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Neuroscience

एकाधिक फ्लोरोसेंट धुंधला और ऊतक समाशोधन दृष्टिकोण का उपयोग करके 3 डी पैटर्न में बालों वाली और चमकदार त्वचा का प्रदर्शन

Published: May 20, 2022 doi: 10.3791/63807
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

ऊतक वर्गों की मोटाई ने त्वचा के रूपात्मक अध्ययन को सीमित कर दिया। वर्तमान प्रोटोकॉल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत मोटी 300 μm ऊतक वर्गों में त्वचीय तंत्रिका तंतुओं की कल्पना करने के लिए एक अद्वितीय ऊतक समाशोधन तकनीक का वर्णन करता है।

Abstract

त्वचा की वृद्धि परिधीय तंत्रिका तंत्र का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। यद्यपि त्वचीय तंत्रिका तंतुओं का अध्ययन तेजी से आगे बढ़ा है, लेकिन उनके वितरण और रासायनिक विशेषताओं की अधिकांश समझ पतले ऊतक वर्गों पर पारंपरिक हिस्टोकेमिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने से आती है। ऊतक समाशोधन तकनीक के विकास के साथ, मोटे ऊतक वर्गों पर त्वचीय तंत्रिका तंतुओं को देखना संभव हो गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल चूहे के हिंडफुट के प्लांटर और पृष्ठीय त्वचा से 300 μm की मोटाई पर ऊतक वर्गों पर कई फ्लोरोसेंट धुंधला का वर्णन करता है, दो विशिष्ट बालों वाली और चमकदार त्वचा साइटें। यहां, कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड संवेदी तंत्रिका तंतुओं को लेबल करता है, जबकि फालोइडिन और लसीका पोत एंडोथेलियल हाइलूरोनन रिसेप्टर 1 क्रमशः रक्त और लसीका वाहिकाओं को लेबल करते हैं। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत, लेबल संवेदी तंत्रिका तंतुओं को पूरी तरह से लंबी दूरी पर पीछा किया गया था, गहरी त्वचीय परत में बंडलों में चल रहा था और सतही परत में फ्रीस्टाइल था। ये तंत्रिका तंतु रक्त वाहिकाओं के समानांतर या घिरे हुए थे, और लसीका वाहिकाओं ने बालों वाली और चमकदार त्वचा में एक त्रि-आयामी (3 डी) नेटवर्क का गठन किया। वर्तमान प्रोटोकॉल पद्धति परिप्रेक्ष्य से मौजूदा पारंपरिक तरीकों की तुलना में त्वचा का अध्ययन करने के लिए एक अधिक प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Introduction

त्वचा, शरीर का सबसे बड़ा अंग, पर्यावरण के लिए एक महत्वपूर्ण इंटरफ़ेस के रूप में सेवा करता है, कई तंत्रिका तंतुओं 1,2,3 द्वारा घनीभूत रूप से आंतरिक होता है। यद्यपि त्वचा के अंतर्वेशन का व्यापक रूप से विभिन्न हिस्टोलॉजिकल तरीकों के साथ पहले अध्ययन किया गया है, जैसे कि पूरे माउंट त्वचा और ऊतक अनुभाग 4,5,6 पर धुंधला होना, त्वचीय तंत्रिका तंतुओं का विस्तृत प्रभावी प्रदर्शन अभी भी एक चुनौती 7,8 है। यह देखते हुए, वर्तमान प्रोटोकॉल ने मोटी ऊतक अनुभाग में त्वचीय तंत्रिका तंतुओं को अधिक स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करने के लिए एक अनूठी तकनीक विकसित की।

वर्गों की मोटाई की सीमा के कारण, अंतर्निहित त्वचा तंत्रिका तंतुओं का अवलोकन कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) तंत्रिका तंतुओं और अधिग्रहित छवि जानकारी से स्थानीय ऊतकों और अंगों के बीच संबंधों को सटीक रूप से चित्रित करने के लिए पर्याप्त सटीक नहीं है। 3 डी ऊतक समाशोधन प्रौद्योगिकी का उद्भव इस समस्या को हल करने के लिए एक व्यवहार्य विधि प्रदान करताहै 9,10। ऊतक-समाशोधन दृष्टिकोण के तेजी से विकास ने हाल के दिनों में ऊतक संरचनाओं, पूरे अंगों, न्यूरोनल अनुमानों और पूरे जानवरों का अध्ययन करने के लिए कई उपकरण ोंकी पेशकश की है 11. पारदर्शी त्वचा ऊतक को त्वचीय तंत्रिका तंतुओं की कल्पना करने के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा बहुत मोटे खंड में चित्रित किया जा सकता है।

वर्तमान अध्ययन में, एक चूहे के हिंडफुट के प्लांटर और पृष्ठीय त्वचा को बालों वाली और चमकदार त्वचा 3,4,7 के दो लक्ष्य स्थलों के रूप में चुना गया था। लंबी दूरी पर त्वचीय तंत्रिका तंतुओं का पता लगाने के लिए, त्वचा के ऊतकों को इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और हिस्टोकेमिकल धुंधला होने के लिए 300 μm की मोटाई पर काटा गया था, इसके बाद ऊतक समाशोधन उपचार किया गया था। सीजीआरपी का उपयोग संवेदी तंत्रिका तंतुओं12,13 को लेबल करने के लिए किया गया था। इसके अलावा, ऊतक पृष्ठभूमि पर त्वचीय तंत्रिका तंतुओं को उजागर करने के लिए, फालोइडिन और लसीका पोत एंडोथेलियल हाइलूरोनन रिसेप्टर 1 (एलवाईवीई 1) का उपयोग क्रमशः14,15 रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं को लेबल करने के लिए किया गया था।

इन दृष्टिकोणों ने एक सीधी विधि प्रदान की जिसे त्वचीय तंत्रिका तंतुओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन दृश्य को प्रदर्शित करने और त्वचा में तंत्रिका तंतुओं, रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं के बीच स्थानिक सहसंबंध की कल्पना करने के लिए लागू किया जा सकता है, जो सामान्य त्वचा के होमियोस्टेसिस और रोग स्थितियों के तहत त्वचीय परिवर्तन को समझने के लिए बहुत अधिक जानकारी प्रदान कर सकता है।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन को एक्यूपंक्चर और मोक्सीबस्टन संस्थान, चीनी चिकित्सा विज्ञान अकादमी (संदर्भ संख्या डी 2018-04-13-1) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ गाइड (नेशनल एकेडमी प्रेस, वाशिंगटन, डीसी, 1996) के बाद सभी प्रक्रियाएं आयोजित की गईं। इस अध्ययन में तीन वयस्क नर चूहों (स्प्रैग-डॉली, वजन 230 ± 15 ग्राम) का उपयोग किया गया था। सभी जानवरों को नियंत्रित तापमान और आर्द्रता के साथ 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र में रखा गया था और भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच की अनुमति दी गई थी।

1. छिड़काव और नमूना तैयारी

  1. इच्छामृत्यु को प्रेरित करने के लिए चूहे में 250 मिलीग्राम / किग्रा ट्राइब्रोमोइथेनॉल समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) इंजेक्ट करें।
  2. एक बार सांस बंद हो जाने के बाद, चूहे के वक्ष गुहा को खोलने के लिए स्टेनलेस स्टील सर्जिकल कैंची का उपयोग करें। मिनट की दर से 3 एमएल / मिनट के माध्यम से 0.9% सामान्य खारा के100 एमएल के साथ 20 जी सुइयों का उपयोग करें, इसके बाद 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी, पीएच 7.4) (चित्रा 1 ए, बी) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 250-300 एमएल।
  3. छिड़काव के बाद, हिंद पंजा से डोरसम और एकमात्र की त्वचा को हटाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
    1. जमे हुए अनुभाग की आवश्यकता वाले नमूनों के लिए, 2 घंटे के लिए 0.1 एम पीबी में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ऊतकों को पोस्ट-फिक्स करें; फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे से अधिक के लिए 0.1 एम पीबी में 25% सुक्रोज में ऊतकों की सुरक्षा करें
    2. ऊतक समाशोधन की आवश्यकता है कि मोटी अनुभाग के साथ नमूनों के लिए, 2 घंटे के लिए 1x फॉस्फेट-बफर खारा (1x पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ऊतकों को पोस्ट-फिक्स करें; फिर 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 सी-ई) पर 1 एक्स पीबीएस में ऊतकों को क्रायोप्रोटेक्ट करें।

2. सीजीआरपी, फालोइडिन और एलवाईवीई 1 के साथ ट्रिपल फ्लोरोसेंट धुंधला ऊतक समाशोधन उपचार के बाद

नोट: सीजीआरपी, फालोइडिन और एलवाईवीई 1 के साथ ट्रिपल फ्लोरोसेंट धुंधला ऊतक समाशोधन उपचार के बाद 300 μm की मोटाई के साथ ऊतक वर्गों पर बालों और चमकदार त्वचा में तंत्रिका तंतुओं, रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं को प्रकट करने के लिए लागू किया गया था।

  1. 1x पीबीएस में 2% एगरोज़ तैयार करें 2 मिनट के लिए एक माइक्रो-ओवन में गर्म करके जब तक कि एगरोज़ घुल न जाए (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. धोने के बाद, त्वचा के ऊतकों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2% एगरोज़ में एम्बेड करें, और उन्हें ठंडा करने के लिए आइसबॉक्स के अंदर रखें (चित्रा 1 एफ, जी)।
  3. बर्फ के पानी के साथ स्पंदनात्मक माइक्रोटोम पर घुड़सवार ऊतक को ठीक करें और उन्हें अनुप्रस्थ दिशा में 500 μm की मोटाई पर काट लें। कंपन स्लाइसर सेट करने और टुकड़ा करने की क्रिया खत्म करने के लिए निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: गति, 0.50 मिमी /
  4. टुकड़ा करने की क्रिया के बाद, वर्गों से एगरोज़ को हटा दें, और उन्हें 1 एक्स पीबीएस (पीएच 7.4) (चित्रा 1 एल) के साथ छह अच्छी तरह से प्लेट में स्टोर करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 1x पीबीएस (ट्रिक्स-पीबी) में 2% ट्राइटन एक्स -100 के समाधान में ऊतक वर्गों सेते हैं। निम्नलिखित प्रक्रिया के लिए चित्रा 2 देखें।
  6. अवरुद्ध बफर में ऊतक वर्गों प्लेस और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्रकार के बरतन पर 72 आरपीएम पर बारी बारी से।
    नोट: अवरुद्ध बफर संरचना 10% सामान्य गधा सीरम, 1% ट्राइटन-एक्स 100, और 1 एक्स पीबीएस में 0.2% सोडियम एजाइड है ( सामग्री की तालिका देखें)।
  7. माइक्रोसेंट्रिफेज ट्यूब में कमजोर पड़ने वाले बफर में माउस मोनोक्लोनल एंटी-सीजीआरपी (1: 500) और भेड़ पॉलीक्लोनल एंटी-एलवाईवीई 1 एंटीबॉडी (1: 500) के प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान में ऊतक वर्गों को स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें), और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए शेकर पर घुमाएं।
    नोट: कमजोर पड़ने बफर संरचना 1% सामान्य गधा सीरम, 0.2% ट्राइटन-एक्स 100, और 1x पीबीएस में 0.2% सोडियम एजाइड है।
  8. कमरे के तापमान पर धोने के बफर के साथ ऊतक वर्गों को दो बार धोलें, फिर उन्हें धोने के बफर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर शेकर पर रखें।
    नोट: धोने बफर संरचना 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) में 0.2% ट्राइटन-एक्स 100 है।
  9. अगले दिन, गधे विरोधी माउस आईजीजी एच एंड एल एलेक्सा-आटा 488 (1: 500) और गधा विरोधी भेड़ आईजीजी एच एंड एल एलेक्सा-आटा 405 (1: 500) के माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त मिश्रित समाधान में ऊतक वर्गों को स्थानांतरित करें, साथ ही एलेक्सा-फ्लोर 594 फालोइडिन (1: 1000) ( सामग्री की तालिका देखें) एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 72 आरपीएम पर घुमाएं और घुमाएं
  10. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए धोने के बफर के साथ छह अच्छी तरह से प्लेट में ऊतक वर्गों को धो लें, दो बार। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्रकार के बरतन पर बफर धोने में ऊतक वर्गों रखें।
  11. ऊतक समाशोधन अभिकर्मक में ऊतक वर्गों स्थानांतरण ( सामग्री की तालिका देखें, इसकी मात्रा नमूना मात्रा से पांच गुना अधिक थी) और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए धीरे से प्रकार के बरतन पर 60 आरपीएम पर बारी बारी से।
    नोट: इस उपचार के बाद, ऊतक वर्गों स्पष्ट हो जाते हैं (चित्रा 2 बी)।
  12. स्लाइड पर साफ ऊतकों माउंट, एक स्पेसर के साथ ऊतकों सर्कल, और ताजा ऊतक समाशोधन अभिकर्मक और कवरस्लिप के साथ अंतर छड़ी।

3. पारंपरिक दृष्टिकोण के बाद सीजीआरपी, फालोइडिन और एलवाईवीई 1 के साथ ट्रिपल फ्लोरोसेंट धुंधला

नोट: एक तुलना के रूप में, पारंपरिक तकनीकों के बाद 30 μm की मोटाई पर ऊतक वर्गों पर एक ही धुंधला प्रदर्शन किया गया था।

  1. अनुप्रस्थ दिशा में एक माइक्रोटोम पर 30 μm पर ऊतक वर्गों स्लाइस और स्लाइड पर उन्हें माउंट।
  2. 0.1 एम पीबी में 3% सामान्य गधा सीरम और 0.3% ट्राइटन एक्स -100 के साथ अवरुद्ध समाधान जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए वर्गों सेते हैं।
  3. अवरुद्ध समाधान निकालें और माउस मोनोक्लोनल विरोधी सीजीआरपी (1: 500) और भेड़ पॉलीक्लोनल विरोधी LYVE1 एंटीबॉडी (1:500) के प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान के साथ वर्गों सेते हैं 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कमजोर पड़ने बफर में।
  4. अगले दिन, 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) के साथ ऊतक वर्गों को तीन बार धोएं, गधे विरोधी माउस आईजीजी एच एंड एल एलेक्सा-आटा 488 (1: 500) और गधा विरोधी भेड़ आईजीजी एच एंड एल एलेक्सा-आटा 405 (1: 500), साथ ही एलेक्सा-फ्लोर 594 फालोइडिन (1: 1000) के माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त मिश्रित समाधान जोड़ें
  5. सूक्ष्म अवलोकन से पहले, 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) में वर्गों को तीन बार धोएं, फिर उन्हें 50% ग्लिसरीन में कवरलिप्स के साथ कवर करें।

4. इमेजिंग और विश्लेषण

  1. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत दाग नमूनों का निरीक्षण करें, और फिर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को लें।
  2. प्रत्येक 300 μm मोटी अनुभाग से 10 μm फ्रेम में प्रत्येक 30 छवियों (Z-स्टैक) पर कब्जा करें और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम के एक छवि प्रोसेसर का उपयोग करके एक एकल इन-फोकस छवि को एकीकृत करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. त्रि-आयामी (3 डी) विश्लेषण के लिए कॉन्फोकल सेटअप के छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर में निम्न चरणों का पालन करें: स्टार्ट फोकल प्लेन सेट करें | अंत फोकल प्लेन | सेट करें चरण आकार | सेट करें गहराई पैटर्न | चुनें छवि कैप्चर | जेड श्रृंखला।
      नोट: नीले प्रतिदीप्ति संकेतों की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य क्रमशः 401 एनएम और 421 एनएम थे। हरे प्रतिदीप्ति संकेतों की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य क्रमशः 499 एनएम और 519 एनएम थे। लाल प्रतिदीप्ति संकेतों की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य क्रमशः 591 एनएम और 618 एनएम थे। 152 μm कॉन्फोकल पिनहोल (10x उद्देश्य लेंस, एनए: 0.4) का व्यास है। इमेज कैप्चर रिज़ॉल्यूशन 1024 × 1024 पिक्सल था।
  3. पारंपरिक नमूनों (चरण 3) के लिए, प्रत्येक 30 μm मोटी अनुभाग से 1 μm फ्रेम में 30 छवियों (Z-ढेर) पर कब्जा और आगे ऊपर वर्णित के रूप में इन छवियों का इलाज (कदम 4.1-4.2).
  4. छवि प्रसंस्करण प्रणाली के साथ 3 डी पुनर्निर्माण के पैटर्न में छवियों का प्रदर्शन करें।
  5. इमारिस 9.0 (सेल इमेजिंग सॉफ्टवेयर, सामग्री की तालिका देखें) में जेड-स्टैक कॉन्फोकल छवियों को आयात करके 3 डी पुनर्निर्माण करें और दाग तीव्रता के आधार पर सतह रेंडरिंग बनाएं: नई सतहों को जोड़ें | स्रोत चैनल | चुनें सतहों के चिकनी विकल्प में मापदंडों का निर्धारण विस्तार | निरपेक्ष तीव्रता के थ्रेशोल्ड विकल्प में पैरामीटर निर्धारित करें | सतहों को | वर्गीकृत करें समाप्त करो।
  6. सेल इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ सकारात्मक तंत्रिका तंतुओं की सतह क्षेत्र में डेटा प्राप्त करें। रेंडर की गई छवि | का चयन करें सांख्यिकी | विस्तृत | विशिष्ट मान | वॉल्यूम।

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Representative Results

ट्रिपल फ्लोरोसेंट धुंधला होने के बाद, तंत्रिका तंतुओं, रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं को स्पष्ट रूप से सीजीआरपी, फालोइडिन और एलवाईवीई 1 के साथ क्रमशः बालों वाली और चमकदार त्वचा (चित्रा 3,4) में लेबल किया गया था। समाशोधन उपचार के साथ, सीजीआरपी-पॉजिटिव तंत्रिका फाइबर, फालोइडिन-पॉजिटिव रक्त वाहिकाओं, और एलवाईवीई 1-पॉजिटिव लसीका वाहिकाओं को त्वचा की पूरी संरचनात्मक जानकारी (चित्रा 3) प्राप्त करने के लिए अधिक गहराई पर चित्रित किया जा सकता है। जब इन ऊतक संरचनाओं को 3 डी पैटर्न में फिर से बनाया गया, तो उनके वितरण का पता लगाना आसान हो गया। यह दिखाया गया था कि सीजीआरपी-पॉजिटिव तंत्रिका फाइबर चमड़े के नीचे के ऊतकों और डर्मिस के माध्यम से एपिडर्मिस में पारित हो गए थे। ये तंत्रिका फाइबर चमड़े के नीचे के ऊतकों में बंडलों में भाग गए, डर्मिस के भीतर शाखित, और एपिडर्मिस (चित्रा 3) में समाप्त हो गए। इसके विपरीत, फालोइडिन-पॉजिटिव रक्त वाहिकाओं और एलवाईवीई 1-पॉजिटिव लसीका वाहिकाओं को चमड़े के नीचे के ऊतकों और डर्मिस (चित्रा 3) में वितरित किया जाता है। आम तौर पर, सीजीआरपी-पॉजिटिव तंत्रिका फाइबर रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं के समानांतर या घिरे हुए थे, जिससे बालों वाली और चमकदार त्वचा में 3 डी नेटवर्क बन गया।

पारंपरिक दृष्टिकोण के साथ, हालांकि तंत्रिका तंतुओं, रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं को पतले वर्गों में सीजीआरपी, फालोइडिन और एलवाईवीई 1 के साथ स्पष्ट रूप से लेबल किया गया था, इन संरचनाओं का अवलोकन टुकड़ा मोटाई से सीमित है और पूरी तरह से नहीं देखा जा सकता है (चित्रा 4)। इमेजिंग तकनीक ने विभिन्न सकारात्मक फ्लोरोसेंट संकेतों से प्रत्येक ऑब्जेक्ट आइटम के लिए गहराई से छवियों को प्रस्तुत किया। छवि उत्पन्न करने के बाद, सीजीआरपी-पॉजिटिव तंत्रिका तंतुओं के सतह क्षेत्र को इमारिस सॉफ्टवेयर के माध्यम से अधिग्रहित किया गया था। 30 μm की मोटाई वाले खंड में, सीजीआरपी-पॉजिटिव तंत्रिका तंतुओं की सतह क्षेत्र में बालों वाली त्वचा और चमकदार त्वचा के बीच कोई अंतर नहीं था। बालों वाली त्वचा की तुलना में 300 μm मोटी ऊतक वर्गों में, ग्लेब्रस त्वचा के सीजीआरपी-पॉजिटिव तंत्रिका तंतुओं की सतह क्षेत्र में काफी वृद्धि हुई थी (* पी < 0.05, क्रुस्कल-वालिस नॉनपैरामेट्रिक परीक्षण, एन = 3, चित्रा 5)। इसलिए, सकारात्मक तंत्रिका तंतुओं के सतह क्षेत्र की सटीक तुलना करने के लिए, 300 μm साफ़ अनुभाग पारंपरिक 30 μm अनुभाग से बेहतर है। तुलना के रूप में, पारंपरिक पतले खंड की तुलना में समाशोधन उपचार के साथ मोटी ऊतक अनुभाग से एक आदर्श 3 डी छवि के लिए अधिक अवसर प्राप्त करना संभव है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक उपकरणों और अध्ययन में प्रमुख चरणों की तस्वीरें ( ए ) सर्जिकल उपकरण (स्केलपेल, कैंची, आदि)। (बी) छिड़काव के लिए पंप। (सी) छिड़काव के बाद हिंद पंजा के प्लांटर और पृष्ठीय पक्ष। (डी) हिंद पंजा से एकमात्र और डोरसम की खाल को हटा दिया गया था। (ई) छंटनी त्वचा के ऊतकों। (एफ, जी) 37 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2% एगरोज के साथ घुड़सवार त्वचा के ऊतकों( एच) कंपन माइक्रोटोम। (मैं) काटने समर्थक पर फिक्स्ड त्वचा के ऊतकों। (जे) टुकड़ा करने की क्रिया के लिए पैरामीटर सेट करें। (के) टुकड़ा करने की प्रक्रिया। (L) प्रतिनिधि वर्गों की मोटाई 300 μm है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरोसेंट धुंधला प्रक्रिया और त्वचा के ऊतकों की समाशोधन( ए) इस अध्ययन में शामिल प्रोटोकॉल चरणों का एक प्रतिनिधित्व। (बी) समाशोधन उपचार से पहले और बाद में त्वचा के ऊतकों के बाहरी दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: मोटी त्वचा अनुभाग पर ऊतक समाशोधन उपचार के बाद तंत्रिका तंतुओं, रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं का स्थानिक सहसंबंध ( ए, बी ) चूहे के हिंडफुट के प्लांटर और पृष्ठीय त्वचा के मोटे खंड की प्रतिनिधि छवियां ग्लेब्रस (ए) और बालों वाली (बी) त्वचा में तंत्रिका फाइबर, रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं के वितरण को दर्शाती हैं। (ए 1-ए 3) पैनल ए को सीजीआरपी-लेबलिंग (ए 1), फा-लेबलिंग (ए 2), और एलवाईवीई 1-लेबलिंग (ए 3) के साथ अलग से दिखाया गया था। (ए 4, ए 5; बी 1, बी 2) पैनल (ए) और (बी) को 3 डी पैटर्न में समायोजित किया गया था और क्रमशः सामने (ए 4, बी 1) और पीछे (ए 5, बी 2) विचारों के साथ दिखाया गया था। सभी पैनलों के लिए एक ही स्केल बार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: पारंपरिक दृष्टिकोण के साथ पतली त्वचा अनुभाग पर तंत्रिका तंतुओं, रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं का स्थानिक सहसंबंध ( ए, बी ) चूहे के हिंडफुट के प्लांटर और पृष्ठीय त्वचा के मोटे खंड की प्रतिनिधि छवियां ग्लेब्रस (ए) और बालों वाली (बी) त्वचा में तंत्रिका फाइबर, रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं के वितरण को दर्शाती हैं। (ए 1, ए 2; बी 1, बी 2): पैनल (ए) और (बी) को 3 डी पैटर्न में समायोजित किया गया था और क्रमशः सामने (ए 1, बी 1) और पीछे (ए 2, बी 2) विचारों के साथ दिखाया गया था। सभी पैनलों के लिए एक ही स्केल बार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: बालों वाली और चमकदार त्वचा में सीजीआरपी-पॉजिटिव तंत्रिका तंतुओं के सतह क्षेत्र को दिखाने वाला एक हिस्टोग्राम। (ए) 30 μm की मोटाई वाले खंड में, सीजीआरपी-पॉजिटिव तंत्रिका फाइबर के सतह क्षेत्र में बालों वाली त्वचा और चमकदार त्वचा के बीच कोई अंतर नहीं था। (बी) बालों वाली त्वचा की तुलना में 300 μm की मोटाई वाले अनुभाग में, चमकदार त्वचा के सीजीआरपी-पॉजिटिव तंत्रिका तंतुओं की सतह क्षेत्र में काफी वृद्धि हुई थी (* पी < 0.05, एन = 3)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्तमान अध्ययन समाशोधन उपचार के साथ मोटे ऊतक वर्गों पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके बालों वाली और चमकदार त्वचा में त्वचीय तंत्रिका तंतुओं का एक विस्तृत प्रदर्शन प्रदान करता है और त्वचा को बेहतर ढंग से समझने के लिए 3 डी दृश्य प्रदान करता है। एंटीबॉडी इनक्यूबेशन 1-2 दिनों तक का समय और रात भर सफाई प्रक्रिया महत्वपूर्ण है। ये दो प्रमुख चरण सीधे मोटे वर्गों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रभाव को प्रभावित करते हैं। एंटीबॉडी की पसंद से एक और समस्या उठाई गई थी, जिनमें से सभी मोटे वर्गों के लिए उपयुक्त नहीं हैं। हम अनुमान लगाते हैं कि छोटे आणविक भार वाले एंटीबॉडी मोटे वर्गों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के लिए आदर्श हो सकते हैं। इस प्रकार, एंटीबॉडी चयन की कठिनाई इस दृष्टिकोण की एक प्रमुख सीमा है। वर्तमान कार्य ने चूहों की बालों वाली और बाल रहित त्वचा पर रक्त वाहिकाओं, लसीका वाहिकाओं और नसों के वितरण में अंतर देखा था। मनुष्यों के लिए, त्वचा की संरचना कृन्तकों से बहुत अलग है; हम अगले चरण में मानव त्वचा का निरीक्षण और शोध करने के लिए ऊतक समाशोधन तकनीक का उपयोग करने के लिए तत्पर हैं।

पिछले अध्ययनों ने त्वचीय तंत्रिका तंतुओं को प्रकट करने के लिए कई प्रयास किए हैं 4,5,6,7,8। पारंपरिक ऊतक अनुभाग अध्ययन के विपरीत, क्यूबिक, क्लैरिटी और वीडिस्को सहित ऊतक समाशोधन तकनीकों का व्यापक रूप से हाल के वर्षों में जानवरों के पूरे अंगों और पूरे शरीर का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गयाहै 16,17,18,19. आमतौर पर, पतली धारा 4,5,6,7,8 में एक लंबी और पूर्ण संरचना के साथ त्वचीय तंत्रिका तंतुओं का पता लगाना मुश्किल होता है; तुलनात्मक रूप से, बड़े आकार के नमूने पर ऊतक समाशोधन उपचार में लंबा समय लग सकता है 16,17,18,19. उनके फायदे और नुकसान को ध्यान में रखते हुए, वर्तमान प्रोटोकॉल पारदर्शी रूप से इलाज किए गए मोटे खंड के भीतर त्वचीय तंत्रिका तंतुओं की विस्तृत संरचना की जांच करने के लिए एक उचित विकल्प है, जो साधारण कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत मनाया और दर्ज किया जाना सुविधाजनक है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, कोई पतले खंड की तुलना में मोटे खंड के भीतर लंबे त्वचीय तंत्रिका तंतुओं का निरीक्षण कर सकता है, और ऊतक समाशोधन के साथ बड़े आकार के नमूनों की तुलना में ऊतक उपचार के लिए प्रयोगात्मक समय बचा सकता है।

इस अध्ययन में, त्वचीय तंत्रिका तंतुओं को सीजीआरपी के साथ लेबल किया गया था। इस प्रकार के तंत्रिका तंतु सी और एδ संवेदी तंतुओं से संबंधित हैं, जो नोसिसेप्टिव संकेतों के परिवहन और वासोडिलेटेशन12,13 को संशोधित करने की भूमिका निभाते हैं। चूंकि सीजीआरपी पॉजिटिव तंत्रिका फाइबर चमड़े के नीचे की परत में रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं के करीब स्थित होते हैं, इसलिए एंजियोजेनेसिस और लिम्फैंगियोजेनेसिस20,21 में सुधार करके घाव भरने में भाग लेने का भी सुझाव दिया गया था। पिछले अध्ययनों 14,20,21,22 के समान, इस ट्रिपल-लेबलिंग प्रयोग के साथ रक्त वाहिकाओं में फालोइडिन को दृढ़ता से व्यक्त किया गया था। इसके अलावा, एलवाईवीई 1 एक अभिन्न झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन है और चूहे त्वचीय लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं 15,23,24 को छांटने के लिए बायोमार्कर के रूप में प्रभावी ढंग से नियोजित किया जाता है। सीजीआरपी, फालोइडिन और एलवाईवीई 1 के साथ ट्रिपल फ्लोरोसेंट धुंधला होने का लाभ उठाते हुए, ऊतक समाशोधन तकनीक के साथ, बालों वाली और चमकदार त्वचा में तंत्रिका तंतुओं, रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं के नेटवर्क में बेहतर अंतर्दृष्टि के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि प्रस्तुत की जाती है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस अध्ययन में केवल सीजीआरपी-पॉजिटिव तंत्रिका तंतुओं का प्रदर्शन किया गया था। संवेदी तंत्रिका फाइबर के इस तरह के अलावा, इस प्रोटोकॉल भी इसी एंटीबॉडी के साथ त्वचीय तंत्रिका फाइबर के अन्य प्रकार की जांच के लिए फिट हो सकता है। इसके अलावा, चूंकि फालोइडिन चिकनी मांसपेशियों और एंडोथेलियल कोशिकाओं21,22,25 में साइटोस्केलेटल घटक में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है, रक्त वाहिकाओं के अलावा, मांसपेशियों और एपिडर्मल ऊतकों को भी फालोइडिन के साथ लेबल किया गया था। हालांकि, रूपात्मक विशेषता के अनुसार, अन्य प्रकार के ऊतकों से रक्त वाहिकाओं की पहचान करना मुश्किल नहीं है।

संक्षेप में, वर्तमान प्रोटोकॉल प्रभावी ढंग से समाशोधन उपचार के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस के संयोजन का उपयोग करके मोटे वर्गों पर बालों वाली और चमकदार त्वचा के अंतर्वेशन की पड़ताल करता है। पद्धति के परिप्रेक्ष्य से, भविष्य में अन्य प्रकार के त्वचीय तंत्रिका तंतुओं और रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं के साथ उनके स्थानिक सहसंबंध की जांच करना एक लाभ होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को चाइना एकेडमी ऑफ चाइनीज मेडिकल साइंसेज इनोवेशन फंड (प्रोजेक्ट कोड नं. सीआई 2021 ए 03404) और राष्ट्रीय पारंपरिक चीनी चिकित्सा अंतःविषय नवाचार निधि (परियोजना कोड सं। ZYYCXTD-डी-202202)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x phosphate-buffered saline Solarbio Life Sciences P1020 pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-Tribromoethanol Sigma Life Science T48402-5G
Confocal fluorescence microscopy Olympus Corporation Fluoview FV1200
Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 Abcam plc. ab150105
Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 Abcam plc. ab175676
EP tube Wuxi NEST Biotechnology Co. 615001 1.5 mL
Freezing stage sliding microtome system Leica Biosystems CM1860
Imaris Software Oxford Instruments v.9.0.1
IRIS standard scissor WPI (World Precision Instruments Inc.) 503242
iSpacer SunJin Lab co. IS005
Micro forceps-Str RWD F11020-11
Mouse monoclonal anti-CGRP antibody Santa cruz biotechnology, Inc. sc-57053
Neutral buffered Formalin Solarbio Life Sciences G2161 10%
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch Laboratories 017-000-12 10 mL
Peristaltic pump Longer Precision Pump Co., Ltd BT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A12381
RapiClear 1.52 solution SunJin Lab co. RC152001 10 mL
Regular agarose Gene Company Limited G-10
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str RWD F13038-12
Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody R&D Systems, Inc. AF7939
Six-well plate Corning Incorporated 3335
Sodium azide Sigma Life Science S2002 25 g
Sucrose Sigma Life Science V900116 500 g
Super Glue Henkel AG & Co. Pattex 502
Surgical Handles RWD S32003-12
Triton X-100 Solarbio Life Sciences 9002-93-1 100 mL
Urethane Sigma Life Science U2500 500 g
VANNAS spring scissors RWD S1014-12
Vibratory microtome Leica Biosystems VT1200S

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 183 त्वचा की वृद्धि कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड संवेदी तंत्रिका फाइबर लसीका वाहिका रक्त वाहिका ऊतक समाशोधन तकनीक
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Wang, X., Cao, W., Shi, J., Zhang, X., Qu, Z., Xu, D., Wan, H., Su, Y., He, W., Jing, X., Bai, W. Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches. J. Vis. Exp. (183), e63807, doi:10.3791/63807 (2022).

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