Summary
Lo spessore delle sezioni tissutali limitava lo studio morfologico dell'innervazione cutanea. Il presente protocollo descrive una tecnica unica di pulizia dei tessuti per visualizzare le fibre nervose cutanee in sezioni di tessuto spesse 300 μm sotto microscopia confocale.
Abstract
L'innervazione della pelle è una parte importante del sistema nervoso periferico. Sebbene lo studio delle fibre nervose cutanee sia progredito rapidamente, la maggior parte della comprensione delle loro caratteristiche distributive e chimiche proviene dalla colorazione istochimica e immunoistochimica convenzionale su sezioni di tessuto sottile. Con lo sviluppo della tecnica di pulizia dei tessuti, è diventato possibile visualizzare le fibre nervose cutanee su sezioni di tessuto più spesse. Il presente protocollo descrive la colorazione fluorescente multipla su sezioni tissutali ad uno spessore di 300 μm dalla pelle plantare e dorsale del ratto posteriore, i due tipici siti cutanei pelosi e glabri. Qui, il peptide correlato al gene della calcitonina etichetta le fibre nervose sensoriali, mentre la falloidina e il recettore ialuronico endoteliale dei vasi linfatici 1 etichettano rispettivamente i vasi sanguigni e linfatici. Sotto un microscopio confocale, le fibre nervose sensoriali etichettate sono state seguite completamente a una distanza più lunga, correndo in fasci nello strato cutaneo profondo e freestyle nello strato superficiale. Queste fibre nervose correvano in parallelo o circondavano i vasi sanguigni e i vasi linfatici formavano una rete tridimensionale (3D) nella pelle pelosa e glabra. L'attuale protocollo fornisce un approccio più efficace allo studio dell'innervazione cutanea rispetto ai metodi convenzionali esistenti dal punto di vista metodologico.
Introduction
La pelle, l'organo più grande del corpo, che funge da interfaccia chiave per l'ambiente, è densamente innervata da molte fibre nervose 1,2,3. Sebbene l'innervazione cutanea sia stata ampiamente studiata in precedenza con vari metodi istologici, come la colorazione su sezioni di pelle e tessuto intero 4,5,6, la dimostrazione efficace dettagliata delle fibre nervose cutanee è ancora una sfida 7,8. Detto questo, il presente protocollo ha sviluppato una tecnica unica per esporre le fibre nervose cutanee più chiaramente nella sezione del tessuto spesso.
A causa del limite per lo spessore delle sezioni, l'osservazione delle fibre nervose della pelle innervata non è abbastanza precisa da rappresentare con precisione la relazione tra le fibre nervose del peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) e i tessuti e gli organi locali dalle informazioni acquisite sull'immagine. L'emergere della tecnologia di compensazione dei tessuti 3D fornisce un metodo fattibile per risolvere questo problema 9,10. Il rapido sviluppo di approcci di compensazione dei tessuti ha offerto molti strumenti per studiare le strutture tissutali, interi organi, proiezioni neuronali e interi animali negli ultimi tempi11. Il tessuto cutaneo trasparente potrebbe essere ripreso in una sezione molto più spessa al microscopio confocale per ottenere i dati per visualizzare le fibre nervose cutanee.
Nel presente studio, la pelle plantare e dorsale di un ratto posteriore è stata selezionata come i due siti bersaglio della pelle pelosa e glabra 3,4,7. Per tracciare le fibre nervose cutanee a una distanza maggiore, il tessuto cutaneo è stato tagliato allo spessore di 300 μm per la colorazione immunoistochimica e istochimica, seguita da un trattamento di pulizia dei tessuti. CGRP è stato utilizzato per etichettare le fibre nervose sensoriali12,13. Inoltre, per evidenziare le fibre nervose cutanee sullo sfondo del tessuto, la falloidina e il recettore ialuronico endoteliale dei vasi linfatici 1 (LYVE1) sono stati ulteriormente utilizzati per etichettare i vasi sanguigni e i vasi linfatici, rispettivamente14,15.
Questi approcci hanno fornito un metodo semplice che può essere applicato per dimostrare una visione ad alta risoluzione delle fibre nervose cutanee e anche per visualizzare la correlazione spaziale tra le fibre nervose, i vasi sanguigni e i vasi linfatici della pelle, che può fornire molte più informazioni per comprendere l'omeostasi della pelle normale e l'alterazione cutanea nelle condizioni patologiche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Il presente studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Agopuntura e Moxibustione, China Academy of Chinese Medical Sciences (numero di riferimento D2018-04-13-1). Tutte le procedure sono state condotte seguendo la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). In questo studio sono stati utilizzati tre ratti maschi adulti (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Tutti gli animali sono stati ospitati in un ciclo luce/buio di 12 ore con temperatura e umidità controllate e hanno consentito l'accesso gratuito a cibo e acqua.
1. Perfusione e preparazione del campione
- Iniettare 250 mg/kg di soluzione di tribromoetanolo (vedere Tabella dei materiali) per via intraperitoneale nel ratto per indurre l'eutanasia.
- Una volta che la respirazione si ferma, utilizzare forbici chirurgiche in acciaio inossidabile per aprire la cavità toracica del ratto. Utilizzare aghi da 20 G per perfusare attraverso il ventricolo cardiaco sinistro13 ad una velocità di 3 ml/min con 100 mL di soluzione salina normale allo 0,9% seguita da 250-300 mL di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato da 0,1 M (PB, pH 7,4) (Figura 1A,B).
- Dopo la perfusione, utilizzare un bisturi per rimuovere la pelle del dorso e la suola dalla zampa posteriore.
- Per i campioni che richiedono una sezione congelata, post-fissare i tessuti in paraformaldeide al 4% in 0,1 M PB per 2 ore; quindi crioproteggere i tessuti in saccarosio al 25% in 0,1 M PB per più di 24 ore a 4 °C
- Per i campioni con la sezione spessa che richiede la pulizia dei tessuti, post-fissare i tessuti in paraformaldeide al 4% in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) per 2 ore; quindi crioproteggere i tessuti in 1x PBS a 4 °C (Figura 1C-E).
2. Tripla colorazione fluorescente con CGRP, falloidina e LYVE1 seguita da trattamento di pulizia dei tessuti
NOTA: Tripla colorazione fluorescente con CGRP, falloidina e LYVE1 è stata applicata per rivelare le fibre nervose, i vasi sanguigni e i vasi linfatici nella pelle pelosa e glabra su sezioni di tessuto con uno spessore di 300 μm dopo il trattamento di pulizia dei tessuti.
- Preparare il 2% di agarosio in 1x PBS riscaldando in un microfornio per 2 minuti fino a quando l'agarosio si dissolve (vedi Tabella dei materiali).
- Dopo il lavaggio, incorporare i tessuti cutanei in agarosio al 2% a 37 °C e posizionarli all'interno della ghiacciaia per il raffreddamento (Figura 1F,G).
- Fissare il tessuto montato sul microtomo vibrante con l'acqua ghiacciata e affettarlo ad uno spessore di 500 μm in direzione trasversale. Utilizzare i seguenti parametri per impostare l'affettatrice a vibrazione e terminare l'affettamento: velocità, 0,50 mm/s e ampiezza, 1,5 mm (Figura 1H-K).
- Dopo l'affettamento, rimuovere l'agarosio dalle sezioni e conservarle in una piastra a sei pozzetti con 1x PBS (pH 7,4) (Figura 1L).
- Incubare le sezioni di tessuto in una soluzione di Triton X-100 al 2% in 1x PBS (TriX-PB) durante la notte a 4 °C. Vedere la Figura 2 per la procedura seguente.
- Posizionare le sezioni di tessuto nel tampone di blocco e ruotare a 72 giri/min sullo shaker durante la notte a 4 °C.
NOTA: La composizione del tampone di blocco è il 10% di siero d'asino normale, l'1% di Triton-X 100 e lo 0,2% di azide di sodio in 1x PBS (vedere Tabella dei materiali). - Trasferire le sezioni di tessuto nella soluzione contenente gli anticorpi primari dell'anticorpo monoclonale di topo anti-CGRP (1:500) e dell'anticorpo policlonale anti-LYVE1 di pecora (1:500) nel tampone di diluizione nel tubo del microcentrifuga (vedere Tabella dei materiali) e ruotare sullo shaker per 2 giorni a 4 °C.
NOTA: La composizione del tampone di diluizione è 1% di siero d'asino normale, 0,2% Triton-X 100 e 0,2% di azide di sodio in 1x PBS. - Lavare le sezioni di tessuto due volte con tampone di lavaggio a temperatura ambiente, quindi tenerle sullo shaker per una notte a 4 °C nel tampone di lavaggio.
NOTA: La composizione del tampone di lavaggio è 0,2% Triton-X 100 in 0,1 M PB (pH 7,4). - Il giorno successivo, trasferire le sezioni di tessuto nella soluzione mista contenente gli anticorpi secondari di asino anti-topo IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) e asino anti-pecora IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), così come Alexa-Flour594 falloidina (1:1000) (vedi Tabella dei materiali) in un tubo microcentrifuga e ruotare a 72 giri / min sullo shaker per 5 ore a 4 ° C.
- Lavare le sezioni di tessuto in una piastra a sei pozzetti con tampone di lavaggio per 1 ora, due volte, a temperatura ambiente. Tenere le sezioni di tessuto nel tampone di lavaggio sullo shaker per una notte a 4 °C.
- Trasferire le sezioni di tessuto nel reagente di compensazione dei tessuti (vedere Tabella dei materiali, il suo volume era cinque volte superiore al volume del campione) e ruotare delicatamente a 60 giri / min sullo shaker per 1 ora a temperatura ambiente.
NOTA: Dopo questo trattamento, le sezioni tissutali diventano chiare (Figura 2B). - Montare i tessuti eliminati sul vetrino, circondare i tessuti con un distanziatore e incollare lo spazio con il reagente di pulizia dei tessuti freschi e il coverslip.
3. Tripla colorazione fluorescente con CGRP, falloidina e LYVE1 seguendo l'approccio convenzionale
NOTA: A titolo di confronto, la stessa colorazione è stata eseguita su sezioni di tessuto ad uno spessore di 30 μm seguendo tecniche convenzionali.
- Affettare le sezioni di tessuto a 30 μm su un microtomo in direzione trasversale e montarle sul vetrino.
- Aggiungere la soluzione bloccante con siero d'asino normale al 3% e Triton X-100 allo 0,3% in 0,1 M PB e incubare le sezioni per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione bloccante e incubare le sezioni con la soluzione contenente gli anticorpi primari del monoclonale di topo anti-CGRP (1:500) e dell'anticorpo policlonale anti-LYVE1 di pecora (1:500) in tampone di diluizione durante la notte a 4 °C.
- Il giorno successivo, lavare le sezioni di tessuto con 0,1 M PB (pH 7,4) tre volte, aggiungere la soluzione mista contenente gli anticorpi secondari di asino anti-topo IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) e asino anti-pecora IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), così come Alexa-Flour594 falloidina (1:1000) sulle sezioni e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Prima dell'osservazione microscopica, lavare le sezioni in 0,1 M PB (pH 7,4) tre volte, quindi coprirle con coperture in glicerina al 50%.
4. Imaging e analisi
- Osservare i campioni macchiati al microscopio fluorescente e quindi scattare le immagini utilizzando un microscopio confocale.
- Cattura 30 immagini (Z-stack), ciascuna in fotogrammi da 10 μm, da ogni sezione di 300 μm di spessore e integra una singola immagine a fuoco utilizzando un processore di immagini del sistema di microscopia confocale (vedi Tabella dei materiali).
- Eseguire i seguenti passaggi nel software di elaborazione delle immagini della configurazione confocale per l'analisi tridimensionale (3D): Impostare il piano focale iniziale | Impostare il piano focale finale | Impostare la dimensione del passo | Selezionate la | della serie di profondità | di acquisizione immagini Serie Z.
NOTA: Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dei segnali di fluorescenza blu erano rispettivamente di 401 nm e 421 nm. Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dei segnali di fluorescenza verde erano rispettivamente di 499 nm e 519 nm. Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dei segnali di fluorescenza rossa erano rispettivamente di 591 nm e 618 nm. 152 μm è il diametro del foro stenopeico confocale (lente obiettivo 10x, NA: 0,4). La risoluzione di acquisizione dell'immagine era di 1024 × 1024 pixel.
- Eseguire i seguenti passaggi nel software di elaborazione delle immagini della configurazione confocale per l'analisi tridimensionale (3D): Impostare il piano focale iniziale | Impostare il piano focale finale | Impostare la dimensione del passo | Selezionate la | della serie di profondità | di acquisizione immagini Serie Z.
- Per i campioni convenzionali (fase 3), acquisire 30 immagini (Z-stacks) in fotogrammi da 1 μm da ogni sezione spessa 30 μm e trattare ulteriormente queste immagini come menzionato sopra (passaggi 4.1-4.2).
- Dimostrare le immagini nel modello di ricostruzione 3D con il sistema di elaborazione delle immagini.
- Eseguire ricostruzioni 3D importando immagini confocali Z-stack in Imaris 9.0 (software di imaging cellulare, vedere Tabella dei materiali) e creare rendering di superfici in base alle intensità delle macchie: Aggiungere nuove superfici | Scegli canale sorgente | Determinate i parametri nell'opzione Liscia (Smooth) di Dettaglio superfici (Surfaces Detail) | Determinare i parametri nell'opzione di soglia di Intensità assoluta | Classificazione delle superfici | Fine.
- Acquisisci dati nella superficie delle fibre nervose positive con il software di imaging cellulare. Selezionare l'immagine sottoposta a rendering | Statistiche | | dettagliato Valori specifici | Volume.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dopo una tripla colorazione fluorescente, le fibre nervose, i vasi sanguigni e i vasi linfatici sono stati chiaramente etichettati con CGRP, falloidina e LYVE1, rispettivamente, nella pelle pelosa e glabra (Figura 3,4). Con il trattamento di compensazione, le fibre nervose CGRP-positive, i vasi sanguigni phalloidin-positivi e i vasi linfatici LYVE1-positivi possono essere ripresi a una profondità maggiore per acquisire le informazioni strutturali complete della pelle (Figura 3). Quando queste strutture tissutali sono state ulteriormente ricostruite in un modello 3D, la loro distribuzione è diventata più facile da rintracciare. È stato dimostrato che le fibre nervose CGRP-positive passavano attraverso il tessuto sottocutaneo e il derma fino all'epidermide. Queste fibre nervose correvano in fasci nel tessuto sottocutaneo, ramificate all'interno del derma e terminate nell'epidermide (Figura 3). Al contrario, i vasi sanguigni positivi alla falloidina e i vasi linfatici LYVE1-positivi sono distribuiti nel tessuto sottocutaneo e nel derma (Figura 3). Generalmente, le fibre nervose CGRP-positive correvano parallele o circondate dai vasi sanguigni e dai vasi linfatici, formando una rete 3D nella pelle pelosa e glabra.
Con l'approccio convenzionale, sebbene le fibre nervose, i vasi sanguigni e i vasi linfatici fossero chiaramente etichettati con CGRP, falloidina e LYVE1 nelle sezioni sottili, l'osservazione di queste strutture è limitata dallo spessore della fetta e non può essere osservata completamente (Figura 4). La tecnica di imaging ha reso immagini approfondite per ogni oggetto oggetto da diversi segnali fluorescenti positivi. Dopo aver generato l'immagine, la superficie delle fibre nervose CGRP-positive è stata acquisita attraverso il software Imaris. Nella sezione con uno spessore di 30 μm, non c'era differenza tra pelle pelosa e pelle glabra nella superficie delle fibre nervose CGRP-positive. Nelle sezioni di tessuto spessa 300 μm, rispetto alla pelle pelosa, la superficie delle fibre nervose CGRP-positive della pelle glabra è stata significativamente aumentata (*P < 0,05, test non parametrico di Kruskal-Wallis, n = 3, Figura 5). Pertanto, per confrontare accuratamente la superficie delle fibre nervose positive, la sezione eliminata da 300 μm è migliore della tradizionale sezione da 30 μm. Come confronto, è possibile acquisire più opportunità per un'immagine 3D ideale dalla sezione di tessuto spesso con il trattamento di compensazione rispetto alla sezione sottile convenzionale.
Figura 1: Fotografie di strumenti sperimentali e passaggi chiave dello studio. (A) Strumenti chirurgici (bisturi, cesoie, ecc.). (B) La pompa per la perfusione. (C) Lati plantari e dorsali della zampa posteriore dopo perfusione. (D) La sogliola e le pelli di dorso sono state rimosse dalla zampa posteriore. (E) Tessuti cutanei tagliati. (F,G) Tessuti cutanei montati con agarosio al 2% a 37 °C e 4 °C. (H) Microtomo vibratorio. (I) Tessuti cutanei fissi sul supporto di taglio. (J) Impostare i parametri per l'affettamento. (K) Processo di affettatura. (L) Le sezioni rappresentative hanno uno spessore di 300 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La procedura di colorazione fluorescente e la pulizia del tessuto cutaneo. (A) Una rappresentazione delle fasi del protocollo coinvolte in questo studio. (B) Viste esterne del tessuto cutaneo prima e dopo il trattamento di compensazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Correlazione spaziale di fibre nervose, vasi sanguigni e vasi linfatici dopo il trattamento di pulizia dei tessuti sulla sezione della pelle spessa. (A, B) Immagini rappresentative della sezione spessa della pelle plantare e dorsale del ratto posteriore mostrano la distribuzione delle fibre nervose, dei vasi sanguigni e dei vasi linfatici nella pelle glabra (A) e pelosa (B). (A1-A3) Il pannello A è stato mostrato separatamente con l'etichettatura CGRP (A1), l'etichettatura Pha (A2) e l'etichettatura LYVE1 (A3). (A4,A5; B1,B2) I pannelli (A) e (B) sono stati regolati in un modello 3D e mostrati rispettivamente con le viste anteriore (A4, B1) e posteriore (A5, B2). Stessa barra di scala per tutti i pannelli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Correlazione spaziale di fibre nervose, vasi sanguigni e vasi linfatici sulla sezione di pelle sottile con l'approccio convenzionale. (A, B) Immagini rappresentative della sezione spessa della pelle plantare e dorsale del ratto posteriore mostrano la distribuzione di fibre nervose, vasi sanguigni e vasi linfatici nella pelle glabra (A) e pelosa (B). (A1,A2; B1, B2): i pannelli (A) e (B) sono stati regolati in un modello 3D e mostrati rispettivamente con le viste anteriore (A1, B1) e posteriore (A2, B2). Stessa barra di scala per tutti i pannelli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Un istogramma che mostra la superficie delle fibre nervose CGRP-positive nella pelle pelosa e glabra. (A) Nella sezione con uno spessore di 30 μm, non c'era differenza tra pelle pelosa e pelle glabra nella superficie delle fibre nervose CGRP-positive. (B) Nella sezione con uno spessore di 300 μm, rispetto alla pelle pelosa, la superficie delle fibre nervose CGRP-positive della pelle glabra è stata significativamente aumentata (*P < 0,05, n = 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il presente studio fornisce una dimostrazione dettagliata delle fibre nervose cutanee nella pelle pelosa e glabra utilizzando l'immunofluorescenza su sezioni di tessuto più spesse con trattamento di compensazione e una vista 3D per comprendere meglio l'innervazione della pelle. Il tempo di incubazione degli anticorpi fino a 1-2 giorni e un processo di pulizia notturno sono importanti. Questi due passaggi chiave influenzano direttamente l'effetto di colorazione dell'immunofluorescenza delle sezioni spesse. Un ulteriore problema è stato sollevato dalla scelta degli anticorpi, non tutti adatti per sezioni spesse. Ipotizziamo che gli anticorpi con pesi molecolari più piccoli potrebbero essere ideali per la colorazione immunofluorescenza di sezioni spesse. Pertanto, la difficoltà della selezione degli anticorpi è una delle principali limitazioni di questo approccio. Il presente lavoro aveva osservato le differenze nella distribuzione dei vasi sanguigni, dei vasi linfatici e dei nervi sulla pelle pelosa e glabra dei ratti. Per l'uomo, la struttura della pelle è molto diversa da quella dei roditori; non vediamo l'ora di utilizzare la tecnologia di pulizia dei tessuti per osservare e ricercare la pelle umana nella prossima fase.
Studi precedenti hanno fatto molti sforzi per rivelare le fibre nervose cutanee 4,5,6,7,8. In contrasto con lo studio convenzionale della sezione tissutale, le tecniche di pulizia dei tessuti tra cui CUBIC, CLARITY e vDISCO sono state ampiamente utilizzate per studiare interi organi e corpi interi di animali negli ultimi anni 16,17,18,19. Di solito, è difficile rintracciare le fibre nervose cutanee con una struttura lunga e completa nella sezione sottile 4,5,6,7,8; comparativamente, il trattamento di compensazione dei tessuti sul campione di grandi dimensioni può richiedere molto tempo 16,17,18,19. Considerando i loro vantaggi e svantaggi, il presente protocollo è una scelta corretta per esaminare la struttura dettagliata delle fibre nervose cutanee all'interno della sezione spessa trattata in modo trasparente, che è conveniente osservare e registrare sotto la normale microscopia confocale. Utilizzando questo approccio, si possono osservare fibre nervose cutanee più lunghe all'interno della sezione spessa rispetto alla sezione sottile e risparmiare tempo sperimentale per il trattamento dei tessuti rispetto ai campioni di grandi dimensioni con pulizia dei tessuti.
In questo studio, le fibre nervose cutanee sono state etichettate con CGRP. Questi tipi di fibre nervose appartengono alle fibre sensoriali C e Aδ, svolgendo il ruolo di trasporto dei segnali nocicettivi e modulando la vasodilatazione12,13. Poiché le fibre nervose CGRP-positive si trovano vicino ai vasi sanguigni e ai vasi linfatici nello strato sottocutaneo, è stato anche suggerito di partecipare alla guarigione delle ferite migliorando l'angiogenesi e la linfangiogenesi20,21. Simile agli studi precedenti 14,20,21,22, la falloidina è stata fortemente espressa nei vasi sanguigni con questo esperimento di tripla marcatura. Inoltre, LYVE1 è una glicoproteina di membrana integrale ed è efficacemente impiegata come biomarcatore per la selezione delle cellule endoteliali linfatiche dermiche di ratto 15,23,24. Sfruttando la tripla colorazione fluorescente con CGRP, falloidina e LYVE1, insieme alla tecnica di pulizia dei tessuti, viene presentata un'immagine ad alta risoluzione per una migliore comprensione della rete di fibre nervose, vasi sanguigni e vasi linfatici nella pelle pelosa e glabra.
Va notato che solo le fibre nervose CGRP-positive sono state dimostrate in questo studio. Oltre a questo tipo di fibra nervosa sensoriale, questo protocollo può anche essere adatto per esaminare altri tipi di fibre nervose cutanee con gli anticorpi corrispondenti. Inoltre, poiché la falloidina è altamente espressa nella componente citoscheletrica nelle cellule muscolari lisce ed endoteliali 21,22,25, oltre ai vasi sanguigni, anche i tessuti muscolari ed epidermici sono stati etichettati con falloidina. Tuttavia, in base alla caratteristica morfologica, non è difficile identificare i vasi sanguigni dall'altro tipo di tessuti.
In sintesi, il presente protocollo esplora efficacemente l'innervazione della pelle pelosa e glabra su sezioni più spesse utilizzando una combinazione di immunofluorescenza con trattamento di compensazione. Dal punto di vista metodologico, sarebbe un vantaggio studiare gli altri tipi di fibre nervose cutanee e la loro correlazione spaziale con i vasi sanguigni e i vasi linfatici in futuro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Codice di progetto n. CI2021A03404) e il Fondo Nazionale per l'Innovazione Interdisciplinare di Medicina Tradizionale Cinese (Codice di Progetto n. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
References
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M.
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
