Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Гидрогелевые матрицы обеспечивают повышенную пропускную способность для скрининговых эффектов компонентов матрицы и терапии в 3D-моделях опухолей

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63791
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1University of California Los Angeles

Summary

Настоящий протокол описывает экспериментальную платформу для оценки влияния механических и биохимических сигналов на химиотерапевтические реакции клеток глиобластомы, полученных от пациента, в 3D матриксно-миметических культурах с использованием специального устройства УФ-освещения, способствующего высокопроизводительному фотосшиванию гидрогелей с настраиваемыми механическими характеристиками.

Abstract

Клеточно-матричные взаимодействия опосредуют сложные физиологические процессы через биохимические, механические и геометрические сигналы, влияя на патологические изменения и терапевтические реакции. Ожидается, что учет матричных эффектов на ранних этапах разработки лекарств увеличит вероятность клинического успеха новых терапевтических средств. Стратегии на основе биоматериалов, повторяющие конкретные микросреды тканей в 3D-культуре клеток, существуют, но интеграция их с методами 2D-культуры, в основном используемыми для скрининга лекарств, была сложной задачей. Таким образом, представленный здесь протокол детализирует разработку методов для 3D-культуры в миниатюрных матрицах биоматериала в формате пластины с несколькими скважинами для облегчения интеграции с существующими трубопроводами скрининга лекарств и обычными анализами жизнеспособности клеток. Поскольку ожидается, что характеристики матрицы, критически важные для сохранения клинически значимых фенотипов в культивируемых клетках, будут высоко ткане- и болезнетворно-специфическими, для выявления соответствующих условий для конкретных применений потребуется комбинаторный скрининг параметров матрицы. Методы, описанные здесь, используют миниатюрный формат культуры для оценки реакций раковых клеток на ортогональную вариацию матричной механики и представления лиганда. В частности, это исследование демонстрирует использование этой платформы для изучения влияния параметров матрицы на реакцию клеток глиобластомы (GBM), полученных от пациента, на химиотерапию.

Introduction

Ожидаемая стоимость разработки нового препарата неуклонно росла в течение последнего десятилетия, и по текущим оценкам 1 млрд. Частью этих расходов является высокий уровень отказов лекарств, поступающих в клинические испытания. Примерно 12% кандидатов на лекарства в конечном итоге получают одобрение Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в 2019 году. Многие препараты терпят неудачу в фазе I из-за непредвиденной токсичности2, в то время как другие, которые проходят испытания на безопасность, могут потерпеть неудачу из-за отсутствия эффективности3. Это истощение из-за неэффективности может быть частично объяснено тем фактом, что модели рака, используемые во время разработки лекарств, как известно, не предсказывают клиническую эффективность4.

Функциональные различия между моделями in vitro и in vivo могут быть связаны с удалением раковых клеток из их собственной микросреды, включая неопухолевые клетки и физический ECM 5,6. Как правило, исследовательские группы используют коммерчески доступные матрицы культур, такие как Matrigel (белковая базальная мембранная матрица, полученная из сарком мышей), чтобы обеспечить культивируемые опухолевые клетки микроокружением 3D-матрицы. По сравнению с 2D культурой, 3D культура в мембранной матрице улучшила клиническую значимость результатов in vitro 7,8. Однако культивируемые биоматериалы из децеллюляризованных тканей, включая мембранный матрикс, обычно проявляют вариабельность от партии к партии, что может поставить под угрозу воспроизводимость9. Кроме того, матрицы, полученные из опухолей с различным тканевым происхождением от изученных, могут не обеспечивать соответствующих физиологических сигналов10. Наконец, раковые заболевания с высокой степенью внутриопухолевой гетерогенности имеют микроокружательные особенности, которые варьируются в субмикронной шкале и которые мембранная матрица не может быть настроена на повторение11.

Глиобластома (GBM), равномерно летальная опухоль головного мозга со средним временем выживания около 15 месяцев, является раком, для которого разработка лечения была особенно трудной12,13. Текущий стандарт лечения GBM состоит из первичной резекции опухоли, за которой следует лучевая терапия, а затем химиотерапия с использованием темозоломида (TMZ)14. Тем не менее, более половины клинических опухолей GBM проявляют устойчивость к лечению через различные механизмы 15,16,17. Предсказать эффективность схемы лечения для отдельного пациента крайне сложно. Стандартные доклинические модели, используемые для прогнозирования индивидуальных исходов, состоят из полученных пациентом опухолевых клеток, ксенотрансплантированных ортотопически в мышей с ослабленным иммунитетом. В то время как ксенотрансплантаты, полученные от пациента, могут повторять многие аспекты клинических опухолей GBM и ценны для доклинических моделей18, они по своей сути дороги, имеют низкую пропускную способность, отнимают много времени и связаны с этическими проблемами19. Культуры клеток, полученных от пациента, на 2D-пластиковых поверхностях или в виде сфероидов, в основном избегают этих проблем. В то время как клетки, полученные от пациента, сохраняют генетические аберрации, их культуры в 2D или в виде взвешенных сфероидов были в значительной степени плохими представлениями о ксенотрансплантатах, полученных от пациента, у грызунов и оригинальных опухолей пациента20. Ранее мы и другие показали, что клетки GBM, культивируемые в 3D ECM, который имитирует механические и биохимические свойства ткани мозга, могут сохранять фенотипы лекарственной устойчивости 10,21,22,23.

Взаимодействия между гиалуроновой кислотой (ГК), полисахаридом, распространенным в ECM мозга и чрезмерно экспрессируемым в опухолях GBM, и ее рецептором CD44 модулируют приобретение лекарственной устойчивости in vitro 21,24,25,26,27. Например, включение ГК в мягкие 3D-культуры увеличило способность клеток GBM, полученных от пациента, приобретать терапевтическую резистентность. Эта механочувствительность зависела от связывания ГК с рецепторами CD44 на клетках GBM21. Кроме того, связывание интегрина с RGD-несущими пептидами, включенными в матрицы 3D-культур, усиливало CD44-опосредованное хеморезистентность в зависимости от жесткости21. Помимо ГК, экспрессия нескольких белков ECM, многие из которых содержат области RGD, варьируется между нормальным мозгом и опухолями GBM28. Например, в одном исследовании сообщалось, что 28 различных белков ECM были повышены в опухолях GBM29. В этом сложном микроокружении опухолевой матрицы раковые клетки интегрируют механические и биохимические сигналы, чтобы получить определенный фенотип резистентности, который зависит от относительно небольших различий (например, менее порядка величины) в модуле Юнга или плотности интегрин-связывающих пептидов 28,29,30.

Настоящий протокол характеризует, как опухолевые клетки интерпретируют уникальные комбинации матричных сигналов и идентифицируют сложные, специфические для пациента матричные микросреды, которые способствуют резистентности к лечению (рисунок 1A). Фотохимический метод генерации миниатюрных, точно настроенных матриц для 3D-культуры обеспечивает большое ортогональное переменное пространство. Специально изготовленный массив светодиодов, управляемый микроконтроллером, был включен в гидрогели фотосшивания в формате пластины с 384 лунками для повышения автоматизации и воспроизводимости. Интенсивность воздействия варьировалась в зависимости от скважины, чтобы изменить микромеханические свойства полученных гидрогелей, как оценивалось с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM). Хотя эта рукопись не фокусируется на построении самого массива освещения, принципиальная схема (рисунок 1B) и список деталей (таблица материалов) предоставляются в качестве вспомогательных средств для воспроизведения устройства.

Этот отчет демонстрирует быструю генерацию массива клеток GBM, культивируемых в уникальных 3D-микросредах, в которых модуль Юнга (четыре уровня на одном порядке) и содержание интегрин-связывающих пептидов (полученных из четырех различных белков ECM) варьировались ортогонально. Затем этот подход был использован для исследования относительного вклада механики гидрогеля и взаимодействия интегрина с ECM-специфической для жизнеспособности и пролиферации клеток GBM, полученных от пациента, когда они приобретают устойчивость к химиотерапии темозоломидом (TMZ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Клеточные линии GBM, полученные от пациентов (GS122 и GS304), были предоставлены профессором Дэвидом Натансоном (нашим сотрудником), который разработал эти линии в соответствии с протоколом, одобренным Советом по институциональному обзору UCLA (IRB # 10-000655). Клетки были предоставлены деидентифицированными, так что клеточные линии не могли быть связаны обратно с отдельными пациентами.

1. Приготовление раствора гидрогеля

  1. Приготовьте HEPES-буферный раствор, растворив порошок HEPES при 20 мМ в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS). Отрегулируйте pH до 7 после полной сольватации.
  2. В HEPES-буферном растворе растворяют тиолированную ГК (номинальная молекулярная масса 700 кДа, см. Таблицу материалов), приготовленную по предыдущему отчету31, таким образом, чтобы 6%-8% остатков карбоновой кислоты на каждой глюкуроновой кислоте модифицировали тиолом, в концентрации 10 мг/мл в буферном растворе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Янтарный флакон рекомендуется для предотвращения окисления тиола окружающим светом.
    1. Перемешивайте с помощью магнитной пластины перемешивания (<1000 об/мин) при комнатной температуре до полного растворения, обычно около 45 мин.
  3. Во время растворения ГК готовят отдельные растворы (1) 100 мг/мл 8-арм-ПЭГ-Норборнена (20 кДа), (2) 100 мг/мл 4-арм-ПЭГ-Тиола (20 кДа), (3) 4 мМ цистеина или цистеинсодержащего пептида (например, GCGYGRGDSPG) и (4) 4 мг/мл LAP в микроцентрифужных пробирках (см. Таблицу материалов).
    1. Подготовьте каждый из этих четырех растворов в HEPES-буферном растворе, приготовленном на этапе 1.1. Вихрь растворов, чтобы обеспечить полное растворение каждого реагента перед выполнением шага 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При тестировании нескольких различных пептидов каждый из них должен содержать цистеин или другой источник тиольного фрагмента для этой химии конъюгации.
    2. Подготовьте растворы (4 мМ доступного тиола) всех пептидов, которые будут привязаны к одному гидрогелю в этот момент.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пептидные последовательности и белки ECM, из которых они были получены и использованы в данном исследовании, перечислены в таблице 1. N-ацетилцистеин (см. Таблицу материалов), с которым клетки не связываются, может быть заменен биологически активным, тиолсодержащим пептидом для титрования концентрации адгезивного пептида или действовать как отрицательный контроль31.
  4. Смешайте отдельные растворы ГК, ПЭГ-Норборнена, ПЭГ-тиола и цистеин/тиолсодержащих пептидов (см. Таблицу материалов) для достижения конечных концентраций для конечных гидрогелевых матриц, перечисленных в Таблице 2. Перемешивайте (<1000 об/мин) на магнитной пластине перемешивания в течение не менее 30 минут, чтобы полностью перемешать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы ГК обладают высокой вязкостью и лучше всего обрабатываются с использованием пипетки с положительным смещением (см. Таблицу материалов). Если пипетка с положительным смещением недоступна, вязкие растворы также можно обойтись стандартной микропипеткой путем медленной пипетки с использованием широкодисперсных наконечников.

2. Освещение и фотосшивка гидрогелей с помощью светодиодной решетки

ВНИМАНИЕ: Носите УФ-защитные очки и покрывайте поле освещения УФ-поглощающим материалом.

ПРИМЕЧАНИЕ: Массив светодиодов, описанный в этом протоколе, состоит из шести наборов из восьми светодиодов, размещенных последовательно, как показано на представленной принципиальной схеме (рисунок 1A). Каждый набор светодиодов может питаться независимо, что позволяет использовать до шести различных излучений за прогон. Дополнительный файл 1 содержит скриншоты, соответствующие следующим указаниям для дальнейших указаний.

  1. Загрузите файл устройства освещения.zip из дополнительных файлов кодирования. Этот каталог содержит следующие файлы: Arduino.zip (Файл дополнительного кодирования 1), Драйверы.zip (Файл дополнительного кодирования 2), Графический интерфейс пользователя.zip (Файл дополнительного кодирования 3) и Holder.zip (Файл дополнительного кодирования 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-печать верхней и нижней частей для удержания печатной платы на месте (см. Дополнительные файлы кодирования для получения подробной информации).
  2. Загрузите и установите программное обеспечение микроконтроллера (см. Таблицу материалов).
  3. Загрузите и установите программное обеспечение с графическим интерфейсом (см. Таблицу материалов). Инструкции по эксплуатации программного обеспечения см. в дополнительном файле 1 .
  4. Откройте Обработка и установите библиотеку controlIP5 , щелкнув Sketch > Импорт библиотеки > Добавить библиотеку. Затем найдите controlIP5 в библиотеках и нажмите кнопку Установить. Выполните это в первый раз.
  5. Включите устройство освещения (см. Таблицу материалов) с помощью блока питания напряжением 36 В и подключите его к ПК с помощью кабеля micro-USB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые устройства не устанавливают драйверы автоматически для различных наноплат Arduino. Один набор драйверов предоставляется в zip-файле устройства.
  6. Откройте файл Arduino.ino, расположенный в папке Adruino.zip, с помощью IDE Arduino.
  7. Скомпилируйте файл Arduino.ino, нажав на кнопку Checkmark . Загрузите скомпилированный код, нажав на кнопку Стрелка .
  8. Откройте файл GUI.pde, расположенный в папке GUI.zip, с помощью команды Обработка.
  9. Нажмите кнопку Выполнить в программе обработки, чтобы запустить графический пользовательский интерфейс для управления устройством освещения.
  10. В окне графического интерфейса пользователя щелкните Интенсивность для столбца, содержащего раствор предшественника гидрогеля, который должен быть сшит, и введите желаемую интенсивность. Нажмите на поле Время и введите желаемое время. Для решения, представленного в таблице 2, это будет 15 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечным пользователям необходимо калибровать цифровые значения интенсивности в соответствии с интенсивностью излучения с помощью радиометра. Примеры типичных интенсивностей приведены на рисунке 2А.
  11. Выровняйте образцы с устройством освещения (рисунок 2B) с любым другим светодиодом в одной колонке силиконовых форм (см. Таблицу материалов) или 384-луночной пластине. Нажмите «Готово», чтобы начать освещение. Повторите этот процесс по мере необходимости для освещения нескольких горок или других скважин плиты из 384 скважин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель сконструирован таким образом, что пластина с 384 лунками находится вровень с одним углом внутренней камеры во время освещения.
    1. После освещения, при размещении в одном углу, переместите плиту колодца в следующий угол и повторите. Чтобы осветить колодцы на другой половине пластины, поднимите пластину из держателя и поверните на 180°.
  12. Создавайте гидрогели с различной механикой для механической характеристики, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Очистите стеклянные слайды и силиконовые формы с помощью ленты для удаления мусора. Прикрепите силиконовые формы к стеклянному слайду, прижмите вниз, чтобы обеспечить хорошее уплотнение, и вытесните любые пузырьки воздуха.
    2. Пипетка 80 мкл раствора предшественника гидрогеля, приготовленного на стадии 1.4, в каждую силиконовую форму на стеклянном слайде.
    3. Поместите стеклянный слайд на устройство освещения, выровненное с любым другим светодиодом в одной колонке. Подвергайте предшественников гидрогеля воздействию ультрафиолетового света в течение 15 с, как описано на этапе 2, для фотоскрытия.
    4. Как только освещение прекратится, извлеките слайды и ослабьте гели из форм, проследив внутреннюю окружность формы тонким наконечником (наконечник пипетки 10 мкл, игла 30 г и т. Д.). Удалите силиконовые формы пинцетом/щипцами.
    5. Перемещайте сшитые гидрогели в отдельные колодцы из 12-луночной плиты, смачивая шпатель и осторожно отталкивая их от стеклянной горки. Заполните каждую лунку 2 мл DPBS (см. Таблицу материалов) перед добавлением гидрогеля. Разбавляйте гели в растворе DPBS в течение не менее 12 ч (обычно на ночь) при комнатной температуре (для механической характеристики на следующий день).

3. Измерения атомно-силовой микроскопии (AFM)

  1. Включите атомно-силовой микроскоп (АСМ) в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Этот протокол содержит краткие инструкции по использованию прибора и соответствующего программного обеспечения.
  2. Установите датчик AFM (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования треугольный консоль нитрида кремния с номинальной постоянной пружины 0,01 Н/м модифицировали сферической частицей диоксида кремния размером 2,5 мкм.
  3. После установки выровняйте лазер по вершине треугольного зонда, а затем отрегулируйте отклонение зеркала и лазера, чтобы максимизировать сумму сигнала (обычно между 1,5-2,2 вольтами).
  4. Погрузите зонд в DPBS и подождите до 15 минут, чтобы получить тепловое равновесие. Нажмите кнопку Калибровка и выберите Контактно-зависимая калибровка. Нажмите кнопку «Собрать тепловую настройку» и после сбора данных выберите пик около 3 кГц для калибровки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшая регулировка зеркала и лазерных дефлекторов может потребоваться после погружения в жидкость из-за изменения показателя преломления.
  5. Подойдите к поверхности чашки Петри (пластика), установив для параметров приближения постоянную скорость, высоту цели 7,5 мкм и скорость приближения 15 мкм/с. Включите базовое измерение за прогон для подхода , чтобы подход выполнялся непрерывно и не останавливался рано из-за дрейфа в дефлекторе.
  6. При приближении задайте параметры захвата для отображения силы на обороты 4 нН, расстояние отступа 2 мкм, скорость 1 мкм/с и время контакта 0 с. Нажмите кнопку Start , чтобы начать собирать кривую силы на пластиковой поверхности (например, на пластине колодца).
  7. Вернитесь в окно калибровки и выберите участок кривой силы, соответствующий контакту и углублению пластика. Примите рассчитанные значения чувствительности и жесткости для зонда для полной калибровки.
  8. После калибровки поднимите зонд AFM и поместите образец гидрогеля для опроса. Подходите к гидрогелю в соответствии с настройками, указанными в шаге 5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процедуры приближения к поверхности гидрогеля устройство может ошибочно вызвать приближенное состояние. Чтобы проверить фактический подход, получите кривую силы, как показано на шаге 4.6. Повторите процедуру подхода, если результирующая кривая не показывает контакта и результирующего отступа.
  9. Когда поверхностный подход будет успешным, переключитесь в режим Force Mapping и задайте параметры сбора карты размером 8 x 8 с длиной 40 мкм на ось. Получение силовых карт в различных регионах для оценки однородности измерений жесткости.
    1. Интерпретируйте силовые кривые с помощью программной программы JPK SPM Data Processing через модель Герца/Снеддона (уравнения 1 и 2, см. таблицу 3 для определения всех переменных) с выбранной сферической геометрией 32,33,3 4.
      Equation 1Уравнение 132
      Equation 2Уравнение 232

4. Настройка и медикаментозное лечение 3D, матричных культур

  1. Подготовьте нужные клетки в виде одноклеточного раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для различных типов ячеек могут потребоваться разные методы пропускания. Типичный протокол для прохождения культуры суспензии сфероидов GBM из колбы Т-75 описан в ссылке31.
  2. Соберите сфероиды GBM (диаметром около 150 мкм) из культуры суспензии колбы Т-75 в коническую трубку объемом 15 мл. Промойте колбу для культивирования 5 мл DPBS, чтобы удалить любые остаточные клетки и среды, и добавьте этот объем в коническую трубку.
  3. Центрифугируют коническую трубку, содержащую ячейки при 200 х г , в течение 5 мин при комнатной температуре. После центрифугирования удалите супернатант серологической пипеткой объемом 5 мл, следя за тем, чтобы не потревожить клеточную гранулу, и повторно суспендируйте в 5 мл DPBS.
  4. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре для промывки клеток. Аспирировать супернатант серологической пипеткой 5 мл, следя за тем, чтобы не нарушить работу клеточной гранулы, а затем повторно суспендировать клетки в 2 мл реагента диссоциации клеток (см. Таблицу материалов).
  5. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Добавьте 3 мл полной среды (см. Таблицу материалов) и аккуратно пипетку 3-5 раз, чтобы разбить сфероиды на одноклеточную суспензию31.
  6. Центрифугировать одноэлементную суспензию при 400 х г (одноэлементные суспензии могут вращаться быстрее для образования гранул) в течение 5 мин в гранулярные ячейки при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант серологической пипеткой 5 мл, заботясь о том, чтобы не потревожить клеточную гранулу. Повторное суспендирование клеток в 1 мл полной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки остаются в сгустках, а не в виде одиночных клеток во взвешенной суспензии, после прохождения клетки могут быть пропущены через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм для получения одноклеточной суспензии.
  7. Удалите часть клеток для подсчета с помощью гемоцитометра. Разбавьте эту порцию в два раза трипан-синим, который пронизывает клетки с нарушенной жизнеспособностью. Подсчитывайте только живые, бесцветные клетки. Как правило, Т-75, посеянный по 800 000 клеток на колбу, дает 2-3 миллиона клеток через неделю в культуре.
  8. Определите количество клеток, необходимое для инкапсуляции. Перенесите объем среды, содержащей общее количество необходимых клеток, в стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,7 мл. Открутите при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, минимум 2,5 миллиона клеток, повторно суспендированных в 1 мл объема геля, необходимы для инкапсуляции клеток при 2,5 миллионах клеток / мл. Гель объемом 1 мл позволяет пользователям дозировать 100 гелевых капель, где каждая капля геля имеет объем 10 мкл. Для учета потерь при переносе пипетки рекомендуется приготовить дополнительный ~20% объем клеток, суспендированных в растворе гидрогеля. Таким образом, в этом примере можно было бы получить 3 миллиона клеток и 1,2 мл раствора предшественника гидрогеля. Рекомендуется минимальная плотность 500 тыс. клеток/мл.
  9. Аспирируйте супернатант с помощью микропипетки, заботясь о том, чтобы не потревожить клеточную гранулу. Повторно суспендируют клеточную гранулу в растворе предшественника гидрогеля, приготовленном на стадии 1.4, хорошо перемешивают путем пипетки вверх и вниз микропипеткой 1000 мкл 4-5 раз.
  10. Загрузите ячейки в повторный пипетку (см. Таблицу материалов), рассчитанную на дозирование 10 мкл. Чтобы избежать пузырьков и неравномерного дозирования, загрунтуйте повторный пипетку, дозируя дополнительно 1-2 раза в контейнер для отходов.
  11. В каждую скважину из 384-луночной пластины дозируют 10 мкл клеток, взвешенных в растворе гидрогеля, из повторного пипетки. Используя светодиодную решетку, освещают каждую скважину, содержащую ячейки (этап 2) в течение 15 с с интенсивностью (пример результатов на фиг.2А используется интенсивности 1,14, 1,55, 2,15, 2,74 мВт/см2) для достижения желаемых механических свойств.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагается начинать с пяти реплик на каждое экспериментальное условие и масштабировать вверх или вниз в зависимости от желаемой пропускной способности и дисперсии анализа конечной точки.
  12. Добавьте 40 мкл полной среды в каждую лунку, содержащую ячейки. Добавьте 50 мкл DPBS в неэкспериментальные, сухие скважины, окружающие гели, чтобы свести к минимуму потери из-за испарения.
  13. Для клеток GBM добавляют 40 мкл средосодержащего лекарственного средства (например, TMZ, см. Таблицу материалов) для достижения конечной желаемой концентрации (10 мкМ-100 мкМ в диметилсульфоксиде (DMSO) или транспортном средстве (DMSO), соответственно, начиная с 3 дней после инкапсуляции.

5. Анализ пролиферации CCK8

  1. Добавьте 10 мкл реагента CCK8 (см. Таблицу материалов) в каждую лунку, содержащую клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы выполняете этот анализ в первый раз, включите отрицательные контрольные скважины, такие как только среда или бесклеточный гидрогель в средах.
  2. Инкубировать в течение 1-4 ч согласно инструкции производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это время может изменяться в зависимости от типа и плотности клеток, и, таким образом, время инкубации должно быть проверено для каждого применения, чтобы значения поглощения попадали в линейный диапазон, что является требованием для применения закона35 бира.
  3. Считывание поглощений при 450 нм для всех скважин после инкубации.
  4. Рассчитайте среднее поглощение при 450 нм, полученное на шаге 3 для состояния транспортного средства для каждой группы. Разделите каждый хорошо обработанный препаратом на среднее значение контроля транспортного средства на группу.
  5. Вычисление доверительных интервалов путем генерации распределений начальной загрузки (N = 10 000) с помощью процентильного метода36.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, можно использовать 95% доверительные интервалы и интерпретировать условия, доверительные интервалы которых не пересекают 1, чтобы быть значительными и требующими дальнейшего изучения. Установка доверительных интервалов на 95% согласуется с установкой отсечения значимости p = 0,05. Для данных, показанных в результатах, полезно различать условия, которые либо способствуют, либо ингибируют матричную опосредованную лекарственную устойчивость, требующую двустороннего анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Измерения AFM подтвердили точное управление механикой гидрогеля в зависимости от ультрафиолетового излучения (мВт/см2) во время фотосшивания с использованием специально изготовленного светодиодного массива с управлением Arduino (рисунок 2A). Состав гидрогеля, используемый в этом протоколе, можно найти в таблице 2. Расстояние между светодиодами на прилагаемом шаблоне соответствует расстоянию для каждой второй лунки пластины из 384 лунок, что позволяет формировать гели внутри пластины (рисунок 2B). Опрос ФОМ областей микронного масштаба на поверхностях одиночных гидрогелей показал, что гидрогели с более мягкими средними модулями Юнга также имеют меньшие диапазоны модулей, чем более жесткие гидрогели (рисунок 2C-E).

Плотность посева клеток, которая максимизирует жизнеспособность, должна быть определена эмпирически для каждого типа клеток. Это исследование показывает, что 3D-культуры клеток GS122, посеянные при плотности 2 500 000 клеток / мл, продемонстрировали значительно более высокую жизнеспособность при оценке через 7 дней в культуре по сравнению с культурой, по сравнению с культурой, посеянной при плотности 500 000 клеток / мл (рисунок 3A). Кроме того, клетки GS122 и GS304 использовались в качестве моделей для культивирования клеток GBM, полученных от пациента, для исследования зависимости ответа химиотерапии от жесткости и биохимического состава матричной микросреды (рисунок 3B-D). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа CCK8 после обработки TMZ в течение 4 дней, что приводило к общему времени культивирования 7 дней путем масштабирования измерения OD450 соответствующим контролем транспортного средства и генерации 95% доверительных интервалов путем начальной загрузки (N = 10 000) с помощью процентильного метода36. При этих распределениях условия, в которых доверительные интервалы не перекрывались значением 1 (пунктирная линия), считались значимыми. По сравнению с более часто используемыми статистическими методами, такими как t-тесты или ANOVA, оценка доверительных интервалов с использованием начальной загрузки для оценки распределений, которые будут присутствовать для больших размеров выборки, является предпочтительной для скрининговых анализов, целью которых является выявление меньшего подмножества условий для дальнейшего исследования. Одним из дополнительных преимуществ этого метода является то, что условия с меньшим спредом в доверительном интервале могут быть приоритетными по сравнению с другими условиями с аналогичным средним значением, но более высоким спредом в доверительном интервале. Это исследование показало, что клетки GS122 получили преимущества выживания от микроокружательных взаимодействий (рисунок 3B). Это преимущество выживаемости было значительным в условиях 0,8, 1 и 4 кПа, но не в состоянии 8 кПа для клеток GS122. Клетки GS304 были нечувствительны как к жесткости, так и к лечению TMZ.

Затем изучали влияние биохимического состава матричной микросреды путем варьирования включения полученных из ECM интегрин-связывающих пептидов (таблица 1), которые, как известно, регулируются в микроокружении опухоли GBM при двух жесткостях, 0,8 кПа и 8 кПа. Опять же, клетки GS304 не получили значительного преимущества выживания от включения матрицы и были нечувствительны к TMZ. Тем не менее, клетки GS122 показали прирост выживаемости в состоянии 8 кПа, когда пептиды, полученные из остеопонтина, были включены в матрицу, в то время как включение интегрин-связывающего сиалопротеина (IBSP) или пептидов, полученных из тенасцина-C, обеспечило минимальные преимущества выживания, такие как культура в матрицах с общим пептидом RGD (рисунок 3C). Напротив, ни один пептид не обеспечил прирост выживаемости в состоянии культуры 0,8 кПа (рисунок 3D). Вместе полученные результаты свидетельствуют о внутренних различиях как в матричном, так и в лекарственном ответах между двумя оцененными клеточными линиями, полученными от пациента.

3D-гидрогелевые культуры могут быть визуализированы с использованием стандартной световой микроскопии для оценки того, как морфология клеток и инвазивное поведение влияют на условия культивирования в зависимости от клеточной линии (рисунок 4). Клетки GS122 и GS304 распространяются при культивировании в мягких или жестких гидрогелевых матрицах, включая RGD-содержащие пептиды (рисунок 4A). В то время как пептиды влияли на распространение клеток, способность клетки к распространению не обязательно предсказывала способность культуры приобретать устойчивость к TMZ. Например, клетки GS122 демонстрируют аналогичное отсутствие распространения как в 0,8, так и в 8 кПа с остеопонтином; однако GS122 показал только повышенную устойчивость к TMZ в состоянии 8 кПа (рисунок 4B). Наконец, эта миниатюрная платформа 3D-культур может быть использована для культивирования клеток человека из других типов опухолей, включая жизнеспособные органоиды терминально дифференцированных нейроэндокринных клеток рака предстательной железы (рисунок 4C).

Figure 1
Рисунок 1: Мультяшное изображение протокола. (A) Мультяшное изображение процесса генерации и мониторинга 3D-культуры. (1) Получают гидрогелевые растворы на основе ГК. (2) Затем гидрогелевые растворы сшиваются с переменной интенсивностью через светодиоды, управляемые микроконтроллером Arduino. (3) Результирующая механика гидрогеля оценивается AFM для проверки разницы в механике геля. (4) Растворы, соответствующие составу из Стадии 1, затем используют для инкапсуляции клеток GBM, полученных от пациента, и обрабатывают препаратом. (5) Через 7 дней жизнеспособность клеток считывается с помощью колориметрического анализа CCK8. (B) Принципиальная схема для пользовательской матрицы светодиодной подсветки, используемой в этом протоколе. Отдельные компоненты перечислены в Таблице материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Гидрогели, изготовленные с различной жесткостью с использованием перестраиваемых светодиодов для изменения излучения. (A) Скрипичные графики показывают расчетный модуль Юнга из кривых силы, генерируемых AFM в трех областях поверхности, охватывающих 40 мкм x 40 мкм, отдельных гидрогелей. Модуль Юнга каждого гидрогеля показан как функция УФ-излучения во время фотосшивания. Горизонтальные белые линии обозначают медиану для каждой экспериментальной группы. (B) Светодиодная решетка с расстоянием, соответствующим шагу многоскважинных плит (384 скважины). (C) Тепловая карта, показывающая региональную вариацию модуля Юнга (среднее = 0,8 кПа) для типичного геля, сшитого воздействием 1,55 мВт/см2 в течение 15 с. (D) Тепловая карта, показывающая региональное изменение модуля Юнга (среднее = 8 кПа) для типичного геля, сшитого при воздействии 2,74 мВт/см2 в течение 15 с. (E) Гистограмма, иллюстрирующая диапазон измерений модуля Юнга по всей поверхности гидрогелей, показанных в C и D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Ортогональное представление жесткости и интегрин-связывающего пептида выявляет внутренние биологические различия между клеточными линиями GBM. (A) Типичные значения абсорбции для клеток GS122, инкапсулированных в гидрогель 10 мкл при плотности 500 000 или 2 500 000 клеток на мл. (B) Данные о реакции на наркотики для клеточных линий GS122 и GS304 визуализируются путем нормализации значения OD450 обработанных препаратом лунок (N = 5) на среднее значение скважин, обработанных транспортным средством (N = 5). Было отмечено, что жизнеспособность в контексте лекарственного лечения варьируется нелинейно для жесткости гидрогеля, демонстрируя различия между клеточными линиями. (С,Г) Данные о лекарственном ответе для клеточных линий GS122 и GS304, когда был включен тип интегрин-связывающего пептида и жесткость матрицы изменялась ортогонально. Все полосы ошибок представляют 95% доверительные интервалы, полученные при начальной загрузке каждого условия по N = 10 000. Пунктирная линия (ось Y = 1) соответствует случаю, когда OD450 для условий обработки равен транспортному средству. Все экспериментальные значения были получены через 7 дней в культуре; TMZ добавляли через 3 дня после первоначальной инкапсуляции для исследований лекарств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Морфологические различия между клетками, инкапсулированными в различных гидрогелевых средах на основе ГК. (A) Фазоконтрастные изображения GS122 и GS304 при культивировании в гидрогеле (0,8 и 8 кПа) отображали мотив RGD. Белыми стрелками обозначены клетки с морфологиями распространения. (B) Фазовые изображения GS122 и GS304 при культивировании в гидрогеле (0,8 и 8 кПа) отображали пептид, полученный из остеопонтина. Белыми стрелками обозначены клетки с морфологиями распространения. Черными стрелками обозначены клетки с округлой морфологией. После 7 дней в культуре были сделаны снимки, и TMZ был добавлен через 3 дня после первоначальной инкапсуляции. (C) Фазовое изображение терминально дифференцированного нейроэндокринного органоида предстательной железы. Шкала стержней = 200 мкм (для A,B); 100 мкм (для C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Белок Пептидная последовательность
РГД ГКГГГРГДСПГ
Тенасцин-С GCGYGRSTDLPGLKAATHYTIRGV
Интегрин-связывающий сиалопротеин (IBSP) GCGYGGNGNGEPRGDTYRAY
Остеопонтин GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG

Таблица 1: Белки ECM и производные пептидные последовательности.

Реагент Начальная концентрация Объем (мкл) Конечная концентрация
Решение HA-SH 10 мг/мл 2300 5 мг/мл
ПЕГ-Ш 100 мг/мл 503 Варьируется в зависимости от эксперимента
ПЭГ-Норборнен 100 мг/мл 443 Варьируется в зависимости от эксперимента
Пептид 4 мкМ 288 0.250 мкМ
Колени 4 мг/мл 288 0,25 мг/мл
HEPES-HBSS Н/Д 798

Таблица 2: Типичные компоненты окончательной рецептуры для гидрогеля.

Переменная Параметр
F Сила
E Модуль Юнга
ν Коэффициент Пуассона
δ Отступ (вертикальное положение наконечника)
a Радиус контактного круга
РС Радиус сферы

Таблица 3: Переменные и соответствующие параметры для расчетов АСМ.

Дополнительный файл 1: Руководство по использованию светодиодной матрицы для освещения и фотосшивки гидрогелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 1: Файл Arduino для микроконтроллера led array (Arduino.zip). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 2: Драйверы сторонних производителей для Arduino nano (Драйверы.zip). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 3: Файл обработки для управления графическим интерфейсом микроконтроллера светодиодного массива (GUI.zip). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный кодовый файл 4: Файл для 3D-печати внешний держатель для микроконтроллера светодиодной решетки (Holder.zip). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В текущей работе представлены методы генерации 3D,миниатюрных культур на основе ГК, одновременно изменяя жесткость матрицы и пептиды, доступные для взаимодействия с интегрином. Этот метод позволяет систематически изучать, как параметры матрицы влияют на клеточные фенотипы (например, жизнеспособность раковых клеток, подвергшихся химиотерапии) с повышенной пропускной способностью. Предыдущие подходы, в том числе представленные в настоящем описании, настраивали жесткость гидрогеля путем изменения процента общего полимера в окончательной рецептуре, где более жесткие гидрогели имеют более высокое содержание полимера21,31. Однако этот подход требует подготовки уникальной гидрогелевой формулы для каждой желаемой жесткости, процесс, который по своей сути снижает пропускную способность. Здесь жесткость гидрогеля настраивается изменяющимся УФ-излучением во время сшивания, так что гидрогели множественной жесткости могут быть получены из одного раствора-предшественника. Будущие практикующие врачи, которые могут не иметь возможности построить пользовательский осветитель, описанный здесь, могут легко заменить коммерчески доступное устройство для точечного отверждения УФ-излучения и отрегулировать освещение по мере отверждения различных секторов плиты скважины. Недостатком использования коммерческого устройства точечного отверждения является снижение пропускной способности по сравнению с пользовательским осветителем. Ограничением современных методов является то, что уникальные растворы все еще должны быть приготовлены для каждого пептидного состояния. Аналогичные методы ранее использовались другими группами для получения гидрогелей, содержащих градиент жесткости37,38. Тем не менее, это исследование демонстрирует, как фотосшивание может обеспечить миниатюризацию экспериментальных образцов и уменьшить сложность экспериментальных установок. В целом, эти улучшения позволят исследователям увеличить экспериментальную пропускную способность при проведении 3D-культур в матрично-миметических биоматериалах и принесут пользу в нескольких областях биомедицинской науки, помимо нейроонкологии.

Репрезентативные результаты демонстрируют, как этот метод может быть использован для создания миниатюрных 3D-культур клеток GBM, полученных от пациента, в определенных матрицах, в которых доступные интегрин-связывающие пептиды и жесткость варьируются, в пределах стандартной 384-луночной пластины, подходящей для нескольких стандартных анализов. Этот метод представляет репрезентативные результаты для скрининга того, как параметры матрицы влияют на ответы на химиотерапию TMZ в клетках GBM, полученных от двух уникальных пациентов, обозначенных как клетки GS122 и GS304. Из двух клеточных линий, полученных от пациента, оцененных здесь, реакция клеток GS122 на лечение TMZ была чувствительна к матричной микросреде, в то время как реакция клеток GS304 была нечувствительной. Что касается жесткости матрицы, клетки GS122, культивируемые в 3D-гидрогелях с модулем микросжима 4 кПа, максимизировали сопротивление TMZ, при этом при этом количество обработанных клеток увеличивалось больше, чем необработанных клеток в течение 7-дневного экспериментального курса. Механические свойства оказывали большее влияние на резистентность к TMZ, чем включенные интегрин-связывающие пептиды. Таким образом, ожидается, что воздействие различных концентраций пептидов, отдельно и в комбинации, позволит в будущем обнаружить матричные условия, способствующие лекарственной устойчивости. Нечувствительность клеток GS304 к окружающему их матриксу может указывать на то, что матрица оказывает большее влияние на клетки, такие как клетки GS122, которые изначально чувствительны к TMZ, но приобретают резистентность во время лечения. Напротив, степень, в которой матричные сигналы влияют на клетки, которые уже устойчивы к лечению в начале эксперимента, неясна, как и в случае с клетками GS304.

Результаты этого исследования несколько отклонились от ранее сообщенных результатов. Самые мягкие гидрогели на основе ГК (модуль Юнга 1 кПа, имитирующий жесткость нативного мозга) способствовали максимальному резистентности к TMZ GBM-клеткам, полученным из четырех опухолей разных пациентов, чем тот, который оценивался здесь21. Существует несколько возможных причин такого несоответствия. Во-первых, расширенный диапазон жесткости гидрогеля был опрошен в текущем исследовании, в котором сравнивались гидрогели в диапазоне от 0,8 кПа до 8 кПа микросжимающих модулей, в то время как в предыдущих исследованиях сравнивались только гидрогели с модулями Юнга 1 кПа и 2 кПа. Кроме того, в предыдущих исследованиях механическая характеристика проводилась в объемном масштабе с использованием линейного механического сжатия для оценки модуля Юнга, тогда как в этом исследовании AFM использовался для измерения модуля микросжима. Для исследователей, стремящихся реализовать представленные здесь методы, которые не требуют микромасштабных механических измерений, модули объемного масштаба, использующие реометрию или линейное механическое тестирование, являются вполне приемлемыми заменителями AFM. Примечательно, что микромеханические анализы выявили гетерогенные модули по всей поверхности одного геля. Сопоставимые измерения AFM на гидрогелях, сформулированных в предыдущих исследованиях, не были сделаны, но ожидается, что дисперсия жесткости, представленная в одном гидрогеле, была больше, чем в текущем исследовании. Гидрогели в предыдущих исследованиях были получены с использованием сшивки с добавлением типа Майкла, зависящего от кинетического перемешивания при 37 градусах C 10,21,24. Напротив, фотосшинка позволяет тщательно перемешивать предшественники гидрогеля до воздействия света, что улучшает однородность в 3D-гидрогеле и, в свою очередь, снижает изменчивость клеточных реакций. Наконец, опухоли GBM демонстрируют заведомо гетерогенное и непредсказуемое поведение39 и, таким образом, разумно ожидать, что клетки, полученные из отдельных опухолей, также будут обладать уникальными свойствами. Это отсутствие согласованности между образцами пациентов мотивирует потребность в высокопроизводительной платформе для выяснения характеристик опухоли, специфичных для пациента.

Общие подводные камни при выполнении процедуры фотосшивки миниатюрного гидрогеля включают неполное смешивание предшественников гидрогеля, что приводит к плохой воспроизводимости, и спонтанное гелеобразование раствора ГК при смешивании. Эти проблемы могут быть смягчены путем перемешивания ГК-тиола в течение как минимум 45 мин и полного раствора прекурсора в течение, по меньшей мере, дополнительных 30 мин при тщательном мониторинге рН растворов предшественников гидрогеля, чтобы убедиться, что он остается ниже 7 для предотвращения окисления тиола и образования дисульфида в сшитые связи. В отличие от методов сшивания, использующих кинетический механизм сложения типа Майкла10,21, метод фотосшивания, используемый в этом протоколе, снижает вероятность спонтанного гелеобразования, когда все реагенты объединены21. Настоятельно рекомендуются контрольные точки контроля качества, такие как измерение процента тиолирования ГК31 и изготовление дополнительных гидрогелей для параллельных механических испытаний каждой партии 3D-культур. Наконец, плотность посева для 3D-инкапсуляции в гидрогелях должна быть идентифицирована для каждого используемого типа клеток или линии. Как правило, результаты показывают, что минимальная концентрация 1 миллиона клеток / мл достаточна для 3D-культуры большинства клеток, которые образуют сфероиды, включая полученные от пациента клетки GBM, эмбриональные стволовые клетки человека (H9) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (данные не показаны). Также рекомендуется включение лечения ингибитором ROCK до инкапсуляции (стадия 4.1) при использовании особо чувствительных клеток40.

В контексте разработки новых подходов к лечению ГБМ, протокол, представленный здесь, предоставляет методы функционального скрининга лекарственных реакций клеток ГБМ, полученных от пациента, в физиологически значимой микросреде. Богатое хранилище генетических, эпигенетических и клинических данных экспрессии мРНК для GBM (и других видов рака) является общедоступным благодаря усилиям Атласа генома рака (TCGA) и других15. Ожидается, что данные, полученные в сочетании с этими большими наборами данных, генерируемые функциональными экранами миниатюрных 3D-культур, могут выявить новые корреляции, улучшая прогнозирование клинических исходов у отдельных пациентов. Например, могут быть идентифицированы субпопуляции опухолей пациентов, для которых некоторые методы лечения, такие как соединения, разрушающие матрицу, такие как циленгитид, могут улучшить клинические исходы41. В дополнение к лекарственному ответу, эта культуральная платформа позволяет оценивать инвазию опухолевых клеток с использованием хорошо совместимых с пластинами тепловизоров с высоким содержанием. Гибкость этой платформы для включения множества различных пептидов, отдельно или в комбинации, в то время как ортогонально изменяющаяся жесткость может помочь идентифицировать матричные особенности, приводящие к агрессии опухоли GBM.

Помимо GBM, эти методы могут быть адаптированы для исследования влияния параметров матрицы на другие типы клеток в контексте других заболеваний, развития тканей и нормальной функции тканей. В будущем будет легко еще больше увеличить пропускную способность этих методов, поскольку они были специально разработаны для выполнения в контексте многоскважинных пластин, чтобы облегчить внедрение в существующие рабочие процессы для обнаружения лекарств путем использования коммерчески доступных автоматизированных обработчиков жидкостей и тепловизоров с высоким содержанием. Легкая интеграция с существующей инфраструктурой и повышенная автоматизация, которая снижает технические навыки, необходимые для производства и обслуживания нагруженных клетками 3D-гидрогелевых культур, значительно снизят барьеры для внедрения этого метода. Хотя в этой работе конкретно представлены культуры в гидрогелях на основе ГК, ожидается, что этот метод может быть легко переведен на другие широко используемые фотосмешиваемые материалы для 3D-клеточной культуры, такие как метакрилированный желатин, и что методы, представленные здесь, обеспечат полезное руководство для дополнительных применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы особо поблагодарить Кэролин Ким, Амелию Лао, Райана Стаутамора и Итая Соломона за их вклад в более ранние итерации схемы фотогелирования. Сотовые линии GS122 и GS304 были щедро предоставлены Дэвидом Натансоном. Все фигуры были созданы с BioRender.com. Основные объекты UCLA, общие ресурсы молекулярного скрининга и лаборатория характеристик nano и pico сыграли важную роль в работе. Чэнь Чиа-Чун был поддержан Ucla Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Григора Варужаняна поддержал грант NIH По программе обучения биологии опухолевых клеток (T32 CA 009056).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.1 kOhm resistors, 6 W Digikey 35601k1ft
1.7 mL microcentrifuge tube Genesse Scientific 21-108
15 mL conical tube Fisher Scientific 14-959-70C
365 nm LED Digikey ltpl-c034uvh365
384 well plate Bio Greiner One 781090
40 µm cell strainer MTC bio C4040
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) Laysan Bio 4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs Digikey 2n5550ta
80 Ohm resistors, 0.125 W Digikey erjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) Jenkem Technology A7025-1
Accutase Innovative Cell Technologies AT104500  cell dissociation  reagent
AFM Probes Novascan 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle
Arduino IDE Arduino 1.8.19
Arduino Nano Makerfire Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board
bFGF Peprotech 100-18B 20 ng/mL
CCK8 Abcam ab228554
Centrifuge Thermoscientific sorvall legend xtr
CP100ST Gilson F148415 Pipette tips for positive displacement pipette
Cubis Semi-Micro Balance Sartorius MSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50) Life Technologies 11330057 1x
DMSO Fisher Scientific BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-) Genesse Scientific 25-508
EGF Peprotech AF100-15 50 ng/mL
Ethanol, Anhydrous Fisher Scientific A405P Add DI water to dilute to 70%
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials Fisher Scientific 03-339-23C
Fisherbrand Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12B
G21 Supplement Gemini Bio 400-160 50x
Hanks Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14175095
HCl, ACS, 12M Sigma Aldrich S25838A Add DI water to dilute to 1 M
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma Aldrich H3149-100Ku 25 µg/mL
HEPES Sigma Aldrich H7006-100G
Hot Air Gun Wagner HT1000
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide Genscript Custom Order GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% Sigma Aldrich 900889-1G
Magnetic stir plate Thermo Scientific SP194715
Microcentrifuge Thermo Scientific Sorvall legend micro 21R
Microman E single Channel Pipettor Gilson FD10004 Positive displacement pipette
Micropipette Tips Various Manufacturs Various sizes
mLine micropipette Sartorious
N-acetyl Cysteine Sigma Aldrich A7250-10G
Nanowizard 4 Bruker AFM microscope
NaOH Fisher Scientific ss255-1 Add DI water to dilute to 1 M
Normoicin Invivogen ant-nr-1 500x
Osteopontin Peptide Genscript Custom Order GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet Aid Drummond 4000102
Plain Microscope Slides Globe Scientific 1301
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep Grace Bio Labs 664201-A Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet
Processing Processing 3.5.4
Repeater M4 Eppendorf 4982000322
Repeater Pipette Tips Sartorious 30089430 1 mL sizes
RGD Peptide Genscript GCGYGRGDSPG
Scoth Tape
Serological Pipettes Genesse Scientific 12-102,12-104 5,10 mL Pipettes
Solder Paste Digikey 315-NC191LT15T5-ND
Solder Wire
Straight dissecting forceps VWR Scientific 82027-408
Synergy H1 Plate Reader Biotek
T-75 Cell Culture Treated Flask Genesee Scientific 25-209
Temozolomide Sigma Aldrich T2577 Typically used from 10 µM to 100 µM
Tenascin-C Peptide Genscript GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified Lifecore Biomedical HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro VWR 58948-375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
  2. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  3. Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
  4. Booth, B., Ma, P., Glassman, R. Oncology's trials. Market indicators. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).
  5. Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
  6. Broekman, M. L., et al. Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma. Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).
  7. Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
  8. Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
  9. Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).
  10. Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
  11. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
  12. Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
  13. Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, Supplement_3 (2021).
  14. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  15. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  16. Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, Poznan, Poland. 68-77 (2015).
  17. Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).
  18. Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
  19. Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
  20. Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
  21. Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
  22. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
  23. Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
  24. Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
  25. Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
  26. Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
  27. Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
  28. Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
  29. Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
  30. Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
  31. Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
  32. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  33. Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
  34. Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
  35. Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
  36. Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
  37. Lavrentieva, A. Gradient hydrogels. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).
  38. Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
  39. da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
  40. Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
  41. Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).

Tags

Биоинженерия выпуск 184
Гидрогелевые матрицы обеспечивают повышенную пропускную способность для скрининговых эффектов компонентов матрицы и терапии в 3D-моделях опухолей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liang, J., Sohrabi, A., Epperson,… More

Liang, J., Sohrabi, A., Epperson, M., Rad, L. M., Tamura, K., Sathialingam, M., Skandakumar, T., Lue, P., Huang, J., Popoli, J., Yackly, A., Bick, M., Wang, Z. Z., Chen, C. C., Varuzhanyan, G., Damoiseaux, R., Seidlits, S. K. Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models. J. Vis. Exp. (184), e63791, doi:10.3791/63791 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter