Summary
De dikte van weefselsecties beperkte de morfologische studie van de huidinternervatie. Het huidige protocol beschrijft een unieke weefselzuiveringstechniek om cutane zenuwvezels te visualiseren in dikke weefselsecties van 300 μm onder confocale microscopie.
Abstract
Huid innervatie is een belangrijk onderdeel van het perifere zenuwstelsel. Hoewel de studie van de huidzenuwvezels snel is gevorderd, komt het grootste deel van het begrip van hun distributieve en chemische kenmerken van conventionele histochemische en immunohistochemische kleuring op dunne weefselsecties. Met de ontwikkeling van de weefselzuiveringstechniek is het mogelijk geworden om de huidzenuwvezels op dikkere weefselsecties te bekijken. Het huidige protocol beschrijft meerdere fluorescerende kleuringen op weefselsecties met een dikte van 300 μm van de plantaire en dorsale huid van de achtervoet van ratten, de twee typische harige en glabreuze huidplaatsen. Hier labelt het calcitonine-gen-gerelateerde peptide de sensorische zenuwvezels, terwijl falloïdine en lymfevat endotheliale hyaluronaatreceptor 1 respectievelijk de bloed- en lymfevaten labelen. Onder een confocale microscoop werden de gelabelde sensorische zenuwvezels volledig op langere afstand gevolgd, lopend in bundels in de diepe cutane laag en freestyle in de oppervlakkige laag. Deze zenuwvezels liepen parallel aan of omringden de bloedvaten en lymfevaten vormden een driedimensionaal (3D) netwerk in de harige en glazige huid. Het huidige protocol biedt een effectievere benadering voor het bestuderen van de innervatie van de huid dan de bestaande conventionele methoden vanuit het methodologische perspectief.
Introduction
De huid, het grootste orgaan in het lichaam, dat dient als een belangrijke interface naar de omgeving, wordt dicht geïnnerveerd door vele zenuwvezels 1,2,3. Hoewel de innervatie van de huid eerder op grote schaal is bestudeerd met verschillende histologische methoden, zoals kleuring op de huid- en weefselsecties 4,5,6, is de gedetailleerde effectieve demonstratie van huidzenuwvezels nog steeds een uitdaging 7,8. Daarom ontwikkelde het huidige protocol een unieke techniek om cutane zenuwvezels duidelijker te vertonen in het dikke weefselgedeelte.
Vanwege de limiet door de dikte van secties, is de observatie van geïnnerveerde huidzenuwvezels niet nauwkeurig genoeg om de relatie tussen calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) zenuwvezels en lokale weefsels en organen nauwkeurig weer te geven uit de verkregen beeldinformatie. De opkomst van 3D-weefselopruimingstechnologie biedt een haalbare methode om dit probleem op te lossen 9,10. De snelle ontwikkeling van weefselzuiveringsbenaderingen heeft de afgelopen tijd veel hulpmiddelen geboden voor het bestuderen van weefselstructuren, hele organen, neuronale projecties en hele dieren11. Het transparante huidweefsel kan in een veel dikker gedeelte worden afgebeeld door confocale microscopie om de gegevens te verkrijgen om huidzenuwvezels te visualiseren.
In de huidige studie werd de plantaire en dorsale huid van een rat achtervoet geselecteerd als de twee doellocaties van de harige en glabreuze huid 3,4,7. Om de huidzenuwvezels op een langere afstand te traceren, werd het huidweefsel gesneden op de dikte van 300 μm voor immunohistochemische en histochemische kleuring, gevolgd door weefselzuiveringsbehandeling. CGRP werd gebruikt om de sensorische zenuwvezels12,13 te labelen. Om de huidzenuwvezels op de weefselachtergrond te benadrukken, werden falloïdine en lymfevat endotheliale hyaluronaatreceptor 1 (LYVE1) verder gebruikt om de bloedvaten en lymfevaten te labelen, respectievelijk14,15.
Deze benaderingen leverden een eenvoudige methode op die kan worden toegepast om een hoge resolutiebeeld van de huidzenuwvezels te demonstreren en ook om de ruimtelijke correlatie tussen de zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten in de huid te visualiseren, wat veel meer informatie kan opleveren om de homeostase van de normale huid en de cutane verandering onder de pathologische omstandigheden te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De huidige studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Instituut voor Acupunctuur en Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referentienummer D2018-04-13-1). Alle procedures werden uitgevoerd volgens de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Drie volwassen mannelijke ratten (Sprague-Dawley, gewicht 230 ± 15 g) werden gebruikt in deze studie. Alle dieren werden gehuisvest in een 12 uur licht/donker cyclus met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid en vrije toegang tot voedsel en water.
1. Perfusie en monstervoorbereiding
- Injecteer 250 mg/kg tribroomethanoloplossing (zie materiaaltabel) intraperitoneaal in de rat om euthanasie te induceren.
- Zodra de ademhaling stopt, gebruikt u een roestvrijstalen chirurgische schaar om de thoracale holte van de rat te openen. Gebruik naalden van 20 G om te perfuseren via de linker hartkamer13 met een snelheid van 3 ml /min met 100 ml van 0,9% normale zoutoplossing gevolgd door 250-300 ml 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB, pH 7,4) (figuur 1A, B).
- Gebruik na perfusie een scalpel om de huid van de dorsum en zool van de achterpoot te verwijderen.
- Voor de monsters die een bevroren sectie nodig hebben, moet u de weefsels na 2 uur fixeren in 4% paraformaldehyde in 0,1 M PB; vervolgens cryoprotectie de weefsels in 25% sucrose in 0,1 M PB gedurende meer dan 24 uur bij 4 °C
- Voor de monsters met het dikke gedeelte dat weefselreiniging vereist, fixeren de weefsels na 4% paraformaldehyde in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS) gedurende 2 uur; cryoprotecteer vervolgens de weefsels in 1x PBS bij 4 °C (figuur 1C-E).
2. Drievoudig fluorescerende kleuring met CGRP, falloidine en LYVE1 gevolgd door weefselzuiveringsbehandeling
OPMERKING: Drievoudig fluorescerende kleuring met CGRP, falloidine en LYVE1 werd aangebracht om de zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten in de harige en glazige huid te onthullen op weefselsecties met een dikte van 300 μm na weefselzuiveringsbehandeling.
- Bereid 2% agarose in 1x PBS door 2 min in een micro-oven te verhitten tot de agarose oplost (zie Materiaaltabel).
- Na het wassen, integreer de huidweefsels in 2% agarose bij 37 °C en plaats ze in de koelbox voor koeling (figuur 1F, G).
- Bevestig het gemonteerde weefsel op de trillende microtoom met het ijswater en snijd ze op een dikte van 500 μm in de transversale richting. Gebruik de volgende parameters om de trilsnijmachine in te stellen en het snijden af te ronden: snelheid, 0,50 mm/s en amplitude, 1,5 mm (figuur 1H-K).
- Verwijder na het snijden de agarose uit de secties en bewaar ze in een zesputtenplaat met 1x PBS (pH 7,4) (figuur 1L).
- Incubeer de weefselsecties in een oplossing van 2% Triton X-100 in 1x PBS (TriX-PB) 's nachts bij 4 °C. Zie figuur 2 voor de volgende procedure.
- Plaats de weefselsecties in de blokkerende buffer en draai met 72 rpm op de shaker een nacht bij 4 °C.
OPMERKING: De blokkerende buffersamenstelling is 10% normaal ezelserum, 1% Triton-X 100 en 0,2% natriumazide in 1x PBS (zie Materiaaltabel). - Breng de weefselsecties over in de oplossing die de primaire antilichamen van monoklonale anti-CGRP bij muizen (1:500) en schapen polyklonaal anti-LYVE1-antilichaam (1:500) bevat in verdunningsbuffer in de microcentrifugebuis (zie Materiaaltabel) en draai gedurende 2 dagen op de shaker bij 4 °C.
OPMERKING: De verdunningsbuffersamenstelling is 1% normaal ezelserum, 0,2% Triton-X 100 en 0,2% natriumazide in 1x PBS. - Was de weefselsecties twee keer met wasbuffer op kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens een nacht op de shaker bij 4 °C in de wasbuffer.
OPMERKING: De wasbuffersamenstelling is 0,2% Triton-X 100 in 0,1 M PB (pH 7,4). - Breng de volgende dag de weefselsecties over in de gemengde oplossing met de secundaire antilichamen van ezel-antimuis IgG H &L Alexa-Flour488 (1:500) en ezel-anti-schapen IgG H &L Alexa-Flour405 (1:500), evenals Alexa-Flour594 falloidin (1:1000) (zie Materiaaltafel) in een microcentrifugebuis en draai met 72 tpm op de shaker gedurende 5 uur bij 4 ° C.
- Was de weefselsecties in een zesputtenplaat met wasbuffer gedurende 1 uur, tweemaal, bij kamertemperatuur. Bewaar de weefseldelen in de wasbuffer op de shaker een nacht bij 4 °C.
- Breng de weefselsecties over in het weefselzuiveringsreagens (zie materiaaltabel, het volume was vijf keer meer dan het monstervolume) en draai met 60 tpm voorzichtig op de shaker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Na deze behandeling worden de weefselsecties duidelijk (figuur 2B). - Monteer de opgeruimde weefsels op de dia, omcirkel de weefsels met een afstandhouder en plak de opening met vers weefselzuiveringsreagens en coverslip.
3. Drievoudige fluorescerende kleuring met CGRP, falloidine en LYVE1 volgens de conventionele aanpak
OPMERKING: Ter vergelijking: dezelfde kleuring werd uitgevoerd op weefselsecties met een dikte van 30 μm volgens conventionele technieken.
- Snijd de weefselsecties op 30 μm op een microtoom in de transversale richting en monteer ze op de dia.
- Voeg de blokkerende oplossing toe met 3% normaal ezelserum en 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PB en incubeer de secties gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de blokkerende oplossing en incubeer de secties met de oplossing die de primaire antilichamen van monoklonale anti-CGRP (1:500) en schapen polyklonaal anti-LYVE1-antilichaam (1:500) bevat in verdunningsbuffer 's nachts bij 4 °C.
- Was de volgende dag de weefselsecties met 0,1 M PB (pH 7,4) drie keer, voeg de gemengde oplossing toe die de secundaire antilichamen van ezel antimuis IgG H &L Alexa-Flour488 (1: 500) en ezel anti-schaap IgG H &L Alexa-Flour405 (1:500), evenals Alexa-Flour594 falloidine (1:1000) op de secties en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was vóór microscopische observatie de secties drie keer in 0,1 M PB (pH 7,4) en bedek ze vervolgens met coverslips in 50% glycerine.
4. Beeldvorming en analyses
- Observeer de gekleurde monsters onder een fluorescerende microscoop en maak de beelden vervolgens met een confocale microscoop.
- Leg 30 beelden (Z-stacks) vast, elk in frames van 10 μm, van elke 300 μm dikke sectie en integreer een enkele in-focus afbeelding met behulp van een beeldprocessor van het confocale microscopiesysteem (zie Materiaaltabel).
- Voer de volgende stappen uit in de beeldverwerkingssoftware van de confocale opstelling voor driedimensionale (3D)-analyse: Start Focal Plane | | van het eindpuntsvlak instellen Stapgrootte instellen | Kies dieptepatroon | | voor het vastleggen van afbeeldingen Z-serie.
OPMERKING: De excitatie- en emissiegolflengten van blauwe fluorescentiesignalen waren respectievelijk 401 nm en 421 nm. Excitatie- en emissiegolflengten van groene fluorescentiesignalen waren respectievelijk 499 nm en 519 nm. Excitatie- en emissiegolflengten van rode fluorescentiesignalen waren respectievelijk 591 nm en 618 nm. 152 μm is de diameter van het confocale gaatje (10x objectieflens, NA: 0,4). De resolutie voor het vastleggen van afbeeldingen was 1024 × 1024 pixels.
- Voer de volgende stappen uit in de beeldverwerkingssoftware van de confocale opstelling voor driedimensionale (3D)-analyse: Start Focal Plane | | van het eindpuntsvlak instellen Stapgrootte instellen | Kies dieptepatroon | | voor het vastleggen van afbeeldingen Z-serie.
- Voor de conventionele monsters (stap 3), leg 30 beelden (Z-stacks) vast in 1 μm frames van elke 30 μm dikke sectie en behandel deze beelden verder zoals hierboven vermeld (stappen 4.1-4.2).
- Demonstreer de afbeeldingen in het patroon van 3D-reconstructie met het beeldverwerkingssysteem.
- Voer 3D-reconstructies uit door confocale Z-stack-afbeeldingen te importeren in Imaris 9.0 (celbeeldvormingssoftware, zie Materiaaltabel) en maak oppervlakteweergaven op basis van vlekintensiteiten: voeg nieuwe oppervlakken toe | Kies bronkanaal | Bepaal de parameters in de vloeiende optie van Surfaces Detail | Bepaal de parameters in de drempeloptie absolute intensiteit | Oppervlakken classificeren | Afmaken.
- Verkrijg gegevens in het oppervlak van positieve zenuwvezels met de celbeeldvormingssoftware. Selecteer de gerenderde afbeelding | Statistieken | Gedetailleerde | Specifieke waarden | Volume.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na drievoudige fluorescerende kleuring werden de zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten duidelijk gelabeld met respectievelijk CGRP, falloidine en LYVE1 in de behaarde en glabrous huid (figuur 3,4). Met de clearingbehandeling kunnen de CGRP-positieve zenuwvezels, falloidine-positieve bloedvaten en LYVE1-positieve lymfevaten op grotere diepte worden afgebeeld om de volledige structurele informatie van de huid te verkrijgen (figuur 3). Toen deze weefselstructuren verder werden gereconstrueerd in een 3D-patroon, werd hun verdeling gemakkelijker te traceren. Er werd aangetoond dat de CGRP-positieve zenuwvezels door het onderhuidse weefsel en de dermis naar de epidermis gingen. Deze zenuwvezels liepen in bundels in het onderhuidse weefsel, vertakt in de dermis en eindigden in de opperhuid (figuur 3). Daarentegen worden falloïdine-positieve bloedvaten en LYVE1-positieve lymfevaten verdeeld in het onderhuidse weefsel en de dermis (figuur 3). Over het algemeen liepen de CGRP-positieve zenuwvezels parallel aan of omringden ze de bloedvaten en lymfevaten en vormden ze een 3D-netwerk in de harige en glabrous huid.
Met de conventionele benadering, hoewel de zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten duidelijk werden gelabeld met CGRP, falloidine en LYVE1 in de dunne secties, wordt de observatie van deze structuren beperkt door de plakdikte en kan deze niet volledig worden waargenomen (figuur 4). De beeldvormingstechniek leverde diepgaande beelden op voor elk objectitem van verschillende positieve fluorescerende signalen. Na het genereren van het beeld werd het oppervlak van CGRP-positieve zenuwvezels verkregen via de Imaris-software. In de sectie met een dikte van 30 μm was er geen verschil tussen de behaarde huid en de glazige huid in het oppervlak van CGRP-positieve zenuwvezels. In de 300 μm dikke weefselsecties, vergeleken met de behaarde huid, was het oppervlak van CGRP-positieve zenuwvezels van glabrous huid significant toegenomen (*P < 0,05, Kruskal-Wallis niet-parametrische test, n = 3, figuur 5). Om het oppervlak van positieve zenuwvezels nauwkeurig te vergelijken, is het 300 μm vrijgemaakte gedeelte daarom beter dan het traditionele gedeelte van 30 μm. Ter vergelijking: met de clearingbehandeling is het mogelijk om uit het dikke weefselgedeelte meer mogelijkheden te verwerven voor een ideaal 3D-beeld dan in het conventionele dunne gedeelte.
Figuur 1: Foto's van experimentele gereedschappen en belangrijke stappen in het onderzoek. (A) Chirurgische hulpmiddelen (scalpel, schaar, enz.). (B) De pomp voor perfusie. (C) Plantaire en dorsale zijden van de achterpoot na perfusie. (D) De huiden van de tong en het dorsum werden van de achterpoot verwijderd. (E) Getrimde huidweefsels. (F,G) Gemonteerde huidweefsels met 2% agarose bij 37 °C en 4 °C. (H) Trillend microtoom. (I) Vaste huidweefsels op de snijsteun. (J) Stel parameters in voor het snijden. (K) Proces van snijden. (L) Representatieve secties hebben een dikte van 300 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De fluorescerende kleuringsprocedure en het opruimen van huidweefsel. (A) Een weergave van de protocolstappen die bij dit onderzoek betrokken zijn. (B) Buitenaanzichten van huidweefsel voor en na de opruimbehandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Ruimtelijke correlatie van zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten na weefselzuiveringsbehandeling op het dikke huidgedeelte. (A, B) Representatieve beelden van het dikke deel van de plantaire en dorsale huid van de achtervoet van de rat tonen de verdeling van zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten in de glabrouze (A) en harige (B) huid. (A1-A3) Paneel A werd afzonderlijk getoond met CGRP-labeling (A1), Pha-labeling (A2) en LYVE1-labeling (A3). (A4,A5; B1,B2) Panelen (A) en (B) werden aangepast in een 3D-patroon en weergegeven met respectievelijk de voorste (A4,B1) en achteraanzichten (A5,B2). Dezelfde schaalbalk voor alle panelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Ruimtelijke correlatie van zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten op het dunne huidgedeelte met de conventionele benadering. (A, B) Representatieve afbeeldingen van het dikke gedeelte van de plantaire en dorsale huid van de achtervoet van de rat tonen de verdeling van zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten in de glabrouze (A) en harige (B) huid. (A1,A2; B1,B2): Panelen (A) en (B) werden aangepast in een 3D-patroon en getoond met respectievelijk de voorste (A1,B1) en achteraanzichten (A2,B2). Dezelfde schaalbalk voor alle panelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Een histogram met het oppervlak van CGRP-positieve zenuwvezels in de harige en glazige huid. (A) In het gedeelte met een dikte van 30 μm was er geen verschil tussen de harige huid en de glabrous huid in het oppervlak van CGRP-positieve zenuwvezels. (B) In het gedeelte met een dikte van 300 μm, vergeleken met de behaarde huid, was het oppervlak van CGRP-positieve zenuwvezels van glabrous huid significant verhoogd (*P < 0,05, n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige studie biedt een gedetailleerde demonstratie van de huidzenuwvezels in de behaarde en glabrous huid door immunofluorescentie te gebruiken op dikkere weefselsecties met clearingbehandeling en een 3D-weergave om de binnenkant van de huid beter te begrijpen. De antilichaamincubatietijd van maximaal 1-2 dagen en een nachtelijk reinigingsproces zijn belangrijk. Deze twee belangrijke stappen hebben direct invloed op het immunofluorescentiekleuringseffect van dikke delen. Een ander probleem werd opgeworpen door de keuze van antilichamen, die niet allemaal geschikt zijn voor dikke secties. We speculeren dat antilichamen met kleinere molecuulgewichten ideaal kunnen zijn voor immunofluorescentiekleuring van dikke delen. De moeilijkheid van antilichaamselectie is dus een belangrijke beperking van deze aanpak. Het huidige werk had de verschillen waargenomen in de verdeling van bloedvaten, lymfevaten en zenuwen op de harige en haarloze huid van ratten. Voor mensen is de huidstructuur heel anders dan die van knaagdieren; we kijken ernaar uit om weefselzuiveringstechnologie te gebruiken om de menselijke huid in de volgende stap te observeren en te onderzoeken.
Eerdere studies hebben veel inspanningen geleverd om huidzenuwvezels 4,5,6,7,8 te onthullen. In tegenstelling tot de conventionele weefselsectiestudie zijn weefselzuiveringstechnieken, waaronder CUBIC, CLARITY en vDISCO, de afgelopen jaren op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van hele organen en hele lichamen van dieren 16,17,18,19. Meestal is het moeilijk om de huidzenuwvezels te traceren met een lange en volledige structuur in de dunne sectie 4,5,6,7,8; ter vergelijking: de behandeling van weefselzuivering op het grote monster kan lang duren 16,17,18,19. Gezien hun voor- en nadelen is het huidige protocol een goede keuze voor het onderzoeken van de gedetailleerde structuur van de huidzenuwvezels binnen het transparant behandelde dikke gedeelte, dat handig is om te worden waargenomen en geregistreerd onder gewone confocale microscopie. Met behulp van deze aanpak kan men langere huidzenuwvezels waarnemen in het dikke gedeelte in vergelijking met het dunne gedeelte en experimentele tijd besparen voor de weefselbehandeling in vergelijking met de grote monsters met weefselopruiming.
In deze studie werden de huidzenuwvezels gelabeld met CGRP. Dit soort zenuwvezels behoren tot C- en Aδ-sensorische vezels en spelen de rol van het transporteren van nociceptieve signalen en het moduleren van vasodilatatie12,13. Aangezien CGRP-positieve zenuwvezels zich dicht bij bloedvaten en lymfevaten in de onderhuidse laag bevinden, werd ook voorgesteld om deel te nemen aan wondgenezing door angiogenese en lymfangiogenese te verbeteren20,21. Vergelijkbaar met eerdere studies 14,20,21,22, werd falloïdine sterk uitgedrukt in de bloedvaten met dit triple-labeling experiment. Bovendien is LYVE1 een integraal membraanglycoproteïne en wordt het effectief gebruikt als biomarker voor het sorteren van dermale lymfekliercellen van ratten 15,23,24. Gebruikmakend van de drievoudige fluorescerende kleuring met CGRP, falloidine en LYVE1, samen met de weefselzuiveringstechniek, wordt een afbeelding met hoge resolutie gepresenteerd voor beter inzicht in het netwerk van zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten in de harige en glabrous huid.
Opgemerkt moet worden dat alleen de CGRP-positieve zenuwvezels in deze studie werden aangetoond. Naast dit soort sensorische zenuwvezels, kan dit protocol ook geschikt zijn voor het onderzoeken van andere soorten huidzenuwvezels met de bijbehorende antilichamen. Bovendien, aangezien falloïdine sterk tot expressie komt in de cytoskeletcomponent in gladde spier- en endotheelcellen 21,22,25, werden naast de bloedvaten ook de spier- en epidermale weefsels gelabeld met falloïdine. Volgens het morfologische kenmerk is het echter niet moeilijk om bloedvaten uit de andere soort weefsels te identificeren.
Samenvattend onderzoekt het huidige protocol effectief de innervatie van de behaarde en glabrous huid op dikkere secties door een combinatie van immunofluorescentie met clearingbehandeling te gebruiken. Vanuit het methodologische perspectief zou het een voordeel zijn om in de toekomst de andere soorten huidzenuwvezels en hun ruimtelijke correlatie met bloedvaten en lymfevaten te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Project Code no. CI2021A03404) en het Nationaal Interdisciplinair Innovatiefonds Traditionele Chinese Geneeskunde (Projectcode nr. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
References
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M.
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
