Summary
Описан протокол выделения мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека и их дифференцировки в линию скелетных мышц.
Abstract
Изучение терапевтического потенциала мезенхимальных стволовых клеток зависит от легкости изоляции, способности к дифференцировке, а также надежности и надежности источника. Мы описываем здесь поэтапный протокол выделения мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека (uMSCs), их иммунофенотипирования и распространения таких культур в течение нескольких проходов. В этой процедуре жизнеспособность uMSC высока, потому что нет ферментативного пищеварения. Далее удаление кровеносных сосудов, включая пуповинные артерии и вену, обеспечивает отсутствие загрязнения клеток эндотелиального происхождения. Используя проточную цитометрию, uMSC при выделении получают CD45−CD34−, что указывает на отсутствие клеток в кроветворной линии. Важно отметить, что они выражают ключевые маркеры поверхности, CD105, CD90 и CD73. После создания культур в данной работе описывается эффективный метод индуцирования дифференцировки в этих умСК в линию скелетных мышц. Детальный анализ миогенной прогрессии в дифференцированных умСК показывает, что умСК экспрессируют Pax7, маркер миогенных предшественников на начальных стадиях дифференцировки, за которым следует экспрессия MyoD и Myf5, и, наконец, терминальный маркер дифференцировки, тяжелая миозиновая цепь (MyHC).
Introduction
Считается, что пуповина человека обладает надежным резервуаром мезенхимальных стволовых клеток, которые в настоящее время исследуются для регенеративной терапии из-за их надежной скорости пролиферации и дифференцировки, иммуномодулирующих свойств и способности генерировать клетки из всех трех зародышевых слоев1. Пуповинная ткань состоит из нескольких компартментов, таких как пуповинная кровь, субэндотелий пуповинной вены и желе Уортона (WJ), которое само по себе охватывает три нечеткие области - периваскулярную зону, межсосудистую зону и субамнион или подкладку пуповины (CL)2. Хотя uMSC могут быть изолированы от всех этих различных регионов и широко выражать ключевые маркеры MSC, нет ясности в отношении того, содержат ли эти отсеки одну и ту же популяцию uMSC или демонстрируют различия в их дифференциационных потенциалах3. Следовательно, протоколы изоляции умСК требуют большей точности в их режиме и области изоляции, надежной характеристики потенциалов дифференциации и, наконец, сравнительного анализа из разных отсеков шнура.
В этом контексте немногие исследования продемонстрировали различия в пролиферативных и дифференцирующих потенциалах uMSC между различными частями пуповины. Из них сравнительный анализ между uMSCs, выделенными из областей CL и WJ, выявил больший пролиферативный потенциал в uMSCs, полученных из CL 3,4. В отдельном исследовании uMSC, полученные из WJ, показали лучшие результаты в анализах пролиферации по сравнению с периваскулярными клетками (HUCPV)5. При изучении различий между uMSC, полученными из пуповинной крови, и uMSC, полученными из пуповинной ткани, лишенными сосудистого загрязнения, сообщалось о дифференциальной экспрессии ключевых маркеров MSC между двумя компартментами, а также об увеличении скорости пролиферации в uMSCs6, полученных из пуповинной ткани.
Из нескольких исследований, изучающих потенциалы дифференциации uMSCs в основном в тканях линии мезодермы, таких как остеогенные, адипогенные и хондрогенные линии, очень немногие предоставили подробные протоколы для миогенной дифференциации и последующей характеристики, а также сравнительный анализ между различными отсеками пуповины. В этом контексте мы разработали надежный протокол дифференцировки мышц и отметили, что uMSCs, полученные из пуповинной ткани, демонстрируют превосходные возможности миогенной дифференцировки по сравнению с пуповинной кровью6. Здесь подробно описан поэтапный протокол для выделения uMSC из всей ткани пуповины, лишенной клеток, связанных с сосудистой системой, их характеристики и их дифференцировки в миогенную линию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование ткани пуповины в этом исследовании было одобрено Институциональным комитетом по исследованию стволовых клеток (IC-SCR), Комитетом по институциональной этике, Институтом науки и технологии трансляционного здравоохранения (IEC-THSTI), Комитетом по институциональной этике гражданской больницы, Гуруграм, Харьяна, и Институциональным комитетом по биобезопасности, THSTI. Образцы пуповинной ткани человека были собраны из доношенных родов во время родов. Информированное письменное согласие было получено от субъектов. Все методы проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами.
1. Выделение МСК из ткани пуповины
- Во время родов отрезают по меньшей мере 5 см пуповины, предпочтительно ближе к плаценте, и стерилизуют пуповину, смазывая внешнюю поверхность 70% этанолом. Перенесите кусок ткани пуповины последовательно из одной 50 мл коллекторной трубки, содержащей фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), в другую, содержащую то же самое. Транспортируйте на льду сборную трубку с именем субъекта в лабораторию в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более крупного исследования может быть полезно штрих-кодировать образцы, чтобы их можно было отслеживать на протяжении всего исследования. Важно отметить, что всему персоналу, работающему с тканями человека, должен быть предложен полный режим вакцинации против гепатита В. - В лаборатории включите ультрафиолетовое излучение в течение 25 минут в капоте BSL-2, чтобы стерилизовать автоклавные инструменты и пипетки перед использованием.
- Перенесите кусок пуповинной ткани из коллекционной трубки в чашку размером 10см2 , обработанную культурой ткани, содержащую PBS, обогащенную 5 г / л глюкозы, 50 мкг / мл гентамицина, 2,5 мкг / мл амфотерицина B, 100 ЕД / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (схема на рисунке 1).
- Используя скальпель, нарежьте ткань пуповины вертикально вдоль ее продольной оси, чтобы получить два полуцилиндрических куска. Из-за перекрута пуповины и слизистой поверхности зафиксируйте ткань парой щипцов, удерживаемых в другой руке.
- В этот момент наблюдайте за пупочными артериями и венами и удаляйте кровеносные сосуды с помощью скальпеля, чтобы соскоблить их в одном направлении с поверхности. Промыть ткань пуповины еще раз в PBS, чтобы удалить всю остаточную кровь, связанную с тканью. Убедитесь, что соскоб мягкий, чтобы сохранить целостность клеток в WJ, окружающих сосуды.
- Измельчите каждую половину ткани пуповины на фрагменты размером 0,5см3 и поместите осколки просветной поверхностью вниз на блюдо. Инкубировать блюдо кратковременно в течение 10 мин в увлажненной камере с температурой 37 °C, содержащей 5% CO2.
- После инкубации залить блюдо, содержащее кусочки ткани пуповины, 20 мл среды, содержащей MEM Alpha Modification без L-глутамина, рибо- и дезоксирибонуклеозидов, 15% фетальной бычьей сыворотки (не инактивированной теплом) и 50 мкг/мл гентамицина. Осторожно добавьте питательную среду по бокам, чтобы предотвратить смещение тканевых эксплантов от их ориентации. Добавьте избыточную среду, чтобы учесть фракцию, которая будет впитываться тканевыми эксплантами во время инкубации.
- После 3 дней инкубации добавить в культуры свежую среду. Убедитесь, что культуры защищены от ударов и движения эксплантов во время работы с посудой.
- Через 1 неделю удаляют фрагменты тканей по отдельности с помощью стерильных щипцов и выбрасывают, используя соответствующие пакеты биологической опасности для утилизации. Сохраните существующую среду и добавьте 10 мл свежей питательной среды. Заменяйте питательную среду каждые 4 дня, пока отдельные колонии не достигнут слияния 70%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вполне вероятно, что клетки не будут равномерно распределены по всему блюду, так как будут отдельные пролиферативные колонии, которые необходимо контролировать для слияния со временем. Как правило, в течение месяца блюдо размером 10см2 генерирует достаточно клеток, чтобы быть разделенным на отдельное блюдо. - Соберите адгезивные клетки, используя раствор трипсина/ЭДТА (1x 0,25% трипсина и 0,02% ЭДТА в растворе сбалансированной соли Хэнкса [HBSS]). Центрифугируют клеточную суспензию при 470 × г в течение 5 мин при 25 °С и повторно суспендируют клеточную гранулу в питательной среде.
2. Иммунофенотипирование и распространение uMSCS
- Приступают к иммунофенотипированию, как только адгезивные клетки достигнут 50-60% слияния и хорошо распространятся. Не выполняйте анализ маркеров MSC на полностью сливающихся культурах, так как это имеет тенденцию вызывать понижение регуляции ключевых маркеров MSC.
- После трипсинизации распределяют клеточную суспензию 1 × 106 клеток/мл в пробирках FACS (1 × 105 клеток/трубку) и окрашивают соответствующими флуорофор-связанными антителами (все разведение 1:50) в комбинации: неокрашенные; CD105 + CD90; CD105 + CD73; СД105; CD90; СД73; CD34 + CD45 (общий флуорофор); контроль изотипа для каждого флуорофора. Запишите общее количество событий не менее 10 000 на проточном цитометре для дальнейшего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку клетки анализируются для каждого маркера поверхности отдельно, наложение на подмножества ячеек не требуется. - В дополнение к вышеуказанным маркерам, подтверждают наличие положительных и отрицательных поверхностных маркеров в линиях uMSC, созданных из отдельных образцов ткани пуповины (таблица 1).
- Анализ меченых клеток методом проточной цитометрии и определение процента клеток CD105+CD90+ и CD105+CD73+ . Анализ клеток CD105+ и CD34−CD45− по отдельности.
3. Дифференциация умСК в скелетные мышцы
- Покрывайте пластины культуры тканей 0,01% коллагеном и 20 мкг/мл ламинина в PBS. Покрывайте эти пластины минимум 4 ч при комнатной температуре.
- Пластинчатые умСК при плотности 10 000 клеток/см2 в питательной среде.
- Когда клетки на 70% сливаются, аспирируйте питательную среду и промывайте культуры в 2 раза PBS. Добавьте к uMSCs миогенную дифференцировочную среду (M1), состоящую из DMEM + 5% конской сыворотки + 0,1 мкМ дексаметазона + 50 мкМ гидрокортизона. Для определения кинетики миогенного прогрессирования добавляйте в культуры среду М1 через день.
- Для определения кинетики миогенного прогрессирования анализируют uMSCs на экспрессию Pax7, MyoD, миогенина и MyHC через 2 дня, 4-5 дней, 6-7 дней и 10-14 дней соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успех выделения умСК из пуповинной ткани составляет >95%, в отличие от плохих показателей успеха из цельноповинной крови. После успешной изоляции uMSC анализ FACS показывает, что все клетки являются CD34−CD45−CD105+CD90+. Однако в сравнительном анализе uMSCs, выделенные из пуповинной крови, отображают гетерогенные популяции, в которых доля клеток показывает CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%). Кроме того, двойные положительные CD105 + CD90 + меньше по количеству (~ 5%) (Дополнительный рисунок S1). Это приводит к снижению уровня миогенной дифференцировки среди умСК из пуповинной крови, поскольку для индукции миогенеза требуется экспрессия CD105 и CD90. uMSC также отображают выражение маркеров, перечисленных в таблице 1. Если есть загрязнение uMSC, полученных из пуповинной крови, также будет присутствие клеток CD34 + CD45 + . Это приводит к ложному количеству клеток для покрытия для миогенной дифференцировки. Признаком того, что >90% клеток являются двойными положительными для экспрессии CD105 и CD90, является то, что uMSC не привержены какой-либо мезодермальной линии и продолжают оставаться мультипотентными, поскольку экспрессия CD105 и CD90 подавляется при дифференцировке. Крайне важно использовать несколько маркеров для подтверждения фенотипов uMSC, так как не существует единого окончательного маркера uMSC. В этом анализе мы оценили наличие всех маркеров, перечисленных в таблице 1 для каждой из линий uMSC, установленных в лаборатории. Кроме того, мы определили двойной положительный статус CD105 и CD90 (рисунок 2A), а также CD105 и CD73 (рисунок 2B), гарантируя, что uMSC выражают несколько ключевых маркеров. Это необходимо, чтобы избежать загрязнения одиночных положительных клеток, которые присутствуют в количестве менее 0,05%.
Рисунок 1: Схема, показывающая ступенчатую изоляцию и характеристику умСК из ткани пуповины. Аббревиатура: uMSCs = мезенхимальные стволовые клетки из ткани пуповины человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ маркеров MSC в uMSC, полученных из ткани пуповины. (A) uMSC отображают экспрессию CD105 и CD90 и не экспрессируют гемопоэтические маркеры, CD34 и CD45. Показаны репрезентативные графики FACS трех линий uMSC (UCT15, UCT18 и UCT26) (N = 16). Верхний ряд панелей показывает ячейки во всех трех линиях uMSC в квадранте Q2 положительный для экспрессии CD105 и CD90. Нижний ряд панелей показывает клетки в квадранте Q1 положительные для экспрессии CD105 и отрицательные для экспрессии CD34 и CD45. (B) uMSC отображают выражение маркера MSC, CD73 (N = 16). Аббревиатура: uMSCs = мезенхимальные стволовые клетки из ткани пуповины человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| положительные маркеры uMSC | отрицательные маркеры uMSC |
| СД105 | СД34 |
| СД90 | СД45 |
| СД73 | СД106 |
| СД29 | HLA DR |
| СД44 | СД31 |
| HLA ABC | СД14 |
| СД49е | СД49е |
| СД54 | |
| СД13 |
Таблица 1: Перечень положительных и отрицательных маркеров для uMSC. Аббревиатура: uMSCs = мезенхимальные стволовые клетки из ткани пуповины человека.
Для дифференцировки uMSC в миогенную линию uMSC обычно экспрессируют Pax7, маркер для клеток-предшественников в течение первых 2 дней после добавления M1, за которым следует MyoD в течение первых 4 дней добавления M1 (рисунок 3). Через 6 дней дифференцировки клетки экспрессируют белок миогенина с последующей экспрессией тяжелой цепи миозина (MyHC) между 10 днями и 14 днями индукции дифференцировки. Мы более подробно охарактеризовали кинетику миогенной экспрессии с использованием секвенирования РНК, проточной цитометрии, иммуноцитохимии, ОТ-ПЦР и западного блот-анализа для документирования поэтапной экспрессии миогенных маркеров, подтверждая надежность этого протокола. Транскриптомное секвенирование всего генома между недифференцированными uMSC и uMSC, которые были дифференцированы в скелетные мышцы, выявило повышение регуляции 907 генов в ответ на индукцию миогенной дифференцировки (рисунок 4).
Рисунок 3: Дифференциация uMSC в скелетные мышцы. uMSC культивировали в среде M1 в течение 2 дней, 4 дней, 7 дней и 10 дней и оценивали для (A) Pax7 через 2 дня, (B) MyoD через 4 дня, (C) экспрессии миогенина из различных линий uMSC, обозначаемых T8, T12, T14 и T25 через 7 дней, и (D) MyHC через 10 дней. Шкала стержней = (B, D) 50 мкм. Сокращения: uMSCs = мезенхимальные стволовые клетки из ткани пуповины человека; GAPDH = глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; MyoD = белок определения миобластов 1; MyHC = тяжелая цепь миозина; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; Mb = миобласт; МТ = миотубе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Сравнительное транскриптомное профилирование умСК, полученных из пуповинной крови и пуповинной ткани, дифференцированной в скелетные мышцы. Тепловая карта нормализованных подсчетов 907 генов между контрольными умСК и умСК дифференцированы в скелетные мышцы в течение 7 дней из пуповинной крови и пуповинной ткани. Диаграмма Венна (слева) показывает большее количество миогенных генов, регульгированных в uMSCs, полученных из пуповинной ткани, по сравнению с uMSCs, полученными из пуповинной крови. В приведенной ниже таблице показаны общие миогенные гены, регулируемые как в пуповинной ткани, так и в пуповинной крови. Эта цифра взята из Мишры и др.6. Сокращения: 1, 2 = биологические реплики; CB1,2 = миогенные клетки, полученные из умСК пуповинной крови; CT1, 2 = миогенные клетки, полученные из умСК ткани пуповины; coB1,2 = контрольные недифференцированные умСК из пуповинной крови; coT1, 2 = контроль недифференцированных умСК из ткани пуповины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
С целью проведения сравнительного анализа мы сравнили умСК, выделенные из пуповинной крови и пуповинной ткани. Данные секвенирования РНК показали, что в uMSC было больше миогенных генов, полученных из миогенных клеток, полученных из пуповинной ткани, чем из пуповинной крови (рисунок 4). Данные секвенирования РНК, используемые для поддержки этого исследования, загружаются в NCBI (присоединение к SRA - GSE147114). Вкратце, тканеспецифический транскриптомный анализ с использованием базы данных PANTHER GO-slim идентифицировал цитоскелетные белки, связанные с связыванием актина и саркомерной сборкой (TPM2, LDB3, PDLIM3, FHL1, NEXN, MYOM1), транспортерами, связанными с сократительной функцией (RTN2, SLC19A2, ACHE, SCN1B, SLC19A2, JPH2, KCNJ12, ANKRD1), поддержанием мышечной массы ( FBXO32, TRIM16L, GHR), передача сигналов кальция (FKBP5) и ферментативная функция (COX7A1, PDK4) (рисунок 4). В целом, эти данные демонстрируют, что uMSC, полученные из пуповинной ткани, представляют собой компартмент, демонстрирующий надежный миогенный потенциал.
Из-за индивидуальных различий между линиями uMSC, которые могут возникнуть из-за эффективности в изоляции, гетерогенности в пределах компартмента uMSC, возраста матери и состояния здоровья матери, включая ее уровни питательных веществ, могут быть различия в скорости пролиферации и миогенных потенциалах между установленными линиями uMSC. Однако, несмотря на различия в кинетике экспрессии, общая тенденция повышения миогенности при поэтапной экспрессии миогенных маркеров сохраняется.
Дополнительный рисунок S1: Анализ маркеров MSC в uMSCs, полученных из пуповинной крови. uMSCs отображают экспрессию CD105 и гемопоэтических маркеров, CD34 и CD45. Анализ популяции CD105+ показывает, что только небольшая часть этих клеток совместно экспрессирует CD90 (N = 5). Аббревиатура: uMSCs = мезенхимальные стволовые клетки из ткани пуповины человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги
Критическим этапом в этом протоколе является сбор ткани в асептических условиях, от момента доставки до поддержания стерильных культур, в течение всего периода размножения. Во время сбора пуповины важно, чтобы шнур не касался какой-либо нестерилизованной поверхности и был снаружи пропитан 70% этанолом перед сбором в пробирках, содержащих PBS, дополненные антибиотиками. Важно ограничить время между забором пуповины и обработкой ткани для выделения uMSC. В случае необходимости транспортировки ткани из места сбора в лабораторию необходимо позаботиться о поддержании ткани в антибиотикосодержащих буферах и хранении ее на льду.
Модификации и устранение неполадок метода
Ключевой модификацией в этом протоколе для индуцирования миогенной дифференциации умСК является покрытие посуды 0,01% коллагеном типа 1 и 20 мкг/мл ламинина. Мы наблюдали, что миогенная прогрессия в uMSCs в присутствии среды M1 усиливается, когда условия адгезии также модулируются. Необходимо проверить, может ли использование других превосходных, хотя и дорогих, матриц, таких как Matrigel, еще больше улучшить этот протокол. Различия в выходе между отдельными образцами могут привести к тому, что некоторые ткани генерируют более низкое количество клеток. В таких случаях может быть предпочтительнее собрать большую длину ткани пуповины, которая составляет >5 см. В этом контексте в немногих отчетах использовалось 10 см пуповинной ткани для увеличения выхода умСК. В большинстве докладов, описывающих выделение умСК из ткани пуповины, использовались ферменты, разрушающие внеклеточный матрикс, для увеличения высвобождения клеток из стромы пуповины 3,5,7,8. Использование эксплантных культур в нескольких исследованиях, включая этот отчет, постоянно продемонстрировало повышенную клеточную жизнеспособность и урожайность 6,9,10. Кроме того, отсутствие необходимости выполнять сортировку клеток для очистки клеточных популяций, которая часто включается в очистку uMSC от пуповинной крови, увеличивает количество клеток и целостность.
Ограничения метода
Ключевым ограничением метода является время, необходимое для полного установления линий uMSC из отдельных образцов ткани пуповины. Как правило, для генерации каждой линии uMSC с использованием этого протокола требуется 3 недели. После этого требуется 2 недели для полной миогенной дифференцировки. Эта увеличенная продолжительность исследования может быть громоздкой в больших когортах, изучающих потенциалы дифференциации uMSC от разных участников, с целью получения информации о внутриутробной среде или прогнозирования метаболических параметров органов потомства, таких как состав тела. Вторым ограничением является гетерогенность в матрице пуповинной ткани, которая может обладать внутренними фенотипическими различиями между различными компартментами uMSC и которая может быть ответственна за потенциалы дифференциации между различными источниками. Например, uMSC из WJ демонстрируют более низкий остеогенный потенциал по сравнению с uMSCs11, полученными из CL. Поэтому этот метод не описывает различия, присущие между различными компартментами внутри самой ткани пуповины.
Значение метода по отношению к существующим методам
Используя этот протокол, мы можем получить количество клеток 1 × 104 до 1 × 106 uMSC из отдельных образцов ткани пуповины. Эти линии uMSC могут быть надежно использованы для анализов не менее 6-8 проходов. Несмотря на степень вариации клеточных фенотипов, типичных для человеческих популяций, среднее время удвоения умСК, наблюдаемое в нашей когорте из 15 женщин из Северной Индии, составило менее 2 дней6. Анализ их пролиферативных показателей с использованием включения 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) показал, что, по крайней мере, 80% клеток прошли через S-фазу в течение 6 ч6. Кроме того, uMSC из пуповинной ткани также демонстрируют низкие показатели старения, что указывает на надежность этого метода изоляции6. Ранее мы сравнивали степень миогенной индукции в умСК с использованием этого протокола с той, которая используется для индуцирования миогенеза в человеческих и мышиных плюрипотенциальных стволовых клетках 6,12. Мы обнаружили, что этот протокол является более мощным индуктором миогенной дифференциации, чем существующие протоколы.
Важность метода и его применения
Успешная клеточная и регенеративная терапия зависит от клеточной жизнеспособности и выхода, требуя большого количества клеток из ранних проходов. Таким образом, этот метод предлагает удобную альтернативу для клинического применения. Надежный протокол миогенной дифференцировки, представленный в этом отчете, и углубленная молекулярная характеристика миогенной прогрессии с использованием этого протокола в нашей работе дополняют усилия по повторению миогенеза плода и могут быть использованы в качестве модели для имитации внутриутробной среды и отражения постнатального метаболизма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим г-на Оджаса Тику за их помощь в съемках и видеопроизводстве. Мы также признаем помощь, полученную от сотрудников GARBH-Ini (Междисциплинарная группа по перспективным исследованиям и результатам родов - DBT India), медсестер и старших научных сотрудников в гражданской больнице Gurugram и доктора Паллави Кшетрапала для помощи в логистике. Эта работа была поддержана грантами, предоставленными Сучитре Гопинатх от Департамента биотехнологии, Индия (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
