Summary
Doku kesitlerinin kalınlığı deri innervasyonunun morfolojik çalışmasını sınırladı. Mevcut protokol, konfokal mikroskopi altında kalın 300 μm doku kesitlerinde kutanöz sinir liflerini görselleştirmek için benzersiz bir doku temizleme tekniğini tanımlamaktadır.
Abstract
Deri innervasyonu periferik sinir sisteminin önemli bir parçasıdır. Kutanöz sinir liflerinin incelenmesi hızla ilerlemiş olsa da, dağılım ve kimyasal özelliklerinin anlaşılmasının çoğu, ince doku kesitlerinde geleneksel histokimyasal ve immünohistokimyasal boyamadan kaynaklanmaktadır. Doku temizleme tekniğinin gelişmesiyle birlikte daha kalın doku kesitlerinde kutanöz sinir liflerinin görüntülenmesi mümkün hale gelmiştir. Mevcut protokol, iki tipik kıllı ve göz kamaştırıcı cilt bölgesi olan sıçan arka ayağının plantar ve dorsal derisinden 300 μm kalınlığında doku kesitlerinde çoklu floresan boyamasını tanımlamaktadır. Burada, kalsitonin geni ile ilişkili peptid duyusal sinir liflerini etiketlerken, faloidin ve lenfatik damar endotelyal hyaluronan reseptörü 1 sırasıyla kan ve lenfatik damarları etiketler. Konfokal mikroskop altında, etiketli duyusal sinir lifleri tamamen daha uzun bir mesafeden takip edildi, derin kutanöz tabakada demetler halinde ve yüzeysel tabakada serbest stilde çalıştı. Bu sinir lifleri kan damarlarına paralel olarak koştu veya onları çevreledi ve lenfatik damarlar tüylü ve göz kamaştırıcı ciltte üç boyutlu (3D) bir ağ oluşturdu. Mevcut protokol, cilt innervasyonunu incelemek için metodoloji perspektifinden mevcut geleneksel yöntemlerden daha etkili bir yaklaşım sunmaktadır.
Introduction
Vücudun en büyük organı olan ve çevreye anahtar bir arayüz görevi gören deri, birçok sinir lifi tarafından yoğun bir şekilde innerve edilir 1,2,3. Deri innervasyonu daha önce tüm deri ve doku kesitlerinde boyama gibi çeşitli histolojik yöntemlerle yaygın olarak çalışılmasına rağmen, 4,5,6, kutanöz sinir liflerinin ayrıntılı etkili gösterimi hala bir zorluktur 7,8. Bu göz önüne alındığında, mevcut protokol, kalın doku bölümünde kutanöz sinir liflerini daha net sergilemek için benzersiz bir teknik geliştirmiştir.
Kesitlerin kalınlığına göre sınır nedeniyle, innerve deri sinir liflerinin gözlemlenmesi, elde edilen görüntü bilgisinden kalsitonin gen ile ilişkili peptid (CGRP) sinir lifleri ile lokal doku ve organlar arasındaki ilişkiyi doğru bir şekilde tasvir edecek kadar kesin değildir. 3D doku temizleme teknolojisinin ortaya çıkışı bu sorunu çözmek için uygulanabilir bir yöntem sağlar 9,10. Doku temizleme yaklaşımlarının hızla gelişmesi, son zamanlarda doku yapılarını, tüm organları, nöronal projeksiyonları ve bütün hayvanları incelemek için birçok araç sunmuştur11. Şeffaf cilt dokusu, kutanöz sinir liflerini görselleştirmek için veri elde etmek için konfokal mikroskopi ile çok daha kalın bir bölümde görüntülenebilir.
Bu çalışmada, bir sıçan arka ayağının plantar ve dorsal derisi, tüylü ve göz kamaştırıcı cildin iki hedef bölgesi olarak seçilmiştir 3,4,7. Kutanöz sinir liflerini daha uzun bir mesafede izlemek için, cilt dokusu immünohistokimyasal ve histokimyasal boyama için 300 μm kalınlığında dilimlendi ve ardından doku temizleme tedavisi uygulandı. CGRP, duyusal sinir liflerini12,13 olarak etiketlemek için kullanıldı. Ek olarak, doku arka planındaki kutanöz sinir liflerini vurgulamak için, sırasıyla 14,15 kan damarlarını ve lenfatik damarları etiketlemek için falloidin ve lenfatik damar endotelyal hyalurondan reseptör 1 (LYVE1) daha fazla kullanılmıştır.
Bu yaklaşımlar, kutanöz sinir liflerinin yüksek çözünürlüklü bir görünümünü göstermek ve ayrıca derideki sinir lifleri, kan damarları ve lenfatik damarlar arasındaki uzamsal korelasyonu görselleştirmek için uygulanabilecek basit bir yöntem sağladı; bu, normal cildin homeostazını ve patolojik koşullar altında kutanöz değişikliği anlamak için çok daha fazla bilgi sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Çin Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Akupunktur ve Moxibustion Enstitüsü Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (referans numarası D2018-04-13-1). Tüm prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) uyarınca gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada üç yetişkin erkek sıçan (Sprague-Dawley, ağırlık 230 ± 15 g) kullanılmıştır. Tüm hayvanlar, kontrollü sıcaklık ve nem ile 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde barındırıldı ve yiyecek ve suya serbest erişime izin verildi.
1. Perfüzyon ve numune hazırlama
- Ötanazi indüklemek için sıçana intraperitoneal olarak 250 mg / kg tribromoetanol çözeltisi (bakınız Malzeme Tablosu) enjekte edin.
- Solunum durduktan sonra, sıçanın göğüs boşluğunu açmak için paslanmaz çelik cerrahi makas kullanın. Sol kardiyak ventrikül13 üzerinden 3 mL/dak oranında perfüze etmek için 20 G iğne kullanın ve 100 mL% 0.9 normal salin ve ardından 0.1 M fosfat tamponunda (PB, pH 7.4) 250-300 mL% 4 paraformaldehit kullanın (Şekil 1A, B).
- Perfüzyondan sonra, dorsum derisini ve tabanını arka pençeden çıkarmak için bir neşter kullanın.
- Dondurulmuş kesit gerektiren numuneler için, dokuları 2 saat boyunca 0.1 M PB'de% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin; daha sonra dokuları 0.1 M PB'de% 25 sakkarozda 4 ° C'de 24 saatten fazla bir süre kriyoprotect
- Doku temizliği gerektiren kalın kesitli numuneler için, dokuları 2 saat boyunca 1x fosfat tamponlu salin (1x PBS) içinde% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin; daha sonra dokuları 4 °C'de 1x PBS'de kriyoproteksiyon yapın (Şekil 1C-E).
2. CGRP, faloidin ve LYVE1 ile üçlü floresan boyama ve ardından doku temizleme tedavisi
NOT: CGRP, faloidin ve LYVE1 ile üçlü floresan boyama, doku temizleme tedavisini takiben 300 μm kalınlığındaki doku kesitlerinde tüylü ve göz kamaştırıcı derideki sinir liflerini, kan damarlarını ve lenfatik damarları ortaya çıkarmak için uygulandı.
- Agaroz çözünene kadar bir mikro fırında 2 dakika ısıtılarak 1x PBS'de% 2 agaroz hazırlayın (bkz.
- Yıkadıktan sonra, cilt dokularını 37 ° C'de% 2 agaroz içine gömün ve soğutma için buz kutusunun içine yerleştirin (Şekil 1F, G).
- Titreşimli mikrotom üzerine monte edilmiş dokuyu buzlu suyla sabitleyin ve enine yönde 500 μm kalınlığında dilimleyin. Titreşim dilimleyiciyi ayarlamak ve dilimlemeyi bitirmek için aşağıdaki parametreleri kullanın: hız, 0,50 mm/sn ve genlik, 1,5 mm (Şekil 1H-K).
- Dilimledikten sonra, agarozu bölümlerden çıkarın ve 1x PBS (pH 7.4) içeren altı delikli bir plakada saklayın (Şekil 1L).
- Doku kesitlerini 4 °C'de gece boyunca 1x PBS'de (TriX-PB) %2 Triton X-100 çözeltisi içinde inkübe edin. Aşağıdaki yordam için Şekil 2'ye bakın.
- Doku bölümlerini bloke edici tampona yerleştirin ve 4 ° C'de gece boyunca çalkalayıcı üzerinde 72 rpm'de döndürün.
NOT: Bloke edici tampon bileşimi 1x PBS'de %10 normal eşek serumu, %1 Triton-X 100 ve %0,2 sodyum aziddir (bkz. - Doku kesitlerini, mikrosantrifüj tüpündeki seyreltme tamponunda fare monoklonal anti-CGRP (1:500) ve koyun poliklonal anti-LYVE1 antikorunun (1:500) birincil antikorlarını içeren çözeltiye aktarın (bkz.
NOT: Seyreltme tamponu bileşimi, 1x PBS'de% 1 normal eşek serumu,% 0.2 Triton-X 100 ve% 0.2 sodyum aziddir. - Doku bölümlerini oda sıcaklığında yıkama tamponu ile iki kez yıkayın, ardından yıkama tamponunda 4 °C'de gece boyunca çalkalayıcıda tutun.
NOT: Yıkama tamponu bileşimi 0,1 M PB'de (pH 7,4) %0,2 Triton-X 100'dür. - Ertesi gün, doku kesitlerini eşek anti-fare IgG H & L Alexa-Flour488 (1:500) ve eşek anti-koyun IgG H & L Alexa-Flour405 (1:500) ve Alexa-Flour594 falloidin (1:1000) (bkz.
- Doku kesitlerini, oda sıcaklığında 1 saat, iki kez yıkama tamponu ile altı delikli bir plakada yıkayın. Doku bölümlerini çalkalayıcı üzerindeki yıkama tamponunda gece boyunca 4 ° C'de tutun.
- Doku kesitlerini doku temizleme reaktifine aktarın ( bakınız Malzeme Tablosu, hacmi numune hacminden beş kat daha fazlaydı) ve çalkalayıcı üzerinde 60 rpm'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca yavaşça döndürün.
NOT: Bu tedaviden sonra doku kesitleri netleşir (Şekil 2B). - Temizlenmiş dokuları slayta monte edin, dokuları bir ara parça ile daire içine alın ve boşluğu taze doku temizleme reaktifi ve örtü kayması ile yapıştırın.
3. Geleneksel yaklaşımı takiben CGRP, falloidin ve LYVE1 ile üçlü floresan boyama
NOT: Bir karşılaştırma olarak, aynı boyama geleneksel teknikler izlenerek 30 μm kalınlığında doku kesitlerinde de gerçekleştirilmiştir.
- Doku kesitlerini enine yönde bir mikrotom üzerinde 30 μm'de dilimleyin ve slayta monte edin.
- 0,1 M PB'de %3 normal eşek serumu ve %0,3 Triton X-100 içeren blokaj çözeltisi ekleyin ve bölümleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve fare monoklonal anti-CGRP (1:500) ve koyun poliklonal anti-LYVE1 antikorunun (1:500) birincil antikorlarını içeren çözelti ile bölümleri, 4 ° C'de gece boyunca seyreltme tamponunda inkübe edin.
- Ertesi gün, doku bölümlerini 0.1 M PB (pH 7.4) ile üç kez yıkayın, eşek anti-fare IgG H & L Alexa-Flour488 (1: 500) ve eşek anti-koyun IgG H & L Alexa-Flour405 (1: 500) ve Alexa-Flour594 falloidin (1: 1000) sekonder antikorlarını içeren karışık çözeltiyi ekler ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Mikroskobik gözlemden önce, bölümleri üç kez 0.1 M PB (pH 7.4) içinde yıkayın, ardından% 50 gliserin içindeki kapaklarla örtün.
4. Görüntüleme ve analizler
- Lekeli örnekleri floresan mikroskop altında gözlemleyin ve ardından konfokal mikroskop kullanarak görüntüleri alın.
- Her 300 μm kalınlığındaki bölümden her biri 10 μm karede 30 görüntü (Z-yığınları ) yakalayın ve konfokal mikroskopi sisteminin görüntü işlemcisini kullanarak tek bir odak içi görüntüyü entegre edin (bkz.
- Üç boyutlu (3B) analiz için konfokal kurulumun görüntü işleme yazılımında aşağıdaki adımları gerçekleştirin: Başlangıç Odak Düzlemini Ayarlama | Bitiş odak düzlemi | ayarlama Adım boyutu | ayarlama Derinlik Deseni | Seçin Görüntü Yakalama | Z serisi.
NOT: Mavi floresan sinyallerinin uyarılması ve emisyon dalga boyları sırasıyla 401 nm ve 421 nm idi. Yeşil floresan sinyallerinin uyarılması ve emisyon dalga boyları sırasıyla 499 nm ve 519 nm idi. Kırmızı floresan sinyallerinin uyarılması ve emisyon dalga boyları sırasıyla 591 nm ve 618 nm idi. 152 μm, konfokal iğne deliğinin çapıdır (10x objektif lens, NA: 0,4). Görüntü yakalama çözünürlüğü 1024 × 1024 piksel idi.
- Üç boyutlu (3B) analiz için konfokal kurulumun görüntü işleme yazılımında aşağıdaki adımları gerçekleştirin: Başlangıç Odak Düzlemini Ayarlama | Bitiş odak düzlemi | ayarlama Adım boyutu | ayarlama Derinlik Deseni | Seçin Görüntü Yakalama | Z serisi.
- Geleneksel numuneler için (adım 3), her 30 μm kalınlığındaki bölümden 1 μm karede 30 görüntü (Z-yığınları) yakalayın ve bu görüntüleri yukarıda belirtildiği gibi ele alın (adım 4.1-4.2).
- Görüntü işleme sistemi ile görüntüleri 3D rekonstrüksiyon deseninde gösterin.
- Z-yığını konfokal görüntüleri Imaris 9.0'a içe aktararak 3B rekonstrüksiyonlar gerçekleştirin (hücre görüntüleme yazılımı, bkz. Malzeme Tablosu) ve leke yoğunluklarına göre yüzey işlemeleri oluşturun: Yeni yüzeyler ekleyin | Kaynak Kanal | Surface Detail (Yüzeyler Ayrıntısı) | pürüzsüz seçeneğindeki parametreleri belirleyin Mutlak Yoğunluk |'nin eşik seçeneğindeki parametreleri belirleyin Yüzeyleri Sınıflandırma | Bitirin.
- Hücre görüntüleme yazılımı ile pozitif sinir liflerinin yüzey alanında veri elde edin. İşlenen görüntü | İstatistik | Detaylı | Belirli Değerler | Hacim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üçlü floresan boyama işleminden sonra, sinir lifleri, kan damarları ve lenfatik damarlar, tüylü ve göz kamaştırıcı deride sırasıyla CGRP, faloidin ve LYVE1 ile açıkça etiketlendi (Şekil 3,4). Temizleme tedavisi ile, CGRP-pozitif sinir lifleri, faloidin-pozitif kan damarları ve LYVE1-pozitif lenfatik damarlar, cildin tüm yapısal bilgisini elde etmek için daha derin bir derinlikte görüntülenebilir (Şekil 3). Bu doku yapıları 3B bir düzende daha da yeniden yapılandırıldığında, dağılımlarının izlenmesi daha kolay hale geldi. CGRP-pozitif sinir liflerinin deri altı dokusundan ve dermisten epidermise geçtiği gösterilmiştir. Bu sinir lifleri deri altı dokusunda demetler halinde koşar, dermis içinde dallanır ve epidermiste sonlanır (Şekil 3). Buna karşılık, falloidin pozitif kan damarları ve LYVE1-pozitif lenfatik damarlar deri altı dokusunda ve dermiste dağılmıştır (Şekil 3). Genel olarak, CGRP-pozitif sinir lifleri kan damarlarına ve lenfatik damarlara paralel olarak veya onları çevreleyerek tüylü ve göz kamaştırıcı ciltte bir 3D ağ oluşturdu.
Konvansiyonel yaklaşımla, sinir lifleri, kan damarları ve lenfatik damarlar ince kesitlerde CGRP, faloidin ve LYVE1 ile açıkça etiketlenmiş olsa da, bu yapıların gözlenmesi dilim kalınlığı ile sınırlıdır ve tamamen gözlenemez (Şekil 4). Görüntüleme tekniği, farklı pozitif floresan sinyallerinden her nesne öğesi için derinlemesine görüntüler oluşturdu. Görüntü oluşturulduktan sonra, CGRP-pozitif sinir liflerinin yüzey alanı Imaris yazılımı aracılığıyla elde edildi. 30 μm kalınlığa sahip kesitte, CGRP-pozitif sinir liflerinin yüzey alanında kıllı deri ile göz kamaştırıcı deri arasında fark yoktu. 300 μm kalınlığındaki doku kesitlerinde, saçlı deri ile karşılaştırıldığında, göz kamaştırıcı derinin CGRP-pozitif sinir liflerinin yüzey alanı anlamlı olarak artmıştır (*P < 0.05, Kruskal-Wallis parametrik olmayan test, n = 3, Şekil 5). Bu nedenle, pozitif sinir liflerinin yüzey alanını doğru bir şekilde karşılaştırmak için, 300 μm temizlenmiş bölüm, geleneksel 30 μm kesitinden daha iyidir. Bir karşılaştırma olarak, temizleme tedavisi ile kalın doku kesitinden ideal bir 3D görüntü için geleneksel ince kesitten daha fazla fırsat elde etmek mümkündür.
Şekil 1: Deneysel aletlerin fotoğrafları ve çalışmadaki önemli adımlar. (A) Cerrahi aletler (neşter, makas, vb.). (B) Perfüzyon pompası. (C) Perfüzyon sonrası arka pençenin plantar ve dorsal tarafları. (D) Taban ve dorsum derileri arka pençeden çıkarıldı. (E) Kesilmiş cilt dokuları. (F,G) 37 °C ve 4 °C'de %2 agarozlu monte cilt dokuları. (H) Titreşimli mikrotom. (I) Kesme destekçisi üzerindeki sabit cilt dokuları. (J) Dilimleme için parametreleri ayarlayın. (K) Dilimleme işlemi. (L) Temsili bölümler 300 μm kalınlığa sahiptir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Floresan boyama prosedürü ve cilt dokusunun temizlenmesi . (A) Bu çalışmada yer alan protokol adımlarının bir temsili. (B) Temizleme tedavisinden önce ve sonra cilt dokusunun dış görünümleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kalın deri kesitinde doku temizleme tedavisini takiben sinir liflerinin, kan damarlarının ve lenfatik damarların uzamsal korelasyonu. (A,B) Sıçan arka ayağının plantar ve dorsal derisinin kalın bölümünün temsili görüntüleri, göz kamaştırıcı (A) ve tüylü (B) derideki sinir liflerinin, kan damarlarının ve lenfatik damarların dağılımını göstermektedir. (A1-A3) Panel A, CGRP-etiketleme (A1), Pha-etiketleme (A2) ve LYVE1-etiketleme (A3) ile ayrı ayrı gösterilmiştir. (A4,A5; B1, B2) Paneller (A) ve (B) 3D deseninde ayarlandı ve sırasıyla ön (A4, B1) ve arka (A5, B2) görünümlerle gösterildi. Tüm paneller için aynı ölçek çubuğu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İnce deri kesitindeki sinir liflerinin, kan damarlarının ve lenfatik damarların konvansiyonel yaklaşımla uzamsal korelasyonu. (A,B) Sıçan arka ayağının plantar ve dorsal derisinin kalın bölümünün temsili görüntüleri, göz kamaştırıcı (A) ve kıllı (B) derideki sinir liflerinin, kan damarlarının ve lenfatik damarların dağılımını göstermektedir. (A1,A2; B1, B2): Paneller (A) ve (B) 3D deseninde ayarlandı ve sırasıyla ön (A1, B1) ve arka (A2, B2) görünümlerle gösterildi. Tüm paneller için aynı ölçek çubuğu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Tüylü ve göz kamaştırıcı deride CGRP pozitif sinir liflerinin yüzey alanını gösteren bir histogram. (A) 30 μm kalınlığındaki bölümde, CGRP-pozitif sinir liflerinin yüzey alanında kıllı deri ile göz kamaştırıcı deri arasında fark yoktu. (B) 300 μm kalınlığa sahip kesitte, tüylü deri ile karşılaştırıldığında, göz kamaştırıcı cildin CGRP-pozitif sinir liflerinin yüzey alanı önemli ölçüde artmıştır (* P < 0.05, n = 3). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, deri innervasyonunu daha iyi anlamak için daha kalın doku kesitlerinde immünofloresan ve 3D görünüm ile daha kalın doku kesitlerinde immünofloresan kullanılarak tüylü ve göz kamaştırıcı derideki kutanöz sinir liflerinin ayrıntılı bir gösterimini sunmaktadır. 1-2 güne kadar antikor inkübasyon süresi ve gece boyunca temizleme işlemi önemlidir. Bu iki önemli adım, kalın kesitlerin immünofloresan boyama etkisini doğrudan etkiler. Hepsi kalın kesitler için uygun olmayan antikorların seçiminden başka bir sorun daha ortaya çıktı. Daha küçük moleküler ağırlıklara sahip antikorların, kalın kesitlerin immünofloresan boyanması için ideal olabileceğini düşünüyoruz. Bu nedenle, antikor seçiminin zorluğu bu yaklaşımın önemli bir sınırlamasıdır. Bu çalışma, kan damarlarının, lenfatik damarların ve sinirlerin sıçanların tüylü ve tüysüz derileri üzerindeki dağılımındaki farklılıkları gözlemlemiştir. İnsanlar için cilt yapısı kemirgenlerinkinden çok farklıdır; Bir sonraki adımda insan derisini gözlemlemek ve araştırmak için doku temizleme teknolojisini kullanmayı dört gözle bekliyoruz.
Önceki çalışmalar, kutanöz sinir lifleri 4,5,6,7,8'i ortaya çıkarmak için birçok çaba sarf etmiştir. Geleneksel doku kesiti çalışmasının aksine, CUBIC, CLARITY ve vDISCO dahil olmak üzere doku temizleme teknikleri, son yıllarda hayvanların tüm organlarını ve tüm vücutlarını incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır16,17,18,19. Genellikle, ince kesit 4,5,6,7,8'de uzun ve eksiksiz bir yapıya sahip kutanöz sinir liflerini izlemek zordur; Karşılaştırmalı olarak, büyük boyutlu numune üzerinde doku temizleme tedavisi uzun sürebilir16,17,18,19. Avantaj ve dezavantajları göz önüne alındığında, mevcut protokol, şeffaf bir şekilde tedavi edilen kalın kesit içindeki kutanöz sinir liflerinin ayrıntılı yapısını incelemek için uygun bir seçimdir ve sıradan konfokal mikroskopi altında gözlemlenmesi ve kaydedilmesi uygundur. Bu yaklaşımı kullanarak, kalın kesitte ince kesitlere kıyasla daha uzun kutanöz sinir lifleri gözlemlenebilir ve doku temizliği ile büyük boyutlu örneklere kıyasla doku tedavisi için deneysel zamandan tasarruf edilebilir.
Bu çalışmada, kutanöz sinir lifleri CGRP ile etiketlendi. Bu tür sinir lifleri C ve Aδ duyusal liflerine aittir, nosiseptif sinyallerin taşınmasında ve vazodilatasyonun modüle edilmesinde rol oynar12,13. CGRP-pozitif sinir lifleri deri altı tabakasında kan damarlarına ve lenfatik damarlara yakın konumlandırıldığından, anjiyogenez ve lenfanjiyogenezi iyileştirerek yara iyileşmesine de katılması önerilmiştir20,21. Önceki çalışmalara benzer şekilde 14,20,21,22, falloidin bu üçlü etiketleme deneyi ile kan damarlarında güçlü bir şekilde ifade edildi. Ek olarak, LYVE1 ayrılmaz bir membran glikoproteinidir ve sıçan dermal lenfatik endotel hücrelerini15,23,24 ayıklamak için bir biyobelirteç olarak etkili bir şekilde kullanılır. CGRP, falloidin ve LYVE1 ile üçlü floresan boyamadan yararlanarak, doku temizleme tekniği ile birlikte, kıllı ve göz kamaştırıcı ciltteki sinir lifleri, kan damarları ve lenfatik damarlar ağı hakkında daha iyi bir fikir edinmek için yüksek çözünürlüklü bir görüntü sunulmaktadır.
Bu çalışmada sadece CGRP-pozitif sinir liflerinin gösterildiği belirtilmelidir. Bu tür duyusal sinir lifinin yanı sıra, bu protokol, karşılık gelen antikorlarla diğer kutanöz sinir lifi türlerini incelemek için de uygun olabilir. Ek olarak, falloidin, düz kas ve endotel hücrelerinde21,22,25 sitoiskelet bileşeninde yüksek oranda eksprese edildiğinden, kan damarlarının yanı sıra, kas ve epidermal dokular da faloidin ile etiketlenmiştir. Bununla birlikte, morfolojik özelliğe göre, diğer doku türlerinden kan damarlarını tanımlamak zor değildir.
Özetle, mevcut protokol, immünofloresan ve temizleme tedavisi ile immünofloresan kombinasyonunu kullanarak kıllı ve göz kamaştırıcı cildin daha kalın kesitlerde innervasyonunu etkili bir şekilde araştırmaktadır. Metodoloji perspektifinden, gelecekte diğer kutanöz sinir lifi türlerini ve bunların kan damarları ve lenfatik damarlarla uzamsal korelasyonunu araştırmak faydalı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Tıp Bilimleri Akademisi İnovasyon Fonu (Proje Kodu no. CI2021A03404) ve Ulusal Geleneksel Çin Tıbbı Disiplinlerarası İnovasyon Fonu (Proje Kodu no. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
References
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M.
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
