiana, to Overcome Insecticide Resistance in Colombia. IntechOpen. , (2012).
- Martínez, C. P., Echeverri, C., Florez, J. C., Gaitan, A. L., Góngora, C. E. In vitro production of two chitinolytic proteins with an inhibiting effect on the insect coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Curculionidae) and the fungus Hemileia vastatrix the most limiting pests of coffee crops. AMB Express. 2, 1-11 (2012).
- Padilla, B. E., Acuña, Z., Velásquez, C. S., Rubio, G. J. D. Inhibitors of [alpha]-amylases from the coffee berry borer Hypothenemus hampei in different plant species. Revista Colombiana de Entomología. 32 (2), 125-130 (2006).
- Alvarez, J. H., Cortina, H. A., Villegas, J. F. Methods to evaluate antibiosis to Hypothenemus hampei Ferrari in coffee under controlled conditions. Cenicafé. 52 (3), 205-214 (2001).
- Arcila, A., Duarte, A. F., Villalba, D. A., Benavides, P. New Product in the Integrated Management of the Coffee Berry Borer in Colombia. National Coffee Research Center (Cenicafé). , Available from: https://biblioteca.cenicafe.org/handle/10778/477 (2014).
- Jaramillo, J., Montoya, E., Benavides, P., Góngora, C. Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae for the control of coffee brocade in fruits on the ground. Revista Colombiana de Entomología. 41, 95-104 (2015).
- Bastidas, A., Velásquez, E., Benavides, P., Bustillo, A., Orozco, C. Evaluation of preformulated Beauveria bassiana (Bálsam) Vuillemin, for the control of the coffee berry borer. Agronomia. 17, 44-61 (2009).
- Villalba-Gault, D., Bustillo, A., Chaves Cordoba, B. Evaluation of insecticides for the control of the coffee berry borer in Colombia. Cenicafe. 46, 152-163 (1995).
- Bustillo, A. E., Orozco, J., Benavides, P., Portilla, M. Mass production and use of parasitoids for the control of the coffee berry borer in Colombia. Cenicafe. 47 (4), 215-230 (1996).
- Celestino, F. N., Pratissoli, D., Machado, L. C., Santos Junior, H. J. G. D., Mardgan, L., Ribeiro, L. V. Adaptation of breeding techniques of the coffee berry borer [Hypothenemus hampei (Ferrari). Coffee Science. 11 (2), 161-168 (2016).
- Domínguez, L., Parzanese, M.
- Jaramillo, J., Chabi-Olaye, A., Poehling, H. M., Kamonjo, C., Borgemeister, C. Development of an improved laboratory production technique for the coffee berry borer Hypothenemus hampei, using fresh coffee berries. Entomologia Experimentalis et Applicata. 130 (3), 275-281 (2009).
- Pérez, J., Infante, F., Vega, F. E. Does the coffee berry borer (Coleoptera: Scolytidae) have mutualistic fungi. Annals of the Entomological Society of America. 98 (4), 483-490 (2005).
- Benavides, P., Gil, P., Góngora, C., Arcila, A. Integrated pest management. Cenicafe. Manual of the Colombian coffee grower: Research and technology for the sustainability of coffee growing. Manizales: FNC: Cenicafé. 3, 179-214 (2013).
- Bustillo, P. A review of the coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae), in Colombia. Revista Colombiana de Entomología. 32 (2), 101-116 (2006).
- Arcila, A., Benavides, P., Mejia, J. New Chemical Control Alternative for the Integrated Management of the Coffee Berry Borer. National Coffee Research Center (Cenicafé). , Available from: https://biblioteca.cenicafe.org/handle/10778/557 (2015).
- Tapias, L., Martinez, C., Benavides, P., Gongora, C. Laboratory method to evaluate the effect of insecticides on the coffee berry borer. Cenicafé. 68 (2), 76-89 (2017).
- Bustillo, A. E., Marín, P. How to reactivate the virulence of Beauveria bassiana to control the coffee berry borer. Manejo Integrado de Plagas. 63, (2002).
- Constantino, L. M., et al. morphological and genetic aspects of Hypothenemus obscurus and Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae). Revista Colombiana de Entomología. 37 (2), 173-182 (2011).
- Estrela, C., et al.
- Diffey, B. L. Solar ultraviolet radiation effects on biological systems. Physics in Medicine and Biology. 36 (3), 299-328 (1991).
- BIOCAFE. , Available from: http://avispitas.blogspot.com/p/biocafe.html (2022).
- Bustillo, A. E., et al. Integrated Management of the Coffee Berry Borer: Hypothenemus hampei Ferrari in Colombia. , Available from: https://biblioteca.cenicafe.org/hangle/10778/848 (1998).
- Portilla, R. Development and evaluation of an artificial diet for the rearing of Hypothenemus hampei. Cenicafé. 50, 24-38 (1999).
- Portilla, R. M., Streett, D. A. New techniques for automated mass production of Hypothenemus hampei on the modified Cenibroca artificial diet. Cenicafé. 57, 37-50 (2006).
