Summary
조직 절편의 두께는 피부 신경과민의 형태학적 연구를 제한하였다. 본 프로토콜은 공초점 현미경 검사 하에서 두꺼운 300 μm 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 시각화하는 독특한 조직 제거 기술을 기술한다.
Abstract
피부 신경은 말초 신경계의 중요한 부분입니다. 피부 신경 섬유에 대한 연구가 빠르게 진행되었지만, 분포 및 화학적 특성에 대한 대부분의 이해는 얇은 조직 절편에 대한 기존의 조직 화학 및 면역 조직 화학 염색에서 비롯됩니다. 조직 제거 기술의 발달로, 더 두꺼운 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 볼 수있게되었습니다. 본 프로토콜은 쥐 뒷발의 발바닥 및 등쪽 피부로부터 300 μm의 두께로 조직 절편에 대한 다중 형광 염색을 기술하며, 두 개의 전형적인 털이 많고 윤곽이 있는 피부 부위이다. 여기서, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드는 감각신경섬유를 표지하는 반면, 팔로이드인과 림프관내피히알루로난 수용체 1은 혈액과 림프관을 각각 표지한다. 공초점 현미경 하에서, 라벨이 붙은 감각 신경 섬유는 더 먼 거리에서 완전히 추적되었고, 깊은 피부 층의 번들과 피상층의 자유형으로 달렸다. 이 신경 섬유는 혈관과 평행하거나 혈관을 둘러싸고 있었고, 림프관은 털이 많고 윤기가 나는 피부에 3차원(3D) 네트워크를 형성했다. 현재의 프로토콜은 방법론 관점에서 기존의 기존의 방법보다 피부 신경을 연구하는 데보다 효과적인 접근법을 제공합니다.
Introduction
신체에서 가장 큰 기관인 피부는 환경에 대한 핵심 인터페이스 역할을하며 많은 신경 섬유 1,2,3에 의해 조밀하게 신경을 씁니다. 피부 신경과민은 이전에 전체 탑재 피부 및 조직 절편 4,5,6에 대한 염색과 같은 다양한 조직학적 방법으로 널리 연구되었지만, 피부 신경 섬유의 상세한 효과적인 입증은 여전히 과제입니다 7,8. 이를 감안할 때, 본 프로토콜은 두꺼운 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 보다 명확하게 나타낼 수 있는 독특한 기술을 개발하였다.
절편의 두께에 의한 한계 때문에, 신경과민된 피부 신경 섬유의 관찰은 획득된 이미지 정보로부터 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP) 신경 섬유와 국소 조직 및 기관 사이의 관계를 정확하게 묘사하기에 충분히 정확하지 않다. 3D 조직 제거 기술의 출현은 이러한 문제(9,10)를 해결할 수 있는 실현 가능한 방법을 제공한다. 조직 제거 접근법의 빠른 개발은 최근11 시간 동안 조직 구조, 전체 장기, 신경 세포 돌기 및 전체 동물을 연구하기위한 많은 도구를 제공했습니다. 투명한 피부 조직은 공초점 현미경으로 훨씬 더 두꺼운 단면에서 이미징되어 피부 신경 섬유를 시각화하는 데이터를 얻을 수 있습니다.
본 연구에서, 쥐 뒷발의 발바닥 및 등쪽 피부는 털이 많고 윤곽이 있는 피부 3,4,7의 두 가지 표적 부위로서 선택되었다. 피부 신경 섬유를 더 먼 거리에서 추적하기 위해, 피부 조직을 면역조직화학 및 조직화학적 염색을 위해 300 μm의 두께로 슬라이스하고, 이어서 조직 소거 처리를 하였다. CGRP는 감각 신경 섬유12,13을 라벨링하는데 사용되었다. 또한, 조직 배경에 피부 신경 섬유를 강조하기 위해, 팔로이드인 및 림프관 내피 히알루로난 수용체 1(LYVE1)을 혈관과 림프관을 각각14,15로 표지하기 위해 추가로 사용하였다.
이러한 접근법은 피부 신경 섬유의 고해상도 뷰를 입증하고 또한 피부의 신경 섬유, 혈관 및 림프관 간의 공간적 상관 관계를 시각화하기 위해 적용 할 수있는 간단한 방법을 제공했으며, 이는 병리학 적 조건 하에서 정상 피부의 항상성 및 피부 변화를 이해하는 데 훨씬 더 많은 정보를 제공 할 수 있습니다.
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Protocol
본 연구는 중국 의학 아카데미 침술 및 Moxibustion 연구소의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (참조 번호 D2018-04-13-1). 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 가이드 (National Academy Press, Washington, D.C., 1996)에 따라 수행되었습니다. 세 마리의 성인 수컷 래트 (Sprague-Dawley, 체중 230 ± 15 g)를 본 연구에 사용하였다. 모든 동물은 온도와 습도가 조절 된 12 시간의 빛 / 어둠주기에 수용되었으며 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있었습니다.
1. 관류 및 샘플 준비
- 안락사를 유도하기 위해 250 mg / kg의 트리브로모 에탄올 용액 ( 물질 표 참조)을 쥐에 복강내 주사하십시오.
- 호흡이 멈추면 스테인레스 스틸 외과 용 가위를 사용하여 쥐의 흉강을 엽니 다. 20G 바늘을 사용하여 좌심실13을 0.9% 정상 식염수 100mL와 함께 3mL/min의 속도로 관류시킨 다음 0.1M 인산염 완충액(PB, pH 7.4)에서 4% 파라포름알데히드 250-300mL를 사용합니다(그림 1A, B).
- 관류 후, 메스를 사용하여 뒷발에서 등받이와 발바닥의 피부를 제거하십시오.
- 냉동 절편을 필요로 하는 샘플의 경우, 조직을 2시간 동안 0.1 M PB 중의 4% 파라포름알데히드에 고정시킨 후; 이어서 조직을 4°C에서 24시간 이상 동안 0.1 M PB 중의 25% 수크로오스로 보호한다.
- 조직 제거를 필요로 하는 두꺼운 절편을 갖는 샘플의 경우, 조직을 1x 포스페이트 완충 식염수(1x PBS) 중의 4% 파라포름알데히드에 2시간 동안 고정시킨 후; 그런 다음 조직을 4°C에서 1x PBS로 동결 보호한다(그림 1C–E).
2. CGRP, phalloidin 및 LYVE1로 삼중 형광 염색을 한 후 조직 제거 처리
참고: CGRP, phalloidin 및 LYVE1을 사용한 삼중 형광 염색을 적용하여 조직 제거 처리 후 두께가 300 μm인 조직 절편에 털이 많고 글래브러스 피부의 신경 섬유, 혈관 및 림프관을 밝혔습니다.
- 2% 아가로오스를 1x PBS에서 2분 동안 마이크로오븐에서 가열하여 아가로오스가 용해될 때까지 제조하였다(표 참조).
- 세척 후, 피부 조직을 37°C에서 2% 아가로오스에 집어넣고, 이를 아이스박스 내부에 넣어 냉각시킨다(그림 1F,G).
- 장착된 조직을 빙수로 진동 마이크로톰에 고정시키고 횡단 방향으로 500 μm의 두께로 슬라이스한다. 진동 슬라이서 및 마무리 슬라이싱을 설정하려면 속도, 0.50mm/s, 진폭 1.5mm(그림 1H-K)를 설정합니다.
- 슬라이스 후, 절편으로부터 아가로스를 제거하고, 이를 1x PBS(pH 7.4)로 6웰 플레이트에 저장한다(도 1L).
- 조직 절편을 4°C에서 하룻밤 동안 1x PBS(TriX-PB) 중의 2% 트리톤 X-100의 용액으로 인큐베이션한다. 다음 절차는 그림 2 를 참조하십시오.
- 조직 절편을 블로킹 완충액에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 진탕기 상에서 72 rpm으로 회전시킨다.
참고: 블로킹 완충액 조성물은 1x PBS 중 10% 정상 당나귀 혈청, 1% 트리톤-X 100, 및 0.2% 아지드 나트륨이다( 표 참조). - 조직 절편을 마이크로원심분리 튜브 내의 희석 완충액에 마우스 모노클로날 항-CGRP (1:500) 및 양 폴리클로날 항-LYVE1 항체 (1:500)의 1차 항체를 함유하는 용액 ( 표 문헌 참조)에 넣고, 4°C에서 2일 동안 진탕기 상에서 회전시킨다.
참고: 희석 완충액 조성물은 1x PBS 중의 1% 정상 당나귀 혈청, 0.2% 트리톤-X 100, 및 0.2% 아지드 나트륨이다. - 조직 절편을 실온에서 세척 완충액으로 두 번 세척한 다음, 세척 완충액 중에서 4°C에서 밤새 진탕기 상에 보관한다.
주: 세척 완충액 조성물은 0.1 M PB (pH 7.4) 중 0.2% 트리톤-X 100이다. - 다음날, 조직 절편을 당나귀 항-마우스 IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) 및 당나귀 항-양 IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500) 및 Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) ( 물질표 참조)의 2차 항체를 포함하는 혼합 용액으로 옮기고 마이크로원심분리 튜브에서 72 rpm으로 회전시키고 4°C에서 5시간 동안 진탕기에서 회전시킨다.
- 여섯 웰 플레이트에서 조직 절편을 실온에서 1 시간, 두 번 세척 완충액으로 세척하십시오. 조직 절편을 4°C에서 하룻밤 동안 진탕기 상의 세척 완충액에 보관한다.
- 조직 절편을 조직 클리어링 시약 내로 옮기고( 표 참조, 그의 부피는 샘플 부피보다 다섯 배 더 컸다) 진탕기 상에서 60 rpm으로 실온에서 1 h 동안 부드럽게 회전시킨다.
참고: 이 치료 후 조직 절편이 명확해집니다(그림 2B). - 클리어 티슈를 슬라이드에 장착하고, 스페이서로 조직을 동그라미로 돌린 다음, 신선한 조직 제거 시약과 커버슬립으로 틈새를 붙입니다.
3. 통상적인 접근법에 따른 CGRP, 팔로이딘 및 LYVE1을 이용한 삼중 형광 염색
참고: 비교로서, 통상적인 기술에 따라 30 μm의 두께로 조직 절편에 대해 동일한 염색을 수행하였다.
- 조직 절편을 횡단 방향으로 마이크로톰에서 30μm로 슬라이스하여 슬라이드에 장착합니다.
- 0.1 M PB 중 3% 정상 당나귀 혈청 및 0.3% 트리톤 X-100으로 블로킹 용액을 첨가하고, 절편을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 블로킹 용액을 제거하고, 절편을 마우스 모노클로날 항-CGRP (1:500) 및 양 폴리클로날 항-LYVE1 항체 (1:500)의 1차 항체를 함유하는 용액과 함께 4°C에서 하룻밤 동안 희석 완충액에서 인큐베이션한다.
- 다음날, 조직 절편을 0.1 M PB (pH 7.4)로 세 번 세척하고, 당나귀 항-마우스 IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) 및 당나귀 항양 IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500) 및 Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000)의 2차 항체를 포함하는 혼합 용액을 절편에 첨가하고, 실온에서 1 h 동안 인큐베이션한다.
- 현미경 관찰 전에, 절편을 0.1 M PB (pH 7.4)로 세 번 세척한 다음, 50% 글리세린의 커버슬립으로 덮는다.
4. 이미징 및 분석
- 염색된 시료를 형광현미경으로 관찰한 다음, 공초점 현미경을 이용하여 영상을 촬영하였다.
- 각 300 μm 두께의 섹션으로부터 각각 10 μm 프레임에서 30개의 이미지(Z-스택)를 캡처하고 공초점 현미경 시스템의 이미지 프로세서를 사용하여 단일 인-포커스 이미지를 통합합니다( 자료 표 참조).
- 3차원(3D) 분석을 위한 공초점 설정의 이미지 처리 소프트웨어에서 다음 단계를 수행합니다: 초점면 시작 | 설정 초점 평면 끝 | 설정 단계 크기를 |으로 설정 깊이 패턴 | 선택 이미지 캡처 | Z 시리즈.
참고: 청색 형광 신호의 여기 및 방출 파장은 각각 401nm 및 421nm였다. 녹색 형광 신호의 여기 및 방출 파장은 각각 499 nm 및 519 nm였다. 적색 형광 신호의 여기 및 방출 파장은 각각 591 nm 및 618 nm였다. 152 μm는 공초점 핀홀의 직경이다(10x 대물렌즈, NA: 0.4). 이미지 캡처 해상도는 1024 × 1024 픽셀이었습니다.
- 3차원(3D) 분석을 위한 공초점 설정의 이미지 처리 소프트웨어에서 다음 단계를 수행합니다: 초점면 시작 | 설정 초점 평면 끝 | 설정 단계 크기를 |으로 설정 깊이 패턴 | 선택 이미지 캡처 | Z 시리즈.
- 종래의 샘플의 경우(단계 3), 각 30 μm 두께의 섹션으로부터 1 μm 프레임에서 30개의 이미지(Z-스택)를 캡처하고, 이들 이미지를 상기 언급된 바와 같이 추가로 처리한다(단계 4.1-4.2).
- 이미지 처리 시스템을 사용하여 3D 재구성 패턴의 이미지를 시연합니다.
- Z-스택 공초점 이미지를 Imaris 9.0(셀 이미징 소프트웨어, 재질 표 참조)으로 가져와 3D 재구성을 수행하고 얼룩 강도를 기반으로 표면 렌더링을 생성: 새 서피스 추가 | 소스 채널 | 선택 서피스 세부 정보 |의 부드러운 옵션에서 매개변수 결정 절대 강도 |의 임계값 옵션에서 매개변수 결정 서피스 | 분류 마침.
- 세포 이미징 소프트웨어를 사용하여 양성 신경 섬유의 표면적에 대한 데이터를 수집합니다. 렌더링된 이미지 |을 선택합니다. 통계 | 자세한 | 특정 값 | 볼륨.
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Representative Results
삼중 형광 염색 후, 신경 섬유, 혈관 및 림프관을 털이 많은 피부와 글래브러스 피부에서 각각 CGRP, phalloidin 및 LYVE1로 명확하게 표지하였다(도 3,4). 클리어링 처리를 통해 CGRP 양성 신경 섬유, 팔로이드 양성 혈관 및 LYVE1 양성 림프관을 더 깊이 이미지화하여 피부의 완전한 구조 정보를 얻을 수 있습니다 (그림 3). 이러한 조직 구조가 3D 패턴으로 더 재구성되었을 때, 그 분포는 추적하기가 더 쉬워졌습니다. CGRP 양성 신경섬유가 피하조직과 진피를 통과하여 표피까지 통과한 것으로 나타났다. 이러한 신경 섬유는 피하 조직에서 다발로 실행되고, 진피 내에서 분지되고, 표피에서 종결되었다(그림 3). 대조적으로, 팔로이드 양성 혈관 및 LYVE1 양성 림프관은 피하 조직 및 진피에 분포한다(도 3). 일반적으로, CGRP 양성 신경 섬유는 혈관과 림프관에 평행하거나 둘러쌌으며, 털이 많고 윤기가 나는 피부에 3D 네트워크를 형성했다.
종래의 접근법에서는 신경 섬유, 혈관 및 림프관이 얇은 단면에 CGRP, phalloidin 및 LYVE1로 명확하게 표지되었지만 이러한 구조의 관찰은 슬라이스 두께에 의해 제한되며 완전히 관찰 될 수 없습니다 (그림 4). 이미징 기술은 서로 다른 포지티브 형광 신호로부터 각 오브젝트 아이템에 대한 심층 이미지를 렌더링했습니다. 이미지를 생성 한 후, CGRP 양성 신경 섬유의 표면적을 Imaris 소프트웨어를 통해 획득했습니다. 두께가 30 μm인 구간에서, CGRP 양성 신경섬유의 표면적에서 털이 많은 피부와 글라브루스 피부에는 차이가 없었다. 털이 많은 피부와 비교하여 300 μm 두께의 조직 절편에서, 글래브러스 피부의 CGRP 양성 신경 섬유의 표면적이 유의하게 증가하였다(*P < 0.05, Kruskal-Wallis 비모수 시험, n=3, 도 5). 따라서, 양성 신경 섬유의 표면적을 정확하게 비교하기 위해, 300 μm 클리어 섹션은 전통적인 30 μm 섹션보다 우수하다. 비교로서, 종래의 얇은 섹션에서보다 클리어링 처리를 통해 두꺼운 조직 섹션으로부터 이상적인 3D 이미지에 대한 더 많은 기회를 획득할 수 있다.
그림 1 : 실험도구 및 연구의 주요 단계 사진. (A) 수술 도구 (메스, 가위 등). (B) 관류용 펌프. (C) 관류 후 뒷발의 질경이와 등쪽 측면. (D) 발바닥과 도섬 스킨을 뒷발에서 제거하였다. (E) 트리밍된 피부 조직. (F, G) 37°C 및 4°C에서 2% 아가로오스로 장착된 피부 조직. (H) 진동 마이크로톰. (I) 절단 지지체에 피부 조직을 고정시켰다. (J) 슬라이싱을 위한 파라미터를 설정합니다. (K) 슬라이싱의 과정. (L) 대표 단면의 두께는 300μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 형광 염색 절차 및 피부 조직의 클리어링 . (A) 본 연구에 관여하는 프로토콜 단계의 표현. (B) 클리어링 치료 전후의 피부 조직의 외부 전망. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 두꺼운 피부 부위에서 조직 제거 처리 후 신경 섬유, 혈관 및 림프관의 공간적 상관 관계. (A,B) 쥐 뒷발의 발바닥과 등쪽 피부의 두꺼운 부분의 대표적인 이미지는 글래브로스 (A) 및 털이 많은 (B) 피부에서 신경 섬유, 혈관 및 림프관의 분포를 보여줍니다. (A1-A3) 패널 A는 CGRP 라벨링(A1), 파-라벨링(A2) 및 LYVE1-라벨링(A3)으로 개별적으로 표시되었다. (A4,A5; B1, B2) 패널 (A) 및 (B)는 3D 패턴으로 조정되었고, 각각 전면 (A4,B1) 및 후면 (A5,B2) 뷰와 함께 나타났다. 모든 패널에 대해 동일한 스케일 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 얇은 피부 부분의 신경 섬유, 혈관 및 림프관의 공간적 상관관계를 종래의 접근법과 함께 합니다. (A,B) 쥐 뒷발의 발바닥과 등쪽 피부의 두꺼운 부분에 대한 대표적인 이미지는 글래브러스(A)와 털이 많은 (B) 피부에서 신경 섬유, 혈관 및 림프관의 분포를 보여줍니다. (A1,A2; B1, B2): 패널 (A) 및 (B)를 3D 패턴으로 조정하고 각각 전면 (A1,B1) 및 후면 (A2,B2) 뷰로 표시하였다. 모든 패널에 대해 동일한 스케일 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 털이 많고 눈부신 피부에서 CGRP 양성 신경섬유의 표면적을 나타낸 히스토그램이다. (A) 두께가 30μm인 구간에서는 CGRP 양성 신경섬유의 표면적에서 털이 많은 피부와 글래브러스 피부의 차이가 없었다. (b) 두께가 300 μm인 구간에서, 털이 많은 피부와 비교하여, 글래브러스 피부의 CGRP 양성 신경섬유의 표면적이 유의하게 증가하였다(*P < 0.05, n=3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 연구는 클리어링 처리와 함께 두꺼운 조직 절편에 대한 면역 형광을 사용하여 털이 많고 글래브러스 피부에서 피부 신경 섬유의 상세한 시연을 제공하고 피부 신경을 더 잘 이해하기 위한 3D 뷰를 제공합니다. 최대 1-2일의 항체 인큐베이션 시간 및 하룻밤 세척 과정이 중요하다. 이 두 가지 주요 단계는 두꺼운 절편의 면역 형광 염색 효과에 직접적인 영향을 미칩니다. 항체의 선택으로부터 또 다른 문제가 제기되었는데, 이들 모두가 두꺼운 부분에 적합한 것은 아니다. 우리는 더 작은 분자량을 가진 항체가 두꺼운 절편의 면역 형광 염색에 이상적 일 수 있다고 추측합니다. 따라서, 항체 선택의 어려움은 이러한 접근법의 주요 한계이다. 본 연구는 쥐의 털이 많고 털이없는 피부에서 혈관, 림프관 및 신경의 분포의 차이를 관찰했다. 인간의 경우 피부 구조는 설치류의 피부 구조와 매우 다릅니다. 우리는 조직 제거 기술을 사용하여 다음 단계에서 인간의 피부를 관찰하고 연구하기를 기대합니다.
이전의 연구는 피부 신경 섬유 4,5,6,7,8을 밝히기 위해 많은 노력을 기울였습니다. 기존의 조직 섹션 연구와는 달리, CUBIC, CLARITY 및 vDISCO를 포함한 조직 제거 기술은 최근 몇 년 동안 동물의 전체 장기 및 전신을 연구하는 데 널리 사용되었습니다16,17,18,19. 보통, 얇은 섹션 4,5,6,7,8에서 길고 완전한 구조를 갖는 피부 신경 섬유를 추적하는 것은 어렵다; 비교적으로, 큰 크기의 샘플에 대한 조직 제거 처리는 오랜 시간이 걸릴 수 있습니다16,17,18,19. 이들의 장점 및 단점을 고려하여, 본 프로토콜은 투명하게 처리된 두꺼운 부분 내의 피부 신경 섬유의 상세한 구조를 검사하기 위한 적절한 선택이며, 이는 통상의 공초점 현미경 하에서 관찰되고 기록되는 것이 편리하다. 이러한 접근법을 활용하면, 얇은 단면에 비해 두꺼운 부분 내에서 더 긴 피부 신경 섬유를 관찰할 수 있고, 조직 제거를 갖는 대형 샘플에 비해 조직 치료를 위한 실험 시간을 절약할 수 있다.
이 연구에서, 피부 신경 섬유는 CGRP로 표지되었다. 이러한 종류의 신경 섬유는 C 및 Aδ 감각 섬유에 속하며, nociceptive 신호를 전달하고 혈관 확장12,13을 조절하는 역할을합니다. CGRP 양성 신경 섬유는 피하층의 혈관 및 림프관에 가깝게 위치하기 때문에, 혈관신생과 림프관형성20,21을 개선함으로써 상처 치유에 참여하는 것이 또한 제안되었다. 이전 연구 14,20,21,22와 유사하게, 팔로이딘은 이 삼중 표지 실험을 통해 혈관에서 강하게 발현되었다. 또한, LYVE1은 필수적인 막 당단백질이며 래트 진피 림프 내피 세포 15,23,24를 분류하기 위한 바이오마커로서 효과적으로 사용된다. CGRP, phalloidin 및 LYVE1을 사용한 삼중 형광 염색을 활용하여 조직 제거 기술과 함께 털이 많고 눈부신 피부의 신경 섬유, 혈관 및 림프관의 네트워크에 대한 더 나은 통찰력을 위한 고해상도 이미지가 제시됩니다.
이 연구에서 CGRP 양성 신경 섬유만이 입증되었다는 점에 유의해야 한다. 이러한 종류의 감각 신경 섬유 외에도이 프로토콜은 해당 항체로 다른 유형의 피부 신경 섬유를 검사하는 데에도 적합 할 수 있습니다. 또한, 팔로이딘은 혈관 외에 평활한 근육 및 내피 세포21,22,25에서 세포골격 성분에서 고도로 발현되기 때문에, 근육 및 표피 조직도 팔로이딘으로 표지되었다. 그러나 형태 학적 특성에 따르면 다른 종류의 조직에서 혈관을 확인하는 것은 어렵지 않습니다.
요약하면, 본 프로토콜은 면역 형광과 클리어링 치료의 조합을 사용하여 두꺼운 절편에서 털이 많고 윤곽이 나는 피부의 신경과민을 효과적으로 탐구합니다. 방법론 관점에서 볼 때, 다른 종류의 피부 신경 섬유와 향후 혈관 및 림프관과의 공간적 상관 관계를 조사하는 것이 유익 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 의학 과학 혁신 기금의 중국 아카데미에 의해 지원되었다 (프로젝트 코드 번호. CI2021A03404) 및 국가 전통 중국 의학 학제 간 혁신 기금 (프로젝트 코드 번호. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
References
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M.
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
