Summary
組織切片の厚さは、皮膚神経支配の形態学的研究を制限した。本プロトコールは、共焦点顕微鏡下で厚さ300μmの組織切片中の皮膚神経線維を可視化する独自の組織透明化技術を記載する。
Abstract
皮膚神経支配は末梢神経系の重要な部分です。皮膚神経線維の研究は急速に進歩しているが、それらの分布的および化学的特性の理解の大部分は、薄い組織切片に対する従来の組織化学的および免疫組織化学的染色から来ている。組織透明化技術の開発により、より厚い組織切片上の皮膚神経線維を見ることが可能となった。本プロトコールは、ラット後足の足底および背部皮膚から300μmの厚さで組織切片に複数の蛍光染色を記載する、2つの典型的な毛深いおよびグラブラスな皮膚部位である。ここで、カルシトニン遺伝子関連ペプチドは感覚神経線維を標識し、一方ファロイジン及びリンパ管内皮ヒアルロン酸受容体1は血液及びリンパ管をそれぞれ標識する。共焦点顕微鏡下では、標識された感覚神経線維は、より長い距離で完全に追跡され、深い皮膚層では束状に、表層ではフリースタイルで走った。これらの神経線維は血管と平行に走ったり、血管を囲んだりして、リンパ管は毛むくじゃらでグラブラスな皮膚に3次元(3D)ネットワークを形成しました。現在のプロトコルは、方法論の観点から既存の従来の方法よりも皮膚神経支配を研究するためのより効果的なアプローチを提供する。
Introduction
皮膚は、環境への重要なインターフェースとして機能する体内最大の器官であり、多くの神経線維1,2,3によって密に神経支配されている。皮膚神経支配は、全マウント皮膚および組織切片4,5,6に対する染色など、様々な組織学的方法を用いて以前に広く研究されてきたが、皮膚神経線維の詳細な効果的な実証は依然として課題である7,8。これを踏まえ、本プロトコールは、厚い組織切片において皮膚神経線維をより明確に示すための独自の技術を開発した。
切片の太さによる限界のため、神経支配皮膚神経線維の観察は、取得した画像情報からカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)神経線維と局所組織・臓器との関係を正確に描くほど正確ではない。3D組織クリアリング技術の出現は、この問題を解決するための実行可能な方法を提供する9,10。組織クリアリングアプローチの急速な発展は、近年、組織構造、器官全体、ニューロン突起、および動物全体を研究するための多くのツールを提供してきました11。透明な皮膚組織は、共焦点顕微鏡によってはるかに厚い部分で画像化され、皮膚神経線維を視覚化するためのデータを得ることができる。
現在の研究では、ラット後足の足底および背部皮膚を、毛状およびグラブラス性皮膚の2つの標的部位として選択した3、4、7。より長い距離で皮膚神経線維をトレースするために、皮膚組織を免疫組織化学的および組織化学的染色のために300μmの厚さでスライスし、続いて組織透明化処置を行った。CGRPは、感覚神経線維12、13を標識するために使用した。さらに、組織背景上の皮膚神経線維を強調するために、ファロイジンおよびリンパ管内皮ヒアルロン酸受容体1(LYVE1)をさらに用いて、それぞれ血管およびリンパ管を標識した14、15。
これらのアプローチは、皮膚神経線維の高解像度ビューを実証し、また、皮膚の神経線維、血管、およびリンパ管間の空間的相関を視覚化するために適用することができる直接的な方法を提供し、正常な皮膚の恒常性および病理学的条件下での皮膚の変化を理解するためのはるかに多くの情報を提供し得る。
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Protocol
本研究は、中国医学科学院鍼灸研究所倫理委員会(参照番号D2018-04-13-1)により承認された。すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイド(National Academy Press、Washington、D.C.、1996)に従って実施されました。3匹の成体雄ラット(Sprague-Dawley、体重230±15g)を本研究に使用した。すべての動物は、温度と湿度を制御した12時間の明暗サイクルで飼育され、食物と水への自由なアクセスが許されました。
1. 灌流とサンプル調製
- 250mg/kgのトリブロモエタノール溶液( 材料表参照)をラットの腹腔内に注入し、安楽死を誘発する。
- 呼吸が止まったら、ステンレス製の外科用はさみを使用してラットの胸腔を開きます。20 G 針を使用して、左心室13 を 3 mL/分の速度で 100 mL の 0.9% 正常生理食塩水で灌流し、続いて 0.1 M リン酸緩衝液 (PB、pH 7.4) に 250 ~ 300 mL の 4% パラホルムアルデヒドを注入します (図 1A、B)。
- 灌流後、メスを使用して背骨と足裏の皮膚を後足から取り除きます。
- 凍結切片を必要とするサンプルについては、組織を0.1M PB中の4%パラホルムアルデヒドに2時間固定する。その後、0.1M PB中の25%スクロース中の組織を4°Cで24時間以上凍結保護します
- 組織透明化を必要とする厚いセクションを有するサンプルの場合、1xリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)中の4%パラホルムアルデヒド中の組織を2時間後固定する。その後、4°Cで1x PBSで組織を凍結保護します(図1C-E)。
2. CGRP、ファロイジン、LYVE1によるトリプル蛍光染色とそれに続く組織透明化処理
注:CGRP、ファロイジンおよびLYVE1によるトリプル蛍光染色を適用して、組織透明化処理後の厚さ300μmの組織切片上の毛状およびグラブラスな皮膚の神経線維、血管、およびリンパ管を明らかにした。
- アガロースが溶解するまで電子レンジで2分間加熱することにより、1x PBS中の2%アガロースを調製する(材料表を参照)。
- 洗浄後、皮膚組織を37°Cで2%アガロースに包埋し、冷却用のアイスボックス内に置きます(図1F、G)。
- 取り付けた組織を氷水で振動ミクロトームに固定し、横方向に500μmの厚さでスライスする。振動スライサーを設定し、スライスを終了するには、速度 0.50 mm/s および振幅 1.5 mm のパラメータを使用します (図 1H-K)。
- スライス後、切片からアガロースを取り出し、1x PBS(pH 7.4)を含む6ウェルプレートに保存します(図1L)。
- 組織切片を1x PBS(TriX-PB)中の2%Triton X-100の溶液中で4°Cで一晩インキュベートする。 以下の手順については、 図 2 を参照してください。
- 組織切片をブロッキングバッファーに入れ、シェーカー上で72rpmで4°Cで一晩回転させる。
注:ブロッキングバッファー組成は、1x PBS中の10%正常ロバ血清、1%Triton-X 100、および0.2%アジ化ナトリウムです( 材料表を参照)。 - マウスモノクローナル抗CGRP(1:500)及びヒツジポリクローナル抗LYVE1抗体(1:500)の一次抗体を微量遠心管内の希釈緩衝液( 材料表参照)に含む溶液に組織切片を移し、シェーカー上で4°Cで2日間回転させた。
注:希釈バッファー組成は、1x PBS中の1%正常ロバ血清、0.2%Triton-X 100、および0.2%アジ化ナトリウムです。 - 組織切片を室温の洗浄バッファーで2回洗浄し、次いで洗浄バッファー中で4°Cで一晩シェーカーに保管する。
注:洗浄バッファー組成は、0.1M PB(pH 7.4)中の0.2%Triton-X 100です。 - 翌日、ロバ抗マウスIgG H&L Alexa-Flour488(1:500)およびロバ抗ヒツジIgG H&L Alexa-Flour405(1:500)、ならびにAlexa-Flour594ファロイジン(1:1000)( 材料表参照)の二次抗体を含む混合溶液に組織切片を微小遠心管に移し、シェーカー上で72rpmで4°Cで5時間回転させる。
- 6ウェルプレートの組織切片を洗浄バッファーで室温で1時間、2回洗浄する。組織切片をシェーカー上の洗浄バッファーに入れて4°Cで一晩保管する。
- 組織切片を組織透明化試薬( 材料表を参照、その体積は試料体積の5倍以上であった)に移し、シェーカー上で60rpmで室温で1時間穏やかに回転させた。
注:この治療後、組織切片は透明になる(図2B)。 - クリアしたティッシュをスライドに取り付け、スペーサーでティッシュを丸め、新鮮なティッシュクリアリング試薬とカバースリップで隙間を貼り付けます。
3. 従来のアプローチに従ったCGRP、ファロイジン、LYVE1によるトリプル蛍光染色
注:比較として、従来の技術に従って厚さ30μmの組織切片に対して同様の染色を実施した。
- ミクロトーム上で組織切片を横方向に30μmでスライスし、スライドに取り付けます。
- 0.1 M PBに3%正常ロバ血清および0.3%Triton X-100を含むブロッキング溶液を加え、室温で30分間切片をインキュベートする。
- ブロッキング溶液を除去し、切片をマウスモノクローナル抗CGRP(1:500)およびヒツジポリクローナル抗LYVE1抗体(1:500)の一次抗体を含む溶液と共に4°Cで一晩希釈緩衝液中でインキュベートする。
- 翌日、組織切片を0.1M PB(pH 7.4)で3回洗浄し、ロバ抗マウスIgG H&L Alexa-Flour488(1:500)およびロバ抗ヒツジIgG H&L Alexa-Flour405(1:500)、ならびにAlexa-Flour594ファロイジン(1:1000)の二次抗体を含む混合溶液を切片に加え、室温で1時間インキュベートする。
- 顕微鏡観察の前に、切片を0.1M PB(pH 7.4)で3回洗浄し、50%グリセリンのカバースリップで覆う。
4. イメージングと解析
- 染色した試料を蛍光顕微鏡で観察し、共焦点顕微鏡で画像を撮影します。
- 厚さ300 μmの各セクションから、それぞれ10 μmフレームの30枚の画像(Zスタック)をキャプチャし、共焦点顕微鏡システムのイメージプロセッサを使用して単一のピントが合った画像を統合します( 材料表を参照)。
- 3次元(3D)解析用の共焦点セットアップの画像処理ソフトウェアで、次の手順を実行します: [焦点面の開始]|焦点面の終了|の設定ステップサイズ|を設定する深度パターン|を選択画像キャプチャ|Zシリーズ。
注:青色蛍光シグナルの励起波長と発光波長は、それぞれ401nmと421nmでした。緑色蛍光シグナルの励起波長および発光波長は、それぞれ499nmおよび519nmであった。赤色蛍光シグナルの励起波長および発光波長は、それぞれ591nmおよび618nmであった。152μmは共焦点ピンホール(10倍対物レンズ、NA:0.4)の直径である。画像キャプチャ解像度は1024×1024ピクセルであった。
- 3次元(3D)解析用の共焦点セットアップの画像処理ソフトウェアで、次の手順を実行します: [焦点面の開始]|焦点面の終了|の設定ステップサイズ|を設定する深度パターン|を選択画像キャプチャ|Zシリーズ。
- 従来のサンプル(ステップ3)では、厚さ30μmの断面から1μmフレームに30枚の画像(Zスタック)をキャプチャし、さらにこれらの画像を上記のように処理します(ステップ4.1-4.2)。
- 画像処理システムによる3D再構成のパターンで画像を実演する。
- Zスタック共焦点画像をImaris 9.0(細胞イメージングソフトウェア、 材料表を参照)にインポートして3D再構成を実行し、汚れの強度に基づいてサーフェスレンダリングを作成する: 新しいサーフェス|追加するソースチャンネル|を選択「サーフェスの詳細」(Surfaces) |の「スムーズ」(smooth) オプションでパラメータを決定します。「絶対強度」のしきい値オプションのパラメータを決定|サーフェスの分類|終了です。
- 陽性神経線維の表面積のデータを細胞イメージングソフトウェアで取得します。 レンダリング イメージ |を選択します。統計|詳細な|特定の値|ボリューム。
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Representative Results
トリプル蛍光染色後、神経線維、血管、リンパ管を、毛むくじゃらの皮膚およびグラブラス皮膚において、それぞれCGRP、ファロイジン、およびLYVE1で明確に標識した(図3、4)。クリアリング治療により、CGRP陽性神経線維、ファロイジン陽性血管、およびLYVE1陽性リンパ管をより高い深さで画像化し、皮膚の完全な構造情報を取得することができます(図3)。これらの組織構造を3Dパターンでさらに再構築すると、その分布を追跡しやすくなりました。CGRP陽性神経線維が皮下組織と真皮を通って表皮に伝わることが示された。これらの神経線維は皮下組織で束となって走り、真皮内で分岐し、表皮で終端した(図3)。これに対し、ファロイジン陽性血管およびLYVE1陽性リンパ管は、皮下組織および真皮に分布している(図3)。一般に、CGRP陽性神経線維は、血管およびリンパ管に平行に走るか、または血管を囲み、毛むくじゃらでグラブラスな皮膚に3Dネットワークを形成する。
従来の手法では、神経線維、血管、リンパ管は、薄切片にCGRP、ファロイジン、LYVE1で明確に標識されていましたが、これらの構造の観察はスライスの厚さによって制限され、完全に観察することはできません(図4)。イメージング技術は、異なる正の蛍光シグナルから各オブジェクトアイテムの詳細な画像をレンダリングしました。画像を生成した後、CGRP陽性神経線維の表面積をImarisソフトウェアを介して取得した。厚さ30μmの切片では、CGRP陽性神経線維の表面積において毛むくじゃらの皮膚とグラブラス皮膚との間に差はなかった。厚さ300μmの組織切片では、毛むくじゃらの皮膚と比較して、グラブラス皮膚のCGRP陽性神経線維の表面積が有意に増加した(*P < 0.05、クラスカル・ウォリスノンパラメトリック検定、n=3、 図5)。したがって、陽性神経線維の表面積を正確に比較するために、300μmのクリアセクションは従来の30μmセクションよりも優れています。比較として、従来の薄切片よりも、透明化処理により、厚い組織切片から理想的な3D画像を得る機会をより多く取得することができる。
図1:実験器具の写真と研究における重要なステップ (A)手術器具(メス、はさみなど)。(B)灌流用ポンプ。(c)灌流後の後足の足底および背側。(D)足裏および背甲の皮膚を後足から除去した。(E)トリミングされた皮膚組織。(F,G)37°Cおよび4°Cで2%アガロースで皮膚組織をマウントした(H)振動ミクロトーム。(I)切断サポーターに皮膚組織を固定する。(J) スライスのパラメータを設定します。(K)スライスのプロセス。(L) 代表的な断面の厚さは300μmです。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2:皮膚組織の蛍光染色手順と透明化(A)この研究に関連するプロトコルステップの表現。(B)クリアリング処理前後の皮膚組織の外観図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:厚い皮膚切片の組織透明化処理後の神経線維、血管、リンパ管の空間相関(A,B)ラット後足の足底および背側皮膚の太い部分の代表的な画像は、グラブラス(A)および毛むくじゃらの(B)皮膚における神経線維、血管、およびリンパ管の分布を示す。(A1-A3)パネルAは、CGRPラベリング(A1)、Phaラベリング(A2)、およびLYVE1ラベリング(A3)で別々に示された。(A4,A5;B1,B2)パネル(A)と(B)を3Dパターンで調整し、それぞれ正面(A4,B1)と背面(A5,B2)の図で示した。すべてのパネルに同じスケールバー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:従来の手法を用いた薄い皮膚部の神経線維、血管、リンパ管の空間的相関(A,B)ラット後肢の足底・背側皮膚の太い部分の代表的な画像は、グラブラス(A)および毛深い(B)皮膚における神経線維、血管、リンパ管の分布を示す。(A1,A2;B1,B2):パネル(A)と(B)を3Dパターンで調整し、それぞれ正面(A1,B1)と背面(A2,B2)の図で示した。すべてのパネルに同じスケールバー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:毛状およびグラブラス皮膚におけるCGRP陽性神経線維の表面積を示すヒストグラム(A)厚さ30μmの切片では、CGRP陽性神経線維の表面積において毛状皮膚とグラブラス皮膚との間に差はなかった。(b)厚さ300μmの切片では、毛むくじゃらの皮膚と比較して、グラブラス皮膚のCGRP陽性神経線維の表面積が有意に増加した(*P <0.05、n=3)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究は、皮膚神経支配をよりよく理解するために、より厚い組織切片に免疫蛍光を用いて、より厚い組織切片に免疫蛍光を用いて、皮膚神経支配をよりよく理解することによって、毛状およびグラブラス皮膚における皮膚神経線維の詳細な実証を提供する。抗体インキュベーション時間は最大1〜2日で、一晩の洗浄プロセスが重要です。これら2つの重要なステップは、厚い切片の免疫蛍光染色効果に直接影響します。抗体の選択からさらなる問題が提起されたが、そのすべてが厚い切片に適しているわけではない。我々は、分子量の小さい抗体が、厚い切片の免疫蛍光染色に理想的であるかもしれないと推測している。したがって、抗体選択の難しさは、このアプローチの主要な限界である。本研究は、ラットの毛むくじゃらで無毛の皮膚上の血管、リンパ管、神経の分布の違いを観察した。人間にとって、皮膚の構造はげっ歯類の構造とは非常に異なります。次のステップでは、組織クリアリング技術を使用して人間の皮膚を観察し、研究することを楽しみにしています。
これまでの研究では、皮膚神経線維4,5,6,7,8を明らかにするために多くの努力が払われてきた。従来の組織切片研究とは対照的に、キュービック、クラリティ、およびvディスコを含む組織透明化技術は、近年、動物の器官全体および全身を研究するために広く使用されている16、17、18、19。通常、細い部分4,5,6,7,8において長く完全な構造を有する皮膚神経線維をトレースすることは困難である。比較的、大型試料に対する組織透明化処理は、長時間を要し得る16、17、18、19。それらの長所および短所を考慮すると、本プロトコールは、透明に処理された太い切片内の皮膚神経線維の詳細な構造を調べるための適切な選択であり、通常の共焦点顕微鏡下で観察および記録するのに便利である。このアプローチを利用すると、細切片に比べて太い切片内の皮膚神経線維が長く観察でき、組織透明化を伴う大型サンプルと比較して、組織治療のための実験時間を節約できます。
本研究では、皮膚神経線維をCGRPで標識した。これらの種類の神経線維はCおよびAδ感覚線維に属し、侵害受容シグナルを輸送し、血管拡張を調節する役割を果たす12,13。CGRP陽性神経線維は皮下層の血管やリンパ管の近くに位置することから、血管新生やリンパ管新生を改善することで創傷治癒に関与することも示唆された20,21。以前の研究14、20、21、22と同様に、ファロイジンは、このトリプルラベル実験で血管内で強く発現した。また、LYVE1は内在性膜糖タンパク質であり、ラット真皮リンパ管内皮細胞15、23、24を選別するためのバイオマーカーとして有効に利用されている。CGRP、ファロイジン、およびLYVE1によるトリプル蛍光染色を組織透明化技術とともに利用して、毛むくじゃらでグラブラスな皮膚の神経線維、血管、およびリンパ管のネットワークをよりよく洞察するための高解像度画像を提示する。
なお、CGRP陽性神経線維のみが本研究で実証された。この種の感覚神経線維に加えて、このプロトコルは、対応する抗体を用いて他のタイプの皮膚神経線維を検査するのにも適している可能性がある。また、ファロイジンは平滑な筋肉細胞及び内皮細胞21、22、25において細胞骨格成分に高発現しているため、血管以外にも、筋肉組織及び表皮組織もファロイジンで標識した。しかし、形態学的特徴によれば、他の種類の組織から血管を同定することは困難ではない。
要約すると、本プロトコールは、免疫蛍光とクリアリング処理との組み合わせを使用することにより、より厚い切片上の毛状およびグラブラスな皮膚の神経支配を効果的に探求する。方法論的な観点からは、今後、他の種類の皮膚神経線維や、血管やリンパ管との空間的相関を調べることは有益であろう。
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Disclosures
著者らには開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、中国医学科学院イノベーション基金(プロジェクトコードNo.CI2021A03404)および国立漢方薬学際的イノベーション基金(プロジェクトコード番号。ZYYCXTD-D-202202)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
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