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Élevage de masse et études moléculaires chez les insectes nuisibles tortricidae

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/63737
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Applied Biological Science, Tokyo University of Agriculture and Technology

Summary

Le présent protocole décrit la méthode d’élevage des insectes ravageurs tortricides dans les laboratoires. Les procédures permettant de distinguer le sexe des insectes et d’extraire les acides nucléiques pour le séquençage à haut débit sont établies à l’aide de deux ravageurs tortricides.

Abstract

Les tortricidae (lépidoptères), communément appelés tortrix ou tordeuses, comprennent de nombreux ravageurs agricoles et forestiers, qui causent de graves pertes agricoles. Pour comprendre la biologie de ces papillons nuisibles, les techniques fondamentales ont été très demandées. Ici, des méthodes d’élevage de masse, d’observations et d’études moléculaires sont développées à l’aide de deux tortrix de thé, Homona magnanima et Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Les insectes ont été élevés en masse avec un régime artificiel tranché et maintenus par consanguinité pendant plus de 100 générations en tenant compte de leurs caractéristiques biologiques. Les insectes ont divers dimorphismes sexuels; par conséquent, il est difficile de distinguer le sexe pendant les stades de développement, qui ont empêché les tests ultérieurs. Le présent travail a mis en évidence que le sexe des larves de tortricides pouvait être déterminé en observant les testicules ou la coloration lactique-acétique de l’orcéine pour visualiser le chromosome W spécifique à la femelle. De plus, en utilisant les méthodes de détermination du sexe, la présente étude a permis d’extraire des acides nucléiques d’embryons déterminés par le sexe et de les appliquer au séquençage à haut débit. Ces conseils sont applicables à d’autres insectes nuisibles et faciliteront d’autres études morphologiques et génétiques.

Introduction

Les insectes lépidoptères représentent plus de 10 % de toutes les espèces vivantes décrites1, et certaines espèces de taxons causent de graves dommages aux plantes et de graves pertes agricoles 2,3. Bien que des études moléculaires et génétiques aient été développées à l’aide d’insectes modèles tels que le ver à soie Bombyx mori 4,5, les insectes nuisibles n’ont pas encore fait l’objet d’enquêtes, en partie à cause des difficultés d’élevage et de manipulation 6,7. Par conséquent, des études et des techniques fondamentales sont nécessaires pour comprendre la biologie de ces insectes nuisibles non modèles.

Les Tortricidae (Lépidoptères), communément appelés tortrix ou tordeuses, comprennent de nombreux ravageurs agricoles et forestiers8. Parmi les taxons d’insectes, la tortrix de thé orientale Homona magnanima Diakonoff et la tortrix de fruits d’été Adoxophyes honmai Yasuda sont de graves ravageurs polyphages connus pour endommager les théiers en Asie de l’Est7. Les deux espèces pondent des grappes d’œufs plates et ovales en forme d’écailles (ou masses d’œufs) constituées d’œufs minces, mous et fragiles recouverts de sécrétions maternelles. Bien que les stades de l’embryogenèse soient cruciaux pour le développement des insectes et la détermination du sexe9, les structures des œufs empêchent une analyse plus approfondie de comprendre la biologie des insectes. Il est important de surmonter les difficultés pour une étude plus approfondie sur les ravageurs ovipositant une masse d’œufs aussi complexe.

Ici, pour comprendre la biologie des tortricides, des méthodes d’élevage de masse, des observations et des études moléculaires ont été développées à l’aide de A. honmai et H. magnanima. Tout d’abord, les méthodes d’élevage de masse maintiennent les deux tortricides sur 100 générations par consanguin. La séparation des œufs de la masse d’œufs concaténée en forme d’écailles a facilité l’observation de l’embryogenèse des tortricides à l’aide de solvants alcalins et organiques précédemment développés à partir de techniques utilisées chez les mouches10. En outre, la présente étude a établi la discrimination sexuelle des petits embryons en développant des méthodes de coloration de la chromatine sexuelle des femelles lépidoptères utilisant l’orcéine lactique-acétique11. En combinant ces méthodes, des acides nucléiques de haute qualité et de grande quantité ont été extraits d’embryons déterminés par le sexe, ce qui était autrement difficile à établir6. L’ARN extrait a été utilisé pour le séquençage de nouvelle génération. Collectivement, les méthodes présentées ici s’appliquent à d’autres insectes lépidoptères et à d’autres taxons d’insectes.

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Protocol

1. Collecte d’insectes et élevage de masse

  1. Collectez des insectes tortricides dans les champs en suivant les références 8,12 publiées précédemment.
    REMARQUE : Les larves de H. magnanima et d’A. honmai sont prélevées sur des feuilles de thé endommagées (figure 1A); les adultes sont attirés par la lumière UV portable de 4 W (longueur d’onde de 365 nm, voir tableau des matériaux, figure 1B).
  2. Élevez les larves recueillies (Figure 1C,D) individuellement sur un morceau de régime artificiel dans une tasse de 1/2 oz pendant 2-3 semaines jusqu’à l’éclosion adulte (Figure 1E,F). Confirmer le sexe des nymphes et des adultes par des traits morphologiques (Figure 1G,I).
  3. Accoupler les mâles et les femelles dans une boîte en plastique (30 cm x 20 cm x 5 cm) pour ovipositer des masses d’œufs sur un papier paraffine (Figure 1J-L). Placez une femelle et deux mâles dans un gobelet en plastique de 120 ml avec un morceau de papier paraffine pour établir une matriline.
    REMARQUE: Il est important de faire des plis sur le papier paraffine. Pour H. magnanima, le papier paraffine doit être au fond du boîtier. Pendant ce temps, pour A. honmai, mettez un papier sur le plafond du boîtier pour collecter les œufs (Figure 1L) puisque H. magnanima oviposit la masse d’œuf sur la face supérieure des feuilles de thé, mais A. honmai pond des œufs sur la face inférieure des feuilles8. Les procédures ont également été vérifiées chez d’autres espèces de tortricides, et il est préférable de placer des papiers des deux côtés si l’écologie et le comportement des espèces cibles ne sont pas clarifiés.
  4. Découpez les masses d’œufs (environ 100 à 200 œufs par masse d’œuf12, figure 1M) sur le papier paraffine avec des ciseaux. Placez les œufs dans une tasse de 1/2 oz avec du papier jeté pendant 5 à 7 jours.
    REMARQUE : L’embryon mature présente une capsule de points noirs (Figure 1N). Les périodes d’embryogenèse sont diversement attribuées aux espèces de tortricides, mais généralement 5 jours après la ponte (dpo) pour H. magnanima et 4 dpo pour A. honmai à 25 °C avec 60% d’humidité relative, 16 h de lumière/8 h de cyclessombres 7.
  5. Conservez les masses d’œufs montrant des capsules de tête noire à 4-8 ° C pendant 7 jours.
  6. Trancher ~ 60 g de régimes artificiels à l’aide d’une râpe pour l’élevage de masse. Placez la masse d’œufs remplie d’embryons mûrs sur le régime artificiel tranché dans un récipient en plastique (23 cm x 16 cm x 8 cm). Placez des papiers de paraffine sur la masse d’œufs avec les régimes tranchés (Figure 10).
    REMARQUE: Une humidité relative inférieure à 30% est considérée comme trop sèche, tandis que plus de 70% est trop humide. Créer des trous sur le couvercle du récipient en plastique est préférable pour permettre une meilleure ventilation. Remplissez les trous avec du coton pour empêcher les fuites de petites larves.
  7. Pour éliminer les contaminants de surface des œufs, faire tremper la masse d’œufs dans une solution de formol à 3 % et de chlorure de benzalkonium à 0,2 % pendant 5 min, respectivement12. Pour éradiquer les bactéries intestinales ou intracellulaires, utilisez un régime artificiel complété par du chlorhydrate de tétracycline à 0,05 % (p/p) ou de rifampicine à 0,06 % (p/p) au lieu d’un régime artificiel normal (voir tableau des matériaux).
    REMARQUE : cette étape est facultative. Il est important de pétrir Silk Mate 2S et 0,05% (p / p) de chlorhydrate de tétracycline ou 0,06% (p / p) de rifampicine de manière égale pour la consistance.
  8. Recueillir les nymphes dans le récipient en plastique et distinguer le sexe en fonction de12 caractéristiques morphologiques (Figure 1G-I).
    REMARQUE: Généralement, les tortricides présentent 5-6 instars jusqu’à la nymphose12. Les larves de H. magnanima et d’A. honmai prennent respectivement 3 semaines et 2 semaines après l’éclosion jusqu’à la nymphose.
  9. Placez 15 mâles et 10 femelles dans une boîte en plastique (30 cm x 20 cm x 5 cm, Figure 1K) pour l’accouplement à 25 °C, 16 L/8 D. Prélevez les œufs tous les 5-7 jours et répétez les étapes 1.4-1.9. pour chaque génération.
    REMARQUE: Si la collecte de masses d’œufs nouvellement ovipositifs pour une analyse ultérieure est nécessaire, définissez le début et la fin de la période sombre, par exemple de 9 h à 17 h. Dans cette condition, H. magnanima et A. honami oviposit généralement des œufs après 5 h (14 h).

2. Séparation des œufs et des larves pharate des masses d’œufs pour la fixation, la perméabilisation et la coloration

  1. Faire tremper la masse d’œufs dans 1 000 μL de solution aqueuse d’hypochlorite de sodium à 1,2 % pendant 10 min ou dans 1 000 μL de solution aqueuse d’hydroxyde de potassium 5 M pendant 30 min pour séparer les œufs.
  2. Laver les œufs séparés dans 1 000 μL de PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,05 % de polyoxyéthylène (20) monolaurate de sorbitan [Tween-20] pH 7,4, voir table des matières) à la suite du rapport publié précédemment7.
  3. Faire tremper les œufs dans un mélange de 500 μL de solution à 100 % d’heptane et de 500 μL de solution de paraformaldéhyde-PBSt à 4 % (p/v). Mélanger pendant 10 min à 1 500 tr/min à l’aide d’un mélangeur vortex.
  4. Faire tremper les œufs dans un mélange de 500 μL de 100 % d’heptane et de 500 μL de 100 % de méthanol. Mélanger pendant 10 min à 1 500 tr/min.
  5. Laver les œufs deux fois avec 1 000 μL de méthanol à 100 % et les conserver à 4 °C dans du méthanol à 100 % jusqu’à ce que d’autres expériences soient effectuées (figure 2A).
    REMARQUE: Les œufs peuvent être conservés pendant au moins 1 an à 4 °C.
  6. Faire tremper les œufs séquentiellement dans de l’éthanol à 99 %, 70 %, 50 % et PBSt pendant 5 min chacun pour l’hydrophilisation à la suite du rapport7 publié précédemment.
  7. Lavez les œufs avec du PBSt, immergez-les dans 1 μg/mL de solution de DAPI pendant 5 min, puis lavez les œufs avec 1x PBS deux fois. Faire tremper les œufs dans 20 μL de solution d’orcéine lactique-acétique à 1,25 % (p/p) (voir Tableau des matériaux)11 pour visualiser l’hétérochromatine jusqu’à ce que les noyaux présentent une couleur rouge brillant (cela varie de 5 à 60 min) (Figure 2B, C).
    REMARQUE: Les périodes de coloration lactique-acétique de l’orcéine dépendent de la température et de l’humidité. Il est préférable de vérifier la coloration appropriée à l’aide d’un microscope avec un grossissement 4x-10x.
  8. Transférer les œufs tachés à l’aide d’une pipette sur une lame de verre. Entourer les œufs colorés d’un réactif antifade (voir Tableau des matériaux) et d’un verre de couverture7.
  9. Extraire les larves de H. magnanima et d’A. honmai (4 à 5 jours après la ponte (dpo)) des masses d’œufs à l’aide d’une pince (Figure 2D). Couper les larves en deux sur une lame de verre (Figure 2E).
  10. Fixez tous les tissus (p. ex., ganglion sous-œsophagien, ganglions thoraciques, tubule malpighien, etc.) avec un mélange de 1:3 (v/v) 99,7 % d’acide acétique et de méthanol à 100 % pendant 5 min. Colorez ceux qui ont une solution d’orcéine lactique-acétique11 à 1,25% (p / p) jusqu’à ce que les noyaux soient colorés (cela peut prendre 5 à 60 minutes, selon la température et l’humidité).
  11. Déterminer le sexe de chaque spécimen en observant la présence (femelle) ou l’absence (mâle) d’hétérochromatine (le chromosome W, Figure 2F,G) au microscope.
    REMARQUE: Le sexe est déterminé en visualisant la chromatine sexuelle. Chaque cellule représente la chromatine sexuelle sous forme de point chez les femelles11,12, tandis que la partie restante des tissus larvaires pharates (non fixés) doit être immédiatement immergée dans le tampon de lyse cellulaire12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA et 1% SDS, pH 8,0) ou des réactifs d’extraction d’ARN contenant du phénol pour l’extraction de l’ADN ou de l’ARN. Avant les dissections, distribuer à l’avance 20 μL des réactifs dans des tubes PCR de 0,2 mL (figure 3A). Immerger et conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à une extraction ultérieure. Les échantillons peuvent être conservés pendant au moins 3 mois, mais il est préférable de procéder aux expériences en aval pour éviter la dégradation des acides nucléiques.

3. Extractions d’ADN et d’ARN de larves pharate déterminées par le sexe

  1. Regrouper 12 larves de pharate mâle ou femelle déterminées par le sexe (embryon de 5 dpo) et ajouter un tampon de lyse cellulaire ou des réactifs d’extraction d’ARN (voir l’étape 2.11 et la table des matières) dans un tube de 1,5 mL.
    REMARQUE: Suivez les étapes 3.2-3.7 pour l’extraction de l’ADN et les étapes 3.8-3.11 pour l’extraction de l’ARN.
  2. Homogénéiser les tissus dans 600 μL du tampon de lyse cellulaire (10 mM tris-HCl, 100 mM EDTA et 1 % de FDS, pH 8,0), et centrifuger les échantillons à 10 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
  3. Recueillir le surnageant (500 μL) à l’aide d’une pipette et incuber à 50 °C avec 1,5 μL de protéinase K (20 mg/mL, voir Tableau des matériaux) pendant 5 h sur un bloc thermique.
  4. Traiter les échantillons avec 1,0 μL de 10 mg/mL de solution de RNase (voir tableau des matériaux) à 37 °C pendant 30 min.
  5. Ajouter 200 μL de solution de précipitation protéique (voir tableau des matériaux) dans les tubes7, puis une centrifugeuse à 17 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  6. Mélanger le surnageant (500 μL) avec 500 μL d’isopropanol à 100 %, puis centrifuger à 20 400 x g pendant 10 min à 4 °C.
  7. Lavez l’ADN granulé deux fois avec 1 000 μL d’éthanol à 70 %. Ensuite, sécher à l’air libre (5-10 min à température ambiante), dissoudre l’ADN dans 30 μL de tampon Tris-Cl de 10 mM (pH 8,5).
  8. Homogénéiser les tissus dans 600 μL de réactifs d’extraction d’ARN et ajouter 240 μL d’eau distillée ultra-pure au tube. Centrifuger les tubes à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
  9. Mélanger le surnageant (600 μL) avec 600 μL d’isopropanol à 100 % et transférer le mélange dans une colonne de spin de silice (voir Tableau des matériaux). Centrifuger les tubes à 17 900 x g pendant 1 min à 4 °C.
  10. Lavez la colonne avec 750 μL d’éthanol à 70 % et centrifugez la colonne deux fois à 17 900 x g pendant 1 min chacune à 4 °C.
  11. Chargez 15 μL d’eau distillée ultra-pure dans la colonne. Centrifuger les tubes à 17 900 x g pendant 1 min à 4 °C pour éluer l’ARN.
  12. Calculez et vérifiez la qualité et la quantité d’ADN et d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre UV. Évaluer la pureté des acides nucléiques à l’aide des rapports A260/A280 (acides nucléiques/protéines) et A260/A230 (acides nucléiques/sels et autres contaminants)13.
    REMARQUE : Pour l’extraction de l’ARN, la procédure12 publiée précédemment a été suivie, ce qui a entraîné une contamination par le phénol (tableau 1). L’ADN et l’ARN extraits d’un seul embryon ou de larves pharates donnent des échantillons de faible quantité et de mauvaise qualité. En règle générale, l’extraction de l’ADN de 12 larves pharate donne 100 à 600 ng, tandis que l’extraction de l’ARN à l’aide de la méthode actuelle génère 900 à 1 500 ng, comme le montre le tableau 1.
    REMARQUE : Les étapes 3.13 à 3.15 sont facultatives pour d’autres essais de séquençage à haut débit.
  13. Calculez les quantités d’ADN et d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre basé sur la fluorescence.
    REMARQUE : Le rapport des quantités d’ARN (concentration à base d’UV (ng/μL)/concentration à base de fluorescence (ng/μL)) a été calculé pour évaluer la qualité en vue d’une application expérimentale ultérieure. Par exemple, lorsque les concentrations d’UV et de fluorescence sont respectivement de 80 ng/uL et de 60 ng/uL, le rapport sera de 1,5 (80/60). Habituellement, les rapports inférieurs à 1,5 indiquent une pureté suffisante pour les applications en aval utilisant le séquençage à haut débit13.
  14. Analyser la qualité de l’ARN à l’aide de l’électrophorèseà micropuce 14.
  15. Utilisez les ARN qualifiés pour préparer la bibliothèque d’ARN à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque d’ARN (voir Tableau des matériaux). Séquencez les bibliothèques à l’aide d’une plate-forme adaptée aux bibliothèques préparées.

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Representative Results

Mise en place des lignes hôtes et leur maintenance
La viabilité des larves collectées sur le terrain est attribuée différemment à l’emplacement, aux saisons et aux conditions d’élevage sur le terrain (p. ex., 90 % de la viabilité à Taïwan, Taoyuan, comme le montrent Arai et al.12). Environ 30% à 50% des paires généreront la prochaine génération comme d’habitude. Pour H. magnanima et A. honmai, les matrilines sont maintenues par consanguinité depuis plus de 100 générations.

Observations morphologiques et détermination du sexe
Le traitement à l’hydroxyde de potassium (3 ou 5 M KOH) ou à l’hypochlorite de sodium (1,2 % Cl2 ou NaClO) sépare les œufs de leurs masses d’œufs concaténées (figure 2A). La concentration plus faible des réactifs n’a pas pu atteindre la séparation. Toutes les étapes de fixation, de perméabilisation et de coloration ont permis la visualisation des noyaux avec la solution DAPI. Les ovules traités uniquement avec du KOH ou du NaClO (séparés) sans les étapes de fixation et de perméabilisation n’ont pas été colorés avec ces colorants7. Les masses d’œufs de H. magnanima non traitées n’ont pas été colorées. L’orcéine lactique-acétique colore l’hétérochromatine (chromosome W) de couleur rouge foncé et les noyaux de couleur rouge vif comme d’habitude (Figure 3A). Cette coloration permet une détermination facile et rapide du sexe de 4 dpo embryons à la sixième larve d’stade. Bien que les noyaux aient été visualisés dans des embryons de 0 à 3 dpo, il était difficile d’observer le chromosome W avec un grossissement de 400x.

De l’ADN et de l’ARN de haute qualité ont été obtenus à partir d’embryons déterminés par le sexe et regroupés
À partir de 12 larves de pharate, ADN de haute qualité (A260/A280 = 1,7-2,0; A260/A230 = 1,7-2,4) ont été extraits avec 100-600 ng en quantité totale (tableau 1). Bien que l’ARN extrait selon la méthode12 précédemment publiée ait donné un produit de 500 à 1 000 ng de faible qualité: A260 / A280 = 1,7-2,1; A260/A230 = 0,1-0,5 (Tableau 1), les protocoles modifiés utilisant une colonne de spin ont amélioré la qualité de l’ARN, produisant un produit de 900-1 500 ng avec A260/A280 = 1,9-2,1 et A260/A230 = 1,9-2,3 (Tableau 1). De plus, le rapport de concentration d’ARN (valeurs de fluorescence UV/Qbit) pour le protocole modifié était inférieur à 1,2, répondant aux exigences de qualité pour le séquençage de nouvelle génération13. Inversement, la qualité et la quantité d’acides nucléiques extraits d’un seul embryon étaient trop faibles pour être calculées. L’intégrité de l’ARN extrait des larves de pharate déterminées selon le sexe à l’aide du protocole modifié a également été confirmée à l’aide de l’électrophorèse par micropuce (figure 3B). Il a été confirmé que les bibliothèques préparées produisaient des lectures de score Q30 élevées (tableau 2).

Figure 1
Figure 1 : Aperçu de la collecte d’insectes et de l’élevage en masse de H. magnanima et A. honmai. (A) Feuilles et nids de thé endommagés par une larve. (B) Piège à lumière avec lumière UV. (C,D) Une femelle (C) et un mâle (D) 6ème larve d’instar de H. magnanima. Le triangle orange indique le testicule. (E,F) Les larves collectées ont été élevées individuellement dans une tasse de 1/2 oz avec un morceau de régime artificiel. (G,H) Pupes de H. magnanima (G) et A. honmai (H). La femelle est montrée à gauche, tandis que le mâle est montré à droite. (I) Adultes de H. magnanima (ci-dessus) et A. honmai (ci-dessous). Les mâles et les femelles sont représentés respectivement à droite et à gauche. (J,K) Un sac en plastique (J) ou un étui en plastique (K) pour la collecte de masse d’œufs. (L) A. honmai oviposite des œufs sur du papier de paraffine placé sur le couvercle, et H. magnanima pond des œufs sur du papier de paraffine placé au fond du boîtier. (M,N) Masse d’oeuf de H. magnanima. Les embryons matures présentent des capsules de tête noires indiquées par des flèches blanches (N). (O) Régimes artificiels tranchés avec une râpe pour l’élevage de masse. Les larves écloses à partir d’œufs, placées sur le régime tranché, formeront des nymphes 3-4 semaines après l’éclosion à 25 ° C (moins de 16 h de cycle clair / 8 h de cycle sombre). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Observations d’embryons. (A) Les œufs séparés, fixés et perméabilisés de H. magnanima à l’aide de 5 N KOH, 4 % DE PFA/heptane, de méthanol/heptane et de méthanol. Un œuf séparé est mis en évidence avec des lignes brisées. (B) L’embryon de 3 dpo a été coloré avec de l’orcéine lactique-acétique. La pointe de flèche noire indique l’embryon. (C) L’embryon de 4 dpo a été coloré avec DAPI. La pointe de flèche blanche indique l’embryon. (D,E) Dissection de larves pharate (5 dpo) à l’aide de pinces. Les larves de pharate sont extraites de la masse de l’œuf (D), coupées en deux sur une lame de verre (E). (F,G) Coloration lactique-acétique de l’orcéine à l’aide des larves de pharate disséquées. Les femelles présentent de l’hétérochromatine sous forme de point (indiqué par une pointe de flèche noire , (F), mais les mâles n’ont pas d’hétérochromatine (G). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Résumé graphique de l’extraction des acides nucléiques à l’aide de larves de pharate déterminées par le sexe et des qualités d’ARN de H. magnanima et d’A. honmai. (A) Les tissus des larves de pharate disséquées sur des lames de verre ont été colorés avec de l’orcéine lactique-acétique pour déterminer leur sexe. Les tissus restants ont été trempés dans des réactifs, regroupés dans un tube trié par sexe des individus, puis soumis à une extraction d’ADN / ARN. (B) La qualité de l’ARN extrait de 12 mâles H. magnanima ou A. honmai a été évaluée à l’aide d’un système d’électrophorèse à micropuce. Abréviations: [nt], taille des nucléotides; [FU], unité de fluorescence; M, marqueur moléculaire; Hm, H. magnanima; Annonce, A. honmai. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Concentration et qualité des acides nucléiques extraits des larves de pharate déterminées par le sexe de H. magnanima. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Qualités des données brutes de séquençage de l’ARN. 1 Q20 (%) indique la probabilité de lectures avec une précision de lecture de 99 %. deux Q30 (%) indique la probabilité de lectures avec une précision de lecture de 99,9 %. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Tortricid comprend plusieurs ravageurs agricoles et forestiers; la présente étude a présenté des méthodes pour élever la tortrix au fil des générations, observer l’embryogenèse et le sexe des insectes, et effectuer une analyse moléculaire à l’aide d’embryons matures.

L’un des obstacles à l’étude des insectes nuisibles est d’établir des méthodes d’élevage. En particulier, la consanguinité affecte parfois négativement la condition physique de l’espèce. La réduction de la condition physique par le consanguin, appelée dépression de consanguinité, a été largement observée chez diverses plantes et animaux, y compris les insectes 15,16,17,18. Comme nous l’avons mentionné, H. magnanima et A. honmai sont entretenus depuis plus de 100 générations (plus de 10 ans) sans coûts apparents de conditionnement physique. Bien qu’il ne suffise pas d’évaluer si d’autres tortricidés ont également une tolérance élevée à la consanguinité en général, les deux espèces peuvent avoir développé les caractéristiques en adaptant des conditions environnementales monotones (c.-à-d. les plantations de thé) et contre plusieurs micro-organismes endosymbiotiques (p. ex., Wolbachia11,12 ). Les œufs des deux espèces sont faciles à obtenir, mais leurs comportements de ponte sont attribués différemment à leur écologie. En effet, l’humidité et la direction du pli semblent affecter directement le nombre d’œufs ovipositifs, ce qui pourrait refléter l’histoire naturelle des insectes dans les champs. Il est important d’adapter les méthodes d’élevage aux espèces en fonction de leurs caractéristiques biologiques dans la nature.

Les protocoles établis dans cette étude ont permis l’observation de l’embryogenèse et des études moléculaires utilisant des embryons et des larves matures déterminés par le sexe. Les œufs d’insectes sont généralement recouverts de plusieurs couchesde coquille 10,19. De plus, les œufs de H. magnanima et A. honmai sont recouverts de sécrétions maternelles. Pour tacher les œufs avec une structure aussi complexe, la séparation, la fixation et la perméabilisation semblent être tout nécessaires. Chez Ostrinia furnacalis (Crambidae), qui oviposite une masse d’œuf semblable à une écailles comme H. magnanima et A. honmai, des protocoles de détermination du sexe basés sur la PCR utilisant des embryons uniques ont été proposés, mais la faible qualité et la faible quantité d’acides nucléiques ont été un problème pour une analyse ultérieure 6,20. En revanche, la présente étude suggérait d’extraire des acides nucléiques d’embryons déterminés par le sexe après avoir observé la chromatine sexuelle spécifique à la femme. Les ARN sont facilement dégradés et la procédure d’extraction présentée ici n’a pas affecté la qualité de l’ARN, ce qui a également été confirmé par l’analyse du transcriptome (séquençage de l’ARN). Les techniques présentées ici sont applicables aux études de l’embryogenèse de diverses espèces d’insectes. En outre, les protocoles ont le potentiel d’être utilisés pour évaluer les effets des pesticides chimiques ou des microbes intracellulaires tels que Wolbachia, qui provoque des défauts spécifiques au sexe au cours de l’embryogenèse 6,11,12.

La présente étude présente plusieurs limites. Tout d’abord, le sexe des embryons immatures (0-3 dpo) était difficile à déterminer en utilisant la coloration lactique-acétique de l’orcéine chez H. magnanima et A. honmai. En effet, le nombre et la taille des noyaux sont généralement faibles au début de l’embryogenèse, ce qui rend difficile l’observation du chromosome W. Pour clarifier le sexe des tortricides au début de l’embryogenèse, la détection et la quantification des marqueurs sur les chromosomes sexuels 6,20 pourraient être une approche alternative. Deuxièmement, il était difficile d’extraire des acides nucléiques de haute pureté d’un seul individu après la détermination du sexe, peut-être en raison du petit nombre de cellules. Cependant, l’ARN ou l’ADN extrait d’un seul embryon peut s’appliquer à des analyses ultérieures telles que des tests PCR et des séquençages unicellulaires.

En résumé, le présent protocole décrit l’élevage de masse, les observations morphologiques et les analyses génétiques des œufs de deux insectes nuisibles lépidoptères non modèles, H. magnanima et A. honmai. Ces techniques simples devraient être applicables à d’autres recherches sur les tortricidés, d’autres insectes lépidoptères et d’autres taxons.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs souhaitent reconnaître le soutien de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) Bourses de recherche pour jeunes scientifiques [numéro de subvention 19J13123 et 21J00895].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/2 ounce cup FP CHUPA CP070009 insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/
1/2 ounce cup lid FP CHUPA CP070011 insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99.7% acetic acid FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 36289 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies not shown Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Agilent RNA6000 nano kit Agilent Technologies 5067-1511 Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG
.pdf
benzalkonium chloride solution Nihon Pharmaceutical Co., Ltd No.4987123116046 Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html
Cotton AOUME 8-1611-02 insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1
DAPI solution Dojindo, Tokyo, Japan 340-07971 stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/
Disodium Hydrogenphosphate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html
dsDNA HS quantification kit Invitrogen Q33231 Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
Econospin RNA II column Epoch Life Science Inc. EP-11201 RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx
Ethanol FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html
Glassine paper HEIKO 2100010 insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&
utm_medium=cpc&utm_source=
Adw
heat block WSC-2620 PowerBLOCK ATTO, Tokyo, Japan 4002620 incubation; https://www.attoeng.site/
heptane FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
INSECTA LF Nosan Co., Ltd not shown Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
ISOGENII Nippon Gene 311-07361 RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html
isopropanol FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html
Lactic acid FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html
methanol FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html
MSV-3500 vortex Biosan BS-010210-TAK Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
Nano Photometer NP 80 Implen not shown Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
Natural pack wide Inomata chemical 1859 insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3%
83%A9%E3%83%AB%E3%83%91%
E3%83%83%E3%82%AF%E3%83%
AF%E3%82%A4%E3%83%89
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7770S Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039
orcein FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
Paraformaldehyde FUJIFILM Wako Chemicals Co. 160-16061 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan not shown Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
Potassium Chloride FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
Potassium Dihydrogen Phosphate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Antifade Mountant Invitrogen, MA, USA P36965 antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
Proteinase K Solution Merck 71049-4CN DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
protein precipitation solution Qiagen 158912 DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_
BIOCOMPARE_ProductListing_
0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4 Invitrogen Q33238 Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
rifampicin FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
RNA HS quantification kit Invitrogen Q32855 Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852
RNase solution Nippon Gene 313-01461 RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2S Nosan Co., Ltd not shown Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Sodium Chloride FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
Sodium Dodecyl Sulfate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
sodium hypochlorite aqueous solution FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Tetracycline Hydrochloride FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HCl FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
ultra-pure distilled water Invitrogen 10977023 RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015

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References

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Sciences de l’environnement numéro 181 Tortricidae embryogenèse détermination du sexe séquençage de l’ARN ravageur endosymbiotes
Élevage de masse et études moléculaires chez les insectes nuisibles tortricidae
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Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M.,… More

Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects. J. Vis. Exp. (181), e63737, doi:10.3791/63737 (2022).

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