Summary
El grosor de las secciones de tejido limitó el estudio morfológico de la inervación de la piel. El presente protocolo describe una técnica única de limpieza de tejidos para visualizar las fibras nerviosas cutáneas en secciones de tejido gruesas de 300 μm bajo microscopía confocal.
Abstract
La inervación de la piel es una parte importante del sistema nervioso periférico. Aunque el estudio de las fibras nerviosas cutáneas ha progresado rápidamente, la mayor parte de la comprensión de sus características distributivas y químicas proviene de la tinción histoquímica e inmunohistoquímica convencional en secciones delgadas de tejido. Con el desarrollo de la técnica de limpieza de tejidos, ha sido posible ver las fibras nerviosas cutáneas en secciones de tejido más gruesas. El presente protocolo describe múltiples tinciones fluorescentes en secciones de tejido a un grosor de 300 μm de la piel plantar y dorsal de la pata trasera de rata, los dos sitios típicos de piel peluda y glabra. Aquí, el péptido relacionado con el gen de la calcitonina etiqueta las fibras nerviosas sensoriales, mientras que la faloidina y el receptor 1 de hialuronano endotelial de los vasos linfáticos etiquetan los vasos sanguíneos y linfáticos, respectivamente. Bajo un microscopio confocal, las fibras nerviosas sensoriales marcadas se siguieron completamente a una distancia más larga, corriendo en haces en la capa cutánea profunda y freestyle en la capa superficial. Estas fibras nerviosas corrían en paralelo o rodeaban los vasos sanguíneos, y los vasos linfáticos formaban una red tridimensional (3D) en la piel peluda y glabra. El protocolo actual proporciona un enfoque más efectivo para estudiar la inervación de la piel que los métodos convencionales existentes desde la perspectiva de la metodología.
Introduction
La piel, el órgano más grande del cuerpo, que sirve como una interfaz clave para el medio ambiente, está densamente inervada por muchas fibras nerviosas 1,2,3. Aunque la inervación de la piel ha sido ampliamente estudiada previamente con varios métodos histológicos, como la tinción en las secciones 4,5,6 de la piel y el tejido de montaje completo, la demostración efectiva detallada de las fibras nerviosas cutáneas sigue siendo un desafío 7,8. Dado esto, el presente protocolo desarrolló una técnica única para exhibir las fibras nerviosas cutáneas más claramente en la sección de tejido grueso.
Debido al límite por el grosor de las secciones, la observación de las fibras nerviosas inervadas de la piel no es lo suficientemente precisa como para representar con precisión la relación entre las fibras nerviosas del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) y los tejidos y órganos locales a partir de la información de la imagen adquirida. La aparición de la tecnología de limpieza de tejidos en 3D proporciona un método factible para resolver este problema 9,10. El rápido desarrollo de enfoques de limpieza de tejidos ha ofrecido muchas herramientas para estudiar estructuras tisulares, órganos enteros, proyecciones neuronales y animales enteros en los últimos tiempos11. El tejido transparente de la piel podría ser fotografiado en una sección mucho más gruesa por microscopía confocal para obtener los datos para visualizar las fibras nerviosas cutáneas.
En el estudio actual, la piel plantar y dorsal de un pie trasero de rata se seleccionó como los dos sitios objetivo de la piel peluda y glabra 3,4,7. Para rastrear las fibras nerviosas cutáneas a una distancia más larga, el tejido de la piel se cortó en rodajas con un grosor de 300 μm para la tinción inmunohistoquímica e histoquímica, seguida de un tratamiento de limpieza de tejidos. CGRP se utilizó para etiquetar las fibras nerviosas sensoriales12,13. Además, para resaltar las fibras nerviosas cutáneas en el fondo tisular, la faloidina y el receptor 1 de hialuronano endotelial de vasos linfáticos (LYVE1) se utilizaron para etiquetar los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos, respectivamente14,15.
Estos enfoques proporcionaron un método sencillo que se puede aplicar para demostrar una vista de alta resolución de las fibras nerviosas cutáneas y también para visualizar la correlación espacial entre las fibras nerviosas, los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos en la piel, lo que puede proporcionar mucha más información para comprender la homeostasis de la piel normal y la alteración cutánea en las condiciones patológicas.
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Protocol
El presente estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Acupuntura y Moxibustión, Academia China de Ciencias Médicas Chinas (número de referencia D2018-04-13-1). Todos los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). En este estudio se utilizaron tres ratas macho adultas (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Todos los animales fueron alojados en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h con temperatura y humedad controladas y se les permitió el libre acceso a alimentos y agua.
1. Perfusión y preparación de muestras
- Inyectar 250 mg/kg de solución de tribromoetanol (ver Tabla de Materiales) por vía intraperitoneal en la rata para inducir la eutanasia.
- Una vez que se detiene la respiración, use tijeras quirúrgicas de acero inoxidable para abrir la cavidad torácica de la rata. Utilice agujas de 20 G para perfundir a través del ventrículo cardíaco izquierdo13 a una velocidad de 3 ml/min con 100 ml de solución salina normal al 0,9% seguida de 250-300 ml de paraformaldehído al 4% en tampón de fosfato al 0,1 M (PB, pH 7,4) (Figura 1A, B).
- Después de la perfusión, use un bisturí para eliminar la piel del dorso y la suela de la pata trasera.
- Para las muestras que requieren sección congelada, posfijar los tejidos en paraformaldehído al 4% en 0,1 M PB durante 2 h; luego crioproteger los tejidos en sacarosa al 25% en PB 0,1 M durante más de 24 h a 4 °C
- Para las muestras con la sección gruesa que requiere limpieza de tejido, posfije los tejidos en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) durante 2 h; luego crioproteger los tejidos en 1x PBS a 4 °C (Figura 1C–E).
2. Tinción fluorescente triple con CGRP, faloidina y LYVE1 seguida de un tratamiento de limpieza de tejidos
NOTA: Se aplicó tinción fluorescente triple con CGRP, faloidina y LYVE1 para revelar las fibras nerviosas, los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos en la piel peluda y glabra en secciones de tejido con un grosor de 300 μm después del tratamiento de limpieza de tejidos.
- Prepare la agarosa al 2% en 1x PBS calentando en un micro-horno durante 2 min hasta que la agarosa se disuelva (ver Tabla de Materiales).
- Después del lavado, incruste los tejidos de la piel en agarosa al 2% a 37 ° C y colóquelos dentro de la nevera para enfriarlos (Figura 1F, G).
- Fije el tejido montado en el microtomo vibratorio con el agua helada y córtelos a un grosor de 500 μm en la dirección transversal. Utilice los siguientes parámetros para ajustar la cortadora de vibración y terminar el corte: velocidad, 0,50 mm/s, y amplitud, 1,5 mm (Figura 1H-K).
- Después de cortar, retire la agarosa de las secciones y guárdelas en una placa de seis pocillos con 1x PBS (pH 7.4) (Figura 1L).
- Incubar las secciones de tejido en una solución de Tritón X-100 al 2% en 1x PBS (TriX-PB) durante la noche a 4 °C. Consulte la Figura 2 para el siguiente procedimiento.
- Coloque las secciones de tejido en el tampón de bloqueo y gire a 72 rpm en el agitador durante la noche a 4 °C.
NOTA: La composición del tampón de bloqueo es 10% de suero de burro normal, 1% de Triton-X 100 y 0.2% de azida de sodio en 1x PBS (ver Tabla de Materiales). - Transfiera las secciones de tejido a la solución que contiene los anticuerpos primarios del anticuerpo monoclonal de ratón anti-CGRP (1:500) y el anticuerpo anti-LYVE1 policlonal de oveja (1:500) en tampón de dilución en el tubo de la microcentrífuga (ver Tabla de materiales), y gire sobre el agitador durante 2 días a 4 °C.
NOTA: La composición tampón de dilución es 1% de suero de burro normal, 0.2% tritón-X 100 y 0.2% de azida de sodio en 1x PBS. - Lave las secciones de pañuelos dos veces con tampón de lavado a temperatura ambiente, luego manténgalas en el agitador durante la noche a 4 ° C en el tampón de lavado.
NOTA: La composición del tampón de lavado es de 0.2% Triton-X 100 en 0.1 M PB (pH 7.4). - Al día siguiente, transfiera las secciones de tejido a la solución mixta que contiene los anticuerpos secundarios de Burro anti-ratón IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) y burro anti-oveja IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), así como Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) (ver Tabla de Materiales) en un tubo de microcentrífuga y gire a 72 rpm en el agitador durante 5 h a 4 °C.
- Lave las secciones de tejido en una placa de seis pocillos con tampón de lavado durante 1 h, dos veces, a temperatura ambiente. Mantenga las secciones de tejido en el tampón de lavado en el agitador durante la noche a 4 °C.
- Transfiera las secciones de tejido al reactivo de limpieza de tejidos (consulte la Tabla de materiales, su volumen fue cinco veces mayor que el volumen de la muestra) y gire a 60 rpm en el agitador suavemente durante 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: Después de este tratamiento, las secciones de tejido se vuelven claras (Figura 2B). - Monte los tejidos despejados en el portaobjetos, rodee los tejidos con un espaciador y pegue el espacio con un reactivo de limpieza de tejido fresco y un recubierto.
3. Triple tinción fluorescente con CGRP, faloidina y LYVE1 siguiendo el enfoque convencional
NOTA: A modo de comparación, se realizó la misma tinción en secciones de tejido con un espesor de 30 μm siguiendo técnicas convencionales.
- Cortar las secciones de tejido a 30 μm en un microtomo en la dirección transversal y montarlas en la diapositiva.
- Añadir solución bloqueadora con suero de burro normal al 3% y Tritón X-100 al 0,3% en PB de 0,1 M e incubar las secciones durante 30 min a temperatura ambiente.
- Retire la solución bloqueadora e incube las secciones con la solución que contiene los anticuerpos primarios del anti-CGRP monoclonal de ratón (1:500) y el anticuerpo anti-LYVE1 policlonal de oveja (1:500) en tampón de dilución durante la noche a 4 °C.
- Al día siguiente, lavar las secciones de tejido con 0,1 M PB (pH 7,4) tres veces, añadir la solución mixta que contiene los anticuerpos secundarios de burro anti-ratón IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) y burro anti-oveja IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), así como Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) en las secciones e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
- Antes de la observación microscópica, lave las secciones en 0.1 M PB (pH 7.4) tres veces, luego cúbralas con fundas en glicerina al 50%.
4. Imágenes y análisis
- Observe las muestras teñidas bajo un microscopio fluorescente y luego tome las imágenes con un microscopio confocal.
- Capture 30 imágenes (pilas Z), cada una en fotogramas de 10 μm, de cada sección de 300 μm de espesor e integre una sola imagen enfocada utilizando un procesador de imágenes del sistema de microscopía confocal (consulte la Tabla de materiales).
- Realice los siguientes pasos en el software de procesamiento de imágenes de la configuración confocal para el análisis tridimensional (3D): Establecer plano focal de inicio | Establecer | de plano focal final Establecer el tamaño de los pasos | Elija el | Patrón de profundidad captura de imágenes | Serie Z.
NOTA: Las longitudes de onda de excitación y emisión de las señales de fluorescencia azul fueron de 401 nm y 421 nm, respectivamente. Las longitudes de onda de excitación y emisión de las señales de fluorescencia verde fueron de 499 nm y 519 nm, respectivamente. Las longitudes de onda de excitación y emisión de las señales de fluorescencia roja fueron de 591 nm y 618 nm, respectivamente. 152 μm es el diámetro del agujero de alfiler confocal (lente de objetivo 10x, NA: 0,4). La resolución de captura de imagen fue de 1024 × 1024 píxeles.
- Realice los siguientes pasos en el software de procesamiento de imágenes de la configuración confocal para el análisis tridimensional (3D): Establecer plano focal de inicio | Establecer | de plano focal final Establecer el tamaño de los pasos | Elija el | Patrón de profundidad captura de imágenes | Serie Z.
- Para las muestras convencionales (paso 3), capture 30 imágenes (pilas Z) en fotogramas de 1 μm de cada sección de 30 μm de espesor y trate estas imágenes como se mencionó anteriormente (pasos 4.1-4.2).
- Demuestre las imágenes en el patrón de reconstrucción 3D con el sistema de procesamiento de imágenes.
- Realice reconstrucciones 3D importando imágenes confocales de pila Z en Imaris 9.0 (software de imágenes de celdas, consulte Tabla de materiales) y cree representaciones de superficies basadas en intensidades de mancha: Agregue nuevas superficies | Elija el canal de origen | Determinar los parámetros en la opción suavizado de Detalle de superficies | Determine los parámetros en la opción de umbral de Intensidad absoluta | Clasificar superficies | Terminar.
- Adquiera datos en el área de superficie de las fibras nerviosas positivas con el software de imágenes celulares. Seleccione la imagen renderizada | estadísticas | | detallado Valores específicos | Volumen.
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Representative Results
Después de la triple tinción fluorescente, las fibras nerviosas, los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos se etiquetaron claramente con CGRP, faloidina y LYVE1, respectivamente, en la piel peluda y glabra (Figura 3,4). Con el tratamiento de limpieza, las fibras nerviosas positivas para CGRP, los vasos sanguíneos positivos para faloidina y los vasos linfáticos positivos para LYVE1 se pueden obtener imágenes a mayor profundidad para adquirir la información estructural completa de la piel (Figura 3). Cuando estas estructuras tisulares se reconstruyeron aún más en un patrón 3D, su distribución se hizo más fácil de rastrear. Se demostró que las fibras nerviosas positivas para CGRP pasaron a través del tejido subcutáneo y la dermis a la epidermis. Estas fibras nerviosas corrían en haces en el tejido subcutáneo, se ramificaban dentro de la dermis y terminaban en la epidermis (Figura 3). Por el contrario, los vasos sanguíneos positivos para faloidina y los vasos linfáticos positivos para LYVE1 se distribuyen en el tejido subcutáneo y la dermis (Figura 3). En general, las fibras nerviosas positivas para CGRP corrían paralelas o rodeaban los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos, formando una red 3D en la piel peluda y glabra.
Con el enfoque convencional, aunque las fibras nerviosas, los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos estaban claramente marcados con CGRP, faloidina y LYVE1 en las secciones delgadas, la observación de estas estructuras está limitada por el grosor de la rebanada y no se puede observar completamente (Figura 4). La técnica de imagen renderizó imágenes en profundidad para cada elemento del objeto a partir de diferentes señales fluorescentes positivas. Después de generar la imagen, el área de superficie de las fibras nerviosas positivas para CGRP se adquirió a través del software Imaris. En la sección con un grosor de 30 μm, no hubo diferencia entre la piel peluda y la piel glabra en el área de superficie de las fibras nerviosas positivas para CGRP. En las secciones de tejido grueso de 300 μm, en comparación con la piel peluda, el área de superficie de las fibras nerviosas positivas para CGRP de la piel glabra aumentó significativamente (*P < 0,05, prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, n = 3, Figura 5). Por lo tanto, para comparar el área de superficie de las fibras nerviosas positivas con precisión, la sección despejada de 300 μm es mejor que la sección tradicional de 30 μm. A modo de comparación, es posible adquirir más oportunidades para una imagen 3D ideal de la sección de tejido grueso con el tratamiento de limpieza que en la sección delgada convencional.
Figura 1: Fotografías de herramientas experimentales y pasos clave en el estudio. (A) Herramientas quirúrgicas (bisturí, tijeras, etc.). (B) La bomba para perfusión. (C) Lados plantar y dorsal de la pata trasera después de la perfusión. (D) Las pieles de la planta y el dorso se retiraron de la pata trasera. (E) Tejidos cutáneos recortados. (F,G) Tejidos cutáneos montados con agarosa al 2% a 37 °C y 4 °C. (H) Microtomo vibratorio. (I) Tejidos cutáneos fijos en el soporte de corte. (J) Establecer parámetros para el corte. (K) Proceso de loncheado. (L) Las secciones representativas tienen un grosor de 300 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El procedimiento de tinción fluorescente y la limpieza del tejido de la piel. (A) Una representación de los pasos del protocolo involucrados en este estudio. (B) Vistas externas del tejido de la piel antes y después del tratamiento de limpieza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Correlación espacial de fibras nerviosas, vasos sanguíneos y vasos linfáticos después del tratamiento de limpieza de tejido en la sección de piel gruesa. (A, B) Las imágenes representativas de la sección gruesa de la piel plantar y dorsal del pie trasero de rata muestran la distribución de fibras nerviosas, vasos sanguíneos y vasos linfáticos en la piel glabra (A) y peluda (B). (A1-A3) El panel A se mostró por separado con etiquetado CGRP (A1), etiquetado Pha (A2) y etiquetado LYVE1 (A3). (A4,A5; B1,B2) Los paneles (A) y (B) se ajustaron en un patrón 3D y se mostraron con las vistas delantera (A4, B1) y trasera (A5, B2), respectivamente. Misma barra de escala para todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Correlación espacial de las fibras nerviosas, los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos en la sección delgada de la piel con el enfoque convencional. (A, B) Las imágenes representativas de la sección gruesa de la piel plantar y dorsal del pie trasero de rata muestran la distribución de las fibras nerviosas, los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos en la piel glabra (A) y peluda (B). (A1,A2; B1, B2): Los paneles (A) y (B) se ajustaron en un patrón 3D y se mostraron con las vistas frontal (A1, B1) y posterior (A2, B2), respectivamente. Misma barra de escala para todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Un histograma que muestra el área de superficie de las fibras nerviosas positivas para CGRP en la piel peluda y glabra. (A) En la sección con un grosor de 30 μm, no hubo diferencia entre la piel peluda y la piel glabra en el área de superficie de las fibras nerviosas positivas para CGRP. (B) En la sección con un grosor de 300 μm, en comparación con la piel peluda, el área de superficie de las fibras nerviosas positivas para CGRP de la piel glabra aumentó significativamente (*P < 0,05, n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El presente estudio proporciona una demostración detallada de las fibras nerviosas cutáneas en la piel peluda y glabra mediante el uso de inmunofluorescencia en secciones de tejido más gruesas con tratamiento de limpieza y una vista 3D para comprender mejor la inervación de la piel. El tiempo de incubación de anticuerpos de hasta 1-2 días y un proceso de limpieza nocturno son importantes. Estos dos pasos clave afectan directamente el efecto de tinción de inmunofluorescencia de secciones gruesas. Otro problema surgió de la elección de los anticuerpos, que no todos son adecuados para secciones gruesas. Especulamos que los anticuerpos con pesos moleculares más pequeños podrían ser ideales para la tinción de inmunofluorescencia de secciones gruesas. Por lo tanto, la dificultad de la selección de anticuerpos es una limitación importante de este enfoque. El presente trabajo había observado las diferencias en la distribución de los vasos sanguíneos, los vasos linfáticos y los nervios en la piel peluda y sin pelo de las ratas. Para los humanos, la estructura de la piel es muy diferente de la de los roedores; esperamos utilizar la tecnología de limpieza de tejidos para observar e investigar la piel humana en el siguiente paso.
Estudios previos han hecho muchos esfuerzos para revelar las fibras nerviosas cutáneas 4,5,6,7,8. En contraste con el estudio convencional de la sección de tejido, las técnicas de limpieza de tejidos que incluyen CUBIC, CLARITY y vDISCO se han utilizado ampliamente para estudiar órganos enteros y cuerpos enteros de animales en los últimos años 16,17,18,19. Por lo general, es difícil rastrear las fibras nerviosas cutáneas con una estructura larga y completa en la sección delgada 4,5,6,7,8; comparativamente, el tratamiento de limpieza de tejidos en la muestra de gran tamaño puede llevar mucho tiempo 16,17,18,19. Teniendo en cuenta sus ventajas y desventajas, el presente protocolo es una opción adecuada para examinar la estructura detallada de las fibras nerviosas cutáneas dentro de la sección gruesa tratada de manera transparente, que es conveniente observar y registrar bajo microscopía confocal ordinaria. Utilizando este enfoque, se pueden observar fibras nerviosas cutáneas más largas dentro de la sección gruesa en comparación con la sección delgada, y ahorrar tiempo experimental para el tratamiento del tejido en comparación con las muestras de gran tamaño con limpieza de tejido.
En este estudio, las fibras nerviosas cutáneas se etiquetaron con CGRP. Este tipo de fibras nerviosas pertenecen a las fibras sensoriales C y Aδ, desempeñando el papel de transportar señales nociceptivas y modular la vasodilatación12,13. Dado que las fibras nerviosas positivas para CGRP se encuentran cerca de los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos en la capa subcutánea, también se sugirió participar en la cicatrización de heridas mediante la mejora de la angiogénesis y la linfangiogénesis20,21. Similar a estudios anteriores 14,20,21,22, la faloidina se expresó fuertemente en los vasos sanguíneos con este experimento de triple etiquetado. Además, LYVE1 es una glicoproteína de membrana integral y se emplea eficazmente como biomarcador para la clasificación de células endoteliales linfáticas dérmicas de rata 15,23,24. Aprovechando la triple tinción fluorescente con CGRP, faloidina y LYVE1, junto con la técnica de limpieza de tejidos, se presenta una imagen de alta resolución para una mejor comprensión de la red de fibras nerviosas, vasos sanguíneos y vasos linfáticos en la piel peluda y glabra.
Cabe señalar que solo las fibras nerviosas positivas para CGRP se demostraron en este estudio. Además de este tipo de fibra nerviosa sensorial, este protocolo también puede ser adecuado para examinar otros tipos de fibras nerviosas cutáneas con los anticuerpos correspondientes. Además, dado que la faloidina está altamente expresada en el componente citoesquelético en las células musculares lisas y endoteliales 21,22,25, además de los vasos sanguíneos, los tejidos musculares y epidérmicos también fueron marcados con faloidina. Sin embargo, de acuerdo con la característica morfológica, no es difícil identificar los vasos sanguíneos del otro tipo de tejidos.
En resumen, el presente protocolo explora eficazmente la inervación de la piel peluda y glabra en secciones más gruesas mediante el uso de una combinación de inmunofluorescencia con tratamiento de limpieza. Desde la perspectiva de la metodología, sería beneficioso investigar los otros tipos de fibras nerviosas cutáneas y su correlación espacial con los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos en el futuro.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Fondo de Innovación de la Academia China de Ciencias Médicas (Código de Proyecto no. CI2021A03404) y el Fondo Nacional de Innovación Interdisciplinaria de Medicina Tradicional China (Código del Proyecto no. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
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