Summary
Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.
Abstract
Hücre-matriks etkileşimleri, biyokimyasal, mekanik ve geometrik ipuçları yoluyla karmaşık fizyolojik süreçlere aracılık eder, patolojik değişiklikleri ve terapötik yanıtları etkiler. İlaç geliştirme boru hattında daha önce matris etkilerinin hesaba katılmasının, yeni terapötiklerin klinik başarı olasılığını artırması beklenmektedir. 3D hücre kültüründe spesifik doku mikroortamlarını özetleyen biyomateryal tabanlı stratejiler mevcuttur, ancak bunları öncelikle ilaç taraması için kullanılan 2D kültür yöntemleriyle bütünleştirmek zor olmuştur. Bu nedenle, burada sunulan protokol, mevcut ilaç tarama boru hatları ve hücre canlılığı için geleneksel analizlerle entegrasyonu kolaylaştırmak için minyatür biyomateryal matrisleri içinde 3D kültür yöntemlerinin çok kuyucuklu bir plaka formatında geliştirilmesini detaylandırmaktadır. Kültürlenmiş hücrelerde klinik olarak ilgili fenotiplerin korunması için kritik öneme sahip matris özelliklerinin yüksek doku ve hastalığa özgü olması beklendiğinden, spesifik uygulamalar için uygun koşulları belirlemek için matris parametrelerinin kombinatoryal taraması gerekli olacaktır. Burada açıklanan yöntemler, matris mekaniğinin ortogonal varyasyonuna ve ligand sunumuna kanser hücresi yanıtlarını değerlendirmek için minyatür bir kültür formatı kullanmaktadır. Spesifik olarak, bu çalışma, matriks parametrelerinin hasta kaynaklı glioblastoma (GBM) hücrelerinin kemoterapiye verdiği yanıtlar üzerindeki etkilerini araştırmak için bu platformun kullanımını göstermektedir.
Introduction
Yeni bir ilaç geliştirmenin beklenen maliyeti, son on yılda istikrarlı bir şekilde artmıştır ve mevcut tahminlerde 1 milyar doların üzerinde 1 milyar dolardan fazladır1. Bu masrafın bir kısmı, klinik çalışmalara giren ilaçların yüksek başarısızlık oranıdır. İlaç adaylarının yaklaşık% 12'si nihayetinde 2019 yılında Amerika Birleşik Devletleri (ABD) Gıda ve İlaç İdaresi'nden (FDA) onay almaktadır. Birçok ilaç, beklenmedik toksisite2 nedeniyle Faz I'de başarısız olurken, güvenlik denemelerini geçen diğerleri etkinlik eksikliği nedeniyle başarısız olabilir3. Etkinliksizlikten kaynaklanan bu yıpranma, kısmen, ilaç geliştirme sırasında kullanılan kanser modellerinin klinik etkinliğin öngörücü olmadığı gerçeğiyle açıklanabilir4.
İn vitro ve in vivo modeller arasındaki fonksiyonel eşitsizlikler, tümör dışı hücreler ve fiziksel ECM 5,6 dahil olmak üzere kanser hücrelerinin doğal mikro ortamlarından çıkarılmasına bağlanabilir. Yaygın olarak, araştırma grupları, kültürlenmiş tümör hücrelerine 3D matris mikro ortamı sağlamak için Matrigel (fare sarkomlarından türetilen proteinli bir bazal membran matrisi) gibi ticari olarak temin edilebilen kültür matrislerini kullanır. 2D kültür ile karşılaştırıldığında, membran matrisindeki 3D kültür, in vitro sonuçların klinik alaka düzeyini geliştirmiştir 7,8. Bununla birlikte, membran matrisi de dahil olmak üzere hücresellikten arındırılmış dokulardan elde edilen kültür biyomateryalleri, tipik olarak, tekrarlanabilirliği tehlikeye atabilecek partiden partiye değişkenlik sergiler9. Ayrıca, incelenenlerden farklı doku kökenlerine sahip tümörlerden türetilen matrisler, uygun fizyolojik ipuçlarını sağlamayabilir10. Son olarak, yüksek derecede intratümöral heterojenliğe sahip kanserler, mikron altı boyuttaki bir ölçekte değişen ve membran matrisinin11'i özetlemek üzere ayarlanamadığı mikroçevresel özelliklere sahiptir.
Glioblastoma (GBM), medyan sağkalım süresi yaklaşık 15 ay olan düzgün ölümcül bir beyin tümörüdür, tedavi gelişiminin özellikle zor olduğu bir kanserdir12,13. GBM için mevcut bakım standardı, primer tümör rezeksiyonu, ardından radyoterapi ve ardından temozolamid (TMZ) kullanılarak kemoterapiden oluşmaktadır 14. Ancak klinik GBM tümörlerinin yarısından fazlası çeşitli mekanizmalarla tedavi direnci göstermektedir15,16,17. Bireysel bir hasta için bir tedavi rejiminin etkinliğini tahmin etmek son derece zordur. Bireysel sonuçları tahmin etmek için kullanılan standart klinik öncesi modeller, immün sistemi baskılanmış farelere ortopik olarak ksenograflanmış hasta kaynaklı tümör hücrelerinden oluşur. Hasta kaynaklı ksenogreftler klinik GBM tümörlerinin birçok yönünü özetleyebilse ve klinik öncesi modeller için değerli olsa da18, doğası gereği pahalı, düşük verimli, zaman alıcı ve etik kaygılar içerir19. Hasta kaynaklı hücrelerin kültürleri, 2D plastik yüzeylerde veya sferoidler olarak, çoğunlukla bu sorunlardan kaçınır. Hasta kaynaklı hücreler genetik anormallikleri korurken, kültürleri 2D veya askıya alınmış sferoidler olarak kemirgenlerde ve orijinal hasta tümörlerinde hasta kaynaklı ksenogreftlerin büyük ölçüde zayıf temsilleri olmuştur20. Daha önce, biz ve diğerleri, beyin dokusunun mekanik ve biyokimyasal özelliklerini taklit eden bir 3D ECM'de kültürlenen GBM hücrelerinin, ilaç direnci fenotipleri10,21,22,23'ü koruyabileceğini göstermiştir.
Beyin ECM'sinde bol miktarda bulunan ve GBM tümörlerinde aşırı eksprese edilen bir polisakkarit olan hyaluronik asit (HA) ile CD44 reseptörü arasındaki etkileşimler, in vitro21,24,25,26,27 ilaç direncinin kazanılmasını modüle eder. Örneğin, HA'nın yumuşak, 3D kültürlere dahil edilmesi, hasta kaynaklı GBM hücrelerinin terapötik direnç kazanma yeteneğini arttırdı. Bu mekano-sorumluluk, GBM hücreleri21 üzerindeki CD44 reseptörlerine HA bağlanmasına bağlıydı. Ek olarak, 3D kültür matrislerine dahil edilen RGD taşıyan peptitlere integrin bağlanması, CD44 aracılı kemodirenci sertliğe bağlı bir şekilde yükseltti21. HA'nın ötesinde, birçoğu RGD bölgeleri içeren birkaç ECM proteininin ekspresyonu, normal beyin ve GBM tümörleri arasında değişir28. Örneğin, bir çalışma, GBM tümörleri29'da 28 farklı ECM proteininin yukarı regüle edildiğini bildirmiştir. Bu karmaşık tümör matriksi mikro ortamında, kanser hücreleri, Young'ın modülünde veya integrin bağlayıcı peptitlerin yoğunluğunda nispeten küçük farklılıklara (örneğin, bir büyüklük sırasından daha az) bağlı olan belirli bir direnç fenotipi üretmek için mekanik ve biyokimyasal ipuçlarını bütünleştirir28,29,30.
Mevcut protokol, tümör hücrelerinin matris ipuçlarının benzersiz kombinasyonlarını nasıl yorumladığını ve tedavi direncini destekleyen karmaşık, hastaya özgü matris mikro ortamlarını nasıl tanımladığını karakterize etmektedir (Şekil 1A). 3B kültür için minyatürleştirilmiş, hassas bir şekilde ayarlanmış matrisler oluşturmak için fotokimyasal bir yöntem, geniş, ortogonal değişken bir alan sağlar. Bir mikrodenetleyici tarafından çalıştırılan özel yapım bir LED dizisi, otomasyonu ve tekrarlanabilirliği artırmak için 384 delikli bir plaka formatında fotoçapraz bağlantı hidrojellerine dahil edildi. Maruz kalma yoğunluğu, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak değerlendirildiği gibi, ortaya çıkan hidrojellerin mikro-mekanik özelliklerini değiştirmek için kuyu boyunca değiştirildi. Bu el yazması aydınlatma dizisinin kendisinin oluşturulmasına odaklanmamakla birlikte, cihaz çoğaltmasına yardımcı olarak bir devre şeması (Şekil 1B) ve parça listesi (Malzeme Tablosu) sağlanmıştır.
Bu rapor, Young modülünün (tek bir büyüklük sırasına göre dört seviye) ve integrin bağlayıcı peptit içeriğinin (dört farklı ECM proteininden türetilmiş) ortogonal olarak değiştirildiği benzersiz, 3D mikro ortamlarda kültürlenmiş bir dizi GBM hücresinin hızlı bir şekilde üretildiğini göstermektedir. Bu yaklaşım daha sonra hidrojel mekaniğinin ve ECM-spesifik integrin katılımının, temozolamid (TMZ) kemoterapisine direnç kazandıkça hasta kaynaklı GBM hücrelerinin yaşayabilirliği ve proliferasyonu üzerindeki göreceli katkılarını araştırmak için kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hasta kaynaklı GBM hücre hatları (GS122 ve GS304), bu hatları UCLA Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB # 10-000655) tarafından onaylanan bir protokol altında geliştiren Profesör David Nathanson (ortak çalışanımız) tarafından sağlanmıştır. Hücreler, hücre hatlarının bireysel hastalara geri bağlanamaması için kimliksizleştirilmiş olarak sağlandı.
1. Hidrojel çözeltisinin hazırlanması
- HEPES tozunu Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) 20 mM'de çözerek HEPES-tamponlu çözelti hazırlayın. Tam çözmeyi takiben pH'ı 7'ye ayarlayın.
- HEPES-tamponlu çözeltide, önceki rapor31'i takiben hazırlanan tiyollenmiş HA'yı (700 kDa nominal moleküler ağırlık, bakınız Malzeme Tablosu) çözün, böylece her bir glukuronik asit üzerindeki karboksilik asit kalıntılarının% 6-8'i, tampon çözeltisinde 10 mg / mL'lik bir konsantrasyonda bir tiol ile modifiye edilir.
NOT: Ortam ışığı ile tiol oksidasyonunu önlemek için amber şişe önerilir.- Tamamen çözünene kadar, tipik olarak yaklaşık 45 dakika oda sıcaklığında manyetik bir karıştırma plakası (<1.000 rpm) kullanarak karıştırın.
- HA çözünürken, (1) 100 mg / mL 8-kol-PEG-Norbornen (20 kDa), (2) 100 mg / mL 4 kollu-PEG-Thiol (20 kDa), (3) 4 mM sistein veya sistein içeren peptid (örneğin, GCGYGRGDSPG) ve (4) mikrosantrifüj tüplerinde 4 mg / mL LAP ayrı çözeltiler hazırlayın (bkz.
- Bu dört çözeltinin her birini, adım 1.1'de hazırlanan HEPES tamponlu çözeltide hazırlayın. 4. adımı gerçekleştirmeden önce her bir reaktifin tamamen çözünmesini sağlamak için çözümleri vorteksleyin.
NOT: Birden fazla farklı peptit test ediliyorsa, her biri bu konjugasyon kimyası için bir sistein veya başka bir tiol moiety kaynağı içermelidir. - Bu noktada tek bir hidrojel içine bağlanacak tüm peptitlerin çözeltilerini (4 mM mevcut tiol) hazırlayın.
NOT: Bu çalışmada türetildikleri ve kullanıldıkları peptid dizileri ve ECM proteinleri Tablo 1'de listelenmiştir. Hücrelerin bağlanmadığı N-asetil sistein (bakınız Malzeme Tablosu), yapışkan bir peptidin konsantrasyonunu titre etmek veya negatif bir kontrol görevi görmek için biyoaktif, tiol içeren bir peptid ile ikame edilebilir31.
- Bu dört çözeltinin her birini, adım 1.1'de hazırlanan HEPES tamponlu çözeltide hazırlayın. 4. adımı gerçekleştirmeden önce her bir reaktifin tamamen çözünmesini sağlamak için çözümleri vorteksleyin.
- Tablo 2'de listelenen nihai hidrojel matrisleri için nihai konsantrasyonları elde etmek için HA, PEG-Norbornen, PEG-tiol ve sistein / tiol içeren peptitlerin bireysel çözeltilerini karıştırın (Malzeme Tablosuna bakınız). Tamamen karıştırmak için manyetik karıştırma plakası üzerinde en az 30 dakika boyunca karıştırın (<1.000 rpm).
NOT: HA çözümleri son derece viskozitelidir ve pozitif yer değiştirmeli pipet kullanılarak en iyi şekilde işlenir (bkz. Pozitif deplasmanlı pipet mevcut değilse, geniş delikli uçlar kullanılarak yavaşça pipetleme yapılarak viskoz çözeltiler standart bir mikropipetle de dağıtılabilir.
2. Bir LED dizisi aracılığıyla hidrojellerin aydınlatılması ve fotoçapraz bağlanması
DİKKAT: UV koruyucu gözlük takın ve aydınlatma alanını UV emici malzeme ile örtün.
NOT: Bu protokolde açıklanan LED dizisi, sağlanan devre şemasında gösterildiği gibi, seri olarak yerleştirilmiş sekiz LED'den oluşan altı setten oluşur (Şekil 1A). Her LED seti bağımsız olarak çalıştırılabilir, bu da çalışma başına altı farklı ışımaya izin verir. Ek Dosya 1, daha fazla rehberlik için aşağıdaki talimatlara karşılık gelen ekran görüntüleri içerir.
- Aydınlatma Cihazı.zip dosyasını Ek Kodlama Dosyalarından indirin. Bu dizin aşağıdaki dosyaları içerir: Arduino.zip (Ek Kodlama Dosyası 1), Sürücüler.zip (Ek Kodlama Dosyası 2), GUI.zip (Ek Kodlama Dosyası 3) ve Holder.zip (Ek Kodlama Dosyası 4).
NOT: 3D Devre kartını yerinde tutmak için üst ve alt kısımları yazdırın (ayrıntılar için Ek Kodlama Dosyalarına bakın). - Mikrodenetleyici yazılımını indirin ve yükleyin (bkz.
- GUI yazılımını indirin ve yükleyin (bkz. Yazılım çalıştırma talimatları için Ek Dosya 1'e bakın.
- İşleme'yi açın ve Çizim > Kitaplığı İçe Aktar > Kitaplık Ekle'ye tıklayarak controlIP5 kitaplığını kurun. Ardından, kütüphanelerde controlIP5'i arayın ve Yükle'ye tıklayın. Bunu ilk kez gerçekleştirin.
- 36 Volt güç kaynağını kullanarak aydınlatma cihazına güç verin (Malzeme Tablosuna bakın) ve bir mikro USB kablosu kullanarak bir PC'ye bağlayın.
NOT: Bazı aygıtlar çeşitli Arduino nano kartları için sürücüleri otomatik olarak yüklemez. Aygıt zip dosyasında bir sürücü kümesi sağlanır. - Arduino IDE kullanarak Adruino.zip klasöründe bulunan Arduino.ino dosyasını açın.
- Arduino.ino dosyasını Onay İşareti düğmesine tıklayarak derleyin. Derlenen kodu Ok düğmesine tıklayarak yükleyin.
- GUI.zip klasöründe bulunan GUI.pde dosyasını İşleme'yi kullanarak açın.
- Aydınlatma cihazını kontrol etmek için grafik kullanıcı arayüzünü başlatmak için işleme programında Çalıştır'a tıklayın.
- Grafik kullanıcı arayüzü penceresinde, hidrojel öncü çözeltisini içeren sütunun çapraz bağlanması ve istenen yoğunluğu girmesi için Yoğunluk'a tıklayın. Saat kutusuna tıklayın ve istediğiniz saati girin. Tablo 2'de sağlanan çözüm için bu 15 s olacaktır.
NOT: Son kullanıcıların bir radyometre kullanarak dijital yoğunluk değerlerini ışımaya kalibre etmeleri gerekir. Tipik yoğunluklara örnekler Şekil 2A'da verilmiştir. - Numuneleri aydınlatma cihazıyla (Şekil 2B) silikon kalıpların tek bir sütunundaki diğer tüm LED'lerle hizalayın (bkz. Malzeme Tablosu) veya 384 delikli plaka. Aydınlatmaya başlamak için Son'a tıklayın. Birden fazla slaytın veya 384 delikli bir plakanın diğer kuyularının aydınlatılması için bu işlemi gerektiği gibi tekrarlayın.
NOT: Tutucu, 384 delikli plaka, aydınlatma sırasında iç haznenin bir köşesiyle aynı hizada oturacak şekilde tasarlanmıştır.- Aydınlatmayı takiben, bir köşeye yerleştirildiğinde, kuyu plakasını bir sonraki köşeye taşıyın ve tekrarlayın. Plakanın diğer yarısındaki kuyuları aydınlatmak için, plakayı tutucudan kaldırın ve 180 ° döndürün.
- Aşağıdaki adımları izleyerek mekanik karakterizasyon için farklı mekaniklere sahip hidrojeller üretin.
- Cam slaytları ve silikon kalıpları, kalıntıları temizlemek için bant kullanarak temizleyin. Silikon kalıpları cam kızağa yapıştırın, iyi bir sızdırmazlık sağlamak için aşağı bastırın ve hava kabarcıklarının yerini alın.
- Pipet, adım 1.4'te hazırlandığı gibi 80 μL hidrojel öncü çözeltisini, cam slayt üzerindeki her silikon kalıba dönüştürür.
- Cam kaydırağı, tek bir sütundaki diğer tüm LED'lerle hizalanmış aydınlatma cihazına yerleştirin. Hidrojel öncüllerini, adım 2'de açıklandığı gibi, fotoçapraz bağlantıya 15 s boyunca UV ışığına maruz bırakın.
- Aydınlatma durduktan sonra, slaytları alın ve kalıbın iç çevresini ince bir uçla (10 μL pipet ucu, 30 G iğne, vb.) İzleyerek jelleri kalıplardan gevşetin. Silikon kalıpları cımbız/forseps ile çıkarın.
- Çapraz bağlı hidrojelleri, bir spatulayı ıslatarak ve yavaşça cam slayttan iterek 12 delikli bir plakanın ayrı ayrı kuyucuklarına taşıyın. Hidrojeli eklemeden önce her bir kuyucuğu 2 mL DPBS ile doldurun ( Malzeme Tablosuna bakınız). DPBS çözeltisindeki jelleri oda sıcaklığında (ertesi günün mekanik karakterizasyonu için) en az 12 saat (tipik olarak gece boyunca) şişirin.
3. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) ölçümleri
- Atomik kuvvet mikroskobunu (AFM) üreticinin talimatlarına göre açın (bkz. Bu protokol, cihazın ve ilgili yazılımın kullanımı için kısa talimatlar sağlar.
- AFM probunu takın (bkz.
NOT: Bu çalışmada, nominal yay sabiti 0.01 N/m olan üçgen silikon nitrür konsol, küresel 2.5 μm silikon dioksit parçacığı ile modifiye edilmiştir. - Kurulumdan sonra, lazeri üçgen probun tepesine hizalayın ve ardından sinyal toplamını en üst düzeye çıkarmak için aynayı ve lazer sapmasını ayarlayın (tipik olarak 1,5-2,2 Volt arasında).
- Probu DPBS'ye batırın ve termal dengeyi elde etmek için 15 dakikaya kadar bekleyin. Kalibrasyon düğmesine tıklayın ve Kontaka Bağlı kalibrasyon'u seçin. Termal Ayar Topla düğmesine tıklayın ve veri toplamayı takiben, kalibrasyon için 3 kHz civarında zirveyi seçin.
NOT: Kırılma indisi değişiklikleri nedeniyle bir sıvıya daldırıldıktan sonra aynanın ve lazer deflektörlerin hafifçe ayarlanması gerekebilir. - Yaklaşım Parametrelerini Sabit Hıza, hedef yüksekliği 7,5 μm'ye ve yaklaşma hızını 15 μm/s'ye ayarlayarak Petri kabının (plastik) yüzeyine yaklaşın. Yaklaşımın sürekli çalışması ve deflektördeki sapma nedeniyle erken durmaması için Yaklaşım için Çalıştırma Başına Temel Ölçüm'ü etkinleştirin.
- Yaklaştıktan sonra, kuvvet haritalama için alım parametrelerini 4 nN geri dönüş, 2 μm girinti mesafesi, 1 μm / s hız ve 0 s temas süresine ayarlayın. Plastik yüzeyde bir kuvvet eğrisi toplamaya başlamak için Başlat düğmesine basın (örneğin, bir kuyu plakası).
- Kalibrasyon penceresine dönün ve kuvvet eğrisinin plastiğin temas ve girintisine karşılık gelen kısmını seçin. Probun kalibrasyonu tamamlaması için hesaplanan hassasiyet ve sertlik değerlerini kabul edin.
- Kalibrasyonu takiben, AFM probunu kaldırın ve sorgulama için hidrojel numunesini yerleştirin. 5. adımda verilen ayarları izleyerek hidrojele yaklaşın.
NOT: Hidrojel yüzeyine doğru yaklaşım prosedürü sırasında, ünite yanlışlıkla yaklaşan durumu tetikleyebilir. Gerçek yaklaşımı doğrulamak için, adım 4.6'daki gibi bir kuvvet eğrisi elde edin. Ortaya çıkan eğri teması ve sonuçta girinti göstermiyorsa yaklaşım prosedürünü tekrarlayın. - Yüzey yaklaşımı başarılı olduğunda, Kuvvet Eşleme moduna geçin ve alma parametrelerini eksen başına 40 μm uzunluğa sahip 8 x 8 boyutunda bir haritaya ayarlayın. Sertlik ölçümlerinin homojenliğini değerlendirmek için çeşitli bölgelerde kuvvet haritaları elde edin.
- JPK SPM Veri İşleme yazılım programını kullanarak kuvvet eğrilerini bir Hertz/Sneddon model uyumu (Denklem 1 ve 2, tüm değişkenlerin tanımı için Tablo 3'e bakınız) ile küresel geometri32,33,3 4 seçilerek yorumlayın.
Denklem 132
Denklem 232
- JPK SPM Veri İşleme yazılım programını kullanarak kuvvet eğrilerini bir Hertz/Sneddon model uyumu (Denklem 1 ve 2, tüm değişkenlerin tanımı için Tablo 3'e bakınız) ile küresel geometri32,33,3 4 seçilerek yorumlayın.
Denklem 132
Denklem 232
4. 3D, matrise gömülü kültürlerin kurulması ve ilaç tedavisi
- İstenilen hücreleri tek hücreli bir çözelti olarak hazırlayın.
NOT: Farklı hücre tipleri farklı pasaj yöntemleri gerektirebilir. GBM sferoidlerinin süspansiyon kültürünü bir T-75 şişesinden geçirmek için tipik bir protokol referans31'de bildirilmiştir. - GBM sferoidlerini (kabaca 150 μm çapında) bir T-75 şişe süspansiyon kültüründen 15 mL'lik bir konik tüpe toplayın. Artık hücreleri ve ortamları çıkarmak için kültür şişesini 5 mL DPBS ile durulayın ve bu hacmi konik tüpe ekleyin.
- Hücreleri içeren konik tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatantı 5 mL'lik bir serolojik pipetle çıkarın, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin ve 5 mL DPBS'de yeniden askıya alın.
- Hücreleri yıkamak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj. Süpernatantı 5 mL'lik bir serolojik pipetle aspire edin, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin ve daha sonra hücreleri 2 mL hücre ayrışma reaktifinde yeniden askıya alın (bkz.
- Oda sıcaklığında 10-15 dakika inkübe edin. 3 mL tam ortam ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve sferoidleri tek hücreli süspansiyona ayırmak için 3-5 kez hafifçe pipetyapın 31.
- Tek hücreli süspansiyonu 400 x g'de (tek hücreli süspansiyonlar pelet oluşumu için daha hızlı döndürülebilir) oda sıcaklığında pelet hücrelerine 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı 5 mL'lik bir serolojik pipetle aspire edin, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin. Hücreleri 1 mL'lik tam ortamda yeniden askıya alın.
NOT: Hücreler süspansiyondaki tek hücreler olarak değil, kümeler halinde kalırsa, pasajdan sonra, hücreler tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirilebilir. - Bir hemositometre kullanarak saymak için hücrelerin bir kısmını çıkarın. Bu kısmı, canlılığı tehlikeye giren hücrelere nüfuz eden tripan mavisi ile iki kat seyreltin. Sadece canlı, renksiz hücreleri sayın. Tipik olarak, şişe başına 800.000 hücrede tohumlanan bir T-75, kültürde bir hafta sonra 2-3 milyon hücre verir.
- Kapsülleme için gerekli hücre sayısını belirleyin. Gerekli toplam hücre sayısını içeren bir ortam hacmini steril 1,7 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün.
NOT: Örneğin, hücreleri 2,5 milyon hücre/mL'de kapsüllemek için 1 mL jel hacminde yeniden askıya alınan en az 2,5 milyon hücre gereklidir. 1 mL'lik bir jel hacmi, kullanıcıların her jel damlasının 10 μL hacimde olduğu 100 jel damlası dağıtmasına izin verir. Pipet transferi sırasındaki kaybı hesaba katmak için hidrojel çözeltisinde asılı ekstra ~% 20'lik bir hücre hacminin hazırlanması önerilir. Böylece, bu örnekte 3 milyon hücre ve 1.2 mL hidrojel öncü çözeltisi hazırlanacaktır. Minimum 500 bin hücre/mL yoğunluğu önerilir. - Süpernatantı bir mikropipetle aspire edin, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin. Hücre peletini hidrojel öncü çözeltisinde, adım 1.4'te hazırlandığı gibi yeniden askıya alın, 1.000 μL mikropipetle 4-5 kez yukarı ve aşağı pipetle iyice karıştırın.
- Hücreleri, 10 μL dağıtmak üzere ayarlanmış tekrarlanan bir pipetleyiciye yükleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Kabarcıkları ve düzensiz dağıtımı önlemek için, tekrarlanan pipettörü bir atık kabına 1-2 kez daha dağıtarak hazırlayın.
- 384 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğunda, tekrarlanan pipetleyiciden hidrojel çözeltisinde asılı 10 μL hücre dağıtın. LED dizisini kullanarak, istenen mekanik özellikleri elde etmek için hücreleri içeren her bir kuyuyu (adım 2) 15 sn yoğunlukta aydınlatın (örnek olarak Şekil 2A'da 1,14, 1,55, 2,15, 2,74 mW/cm2 yoğunlukları kullanılmıştır).
NOT: Deneysel koşul başına beş çoğaltma ile başlamanız ve uç nokta testinin istenen aktarım hızına ve varyansına bağlı olarak ölçeği artırmanız veya azaltmanız önerilir. - Hücreleri içeren her bir kuyucuğa 40 μL tam ortam ekleyin. Buharlaşmadan kaynaklanan kayıpları en aza indirmek için jelleri çevreleyen deneysel olmayan, kuru kuyucuklara 50 μL DPBS ekleyin.
- GBM hücreleri için, istenen nihai konsantrasyonu (dimetilsülfoksit (DMSO) veya araçta (DMSO) 10 μM-100 μM) elde etmek için ortam içeren ilacın 40 μL'sini (örneğin, TMZ, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, buna göre, kapsüllemeden 3 gün sonra başlar.
5. CCK8 proliferasyon testi
- Hücreleri içeren her bir kuyucuğa 10 μL CCK8 reaktifi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Bu tahlili ilk kez yapıyorsanız, ortama yalnızca ortam veya hücresiz hidrojel gibi negatif kontrol kuyuları ekleyin. - Üreticinin talimatlarına göre 1-4 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu süre, hücre tipi ve yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak değişebilir ve bu nedenle kuluçka sürelerinin her uygulama için test edilmesi gerekir, böylece absorbans değerleri doğrusal bir aralıkta kalır, bu da Bira Yasası35'in uygulanması için bir gerekliliktir. - Kuluçkayı takiben tüm kuyucuklar için 450 nm'deki absorbansları okuyun.
- Her grup için araç durumu için adım 3'te elde edilen 450 nm'deki ortalama absorbansı hesaplayın. İyi tedavi edilen her ilacı, grup başına araç kontrolünün ortalamasına bölün.
- Yüzdelik yöntem36 aracılığıyla önyükleme dağıtımları (N = 10.000) oluşturarak güven aralıklarını hesaplayın.
NOT: Genel olarak, %95 güven aralıkları kullanılabilir ve güven aralıkları 1'in üzerine çıkmayan koşulları önemli olarak yorumlayabilir ve daha fazla araştırma yapılmasını gerektirebilir. Güven aralıklarını %95 olarak ayarlamak, p = 0,05 anlamlılık sınırı ayarlamakla uyumludur. Sonuçlarda gösterilen veriler için, matris aracılı ilaç direncini teşvik eden veya inhibe eden, iki taraflı bir analiz gerektiren koşulları ayırt etmede yarar vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AFM ölçümleri, özel yapım, Arduino kontrollü bir LED dizisi kullanılarak foto-çapraz bağlama sırasında UV ışınımının (mW /cm2) bir fonksiyonu olarak hidrojel mekaniğinin hassas kontrolünü doğruladı (Şekil 2A). Bu protokolde kullanılan hidrojel formülasyonu Tablo 2'de bulunabilir. Sağlanan şablondaki LED'lerin aralığı, 384 delikli bir plakanın diğer her bir kuyucuğunun aralığıyla eşleşir ve plakanın içinde jellerin oluşmasına izin verir (Şekil 2B). Tek hidrojellerin yüzeylerindeki mikron ölçekli bölgelerin AFM sorgulaması, daha yumuşak ortalama Young modülüne sahip hidrojellerin de daha sert hidrojellerden daha küçük modül aralıklarına sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 2C-E).
Canlılığı en üst düzeye çıkaran hücre tohumlama yoğunlukları, her hücre tipi için ampirik olarak belirlenmelidir. Bu çalışma, 2.500.000 hücre / mL yoğunluklarında tohumlanan GS122 hücrelerinin 3D kültürlerinin, kültürde 7 gün sonra değerlendirildiğinde, 500.000 hücre / mL yoğunluklarında tohumlananlara kıyasla önemli ölçüde daha yüksek canlılıklar sergilediğini göstermektedir (Şekil 3A). Ayrıca, GS122 ve GS304 hücreleri, kemoterapi yanıtının matris mikroçevresinin sertliği ve biyokimyasal bileşimine bağımlılığını araştırmak için hasta kaynaklı GBM hücrelerinin kültürlenmesinde model olarak kullanılmıştır (Şekil 3B-D). Hücre canlılığı, TMZ ile 4 gün boyunca tedaviden sonra CCK8 testi ile değerlendirildi ve OD450 ölçümünün ilgili bir araç kontrolü ile ölçeklendirilmesi ve yüzdelik yöntem36 ile önyükleme (N = 10.000) ile% 95 güven aralıkları oluşturularak toplam 7 günlük bir kültür süresine yol açtı. Bu dağılımlarla, güven aralıklarının 1 (kesikli çizgi) değeriyle çakışmadığı koşullar önemli kabul edildi. T-testleri veya ANOVA gibi daha yaygın olarak kullanılan istatistiksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, daha büyük örneklem büyüklükleri için mevcut olacak dağılımları tahmin etmek için önyükleme kullanarak güven aralıklarının tahmini, amacı daha fazla araştırma için koşulların daha küçük bir alt kümesini tanımlamak olan tarama tahlilleri için tercih edilir. Bu yöntemin ek bir yararı, bir güven aralığında daha küçük bir yayılmaya sahip koşulların, benzer bir ortalama değere sahip, ancak güven aralığında daha yüksek bir yayılmaya sahip diğer koşullara göre önceliklendirilebilmesidir. Bu çalışma, GS122 hücrelerinin mikroçevresel etkileşimlerden hayatta kalma yararları elde ettiğini göstermiştir (Şekil 3B). Bu sağkalım yararı, 0.8, 1 ve 4 kPa koşullarında anlamlıydı, ancak GS122 hücreleri için 8 kPa koşulunda anlamlı değildi. GS304 hücreleri hem sertliğe hem de TMZ tedavisine duyarsızdı.
Matriks mikroçevresinin biyokimyasal bileşiminin etkisi daha sonra, GBM tümör mikroortamında iki sertlikte, 0.8 kPa ve 8 kPa'da yukarı regüle edildiği bilinen ECM türevli, integrin bağlayıcı peptitlerin (Tablo 1) dahil edilmesiyle incelenmiştir. Yine, GS304 hücreleri matriks infüzyonundan anlamlı bir sağkalım yararı almadı ve TMZ'ye duyarsızdı. Bununla birlikte, GS122 hücreleri, osteopontin türevi peptitler matrise dahil edildiğinde 8 kPa durumunda hayatta kalma kazanımları gösterirken, integrin bağlayıcı sialoprotein (IBSP) veya tenassin-C türevli peptitlerin dahil edilmesi, genel RGD peptidi ile matrislerdeki kültür gibi minimal sağkalım yararları sağlamıştır (Şekil 3C). Buna karşılık, hiçbir peptit 0.8 kPa kültür koşulunda hayatta kalma kazanımları sağlamamıştır (Şekil 3D). Birlikte, sonuçlar değerlendirilen iki hasta kaynaklı hücre hattı arasındaki hem matriks hem de ilaç yanıtlarında içsel farklılıklar olduğunu göstermektedir.
3D hidrojel kültürleri, hücre morfolojisinin ve invaziv davranışların kültür koşullarından hücre hattına bağımlı bir şekilde nasıl etkilendiğini değerlendirmek için standart ışık mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir (Şekil 4). Hem GS122 hem de GS304 hücreleri, RGD içeren peptitler de dahil olmak üzere yumuşak veya sert hidrojel matrislerinde kültürlendiğinde yayılır (Şekil 4A). Peptitler hücre yayılımını etkilerken, bir hücrenin yayılma yeteneği, kültürün TMZ direnci kazanma yeteneğini mutlaka öngörmedi. Örneğin, GS122 hücreleri, osteopontin ile hem 0.8 hem de 8 kPa'da benzer bir yayılma eksikliği gösterir; Bununla birlikte, GS122 sadece 8 kPa durumunda TMZ'ye karşı gelişmiş direnç göstermiştir (Şekil 4B). Son olarak, bu minyatürleştirilmiş, 3D kültür platformu, ölümcül olarak farklılaşmış, nöroendokrin prostat kanseri hücrelerinin canlı organoidleri de dahil olmak üzere diğer tümör tiplerinden insan hücrelerini kültürlemek için kullanılabilir (Şekil 4C).
Şekil 1: Protokolün karikatür tasviri. (A) 3D kültür oluşturma ve izleme sürecinin karikatür tasviri. (1) HA bazlı hidrojel çözeltileri hazırlanır. (2) Hidrojel çözeltileri daha sonra bir Arduino mikrodenetleyici tarafından kontrol edilen LED'ler aracılığıyla değişken yoğunlukta çapraz bağlanır. (3) Ortaya çıkan hidrojel mekaniği, jel mekaniğindeki farkı doğrulamak için AFM tarafından değerlendirilir. (4) Adım 1'deki formülasyona uyan çözeltiler daha sonra hasta kaynaklı GBM hücrelerini kapsüllemek için kullanılır ve ilaçla tedavi edilir. (5) 7 gün sonra, hücre canlılığı CCK8 kolorimetrik tahlil ile okunur. (B) Bu protokolde kullanılan özel LED aydınlatma dizisi için devre şeması. Tek tek bileşenler Malzeme Tablosunda listelenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Işığı değiştirmek için ayarlanabilir LED'ler kullanılarak değişen sertlikte üretilen hidrojeller. (A) Keman grafikleri, AFM tarafından üç yüzey bölgesinde üretilen kuvvet eğrilerinden hesaplanan Young Modülünü gösterir ve bireysel hidrojellerin 40 μm x 40 μm'sini kapsar. Young'ın her bir hidrojelin modülü, fotoçapraz bağlama sırasında UV ışınımının bir fonksiyonu olarak gösterilmiştir. Yatay beyaz çizgiler her deney grubu için medyanı gösterir. (B) Çok kuyulu plakaların (384 kuyu) eğimine uyan aralıklı LED dizisi. (C) 15 s için 1,55 mW/cm2'ye maruz bırakılarak çapraz bağlanan tipik bir jel için Young modülünün (ortalama = 0,8 kPa) bölgesel varyasyonunu gösteren ısı haritası (D) 15 sn için 2,74 mW/cm2'ye maruz kalındığında çapraz bağlanan tipik bir jel için Young modülünün bölgesel varyasyonunu gösteren ısı haritası (ortalama = 8 kPa) (E) C ve D'de gösterilen hidrojellerin yüzeyindeki Young modül ölçümlerinin aralığını gösteren histogram. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sertlik ve integrin bağlayıcı peptidin ortogonal sunumu, GBM hücre hatları arasındaki içsel biyolojik farklılıkları ortaya koymaktadır . (A) ML başına 500.000 veya 2.500.000 hücre yoğunluğunda 10 μL'lik bir hidrojel içinde kapsüllenmiş GS122 hücreleri için tipik absorbans değerleri. (B) GS122 ve GS304 hücre hatları için ilaç yanıt verileri, ilaçla muamele edilen kuyuların OD450 değerinin (N = 5) araçla muamele edilen kuyuların ortalamasına (N = 5) göre normalleştirilmesiyle görselleştirilir. İlaç tedavisi bağlamında canlılığın, hidrojel sertliği için doğrusal olmayan bir şekilde değiştiği ve hücre hatları arasındaki varyasyonu gösterdiği gözlenmiştir. (C,D) GS122 ve GS304 hücre hatları için ilaç yanıt verileri, integrin bağlayıcı peptid tipi dahil edildiğinde ve matris sertliği ortogonal olarak değiştiğinde. Tüm hata çubukları, her koşulun N = 10.000 tarafından önyüklenmesinden elde edilen %95 güven aralıklarını temsil eder. Kesikli çizgi (y ekseni = 1), tedavi koşulları için OD450'nin araca eşit olduğu duruma karşılık gelir. Tüm deneysel değerler kültürde 7 gün sonra elde edildi; TMZ, ilaç çalışmaları için ilk kapsüllemeden 3 gün sonra eklendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Farklı HA bazlı hidrojel ortamlarında kapsüllenmiş hücreler arasındaki morfolojik farklılıklar . (A) GS122 ve GS304'ün faz kontrastı görüntüleri, bir hidrojelde (0.8 ve 8 kPa) kültürlendiğinde, bir RGD motifi sergiledi. Beyaz oklar, yayılmış morfolojileri olan hücreleri gösterir. (B) GS122 ve GS304'ün faz görüntüleri, bir hidrojelde (0.8 ve 8kPa) kültürlendiğinde, osteopontin'den türetilmiş bir peptid gösterdi. Beyaz oklar, yayılmış morfolojileri olan hücreleri gösterir. Siyah oklar, yuvarlak morfolojilere sahip hücreleri gösterir. Kültürde 7 gün kaldıktan sonra görüntüler çekildi ve TMZ ilk kapsüllemeden 3 gün sonra eklendi. (C) Terminal olarak farklılaşmış nöroendokrin prostat organoidinin faz görüntüsü. Ölçek çubukları = 200 μm ( A,B için); 100 μm (C için). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Protein | Peptit Dizisi |
| cesaret | GCGYGRGDSPG |
| Tenascin-C | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIRGV |
| İntegrin bağlayıcı sialoprotein (IBSP) | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Osteopontin | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
Tablo 1: ECM proteinleri ve türetilmiş peptit dizileri.
| Reaktif | Başlangıç Konsantrasyonu | Ses seviyesi (μL) | Son Konsantrasyon |
| HA-SH Çözümü | 10 mg/mL | 2300 | 5 mg/mL |
| PEG-SH | 100 mg/mL | 503 | Denemeye göre değişir |
| PEG-Norbornene | 100 mg/mL | 443 | Denemeye göre değişir |
| Peptit | 4 μM | 288 | 0,250 μM |
| Kucak | 4 mg/mL | 288 | 0.25 mg/mL |
| HEPES-HBSS | Yok | 798 |
Tablo 2: Hidrojel için tipik nihai formülasyon bileşenleri.
| Değişken | Parametre |
| F | Kuvvet |
| E | Genç Modülü |
| ν | Poissons Oranı |
| δ | Girinti (dikey uç konumu) |
| a | Temas çemberinin yarıçapı |
| RS | Küre Yarıçapı |
Tablo 3: AFM hesaplamaları için değişkenler ve karşılık gelen parametreler.
Ek Dosya 1: Hidrojellerin Aydınlatma ve fotoçapraz bağlanması için LED Dizisinin kullanımı ile ilgili rehberlik. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Kodlama Dosyası 1: LED dizi mikrodenetleyici için Arduino dosyası (Arduino.zip). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Kodlama Dosyası 2: Arduino nano için üçüncü taraf sürücüler (Sürücüler.zip). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Kodlama Dosyası 3: LED dizi mikrodenetleyicisinin (GUI.zip) GUI kontrolü için işleme dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Kodlama Dosyası 4: LED dizi mikrodenetleyici için harici tutucu 3D baskı dosyası (Tutucu.zip). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut çalışma, HA tabanlı 3D, minyatür kültürler üretmek için yöntemler sunarken, aynı zamanda integrin katılımı için mevcut matris sertliğini ve peptitleri değiştirmektedir. Bu teknik, matris parametrelerinin hücresel fenotipleri (örneğin, kemoterapiye maruz kalan kanser hücrelerinin yaşayabilirliği) artan verimle nasıl etkilediğinin sistematik olarak incelenmesini sağlar. Burada sunulanlar da dahil olmak üzere önceki yaklaşımlar, daha sert hidrojellerin daha yüksek polimer içeriğine sahip olduğu nihai formülasyondaki toplam polimer yüzdesini değiştirerek hidrojel sertliğini ayarlamıştır21,31. Bununla birlikte, bu yaklaşım, istenen her sertlik için benzersiz bir hidrojel formülasyonu hazırlamayı gerektirir; bu, verimi doğal olarak düşüren bir işlemdir. Burada, hidrojel sertliği, çapraz bağlama sırasında değişen UV ışınımı ile ayarlanır, böylece çoklu sertlikteki hidrojeller tek bir öncü çözeltiden elde edilebilir. Burada açıklanan özel aydınlatıcıyı inşa etme fırsatına sahip olmayabilecek gelecekteki uygulayıcılar, ticari olarak temin edilebilen bir UV nokta kürleme cihazını kolayca değiştirebilir ve bir kuyu plakasının farklı sektörleri iyileştirildikçe aydınlatmayı ayarlayabilir. Ticari bir nokta kürleme cihazı kullanmanın dezavantajı, özel aydınlatıcıya kıyasla verim azaltılır. Mevcut yöntemlerin bir sınırlaması, her peptid durumu için hala benzersiz çözeltilerin hazırlanması gerektiğidir. Benzer yöntemler daha önce diğer gruplar tarafından sertlik gradyanı içeren hidrojeller üretmek için kullanılmıştır37,38. Bununla birlikte, bu çalışma, fotoçapraz bağlamanın deneysel örneklerin minyatürleştirilmesini nasıl sağlayabileceğini ve deney düzeneklerinin karmaşıklığını nasıl azaltabileceğini göstermektedir. Genel olarak, bu iyileştirmeler, araştırmacıların matris-mimetik biyomalzemelerde 3D kültürleri yürütürken deneysel verimi artırmalarına ve nöro-onkolojinin ötesinde biyomedikal bilimde çeşitli alanlarda fayda sağlamalarına izin verecektir.
Temsili sonuçlar, bu tekniğin, mevcut integrin bağlayıcı peptitlerin ve sertliklerin çeşitli olduğu tanımlanmış matrislerde, hasta kaynaklı GBM hücrelerinin minyatürleştirilmiş, 3D kültürlerini kurmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu yöntem, matris parametrelerinin GS122 ve GS304 hücreleri olarak belirtilen iki benzersiz hastadan türetilen GBM hücrelerinde TMZ kemoterapisine verilen yanıtları nasıl etkilediğini taramak için temsili sonuçlar sunmaktadır. Burada değerlendirilen iki hasta kaynaklı hücre hattından, GS122 hücrelerinin TMZ tedavisine yanıtı matris mikroçevresine duyarlıyken, GS304 hücrelerininki duyarsızdı. Matriks sertliği ile ilgili olarak, 4 kPa mikro sıkıştırma modülüne sahip 3D hidrojellerde kültürlenen GS122 hücreleri, TMZ direncini en üst düzeye çıkardı; bu durumda, tedavi edilen hücreler, 7 günlük bir deney kursu boyunca tedavi edilmemiş hücrelerden daha fazla sayıca arttı. Mekanik özelliklerin TMZ direnci üzerinde integrin bağlayıcı peptitlerden daha büyük etkileri vardı. Bu nedenle, değişen peptit konsantrasyonlarının tek başına ve kombinasyon halindeki etkisinin, gelecekte ilaç direncini teşvik eden matris koşullarının keşfedilmesini sağlayacağı beklenmektedir. GS304 hücrelerinin çevresindeki matrise duyarsızlığı, matrisin başlangıçta TMZ'ye duyarlı olan ancak tedavi sırasında direnç kazanan GS122 hücreleri gibi hücreler üzerinde daha etkili olduğunu gösterebilir. Buna karşılık, matris ipuçlarının, deneyin başlangıcında zaten tedaviye dirençli olan hücreleri ne ölçüde etkilediği, GS304 hücrelerinde olduğu gibi belirsizdir.
Bu çalışmanın sonuçları, daha önce bildirilen sonuçlardan biraz sapmıştır. Değerlendirilen en yumuşak HA bazlı hidrojeller (doğal beynin sertliğini taklit eden 1 kPa toplu Young modülü), farklı hastalardan dört tümörden türetilen maksimum TMZ direnci GBM hücrelerini burada değerlendirilenden daha fazla destekledi21. Bu tutarsızlığın birkaç olası nedeni vardır. İlk olarak, mevcut çalışmada, hidrojelleri 0.8 kPa ila 8 kPa mikro-kompresyon modülü aralığında karşılaştıran genişletilmiş bir hidrojel sertliği aralığı sorgulanırken, önceki çalışmalar sadece 1 kPa ve 2 kPa Young modülüne sahip hidrojelleri karşılaştırdı. Ek olarak, önceki çalışmalarda, Young modülünü tahmin etmek için doğrusal mekanik sıkıştırma kullanılarak toplu ölçekte mekanik karakterizasyon yapılırken, bu çalışmada bir mikro basınç modülünü ölçmek için AFM kullanılmıştır. Burada bulunan ve mikro ölçekli mekanik ölçümler gerektirmeyen yöntemleri uygulamak isteyen araştırmacılar için, reometri veya doğrusal mekanik test kullanan toplu ölçekli moduli, AFM için mükemmel kabul edilebilir alternatiflerdir. Özellikle, mikro-mekanik analizler, tek bir jelin yüzeyindeki heterojen modülleri ortaya çıkardı. Önceki çalışmalarda formüle edilen hidrojeller üzerinde karşılaştırılabilir AFM ölçümleri yapılmamıştır, ancak tek bir hidrojel içinde sunulan sertliklerin varyansının mevcut çalışmadakilerden daha büyük olması beklenmektedir. Önceki çalışmalardaki hidrojeller, 37 derece C10,21,24'te kinetik karıştırmaya dayanan Michael tipi bir çapraz bağlama ilavesi kullanılarak üretildi. Buna karşılık, fotoçapraz bağlama, ışığa maruz kalmadan önce hidrojel öncüllerinin tamamen karıştırılmasına izin verir, bu da 3D hidrojel içindeki homojenliği arttırır ve sonuç olarak hücre tepkilerinin değişkenliğini azaltır. Son olarak, GBM tümörleri heterojen ve öngörülemeyen davranışlar sergiler39 ve bu nedenle, bireysel tümörlerden türetilen hücrelerin de aynı şekilde benzersiz özelliklere sahip olmasını beklemek mantıklıdır. Hasta örnekleri arasındaki bu tutarlılık eksikliği, hastaya özgü tümör özelliklerini aydınlatmak için yüksek verimli bir platforma duyulan ihtiyacı motive etmektedir.
Minyatür hidrojel fotoçapraz bağlama prosedürünü gerçekleştirirken yaygın tuzaklar arasında hidrojel öncüllerinin eksik karıştırılması, zayıf tekrarlanabilirliğe neden olur ve karıştırma sırasında HA çözeltisinin kendiliğinden jelleşmesi yer alır. Bu sorunlar, HA-tiolün en az 45 dakika ve tüm öncü çözeltinin en az 30 dakika daha karıştırılmasıyla hafifletilebilirken, tiol oksidasyonunu ve çapraz bağlantılara disülfür oluşumunu önlemek için 7'nin altında kalmasını sağlamak için hidrojel öncü çözeltilerinin pH'ı yakından izlenebilir. Kinetik Michael tipi bir ekleme mekanizması 10,21 kullanan çapraz bağlama yöntemlerinin aksine, bu protokolde kullanılan fotoçapraz bağlama yöntemi, tüm reaktifler birleştirildiğinde kendiliğinden jelleşme olasılığını azaltır21. HA tiyolasyon yüzdesi31'i ölçmek ve her bir 3D kültür grubuna paralel mekanik test için ekstra hidrojeller yapmak gibi kalite kontrol noktaları şiddetle tavsiye edilir. Son olarak, hidrojellerde 3D kapsülleme için tohumlama yoğunlukları, kullanılan her hücre tipi veya hattı için tanımlanmalıdır. Genel olarak, sonuçlar, hasta kaynaklı GBM hücreleri, insan embriyonik kök hücreleri (H9) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (veriler gösterilmemiştir) dahil olmak üzere sferoidleri oluşturan çoğu hücrenin 3D kültürü için minimum 1 milyon hücre / mL konsantrasyonunun yeterli olduğunu göstermektedir. Özellikle hassas hücreler kullanılırken kapsüllemeden önce ROCK inhibitörü tedavisinin dahil edilmesi (adım 4.1) de önerilmektedir40.
GBM için yeni tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesi bağlamında, burada sunulan protokol, fizyolojik olarak ilgili bir mikro ortamda hasta kaynaklı GBM hücrelerinin ilaç yanıtlarını fonksiyonel olarak taramak için yöntemler sunmaktadır. GBM (ve diğer kanserler) için genetik, epigenetik ve klinik mRNA ekspresyon verilerinin zengin bir deposu, Kanser Genom Atlası (TCGA) ve diğerlerinin çabaları sayesinde halka açıktır15. Bu büyük veri kümeleriyle birlikte kullanıldığında, minyatürleştirilmiş, 3D kültürlerin fonksiyonel ekranlarından üretilen verilerin, bireysel hastalarda klinik sonuçların tahminini geliştirerek yeni korelasyonları ortaya çıkarması beklenmektedir. Örneğin, silengitid gibi matriks bozucu bileşikler gibi bazı tedavilerin klinik sonuçları iyileştirebileceği hasta tümörlerinin alt popülasyonları tanımlanabilir41. İlaç yanıtına ek olarak, bu kültür platformu, iyi plaka uyumlu, yüksek içerikli görüntüleyiciler kullanarak tümör hücresi invazyonunun değerlendirilmesini sağlar. Bu platformun tek başına veya kombinasyon halinde birçok farklı peptiti dahil etme esnekliği, ortogonal olarak değişen sertlikler, GBM tümör saldırganlığını yönlendiren matris özelliklerinin tanımlanmasına yardımcı olabilir.
GBM'nin ötesinde, bu yöntemler matris parametrelerinin diğer hastalıklar, doku gelişimi ve normal doku fonksiyonu bağlamında diğer hücre tipleri üzerindeki etkilerini araştırmak için uyarlanabilir. Gelecekte, ticari olarak temin edilebilen otomatik sıvı işleyicileri ve yüksek içerikli görüntüleyicileri kullanarak ilaç keşfi için mevcut iş akışlarına benimsenmesini kolaylaştırmak için çok kuyulu plakalar bağlamında gerçekleştirilmek üzere özel olarak tasarlandıklarından, bu yöntemlerin verimini daha da artırmak kolay olacaktır. Mevcut altyapı ile kolay entegrasyon ve hücre yüklü, 3D hidrojel kültürleri üretmek ve sürdürmek için gereken teknik becerileri azaltan artan otomasyon, bu yöntemin benimsenmesinin önündeki engelleri önemli ölçüde azaltacaktır. Buradaki çalışma özellikle HA bazlı hidrojeller içindeki kültürleri sunarken, bu yöntemin metakrilatlanmış jelatin gibi 3D hücre kültürü için yaygın olarak kullanılan diğer fotoçapraz bağlanabilir malzemelere kolayca çevrilebilmesi ve burada bildirilen yöntemlerin ek uygulamalar için yararlı bir kılavuz sağlaması beklenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore ve Itay Solomon'a fotojelasyon şemasının önceki yinelemelerine katkılarından dolayı özellikle teşekkür etmek istiyor. GS122 ve GS304 hücre hatları David Nathanson tarafından cömertçe sağlandı. Tüm figürler BioRender.com ile yaratılmıştır. UCLA çekirdek tesisleri, Moleküler Tarama Ortak Kaynakları ve Nano ve Pico Karakterizasyon Laboratuvarı çalışmaya yardımcı oldu. Chen Chia-Chun, UCLA Eli ve Edythe Geniş Rejeneratif Tıp Merkezi ve Kök Hücre Araştırma Eğitim Programı tarafından desteklendi. Grigor Varuzhanyan, Tümör Hücresi Biyolojisi Eğitim Programı NIH Grant (T32 CA 009056) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM - F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
References
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
- Booth, B., Ma, P., Glassman, R.
- Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
- Broekman, M. L., et al.
- Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
- Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
- Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
- Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, Supplement_3 (2021).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, Poznan, Poland. 68-77 (2015).
- Lee, S. Y.
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
- Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
- Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
- Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
- Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
- Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
- Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
- Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
- Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
- Lavrentieva, A.
- Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
- da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).
