Summary
A espessura das seções teciduais limitou o estudo morfológico da inervação da pele. O presente protocolo descreve uma técnica única de limpeza tecidual para visualizar fibras nervosas cutâneas em seções de tecido espessas de 300 μm sob microscopia confocal.
Abstract
A inervação da pele é uma parte importante do sistema nervoso periférico. Embora o estudo das fibras nervosas cutâneas tenha progredido rapidamente, a maior parte da compreensão de suas características distribucionais e químicas vem da coloração histoquímica e imunohistoquímica convencional em seções de tecidos finos. Com o desenvolvimento da técnica de limpeza tecidual, tornou-se possível ver as fibras nervosas cutâneas em seções de tecido mais grossas. O presente protocolo descreve múltiplas manchas fluorescentes em seções de tecido a uma espessura de 300 μm da pele plantar e dorsal do pé traseiro de rato, os dois típicos locais de pele peludo e glabrous. Aqui, o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina rotula as fibras nervosas sensoriais, enquanto a falo e o receptor endotelial do vaso endotelial 1 rotulam o sangue e os vasos linfáticos, respectivamente. Sob um microscópio confocal, as fibras nervosas sensoriais rotuladas foram seguidas completamente a uma distância mais longa, correndo em feixes na camada cutânea profunda e estilo livre na camada superficial. Essas fibras nervosas corriam paralelamente ou cercavam os vasos sanguíneos, e os vasos linfáticos formavam uma rede tridimensional (3D) na pele pelirpelenta e glabrous. O protocolo atual fornece uma abordagem mais eficaz para estudar a inervação da pele do que os métodos convencionais existentes do ponto de vista da metodologia.
Introduction
A pele, o maior órgão do corpo, servindo como uma interface chave para o ambiente, é densamente inervada por muitas fibras nervosas 1,2,3. Embora a inervação da pele tenha sido amplamente estudada anteriormente com vários métodos histológicos, como a coloração em seções de pele e tecido demontagem total 4,5,6, a demonstração detalhada e eficaz de fibras nervosas cutâneas ainda é um desafio 7,8. Diante disso, o presente protocolo desenvolveu uma técnica única para exibir fibras nervosas cutâneas mais claramente na seção de tecido grosso.
Devido ao limite pela espessura das seções, a observação de fibras nervosas da pele inervadas não é precisa o suficiente para descrever com precisão a relação entre as fibras nervosas relacionadas ao gene da calcitonina (CGRP) e tecidos e órgãos locais a partir das informações de imagem adquiridas. O surgimento da tecnologia de limpeza de tecidos 3D fornece um método viável para resolver esse problema 9,10. O rápido desenvolvimento de abordagens de limpeza de tecidos tem oferecido muitas ferramentas para estudar estruturas teciduais, órgãos inteiros, projeções neuronais e animais inteiros nos últimostempos 11. O tecido da pele transparente pode ser imageado em uma seção muito mais espessa por microscopia confocal para obter os dados para visualizar fibras nervosas cutâneas.
No presente estudo, a pele plantar e dorsal de um pé traseiro de rato foi selecionada como os dois locais alvo de pelepelrosa e glabrous 3,4,7. Para traçar as fibras nervosas cutâneas a uma distância maior, o tecido da pele foi cortado na espessura de 300 μm para coloração imunohistoquímica e histoquímica, seguido de tratamento de limpeza tecidual. O CGRP foi usado para rotular as fibras sensoriais do nervo12,13. Além disso, para destacar as fibras nervosas cutâneas no fundo tecidual, a faloidina e o receptor de hialuronan do vaso linfático 1 (LYVE1) foram ainda utilizados para rotular os vasos sanguíneos e os vasos linfáticos, respectivamente14,15.
Essas abordagens forneceram um método simples que pode ser aplicado para demonstrar uma visão de alta resolução das fibras nervosas cutâneas e também para visualizar a correlação espacial entre as fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos na pele, o que pode fornecer muito mais informações para entender a homeostase da pele normal e a alteração cutânea sob as condições patológicas.
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Protocol
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Acupuntura e Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (número de referência D2018-04-13-1). Todos os procedimentos foram realizados seguindo o Guia Nacional de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Neste estudo foram utilizados três ratos adultos (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Todos os animais foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12h com temperatura e umidade controladas e permitiram acesso livre a alimentos e água.
1. Perfusão e preparação da amostra
- Injete 250 mg/kg de solução de tribromoetanol (ver Tabela de Materiais) intraperitonealmente no rato para induzir eutanásia.
- Uma vez que a respiração pare, use tesoura cirúrgica de aço inoxidável para abrir a cavidade torácica do rato. Use agulhas de 20 G para perfuse através do ventrículo cardíaco esquerdo13 a uma taxa de 3 mL/min com 100 mL de soro fisiológico normal de 0,9%, seguido por 250-300 mL de 4% paraformaldeído em 0,1 M tampão fosfato (PB, pH 7.4) (Figura 1A,B).
- Após a perfusão, use um bisturi para remover a pele do dorso e sola da pata traseira.
- Para as amostras que requerem seção congelada, pós-fixar os tecidos em 4% de paraformaldeído em 0,1 M PB por 2h; em seguida, crioprotetor os tecidos em 25% de sacarose em 0,1 M PB por mais de 24 h a 4 °C
- Para as amostras com a seção grossa que requer limpeza tecidual, pós-fixar os tecidos em 4% de paraformaldeído em 1x salina tamponada com fosfato (1x PBS) por 2 h; em seguida, crioproteta os tecidos em 1x PBS a 4 °C (Figura 1C-E).
2. Coloração fluorescente tripla com CGRP, faloidina e LYVE1 seguida de tratamento de limpeza tecidual
NOTA: A coloração fluorescente tripla com CGRP, faloidina e LYVE1 foi aplicada para revelar as fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos na pele pelireira e glabrous em seções de tecido com espessura de 300 μm após o tratamento de limpeza tecidual.
- Prepare 2% de agarose em 1x PBS aquecendo em um micro forno por 2 min até que a agarose se dissolva (ver Tabela de Materiais).
- Após a lavagem, incorpore os tecidos da pele em 2% agarose a 37 °C, e coloque-os dentro da geladeira para resfriamento (Figura 1F,G).
- Fixar o tecido montado no microtome vibratório com a água gelada e cortá-los a uma espessura de 500 μm na direção transversal. Use os seguintes parâmetros para definir o cortador de vibração e o corte de acabamento: velocidade, 0,50 mm/s e amplitude, 1,5 mm (Figura 1H-K).
- Após o corte, retire a agarose das seções e armazene-as em uma placa de seis poços com 1x PBS (pH 7.4) (Figura 1L).
- Incubar as seções teciduais em uma solução de 2% Triton X-100 em 1x PBS (TriX-PB) durante a noite a 4 °C. Consulte a Figura 2 para o seguinte procedimento.
- Coloque as seções teciduais no tampão de bloqueio e gire a 72 rpm no agitador durante a noite a 4 °C.
NOTA: A composição do tampão de bloqueio é 10% de soro de burro normal, 1% Triton-X 100 e 0,2% de azida de sódio em 1x PBS (ver Tabela de Materiais). - Transfira as seções teciduais para a solução contendo os anticorpos primários do anti-CGRP monoclonal do rato (1:500) e do anticorpo anti-LYVE1 de ovelhas (1:500) em tampão de diluição no tubo de microcentrifusagem (ver Tabela de Materiais), e gire no agitador por 2 dias a 4 °C.
NOTA: A composição do tampão de diluição é 1% de soro de burro normal, 0,2% Triton-X 100 e 0,2% de azida de sódio em 1x PBS. - Lave as seções de tecido duas vezes com tampão de lavagem à temperatura ambiente e, em seguida, mantenha-as no shaker durante a noite a 4 °C no tampão de lavagem.
NOTA: A composição do tampão de lavagem é de 0,2% Triton-X 100 em 0,1 M PB (pH 7.4). - No dia seguinte, transfira as seções de tecido para a solução mista contendo os anticorpos secundários do anti-rato de burro IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) e anti-ovelhas de burro IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), assim como a faloidina Alexa-Flour594 (1:1000) (ver Tabela de Materiais) em um tubo de microcentrifusagem e gire a 72 rpm no shaker por 5h a 4 °C.
- Lave as seções de tecido em uma placa de seis poços com tampão de lavagem por 1h, duas vezes, à temperatura ambiente. Mantenha as seções teciduais na lavagem do tampão durante a noite a 4 °C.
- Transfira as seções teciduais para o reagente de limpeza tecidual (ver Tabela de Materiais, seu volume foi cinco vezes maior que o volume da amostra) e gire a 60 rpm no shaker suavemente por 1h à temperatura ambiente.
NOTA: Após este tratamento, as seções teciduais ficam claras (Figura 2B). - Monte os tecidos limpos na lâmina, circule os tecidos com um espaçador, e coloque a lacuna com reagente de limpeza de tecido fresco e deslizamento de cobertura.
3. Coloração fluorescente tripla com CGRP, faloidina e LYVE1 seguindo a abordagem convencional
NOTA: Como comparação, a mesma coloração foi realizada em seções de tecido a uma espessura de 30 μm seguindo técnicas convencionais.
- Corte as seções teciduais a 30 μm em um microtome na direção transversal e monte-as no slide.
- Adicione a solução de bloqueio com soro de burro 3% normal e 0,3% Triton X-100 em 0,1 M PB e incubar as seções por 30 minutos à temperatura ambiente.
- Remova a solução de bloqueio e incuba as seções com a solução contendo os anticorpos primários do anti-CGRP monoclonal do rato (1:500) e do anticorpo anti-LYVE1 policlonal de ovelhas (1:500) no tampão de diluição durante a noite a 4 °C.
- No dia seguinte, lave as seções teciduais com 0,1 M PB (pH 7.4) três vezes, adicione a solução mista contendo os anticorpos secundários do anti-rato de burro IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) e do anti-ovelha de burro IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), bem como a faloidina Alexa-Flour594 (1:1000) nas seções e incubar por 1 h em temperatura ambiente.
- Antes da observação microscópica, lave as seções em 0,1 M PB (pH 7.4) três vezes e cubra-as com deslizamentos em 50% de glicerina.
4. Imagens e análises
- Observe as amostras manchadas sob um microscópio fluorescente e, em seguida, pegue as imagens usando um microscópio confocal.
- Capture 30 imagens (Z-stacks), cada uma em quadros de 10 μm, de cada seção de 300 μm de espessura e integre uma única imagem em foco usando um processador de imagem do sistema de microscopia confocal (ver Tabela de Materiais).
- Execute as seguintes etapas no software de processamento de imagem da configuração confocal para análise tridimensional (3D): Defina o Plano Focal iniciar | Set End focal plane | Definir o tamanho do passo | Escolha | padrão de profundidade | de captura de imagens Série Z.
NOTA: Os comprimentos de onda de excitação e emissão dos sinais de fluorescência azul foram de 401 nm e 421 nm, respectivamente. Os comprimentos de onda de excitação e emissão de sinais de fluorescência verde foram de 499 nm e 519 nm, respectivamente. Os comprimentos de onda de excitação e emissão de sinais de fluorescência vermelha foram de 591 nm e 618 nm, respectivamente. 152 μm é o diâmetro do pinhole confocal (lente objetiva de 10x, NA: 0,4). A resolução de captura de imagem foi de 1024 × 1024 pixels.
- Execute as seguintes etapas no software de processamento de imagem da configuração confocal para análise tridimensional (3D): Defina o Plano Focal iniciar | Set End focal plane | Definir o tamanho do passo | Escolha | padrão de profundidade | de captura de imagens Série Z.
- Para as amostras convencionais (etapa 3), capture 30 imagens (Z-stacks) em quadros de 1 μm de cada seção de 30 μm de espessura e trate ainda mais essas imagens como mencionado acima (etapas 4.1-4.2).
- Demonstre as imagens no padrão de reconstrução 3D com o sistema de processamento de imagens.
- Realize reconstruções 3D importando imagens confocal de pilha Z em Imaris 9.0 (software de imagem celular, ver Tabela de Materiais) e crie renderizações de superfície baseadas em intensidades de manchas: Adicione novas superfícies | Escolha | do Canal fonte Determine os parâmetros na opção suave de superfícies detalham | Determinar os parâmetros na opção limiar de intensidade absoluta | Classificar superfícies | Termine.
- Adquira dados na superfície de fibras nervosas positivas com o software de imagem celular. Selecione a | de imagem renderizada | de estatísticas | detalhado Valores específicos | Volume.
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Representative Results
Após a coloração fluorescente tripla, as fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos foram claramente rotulados com CGRP, phalloidin e LYVE1, respectivamente, na pele pelrosa e glabrou (Figura 3,4). Com o tratamento de compensação, as fibras nervosas CGRP positivas, os vasos sanguíneos fábula positivo e os vasos linfáticos LYVE1 positivos podem ser imagens em maior profundidade para adquirir as informações estruturais completas da pele (Figura 3). Quando essas estruturas teciduais foram reconstruídas em um padrão 3D, sua distribuição tornou-se mais fácil de rastrear. Foi demonstrado que as fibras nervosas CGRP-positivas passaram pelo tecido subcutâneo e derme para a epiderme. Estas fibras nervosas correram em feixes no tecido subcutâneo, ramificadas dentro da derme, e terminadas na epiderme (Figura 3). Em contraste, os vasos sanguíneos positivos da falo e os vasos linfáticos LYVE1 positivos estão distribuídos no tecido subcutâneo e na dermis (Figura 3). Geralmente, as fibras nervosas CGRP positivas corriam paralelamente ou cercavam os vasos sanguíneos e vasos linfáticos, formando uma rede 3D na pele pelrosa e glabrous.
Com a abordagem convencional, embora as fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos tenham sido claramente rotulados com CGRP, phalloidina e LYVE1 nas seções finas, a observação dessas estruturas é limitada pela espessura da fatia e não pode ser observada completamente (Figura 4). A técnica de imagem rendeu imagens aprofundadas para cada item do objeto a partir de diferentes sinais fluorescentes positivos. Após a geração da imagem, a área superficial das fibras nervosas CGRP-positivas foi adquirida através do software Imaris. Na seção com espessura de 30 μm, não houve diferença entre pele pelrosa e pele glabrous na superfície das fibras nervosas CGRP positivos. Nas seções de tecido de 300 μm de espessura, em comparação com a pele pelrosa, a área superficial das fibras nervosas CGRP positivas da pele glabrous foi significativamente aumentada (*P < 0,05, teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, n = 3, Figura 5). Portanto, para comparar a área superficial de fibras nervosas positivas com precisão, a seção de 300 μm desmatada é melhor do que a seção tradicional de 30 μm. Como comparação, é possível adquirir mais oportunidades para uma imagem 3D ideal da seção de tecido grosso com o tratamento de compensação do que na seção fina convencional.
Figura 1: Fotografias de ferramentas experimentais e passos-chave no estudo. (A) Ferramentas cirúrgicas (bisturi, tesouras, etc.). (B) A bomba para perfusão. (C) Lados plantar e dorsal da pata traseira após a perfusão. (D) As peles de sola e dorso foram removidas da pata traseira. (E) Tecidos de pele aparados. (F,G) Tecidos de pele montados com 2% de agarose a 37 °C e 4 °C. (H) microtome vibratório. (I) Tecidos de pele fixos no apoiador de corte. (J) Definir parâmetros para cortar. (K) Processo de fatiamento. (L) As seções representativas têm uma espessura de 300 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O procedimento de coloração fluorescente e a limpeza do tecido da pele. (A) Uma representação das etapas do protocolo envolvidas neste estudo. (B) Visões externas do tecido da pele antes e depois do tratamento de compensação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Correlação espacial de fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos após o tratamento de limpeza tecidual na seção de pele grossa. (A,B) Imagens representativas da seção espessa da pele plantar e dorsal do pé traseiro do rato mostram a distribuição de fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos na pele glabrous (A) e pelirço (B). (A1-A3) O painel A foi mostrado separadamente com rotulagem CGRP (A1), rotulagem pha (A2) e rotulagem LYVE1 (A3). (A4,A5; B1,B2) Os painéis (A) e (B) foram ajustados em padrão 3D e apresentados com as visualizações frontal (A4,B1) e traseira (A5,B2), respectivamente. Mesma barra de escala para todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Correlação espacial de fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos na seção de pele fina com a abordagem convencional. (A,B) Imagens representativas da seção espessa da pele plantar e dorsal do pé traseiro do rato mostram a distribuição de fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos na pele glabrous (A) e pelirna (B). (A1,A2; B1,B2): Os painéis (A) e (B) foram ajustados em padrão 3D e apresentados com as visualizações frontal (A1,B1) e traseira (A2,B2), respectivamente. Mesma barra de escala para todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Um histograma mostrando a área superficial das fibras nervosas CGRP-positivas na pele pelrosa e glabrous. (A) Na seção com espessura de 30 μm, não houve diferença entre pele pelrosa e pele glabrous na superfície das fibras nervosas CGRP-positivas. (B) Na seção com espessura de 300 μm, em comparação com a pele pelrosa, a área superficial das fibras nervosas CGRP-positivas da pele glabrous foi significativamente aumentada (*P < 0,05, n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O presente estudo fornece uma demonstração detalhada das fibras nervosas cutâneas na pele pelrosa e glabrous usando imunofluorescência em seções de tecido mais grosso com tratamento de limpeza e uma visão 3D para entender melhor a inervação da pele. O tempo de incubação de anticorpos de até 1-2 dias e um processo de limpeza noturno são importantes. Estas duas etapas-chave afetam diretamente o efeito de coloração da imunofluorescência de seções grossas. Outro problema foi levantado a partir da escolha de anticorpos, nem todos adequados para seções grossas. Especulamos que anticorpos com pesos moleculares menores podem ser ideais para a coloração de imunofluorescência de seções grossas. Assim, a dificuldade de seleção de anticorpos é uma grande limitação dessa abordagem. O presente trabalho observou as diferenças na distribuição de vasos sanguíneos, vasos linfáticos e nervos na pele pelada e sem cabelo dos ratos. Para os humanos, a estrutura da pele é muito diferente da dos roedores; esperamos usar a tecnologia de limpeza de tecidos para observar e pesquisar a pele humana no próximo passo.
Estudos anteriores têm feito muitos esforços para revelar fibras nervosas cutâneas 4,5,6,7,8. Em contraste com o estudo convencional da seção tecidual, técnicas de limpeza de tecidos, incluindo CUBIC, CLARITY e vDISCO têm sido amplamente utilizadas para estudar órgãos inteiros e corpos inteiros de animais nos últimos anos 16,17,18,19. Normalmente, é difícil rastrear as fibras nervosas cutâneas com uma estrutura longa e completa na fina seção 4,5,6,7,8; comparativamente, o tratamento de limpeza tecidual na amostra de grande porte pode levar um longo tempo 16,17,18,19. Considerando suas vantagens e desvantagens, o presente protocolo é uma escolha adequada para examinar a estrutura detalhada das fibras nervosas cutâneas dentro da seção grossa tratada de forma transparente, que é conveniente de ser observada e registrada sob microscopia confocal comum. Utilizando essa abordagem, pode-se observar fibras nervosas mais longas e cutâneas dentro da seção espessa em comparação com a seção fina, e economizar tempo experimental para o tratamento tecidual em comparação com as amostras de grande porte com limpeza tecidual.
Neste estudo, as fibras nervosas cutâneas foram rotuladas com CGRP. Esses tipos de fibras nervosas pertencem às fibras sensoriais C e Aδ, desempenhando o papel de transportar sinais nociceptivos e modular a vasodilatação12,13. Uma vez que as fibras nervosas CGRP-positivas estão localizadas perto dos vasos sanguíneos e vasos linfáticos na camada subcutânea, também foi sugerido participar da cicatrização da ferida melhorando a angiogênese e a linfógenese20,21. Semelhante aos estudos anteriores 14,20,21,22, a falooidina foi fortemente expressa nos vasos sanguíneos com este experimento de rotulagem tripla. Além disso, LYVE1 é uma glicoproteína de membrana integral e é efetivamente empregada como biomarcadora para classificar células endoteliais dérfaticas de ratos 15,23,24. Aproveitando a coloração fluorescente tripla com CGRP, fábulina e LYVE1, juntamente com a técnica de limpeza tecidual, é apresentada uma imagem de alta resolução para melhor discernimento sobre a rede de fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos na pele pelrosa e glabrous.
Observa-se que apenas as fibras nervosas CGRP positivas foram demonstradas neste estudo. Além desse tipo de fibra nervosa sensorial, este protocolo também pode ser adequado para examinar outros tipos de fibras nervosas cutâneas com os anticorpos correspondentes. Além disso, uma vez que a falooidina é altamente expressa no componente citoesquelético em células musculares lisas e endoteliais 21,22,25, além dos vasos sanguíneos, os tecidos musculares e epidérmicos também foram rotulados com falitina. No entanto, de acordo com a característica morfológica, não é difícil identificar vasos sanguíneos a partir de outros tipos de tecidos.
Em resumo, o presente protocolo explora efetivamente a inervação da pele pelrosa e glabrous em seções mais grossas, usando uma combinação de imunofluorescência com tratamento de compensação. Do ponto de vista da metodologia, seria um benefício investigar os outros tipos de fibras nervosas cutâneas e sua correlação espacial com vasos sanguíneos e vasos linfáticos no futuro.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Project Code no. CI2021A03404) e o Fundo Nacional de Inovação Interdisciplinar da Medicina Tradicional Chinesa (Project Code no. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
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